CN102388067A - 定向于cd105的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对抗CD105的靶向结合剂以及这种试剂的用途。更具体而言，本发明涉及定向于CD105的全人源单克隆抗体。所述的靶向结合剂可用于治疗与CD105的活性和/或过量产生有关的疾病，并且可以用作诊断工具。

Description

定向于CD105的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及对抗CD105的靶向结合剂以及这种试剂的用途。更具体而言，本发明涉及定向于CD105的全人源单克隆抗体。所述的靶向结合剂可用于治疗与CD105的活性和/或过量产生有关的疾病，并且可用作诊断工具。 
背景技术
CD105，或者称为内皮因子，是在激活的血管内皮细胞上表达的跨膜糖蛋白(Letamendia A，Lastres P，Botella LM，et al.J Biol Chem 1998；273：33011-9)。CD105也已经报道肿瘤血管上高度表达，并且在有限数量的其他细胞类型上表达较弱，这些细胞包括巨噬细胞、成纤维细胞和合胞体滋养层(Fonsatti E et al.，Oncogene 2003：22：6557-6563)。 
CD105由两种均为95kDa的二硫键亚基构成，从而形成180-kDa同型二聚体蛋白(Barbara NP，Wrana JL，Letarte M.J Biol Chem 1999；274：584-94.)。CD105基因长度为40kb，并且定位在人染色体9q34上(Fonsatti E，Sigalotti L，Arslan P，Altomonte M，Maio M.Curr Cancer Drug Targets 2003；3：427-32；Rius C，Smith JD，Almendro N，et al.Blood 1998；92：4677-90.)。mRNA转录物长度为3.4kb，并且由14个外显子构成。外显子1至12编码胞外结构域，而跨膜结构域由外显子13编码，并且胞浆结构域由外显子14编码。已经鉴定CD105的两种不同亚型，表示为长型(L-CD105/内皮因子)和短型(S-CD105/内皮因子)。上述亚型在细胞质尾端内的氨基酸组成不同。更具体而言，在胞浆结构域中L亚型占主导地位并且含有47个残基，而S亚型仅含14个氨基酸(Gougos A，Letarte M.J Biol Chem 1990；265：8361-8364；Lastres P et al.Biochem J，1990； 301：765-768)。 
CD105是转化生长因子-β(TGF-β)受体的共受体；其和TGF-β的信号传导类型I与类型II受体形成异二聚体，并且可调制对于TGF-β的应答(Yamashita H et al.，J Biol Chem，1994；269：1995-2001；Guerrero-Esteo M et al.，J Biol Chem 2002；277：29197-29209)。TGF-β是细胞因子，该细胞因子是包括激活素和骨形成蛋白(BMP)的较大超家族的一部分(Piek E et al.，FASEB J，1999；13：2105-2124)。TGF-β超家族的成员通过类型I与II丝氨酸/苏氨酸激酶受体和它们下游核效应子(称为Smads)来介导细胞应答(Heldin C-H et al.，Nature，1997；390：465-471)。在内皮细胞中，TGF-β已经显示激活类型I受体的两种途径：激活素受体样激酶ALK5和ALK1。ALK1的激活促进Smad1/5磷酸化，并且刺激细胞增殖和迁移。相反，ALK5的激活诱导Smad2/3磷酸化并且抑制细胞增殖和迁移(Goumans M-J et al.，EMBO J 2002；21：1743-1753)。因此，在静态内皮细胞中，ALK5是TGF-β信号传导的主要调制物。然而，在血管生成的过程中，ALK1优选被激活(Lebrin F，Deckers M，Bertolino P，ten Dijke P.Cardiovasc Res 2005；65：599-608)。 
CD105的突变导致I型遗传性出血性毛细血管扩张症(或Osler-Rendu-Weber综合征1)(Bobik A.Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006；26：1712-20.)。该综合征是遗传性常染色体显性疾病，并且表征为多***血管发育不良、复发性鼻出血、皮肤粘膜毛细血管扩张以及肺、脑、肝和胃肠道的动静脉畸形(Bertolino P，Deckers M，Lebrin F，ten Dijke P.Chest 2005；128：585-90S；Bobik A.Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006；26：1712-20)。已经描述了疾病的两种基因型：遗传性出血性毛细血管扩张症1，表征为CD105中的突变；以及遗传性出血性毛细血管扩张症2，表征为ALK1中的突变(Bobik A.Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006；26：1712-20；Lebrin F，Deckers M，Bertolino P，ten Dijke P.Cardiovasc Res 2005；65：599-608)。在具有用于CD105(CD105+/-)的杂合基因型遗传性出血性毛细血管扩张症的转基因啮齿动物模型中，相比于野生型动物，小鼠表现出无规则、扩大和薄壁的血管，同时和血管平滑肌细胞相关性较差。令人感兴趣地，CD105杂合小鼠存活至成年期，而显示出无效突变纯合 (CD105-/-)的小鼠无法发育，从而导致由于卵黄囊血管缺陷、心脏瓣膜异常和不规则的心室发育而在第11.5天胚胎致死(Arthur HM，Ure J，Smith AJ，et al.，Dev Biol 2000；217：42-53；Li DY，Sorensen LK，Brooke BS，et al.Science 1999；284：1534-7)。因此，上述发现强调了CD105在血管内平衡中的重要性。近年来，CD105也已经暗指调制内皮细胞迁移和细胞骨架的形成(Conley BA et al.，J Biol Chem 2004；279：27440-27449；Sanz-Rodriguez F et al.，J Biol Chem，2004；279：32858-32868)。 
CD105表达已经报道和癌症患者的较差预后有关联。更具体地，CD105表达相关于乳腺癌、肺癌和结肠直肠癌患者的较差总存活率(Kumar S et al.，Cancer Res 1999；59：856-861；Tanaka F et al.，Clin Cancer Res 2001；7：3410-3415；Li C et al.，Br J Cancer 2003；88：1424-1431)。此外，如上所述，在胃肠道、***、***以及头颈部恶性肿瘤中，CD105表达和远处转移病灶的存在有关联(Ding S，Li C，Lin S，et al.Hum Pathol 2006；37：861-6；Saad RS，El-Gohary Y，Memari E，Liu YL，Silverman JF.Hum Pathol 2005；36：955-61；Saad RS，Liu YL，Nathan G，Celebrezze J，Medich D，Silverman J F.Mod Pathol 2004；17：197-203；Li C，Guo B，Wilson PB，et al.Int J Cancer 2000；89：122-6；Yang LY，Lu WQ，Huang GW，Wang W.BMC Cancer 2006；6：110；El-Gohary YM，Silverman JF，Olson PR，et al.Am J Clin Pathol 2007；127：572-9；Chien CY，Su CY，Hwang CF，Chuang HC，Chen CM，Huang CC.J Surg Oncol 2006；94：413-7)。 
近年来，已经报道了增加CD105表达水平具有下列VEGF途径的抑制。在胰腺癌移植瘤模型中，CD105转录水平的上调为用抗-VEGF中和抗体处理的小鼠中的水平的2倍多(Bockhorn M et al.，Clin Cancer Res.2003；9：4221-4226)。在膀胱癌移植瘤模型中，通过免疫组织化学法测定的CD105水平在用抗-VEGF中和抗体处理的小鼠的肿瘤核心内提高(Davis D et al.，Cancer Res.2004；64：4601-4610)。 
另外，CD105表达通过组织缺氧而增强，并且已经报道：保护低氧细胞避免细胞凋亡；在缺氧负荷下抑制CD105增强的细胞凋亡(Li C，Issa R，Kumar P，et al.J Cell Sci 2003；116：2677-85.)。CD105mRNA和启动子活性在缺氧条件下也显著地提高(Li C，Issa R，Kumar P，et al.J Cell Sci  2003；116：2677-85.)。因此，缺氧被认为是在血管内皮细胞中CD105基因表达的有效刺激。 
因此，需要开发新的抑制CD105信号传导的方式。 
发明概述 
本发明涉及特异性地与CD105结合并抑制CD105的生物学活性的靶向结合剂。本发明的实施方案涉及特异性地与CD105结合并抑制CD105依赖性TGF-β信号传导的靶向结合剂。例如，本发明的CD105结合剂抑制CD105配体(例如TGF-β1、TGF-β3、激活素-A、BMP-2和/或BMP-7)与TGF-β1受体络合物的CD105部分的结合。 
本发明的实施方案涉及特异性地与CD105结合并抑制CD105配体与CD105结合的靶向结合剂。在本发明的一个实施方案中，靶向结合剂特异性地与CD105结合并抑制CD105配体(TGF-β 1、TGF-β 3、激活素-A、BMP-2和/或BMP-7)与CD105结合。在一个实施方案中，与缺少靶向结合剂的条件下所发生的结合情况相比，所述的靶向结合剂抑制了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的CD105配体与CD105的结合。 
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂以低于5纳摩尔(nM)的结合亲和性(KD)与CD105结合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂以低于4nM、3nM、2nM或1nM的KD进行结合。在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂以低于950兆摩尔(pM)的KD与CD105结合。在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂以低于900pM的KD与CD105结合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂以低于800pM、700pM或600pM的KD进行结合。在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂以低于500pM的KD与CD105结合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂以低于400pM的KD进行结合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂以低于300pM的KD进行结合。在一些其他的实施方案中，所述的靶向结合剂以低于200pM的KD进行结合。在一些其他的实施方案中， 所述的靶向结合剂以低于100pM的KD进行结合。在一个特定的实施方案中，本发明的靶向结合剂可以以低于10pM的亲和性KD与人源CD105相结合。在另一个特定的实施方案中，本发明的靶向结合剂可以以低于1pM的亲和性KD与人源CD105相结合。可以采用本文所述的方法或本领域的任一技术人员已知的方法来估测KD(例如BIAcore测试，ELISA，FACS)(Biacore International AB，Uppsala，Sweden)。 
本发明的靶向结合剂或抗体的结合性质还可以通过参照解离速率或结合速率(分别为koff和kon)来测定。 
在本发明的一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以具有至少104M-1s-1、至少5X104M-1s-1、至少105M-1s-1、至少2X105M-1s-1、至少5X105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5X106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5X107M-1s-1、或者至少108M-1s-1的kon速率(抗体(Ab)+抗原(Ag)kon→Ab-Ag)。 
在本发明的另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以具有低于5x10-1s-1、低于10-1s-1、低于5x10-2s-1、低于10-2s-1、低于5x10-3s-1、低于10-3s-1、低于5x10-4s-1、低于10-4s-1、低于5x10-5s-1、低于10-5s-1、低于5x10-6s-1、低于10-6s-1、低于5x10-7s-1、低于10-7s-1、低于5x10-8s-1、低于10-8s-1、低于5x10-9s-1、低于10-9s-1、或者低于10-10s-1的koff速率((Ab-Ag)koff→抗体(Ab)+抗原(Ag))。 
在一些实例中，本发明的靶向结合剂对得自其他物种的其他CD105蛋白质具有交叉反应性。在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂(例如4.120，6B1，9H10，10C9，4D4，11H2，4.37，6B10，3C1和6A6)对猕猴CD105具有交叉反应性。在另一实施方案中，本发明的靶向结合剂对小鼠CD105(，例如6B1)具有交叉反应性。 
本发明的靶向结合剂还可具有抗增殖活性。在特定实例中，本发明的抗体可使增殖抑制至少5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％13％，14％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。在一个实施方案中，当抗体浓度为50μg/ml时，本发明的抗体可使HUVEC细胞的增殖抑制在2-30％，4-25％或8-20％的范围内。 
在本发明的另一实施方案中，本发明的靶向结合剂可调制血管形成。在一个例子中，本发明的抗体可抑制血管增长和/或分叉数量。在一个特定 实施方案中，本发明的抗体可使血管增长抑制至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。例如，在实施例6中所述的全细胞图像分析法中，抗体6B10可使血管增长抑制至少20％例如20-30％，并且可使分叉数量抑制至少40％例如40-60％。 
在本发明的另一实施方案中，本发明的抗体可调制细胞的肌动蛋白细胞骨架结构。在一个特定实施方案中，3C.1，6B1，6B10，10C9，4.120或4.37的靶向抗体可因此内皮细胞的肌动蛋白细胞骨架结构的显著调制。 
在本发明的另一实施方案中，本发明的靶向结合剂干扰TGFβ信号传导。在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂(例如4D4，6A6，6B10，9H10，4.120或4.37)介导pSMAD2磷酸化。 
在本发明的另一实施方案中，靶向结合剂交叉竞争SN6抗体，例如6A6，6B10，9H10或3C1。 
在一些实施方案中，靶向结合剂可治疗和血管生成有关的病症。在本发明的一个实施方案中，靶向结合剂抑制哺乳动物中肿瘤的生长和/或转移。特别地，靶向结合剂可用于治疗实体瘤。靶向结合剂可联合使用其他抗癌疗法例如化疗方案，或单独抑制肿瘤的生长和/或转移。当用作单独疗法时，本发明的靶向结合剂可于其他疗法例如抗VEGF疗法都无效的患者。在另一实施方案中，靶向结合剂可治疗眼部疾病，例如糖尿病视网膜病和新生血管性黄斑变性。在又一实施方案中，靶向结合剂可用于治疗慢性炎症性疾病，例如风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘、Crohn’s疾病、溃疡性结肠炎和炎症性肠病。 
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂为抗体。在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂为单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，所述的靶向结合剂为全人源单克隆抗体。在本发明的另一个实施方案中，所述的靶向结合剂为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的全人源单克隆抗体。在本发明的另一个实施方案中，所述的靶向结合剂为IgG2同种型的全人源单克隆抗体。与其他同种型相比，所述的IgG2同种型具有降低的引发效应器功能的潜力，这可以使得毒性降低。在本发明的另一个实施方案中，所述的靶向结合剂为IgG1同种型的全人源单克隆抗体。与其他同种型相比，所述的IgG1同种型具有升高的引发ADCC和/或CDC 的潜力，这可以使得效力得到改善。与其他同种型(例如IgG4)相比，IgG1同种型具有改善的稳定性，这可以使得生物利用率得到改善，或者使制造的方便程度得到改善或者得到更长的半衰期。在一个实施方案中，IgG1同种型的全人源单克隆抗体为z、za或f同种异型。 
在本发明的一个实施方案中，特异性结合CD105的靶向结合剂可表现出一种或多种以下所述的性质，包括： 
以小于1nM的KD与人源CD105相结合； 
使HUVEC细胞的细胞增殖的抑制大于5％，例如5-20％； 
增强SMAD2磷酸化； 
表现为抗血管原活性；以及 
表现为ADCC活性。 
另一个实施方案为特异性地与CD105结合并包含以下序列的靶向结合剂或抗体，其中所述的序列包含表2所示的互补性决定区(CDR)的序列。本发明的实施方案包含具有以下序列的靶向结合剂或抗体，其中所述的序列包含：如表2所示，得自重链可变结构域的CDR1、CDR2或CDR3序列中的任何一者。另一个实施方案为特异性地与CD105结合并包含以下序列的靶向结合剂或抗体，其中所述的序列包含表2所示的重链可变结构域的CDR序列中的两个。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体具有这样的序列，该序列包含表2所示的重链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体具有这样的序列，该序列包含表2所示的轻链可变结构域的CDR序列中的一者。本发明的实施方案包含具有以下序列的靶向结合剂或抗体，其中所述的序列包含：表2所示的重链可变结构域的CDR1、CDR2或CDR3序列中的任何一者。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体具有这样的序列，该序列包含表2所示的重链可变结构域的CDR序列中的两个。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体具有这样的序列，该序列包含表2所示的轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体可以具有这样的序列，该序列包含表2所示的重链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3序列以及表2所示的轻 链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些实施方案中，所述的靶向结合剂为抗体。在某些实施方案中，所述的靶向结合剂为全人源单克隆抗体。在某些其他的实施方案中，所述的靶向结合剂为全人源单克隆抗体的结合片段。 
在一个实施方案中，本发明的抗体包括： 
(a)SEQ ID NO：2的VH CDR1，其具有与SEQ ID NO：2的VH CDR1相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：2的VH CDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代； 
(b)SEQ ID NO：2的VH CDR2，其具有与SEQ ID NO：2的VH CDR2相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：2的VH CDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代； 
(c)SEQ ID NO：2的VH CDR3，其具有与SEQ ID NO：2的VH CDR3相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：2的VH CDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代； 
(d)SEQ ID NO：4的VL CDR1，其具有与SEQ ID NO：4的VL CDR1相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：4的VL CDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代； 
(e)SEQ ID NO：4的VL CDR2，其具有与SEQ ID NO：4的VL CDR2相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：4的VL CDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；以及 
(f)SEQ ID NO：4的VL CDR3，其具有与SEQ ID NO：4的VL CDR3相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：4的VL CDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代。 
在另一个实施方案中，本发明的抗体包括： 
(a)SEQ ID NO：26的VH CDR1，其具有与SEQ ID NO：26的VH CDR1相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：26的VH CDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代； 
(b)SEQ ID NO：26的VH CDR2，其具有与SEQ ID NO：26的VH CDR2相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：26的VH CDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代； 
(c)SEQ ID NO：26的VH CDR3，其具有与SEQ ID NO：26的VH CDR3相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：26的VH CDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代； 
(d)SEQ ID NO：28的VL CDR1，其具有与SEQ ID NO：28的VL CDR1相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：28的VL CDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代； 
(e)SEQ ID NO：28的VL CDR2，其具有与SEQ ID NO：28的VL CDR2相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：28的VL CDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；以及 
(f)SEQ ID NO：28的VL CDR3，其具有与SEQ ID NO：28的VL CDR3相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：28的VL CDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代。 
在又一个实施方案中，本发明的抗体包括： 
(a)SEQ ID NO：30的VH CDR1，其具有与SEQ ID NO：30的VH CDR1相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：30的VH CDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代； 
(b)SEQ ID NO：30的VH CDR2，其具有与SEQ ID NO：30的VH CDR2相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：30的VH CDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代； 
(c)SEQ ID NO：30的VH CDR3，其具有与SEQ ID NO：30的VH CDR3相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：30的VH CDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代； 
(d)SEQ ID NO：32的VL CDR1，其具有与SEQ ID NO：32的VL CDR1相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：32的VL CDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代； 
(e)SEQ ID NO：32的VL CDR2，其具有与SEQ ID NO：32的VL CDR2相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：32的VL CDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；以及 
(f)SEQ ID NO：32的VL CDR3，其具有与SEQ ID NO：32的VL CDR3相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：32的VL CDR3相比具有1、 2或3个氨基酸残基的取代。 
在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂可以包含这样的序列，该序列包含由命名为Mab4.120VH、Mab4.37VH或Mab6B10VH的质粒中的多核苷酸所编码的可变重链序列的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(American type culture collection(ATCC))中，编号分别为2008年9月17日的PTA-9514、PTA-9511或PTA-9510。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂可以包含这样的序列，该序列包含由命名为Mab4.120VL、Mab4.37VL或Mab6B10VL的质粒中的多核苷酸所编码的可变轻链序列的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号分别为2008年9月17日的PTA-9513、PTA-9512或PTA-9499。 
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab4.120VH的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9514。 
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab4.120VH的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9514；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab4.120VL的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9513。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab4.120VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9514。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变轻链氨基酸序列，该可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab4.120VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所 述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9514。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab4.120VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9514；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab4.120VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9513。 
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab4.37VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9511。 
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab4.37VH的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9511；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab4.37VL的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9512。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab4.37VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9511。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变轻链氨基酸序列，该可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab4.37VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17 日的PTA-9512。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab4.37VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9511；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab4.37VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9512。 
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab6B10VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9510。 
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab6B10VH的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9510；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab6B10VL的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9499。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab6B10VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9510。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变轻链氨基酸序列，该可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab6B10VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9499。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab6B10VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9510；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab6B10VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9499。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab4.120VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9514。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab4.37VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9511。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab6B10VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9510。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab4.120VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9513。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab4.37VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9512。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab6B10VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链，其中所述的 质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9499。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab4.120VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9514，以及由命名为Mab4.120VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9513。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab4.37VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9512；以及由命名为Mab4.37VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9511。 
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab6B10VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9510，以及由命名为Mab6B10VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9499。 
应该注意，本领域的普通技术人员可以容易地完成CDR的测定。例如参见Kabat et al，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，vols.1-3。Kabat提供了得自多个物种的同种型抗体的免疫球蛋白链的多个序列比对。根据单一的编号***(Kabat编号***)对比对的序列进行编号。Kabat序列从1991的出版物开始更新，并且可以用作电子序列数据库(最近的可下载的版本1997)。可以根据Kabat通过与Kabat参照序列进行比对来对任何免疫球蛋白序列进行编码。因此，Kabat编码***提供了用于编码免疫球蛋白链的统一的***。 
在一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有表2所示重链 序列中的任何一者的序列。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有抗体4.120，4.37和6B10的重链序列中的任何一者的序列。 
轻链混杂(promiscuity)在本领域中是良好建立的，因此包含以下序列的靶向结合剂或抗体可以进一步包含表2中所示的；或者抗体4.120，4.37和6B10的；或者本文中所公开的另一种抗体的轻链序列中的任何一者，其中所述的序列包含抗体4.120，4.37和6B10的或者本文中所公开的另一种抗体的重链序列中的任何一者。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。 
在一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有表2所示的轻链序列中的任何一者的序列。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有抗体4.120，4.37和6B10轻链序列中的任何一者。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。 
在一些实施方案中，靶向结合剂是选自4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1和6A6中的单克隆抗体。在一个实施方案中，靶向结合剂包含全人源单克隆抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1和6A6中的一种或多种。在某些实施方案中，靶向结合剂是单克隆抗体4.120。在某些其他实施方案中，靶向结合剂是单克隆抗体4.37。在某些其他实施方案中，靶向结合剂是单克隆抗体6B10。 
在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有选自表2中所示序列中的任何一者的重链CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有选自表2中所示序列中的任何一者的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有选自抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1和6A6的CDR中的任何一者的重链CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有选自抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1和6A6的CDR中的任何一者的轻链CDR1、CDR2和CDR3。 
在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体4.120，4.37或6B10中的 任何一者的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一者。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体4.120，4.37或6B10中的任何一者的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一者。在一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体4.120，4.37或6B10的CDR1、CDR2或CDR3。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体4.120，4.37或6B10的CDR1、CDR2或CDR3。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体4.120，4.37或6B10的CDR1、CDR2或CDR3；以及表2中所示的全人源单克隆抗体4.120，4.37或6B10的CDR1、CDR2或CDR3。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。 
在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体4.120的CDR1、CDR2和CDR3序列和表2中所示的全人源单克隆抗体4.120的CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体4.37的CDR1、CDR2和CDR3序列和表2中所示的全人源单克隆抗体4.37的CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体6B10的CDR1、CDR2和CDR3序列和表2中所示的全人源单克隆抗体6B10的CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。 
本发明的另一个实施方案为包含以下序列的靶向结合剂或抗体，其中所述的序列具有跨越表2中所示序列的任何一者的构架区和CDR(具体而言为FR1至FR4、或者CDR1至CDR3)的临近序列。在一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列具有跨越表2中所示的单克隆抗体4.120，4.37或6B10序列的任何一者的构架区和CDR(具体而言为FR1至FR4、或者CDR1至CDR3)的临近序列。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。 
在另一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分包含 具有SEQ ID NO.：2序列的重链多肽。在一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分还包含具有SEQ ID NO.：4序列的轻链多肽。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。 
一个实施方案提供靶向结合剂或抗体、或者其抗原结合部分，其中所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO.：26序列的重链多肽。在一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分还包含具有SEQ ID NO.：28序列的轻链多肽。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。 
在另一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO.：30序列的重链多肽。在另一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分还包含具有SEQ ID NO.：32的轻链多肽。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。 
在一个实施方案中，在所公开的CDR、或者重链或轻链框架序列中，所述的靶向结合剂或抗体包含多达20、16、10、9或更少(例如1、2、3、4或5个)的氨基酸添加、取代、删除和/或***。这种修饰可以潜在地在CDR和/或框架序列范围内的任何残基处形成。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。 
在一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含本文所公开的CDR的变体或衍生物、跨越构架区和CDR的临近序列(具体而言为FR1至FR4、或者CDR1至CDR3)、本文所公开的轻链或重链序列、或者本文所公开的抗体。变体包含这样的靶向结合剂或抗体，该靶向结合剂或抗体具有在表2中所示的CDR1、CDR2或CDR3的任何一者中具有多达20、16、10、9或更少(例如1、2、3、4、5或6个)的氨基酸添加、取代(例如保守氨基酸取代)、删除和/或***的序列；跨越表2中所示的构架区和CDR(具体而言为FR1至FR4、或者CDR1至CDR3)的临近序列；本文所公开的轻链或重链序列；或者本文所公开的单克隆抗体。变体包含这样的靶向结合剂或抗体，该靶向结合剂或抗体具有表2中所示的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一者的至少大约60、70、80、85、90、95、98或大约99％氨基酸序列一致性的序列；跨越表2中所示的构架区和CDR(具体而言为FR1至FR4、或者CDR1至CDR3)的临近序列；本文所公开的轻链或重链序 列；或者本文所公开的单克隆抗体。两个氨基酸序列的百分率一致性可以通过本领域的技术人员已知的任何方法来测定，包括但不限于成对的蛋白质比对。在一个实施方案中，变体包含在CDR序列中或者在本文所公开的轻链或重链多肽中的变化，所述的变化是天然存在的，或者采用重组DNA技术或诱变技术对天然序列进行体外基因工程处理而诱导得到的。天然存在的变体包括在针对外源抗原产生抗体的过程中相对于种系核苷酸序列而在体内产生的那些。在一个实施方案中，所述的衍生物可以为异种抗体，其为其中两个或多个抗体被连接到一起而形成的抗体。衍生物包括经过化学修饰的抗体。实例包括一种或多种聚合物形成的共价连接物，例如水溶性的聚合物，N-连接或O-连接的碳水化合物，糖，磷酸酯和/或其他此类分子。所述的衍生物按照不同于天然存在的或起始抗体的方式进行修饰(按照所附分子的种类或位置)。衍生物还包含删除天然存在于所述抗体上的一个或多个化学基团。 
在一个实施方案中，所述的靶向结合剂为双特异性抗体。双特异性抗体为对至少两个不同的抗原决定部位具有结合特异性的抗体。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。(例如参见，Millstein et al，Nature，305：537-539(1983)；Traunecker et al，EMBO J，10：3655-3659(1991)；Suresh et al，Methods in Enzymology，121：210(1986)；Kostelny et al，J.Immunol，148(5)：1547-1553(1992)；Hollinger et al，Proc.Natl Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)；Gruber et al，J.Immunol，152：5368(1994)；美国专利No.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,81；95,731,168；4,676,980；和4,676,980，WO 94/04690；WO 91/00360；WO 92/200373；WO 93/17715；WO 92/08802；和EP 03089)。在一个例子中，本发明的双特异性抗体是对于至少两个不同CD105抗原决定部位具有结合特异性的抗体。由于本发明的多种CD105靶向结合剂具有不同的抗原决定部位或者具有部分或重叠的抗原决定部位，因此涵盖本发明的双特异性抗体可包括具有部分或重叠的抗原决定部位的CD105靶向结合剂的任意组合。例如，6A6和6B10具有与4D4和10C9不同的抗原决定部位。在一个例子中，双特异性抗体6A6或6B10的可变或高变区以及4D4或10C9的可变或高变区。 
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有SEQ  ID NO.：26的序列。在某些实施方案中，SEQ ID NO.：26包含表5的各行中所示的种系和非种系残基的组合中的任何一者。在一些实施方案中，SEQ ID NO.：26包含表5中所示的种系残基的任何一者、任何二者、或三者或者所有三者。在某些实施方案中，SEQ ID NO.：2包含表5的各行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一者。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体衍生自具有VH3-33、D6-13和JH6结构域的种系序列，其中一个或多个残基已经突变，从而在所述位置处产生相应的种系残基。 
本发明的另一个实施方案为与本发明的靶向结合剂或抗体竞争性地结合CD105的靶向结合剂或抗体。在本发明的另一个实施方案中，存在有与本发明的靶向结合剂或抗体竞争性地结合CD105的抗体。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体与全人源单克隆抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1或6A6的任何一者竞争性地结合CD105。“竞争”是指所述的靶向结合剂或抗体与全人源单克隆抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1或6A6中的任何一者竞争性地结合CD105，即，竞争是非单向性的。 
本发明的实施方案包含与全人源单克隆抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1或6A6中的任何一者交叉竞争以结合CD105的靶向结合剂或抗体。“交叉竞争”是指与全人源单克隆抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1或6A6中的任何一者竞争性地结合CD105的靶向结合剂或抗体，反之，即，竞争是指双向性的。 
本发明的另一个实施方案为竞争性地结合CD105的靶向结合剂或抗体。在本发明的另一个实施方案中，存在有与本发明的靶向结合剂或抗体交叉竞争性地结合CD105的靶向结合剂或抗体。 
本发明的另一个实施方案为与本发明的靶向结合剂或抗体相同的CD105上的抗原决定部位相结合的靶向结合剂或抗体。本发明的实施方案还包括与全人源单克隆抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1或6A6中的任何一者的CD105上相同的抗原决定部位相结合的靶向结合剂或抗体。 
本发明的其他实施方案包括编码本文所述的靶向结合剂或抗体中的任何一者的经分离的核酸分子、具有编码本文所述的靶向结合剂或抗体的 经分离的核酸分子的载体、或者使用这种核酸分子的任何一者的转化的宿主细胞。本发明的实施方案包括这样的核酸分子，该核酸分子编码特异性地与CD105相结合并抑制CD105配体例如TGF-β与CD105受体相结合的全人源经分离的靶向结合剂。本发明还涵盖了在如本文所定义的严格或严格程度较低的杂交条件下与编码本文所述的靶向结合剂或抗体中的任何一者的多核苷酸相杂交的多核苷酸。本发明的实施方案还包括具有编码所述结合剂的核酸分子的载体。其他实施方案包括具有所述载体(包含所述的核酸分子)的宿主细胞。 
如本领域已知的那样，抗体可以有利地为(例如)多克隆、寡克隆、单克隆、嵌合的、人源的和/或全人源的抗体。 
应该理解的是，本发明的实施方案不限于任何特定形式的抗体或者生成或制备方法。在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂为全人源单克隆抗体的结合片段。例如，所述的靶向结合剂可以为全长的抗体(例如具有完整的人源Fc区域)或者抗体结合片段(例如Fab、Fab’或F(ab’)2、FV或者dAb)。此外，所述的抗体可以为单一结构域的抗体，例如与CD105结合的camelid或人源单一VH或VL结构域(例如dAb片段)。 
本文所述的本发明的实施方案还提供了用于制备所述这些抗体的细胞。细胞的实例包括杂交瘤细胞、重组创建的细胞(例如中国仓鼠***(CHO))、CHO细胞的变体(例如DG44)以及产生对抗CD105的抗体的NS0细胞。关于CHO细胞的变体的其他信息可以在Andersen and Reilly(2004)Current Opinion in Biotechnology 15，456-462中找到，该文献以引用方式全文并入本文。所述的抗体可以由分泌所述抗体的杂交瘤细胞、或者由重组的基因工程细胞(其经编码所述抗体的基因转化或转染)制得。 
此外，本发明的一个实施方案为通过在核酸分子被表达从而制得所述抗体、然后回收所述抗体的条件下培养宿主细胞来制备本发明的抗体的方法。应该认识到，本发明的实施方案还包括可以编码本发明的抗体或抗体片段的任何核酸分子(包括当被转染到用于抗体制备的宿主细胞中时被优化用于提高抗体及其片段的核酸序列的产量)。 
本发明的另一个实施方案包括通过使用表达人源CD105的细胞免疫哺乳动物、分离含有人源CD105的细胞膜、纯化出人源CD105或其片段 和/或一个或多个定向进化同源序列或其片段来制备与CD105特异性结合并抑制CD105的生物学活性的抗体的方法。 
在其他实施方案中，本发明提供了组合物，该组合物包含本发明的靶向结合剂或抗体或者其结合片段、以及可药用的载体或稀释剂。 
本发明的又一个实施方案包括通过对动物给药治疗有效剂量的、特异性结合CD105的靶向结合剂来有效地治疗患有血管原增殖性疾病的动物的方法。在某些实施方案中，所述的方法还包括选择需要***、癌症和/或细胞增殖紊乱的动物，以及向这些动物给药治疗有效剂量的、特异性结合CD105的靶向结合剂。 
本发明的又一个实施方案包括通过对动物给药治疗有效剂量的、特异性结合CD105的靶向结合剂来有效地治疗患有赘生性疾病的动物的方法。在某些实施方案中，所述的方法还包括选择需要治疗赘生性疾病的动物，以及向这些动物给药治疗有效剂量的、特异性结合CD105的靶向结合剂。 
本发明的又一个实施方案包括通过对动物给药治疗有效剂量的、特异性结合CD105的靶向结合剂来有效地治疗患有恶性肿瘤的动物的方法。在某些实施方案中，所述的方法还包括选择需要治疗恶性肿瘤的动物，以及向这些动物给药治疗有效剂量的、特异性结合CD105的靶向结合剂。 
本发明的又一个实施方案包括通过对动物给药治疗有效剂量的、特异性结合CD105的靶向结合剂来有效地治疗患有与CD105表达有关的疾病或状况的动物的方法。在某些实施方案中，所述的方法还包括选择需要治疗与CD105表达有关的疾病或状况的动物，以及向这些动物给药治疗有效剂量的、特异性结合CD105的靶向结合剂。 
恶性肿瘤可以选自：黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、胃部(胃)癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、头部和颈部的癌症、间皮瘤、肉瘤、胆管癌(胆管细胞癌)、小肠腺癌、小儿恶性肿瘤(pediatric malignancy)以及扁平上皮癌。 
可治疗的增殖性或血管原疾病包括赘生性疾病，例如黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、晚期非小细胞肺癌、肝细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、胃部(胃)癌、胆囊癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱 癌、肾细胞癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、头部和颈部的癌症、间皮瘤、肉瘤、胆管癌(胆管细胞癌)、小肠腺癌、小儿恶性肿瘤、扁平上皮癌和白血病(包括慢性粒细胞白血病)。 
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂可用于治疗实体瘤，包括肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、***癌、卵巢癌、肝细胞癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、食道癌。 
在一个实施方案中，本发明适用于抑制具有肿瘤的患者中的CD105，所述肿瘤单独或部分依赖于CD105。 
本发明的又一个实施方案包括本发明的靶向结合剂或抗体在制备用于治疗患有增殖或血管原相关性疾病的动物的药剂中的用途。在某些实施方案中，所述的用途还包括选择需要治疗增殖或血管原相关性疾病的动物。 
本发明的又一个实施方案包括本发明的靶向结合剂或抗体在制备用于治疗患有赘生性疾病的动物的药剂中的用途。在某些实施方案中，所述的用途还包括选择需要治疗赘生性疾病的动物。 
本发明的又一个实施方案包括本发明的靶向结合剂或抗体在制备用于治疗患有非赘生性疾病的动物的药剂中的用途。在某些实施方案中，所述的用途还包括选择需要治疗非赘生性疾病的动物。 
本发明的又一个实施方案包括本发明的靶向结合剂或抗体在制备用于治疗患有恶性肿瘤的动物的药剂中的用途。在某些实施方案中，所述的用途还包括选择需要治疗恶性肿瘤的动物。 
本发明的又一个实施方案包括本发明的靶向结合剂或抗体在制备用于治疗患有CD105表达相关性疾病或状况的动物的药剂中的用途。在某些实施方案中，所述的用途还包括选择需要治疗CD105表达相关性疾病或状况的动物。 
本发明的又一个实施方案包括用作用于治疗患有增殖或血管原相关性疾病的动物的药剂的、本发明的靶向结合剂或抗体。 
本发明的又一个实施方案包括用作用于治疗患有赘生性疾病的动物的药剂的、本发明的靶向结合剂或抗体。 
本发明的另一个实施方案包括用作用于治疗患有恶性肿瘤的动物的 药剂的、本发明的靶向结合剂或抗体。 
本发明的又一个实施方案包括用作用于治疗患有CD105表达相关性疾病或状况的动物的药剂的、本发明的靶向结合剂或抗体。 
本发明的又一个实施方案包括用作用于治疗患有CD105诱导疾病的动物的药剂的、本发明的靶向结合剂或抗体。 
在一个实施方案中，治疗 
增殖或血管原相关性疾病 
赘生性疾病； 
恶性肿瘤； 
眼病； 
慢性炎症疾病； 
与CD105表达有关的疾病或状况；或者 
包括管理、减轻、抑制任何上述疾病或状况。 
在一个实施方案中，赘生性疾病的治疗包括肿瘤生长的抑制、肿瘤生长的延迟、肿瘤的衰退、肿瘤的收缩、在治疗终止时肿瘤再次生长的时间的增长、肿瘤复发的时间的增长、疾病进程的减慢。 
在本发明的一些实施方案中，所述的待治疗的动物为人。 
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂为全人源单克隆抗体。 
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂选自全人源单克隆抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1和6A6。 
本发明的实施方案包括含有本文所述的靶向结合剂与治疗剂的缀合物。在本发明的一些实施方案中，所述的治疗剂为毒素。在其他实施方案中，所述的治疗剂为放射性同位素。在其他实施方案中，所述的治疗剂为药物组合物。 
在另一个方面中，提供了选择性地杀死患者中的癌细胞的方法。所述的方法包括向患者给药全人源抗体缀合物。该全人源抗体缀合物包括可以与CD105结合的抗体、以及试剂。所述的试剂为毒素、放射性同位素或者会杀死癌细胞的另一种物质。因此，所述的抗体缀合物选择性地杀死癌细胞。 
在一个方面中，提供了特异性地结合CD105的缀合全人源抗体。所述的抗体附着在试剂上，并且抗体与细胞相结合使得所述的试剂被传递给细胞。在一个实施方案中，上述缀合全人源抗体与CD105的细胞外结构域结合。在另一个实施方案中，所述的抗体与缀合的毒素被表达CD105的细胞内化。在另一个实施方案中，所述的试剂为细胞毒性试剂。在另一个实施方案中，所述的试剂为(例如)皂草素、auristatin、假单胞菌外毒素、白树毒素、蓖麻毒素、刺孢毒素、或者基于美登素的免疫缀合物等。在另一个实施方案中，所述的试剂为放射性同位素。 
本发明的靶向结合剂或抗体可以单独给药，或者可以与其他的抗体、化疗药品或放疗结合给药。例如，阻断细胞粘附、侵入、血管生成或增殖的CD105抗体的单克隆、寡克隆或多克隆混合物可以与表现出可抑制肿瘤细胞增殖的药品结合给药。此外，本发明的CD105靶向剂可以用于其他化疗治疗(例如包含抗-VEGF试剂的治疗)失效的患者中。 
本发明的另一个实施方案包括诊断疾病或状况的方法，其中本文所述的抗体用于检测患者或患者样品中CD105的水平。在一个实施方案中，所述的患者样品为血液、血清或尿液。在另一个实施方案中，列出了检测风险因子、诊断疾病以及疾病分段的方法，其中涉及使用抗CD105抗体检测CD105的表达和/或过表达。在一些实施方案中，所述的方法包括向患者给药与细胞上的CD105选择性地结合的全人源抗体缀合物。所述的抗体缀合物包含特异性地与CD105相结合的抗体以及标记。所述的方法还包括观察患者中所述标记的存在情况。标记的量相对高表明所述疾病的风险相对高，而标记的量相对低表明所述疾病的风险相对低。在一个实施方案中，所述的标记为绿色荧光蛋白质。 
本发明还提供了测定患者样品中CD105水平的方法，包括将本文所述的抗体与得自患者的生物学样品相接处，以及检测所述样品中所述抗体与CD105之间的结合水平。在更具体的实施方案中，所述的生物学样品为血液、血浆或血清。 
本发明的另一个实施方案包括通过将所述的血清或细胞与本文所述的抗体相接触、然后检测CD105的存在情况来诊断与细胞中CD105的表达有关的状况的方法。在一个实施方案中，所述的状况可以为增殖、血管 原性、细胞粘附或侵入相关性疾病，包括但不限于赘生性疾病。 
在另一个实施方案中，本发明包括用于检测哺乳动物组织、细胞或体液中的CD105以筛查CD105相关性疾病的测试试剂盒。所述的试剂盒包括本文所述的抗体以及用于表明所述抗体与CD105(如果存在的话)的反应情况的手段。在一个实施方案中，与CD105相结合的抗体被标记。在另一个实施方案中，所述的抗体为未标记的初级抗体，而所述的试剂盒还包含用于检测所述初级抗体的手段。在一个实施方案中，所述的检测手段包括作为抗免疫球蛋白的经标记的第二抗体。所述的抗体可以用选自荧光色素、酶、放射性核以及非透过性材料的标志物来标记。 
在一些实施方案中，可以对本文所公开的靶向结合剂或抗体进行修饰，从而增强它们结合补体及参与补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力。在其他实施方案中，可以对所述的靶向结合剂或抗体进行修饰，从而增强它们活化效应器细胞及参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的能力。在其他实施方案中，可以对本文所述的靶向结合剂或抗体进行修饰，从而增强它们活化效应器细胞及参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的能力，以及增强它们结合补体及参与补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力。 
在一些实施方案中，可以对本文所公开的靶向结合剂或抗体进行修饰，从而降低它们结合补体及参与补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力。在其他实施方案中，可以对所述的靶向结合剂或抗体进行修饰，从而降低它们活化效应器细胞及参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的能力。在其他实施方案中，可以对本文所述的靶向结合剂或抗体进行修饰，从而降低它们活化效应器细胞及参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的能力，以及降低它们结合补体及参与补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力。 
在某些实施方案中，本文所公开的靶向结合剂或抗体的半衰期以及本发明的组合物的半衰期为至少大约4至7天。在某些实施方案中，本文所公开的靶向结合剂或抗体的平均半衰期以及本发明的组合物的平均半衰期为至少大约2至5天、3至6天、4至7天、5至8天、6至9天、7至10天、8至11天、8至12天、9至13天、10至14天、11至15天、12至16天、13至17天、14至18天、15至19天、或者16至20天。在其他实施方案中，本文所公开的靶向结合剂或抗体的平均半衰期以及本发明 的组合物的平均半衰期为至少大约17至21天、18至22天、19至23天、20至24天、21至25天、22至26天、23至27天、24至28天、25至29天、或者26至30天。在另一个实施方案中，本文所公开的靶向结合剂或抗体的半衰期以及本发明的组合物的半衰期可以为至多大约50天。在某些实施方案中，抗体的半衰期以及本发明的组合物的半衰期可以通过本领域已知的方法延长。这种延长转而可以降低所述抗体组合物的定量给药的量和/或频率。具有改善的体内半衰期的抗体以及制备这些抗体的方法在美国专利No.6,277,375、以及国际公开No.WO 98/23289和WO 97/3461中有所公开。 
在另一个实施方案中，本发明提供了具有容器的制造制品。所述的容器包含装有本文所公开的靶向结合剂或抗体的组合物，以及表明所述组合物可以用于治疗细胞粘附、侵入、血管生成和/或增殖相关性疾病(包括但不限于由CD105表达或过表达所表征的疾病)的包装***物或标记。 
在其他实施方案中，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包含装有本文所公开的靶向结合剂或抗体的组合物、以及向需要治疗的受试对象给药所述组合物的说明书。 
本发明提供了包含变体Fc区域的蛋白质的配制物。即，非天然存在的Fc区域，例如包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基的Fc区域。此外，本发明的变体Fc区域还涵盖了包含氨基酸删除、添加和/或修饰的Fc区域。 
可以通过增加Fc区域对FcRn的结合亲和性来增长包含Fc区域的蛋白质的血清半衰期。在一个实施方案中，与同类分子相比，Fc变体蛋白质增长了血清半衰期。
在另一个实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述的Fc区域在选自239、330和332(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含至少一个非天然存在的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述的Fc区域包含至少一个选自239D、330L和332E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然存在的氨基酸。可选地，所述的Fc区域还可以在选自252、254和256(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含添加的非天然存在的氨基酸。在具体的 实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述的Fc区域包含至少一个选自239D、330L和332E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然存在的氨基酸，以及在选自252Y、254T和256E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处的至少一个非天然存在的氨基酸。 
在另一个实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述的Fc区域在选自234、235和331(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含至少一个非天然存在的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述的Fc区域包含至少一个选自234F、235F、235Y和331S(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然存在的氨基酸。在另一个具体的实施方案中，本发明的Fc变体包含234F、235F和331S(按照Kabat列出的EU索引编号)非天然存在的氨基酸残基。在另一个具体的实施方案中，本发明的Fc变体包含234F、235Y和331S(按照Kabat列出的EU索引编号)非天然存在的氨基酸。可选地，所述的Fc区域还可以在选自252、254和256(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含添加的非天然存在的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述的Fc区域包含至少一个选自234F、235F、235Y和331S(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然存在的氨基酸；以及在选自252Y、254T和256E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处的至少一个非天然存在的氨基酸。 
在另一个实施方案中，本发明提供了Fc变体蛋白质配制物，其中所述的Fc区域在选自239、330和332(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含至少一个非天然存在的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体蛋白质配制物，其中所述的Fc区域包含至少一个选自239D、330L和332E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然存在的氨基酸。可选地，所述的Fc区域还可以在选自252、254和256(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含添加的非天然存在的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体蛋白质配制物，其中所述的Fc区域包含至少一个选自239D、330L和332E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然存在的氨基酸，以及在选自252Y、254T和256E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个 位置处的至少一个非天然存在的氨基酸。 
在另一个实施方案中，本发明提供了Fc变体蛋白质配制物，其中所述的Fc区域在选自234、235和331(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含至少一个非天然存在的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体蛋白质配制物，其中所述的Fc区域包含至少一个选自234F、235F、235Y和331S(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然存在的氨基酸。可选地，所述的Fc区域还可以在选自252、254和256(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含添加的非天然存在的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体蛋白质配制物，其中所述的Fc区域包含至少一个选自234F、235F、235Y和331S(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然存在的氨基酸；以及在选自252Y、254T和256E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处的至少一个非天然存在的氨基酸。 
用于生成非天然存在的Fc区域的方法是本领域已知的。例如，氨基酸的取代和/或删除可以通过突变方法生成，包括但不限于定点突变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985))、PCR突变(Higuchi，in″PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications″，Academic Press，San Diego，pp.177-183(1990))、盒式突变(Wells et al，Gene 34：315-323(1985))。优选的是，定点突变是通过重叠延伸PCR方法来进行的(Higuchi，in″PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification″，Stockton Press，New York，pp.61-70(1989))。重叠延伸PCR(Higuchi，ibid.)技术还可以用于向靶向序列(起始DNA)中引入任何所需的突变。例如，在重叠延伸方法中PCR的第一个循环涉及使用外引物(引物1)和内突变引物(引物3)、以及分开的第二外引物(引物4)和内引物(引物2)来扩增靶向序列，从而产生两条PCR节段(节段A和B)。内突变引物(引物3)被设计成包含与靶向序列的错配，从而指定了所需的突变。在PCR的第二个循环中，通过使用所述的两个外引物(引物1和4)进行PCR而扩增得到第一个PCR循环的产物(节段A和B)。使用限定性酶对所得的全长PCR节段(节段C)进行水解，并将所得的限制性片段克隆到合适的载体中。作为突变的第一个步骤，将起始DNA(例如编 码Fc融合蛋白质、抗体或者简单的Fc区域)可操作地克隆到突变载体中。所述的引物被设计成反应了所需的氨基酸取代。用于生成变体Fc区域的其他方法是本领域已知的(例如参见美国专利No.5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,528,624；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；美国专利公开No.2004/0002587以及PCT公开WO 94/29351；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 02/060919；WO 04/029207；WO 04/099249；WO 04/063351)。 
在本发明的一些实施方案中，本文所提供的抗体的糖基化模式被修改，以增强ADCC和CDC效应器的功能。参见Shields RL et al，(2002)JBC.277：26733；Shinkawa T et al，(2003)JBC.278：3466和Okazaki A et al，(2004)J.Mol.Biol.，336：1239。在一些实施方案中，Fc变体蛋白质包含一个或多个基因工程化的糖型，即，碳水化合物组合物以共价方式与包含Fc区域的分子相连。基因工程化的糖型可以用于多种目的，包括但不限于增强或降低效应器的功能。基因工程化的糖型可以通过本领域的技术人员已知的任何方法生成，例如通过采用基因工程化的或变体表达的菌株，通过与一种或多种酶(例如DI N-乙酰基氨基葡糖转移酶III(GnTI11))共表达，通过在多种有机体或得自多种有机体的细胞系中表达包含Fc区域的分子，或者通过在包含Fc区域的分子已经被表达之后对碳水化合物进行修饰。用于生成基因工程化的糖型的方法是本领域已知的，并且包括但不限于在Umana et al，1999，Nat.Biotechnol 17：176-180；Davies et al，20017 Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields et al，2002，J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa et al，2003，J Biol Chem 278：3466-3473)美国专利No.6,602,684；美国系列号No.10/277,370；美国系列号No.10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；PotillegentTM technology(Biowa，Inc.Princeton，N.J.)；GlycoMAbTM glycosylation engineering technology(GLYCART biotechnology AG，Zurich，Switzerland)。例如参见WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki et al，2004，JMB，336：1239-49中所描述的那些。 
因此，在一个实施方案中，本发明的抗-CD105抗体的Fc区域包含氨基酸残基的改变的糖基化。在另一个实施方案中，氨基酸残基的改变的糖 基化导致降低的效应器的功能。在另一个实施方案中，氨基酸残基的改变的糖基化导致增加的效应器的功能。在特定实施方案中，Fc区域具有降低的岩藻糖基化。在另一个实施方案中，Fc区域是非岩藻糖基化的(afucosylated)(例如参见美国专利申请公开No.2005/0226867)。在一个方面，这些具有增加的效应器的功能的抗体，具有而言为ADCC，产生在宿主细胞(例如CHO细胞，Lemna minor)，其被工程化以产生高度去岩藻糖基化抗体，所述抗体和由亲代细胞产生的抗体相比具有超过100倍高的ADCC(Mori et al.，2004，Biotechnol Bioeng 88：901-908；Cox et al.，2006，Nat Biotechnol.，24：1591-7)。 
本领域还已知Fc区域的糖基化可以被修饰，以增强或降低效应器的功能(例如参见Umana et al，1999，Nat.Biotechnol 17：176-180；Davies et al，2001，Biotechnol Bioeng 74：288-294；Shields et al，2002，J Biol Chem 277：26733-26740；Shinkawa et al，2003，J Biol Chem 278：3466-3473)美国专利No.6,602,684；美国序列.No.10/277,370；美国序列.No.10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；PotillegentTM technology(Biowa，Inc.Princeton，N.J.)；GlycoMAbTM glycosylation engineering technology(GLYCART biotechnology AG，Zurich，Switzerland))。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体的Fc区域包含糖基化被改变的氨基酸残基。在另一个实施方案中，糖基化被改变的氨基酸使得效应器的功能降低。在另一个实施方案中，糖基化被改变的氨基酸残基使得效应器的功能增强。在具体的实施方案中，所述的Fc区域具有减少的岩藻糖基化。在另一个实施方案中，所述的Fc区域为岩藻糖基化的(例如参见美国专利申请公开No.2005/0226867)。 
附图简述 
图1示出柱状图，其表示抗体4.37和4.120的HUVEC增殖测定的结果。 
图2示出柱状图，其表示抗体4D4，6A6，6B1，6B10，11H2，9H10，3C1和10C9的HUVEC增殖测定的结果。 
图3示出柱状图，其表示抗体4D4，6B1，6B10和10C9对于血管长度 (mm)和分叉数量的影响。 
图4示出柱状图，其表示结合研究的结果。具体而言，抗体4D4，6A6，6B1，6B10，11H2，9H10，3C1，4.37，4.120和10C9能够阻断SN6结合HUVEC细胞。 
图5示出柱状图，其表示对于抗体4.120，4D4，6B 10和4.37而言测量血红蛋白(hb)含量的Colo205基质胶塞测定的结果。 
图6示出柱状图，其表示对于抗体4.120，4D4，6B10和4.37而言测量阳性CD31染色的Colo205基质胶塞测定的结果。 
图7示出柱状图，其表示抗体4D4，6A6，6B1，6B10，11H2，9H10，3C1，4.37，4.120和10C9的ADCC活性。 
图8示出柱状图，其表示抗体4.120的CDC活性。 
图9示出柱状图，其表示抗体4D4，6A6，6B1，6B10，11H2，9H10，3C1，4.37，4.120和10C9的内在化结果。 
发明详述 
本发明的实施方案涉及能够抑制TGF-β信号传导的一组新型的CD105阻断分子，例如抗体。这种分子可以以单一试剂的形式使用、或者可选择地与其他结合抗体/试剂组合使用。此外，它们还可以与任何标准品或新型抗癌试剂组合使用。 
本发明的实施方案涉及与CD105相结合的靶向结合剂。在一些实施方案中，所述的靶向结合剂与CD105相结合，并抑制CD105配体例如TGF-β与其受体CD105相结合。在一些实施方案中，这种结合可以中和、阻断、抑制、消除或干扰CD105相关作用的一个或多个方面。在一个实施方案中，所述的靶向结合剂为单克隆抗体或其结合片段。本文中，这种单克隆抗体可以被称为抗CD105的抗体。 
本发明的其他实施方案包括全人源抗CD105的抗体，以及具有治疗用途的抗体制备物。在一个实施方案中，本发明的抗CD105抗体的制备物具有所需的治疗性质，包括对CD105的强的结合亲和性、促进内皮细胞凋亡或抑制内皮细胞增殖的能力、调制细胞骨架的形成、抑制管的形成、以及通过ADCC和/或CDC活性诱导内皮细胞的细胞毒性的能力。 
此外，本发明的实施方案包括使用所述的这些抗体来治疗疾病的方法。本发明的抗CD105的抗体可以用于预防CD105介导的肿瘤细胞的增殖和健康组织的肿瘤侵入。另外，CD105抗体可以用于治疗和血管生成有关的疾病，例如眼病如AMD、炎症性疾病如风湿性关节炎、和心血管疾病与败血症、以及赘生性疾病。可以表征为任何类型的恶性肿瘤(包括转移性癌症、淋巴肿瘤以及血癌)的任何疾病也都可以通过这种抑制机制来进行治疗。人类中示例性的癌症包括***、肾细胞癌、乳腺肿瘤、***肿瘤、基细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌(例如神经胶质肿瘤)、***、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、***癌、消化***的癌症；子宫内膜癌、食管癌；眼癌；头部和颈部的癌症；胃部的癌症；上皮内赘生物；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞)；淋巴瘤，包括Hodgkin或非Hodgkin淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌、视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌、肾癌、呼吸***的癌症；肉瘤、皮肤癌；胃癌、睾丸癌、甲状腺癌；子宫癌、泌尿***的癌症以及其他癌症和肉瘤。通常在狗、猫和其他宠物中诊断的恶性紊乱包括但不限于淋巴肉瘤、骨肉瘤、***肿瘤、肥大细胞瘤、脑肿瘤、黑素瘤、腺鳞癌、良性的肺部肿瘤、支气管腺肿瘤、细支气管腺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺部肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、刺瘤、视网膜母细胞瘤、Ewing肉瘤、Wilm肿瘤、Burkitt淋巴瘤、小神经胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、破骨细胞瘤、口腔瘤形成、纤维肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、传染性性病肿瘤、睾丸肿瘤、***瘤、Sertoli细胞肿瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤(例如粒细胞肉瘤)、角膜刺瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基细胞肿瘤、胸腺瘤、胃部肿瘤、肾上腺癌、口腔多发性***瘤、血管内皮瘤和囊腺瘤、毛囊淋巴瘤、小肠淋巴瘤、纤维肉瘤和肺部鳞状细胞癌。在啮齿动物(例如雪貂)中，示例性的癌症包括胰岛瘤、淋巴瘤、肉瘤、神经瘤、胰腺岛细胞肿瘤、胃部MALT淋巴瘤和胃腺瘤。影响农业牲畜的瘤形成包括白血病、血管外皮细胞瘤和牛眼部的瘤形成(在牛中)；***纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、***癌、***瘤形成和肥大细胞瘤(在马中)；肝细胞癌(在猪中)；淋巴瘤和肺部腺瘤病(在羊中)；肺部肉瘤、 淋巴瘤、Rous肉瘤、成血细胞综合症、纤维肉瘤、肾母细胞瘤、B细胞淋巴瘤和淋巴白血性增生(在鸟类物种中)；视网膜母细胞瘤、肝脏的瘤形成、淋巴肉瘤(成淋巴细胞的淋巴瘤)、类浆细胞白血病和浮囊肉瘤(在鱼中)、干酪样***炎(CLA)；由细菌假结核棒杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)引起的绵羊和山羊的慢性感染性传染病、以及由南非羊肺炎引起的绵羊的传染性肺部肿瘤。 
本发明的其他实施方案包括用于特异性检测生物学样品中CD105的数量的诊断性测试。所述的测试试剂盒可以包括本文所公开的靶向结合剂或抗体以及用于检测这些抗体的必要性的标记。这些诊断性测试可用于筛查细胞粘附、侵入、血管生成或增殖相关性疾病，包括但不限于赘生性疾病。 
本发明的另一个方面为CD105的生物学活性的拮抗剂，其中所述的拮抗剂能够与CD105结合。在一个实施方案中，所述的拮抗剂为靶向结合剂，例如抗体。所述的拮抗剂可以选自本文所述的抗体，例如抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1和6A6。 
在一个实施方案中，所述的CD105的生物学活性的拮抗剂可以与CD105相结合，并由此抑制或阻止配体与CD105受体相结合，由此抑制肿瘤血管生成和/或细胞增殖。 
一个实施方案为与全人源单克隆抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1和6A6相同的一个或多个抗原决定部位相结合的靶向结合剂。 
一个实施方案为与全人源单克隆抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1和6A6相同的一个或多个抗原决定部位相结合的抗体。 
一个实施方案为能够产生上文所述的靶向结合剂的杂交瘤细胞。在一个实施方案中，为能够产生上文所述的抗体的轻链和/或重链的杂交瘤细胞。在一个实施方案中，所述的杂交瘤细胞能够产生全人源单克隆抗体的轻链和/或重链。在另一个实施方案中，所述的杂交瘤细胞能够产生全人源单克隆抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1和6A6的轻链和/或重链。可选择地，所述的杂交瘤细胞可以产生这样的抗体，该抗 体能够与全人源单克隆抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1和6A6相同的一个或多个抗原决定部位相结合。 
另一个实施方案为编码上文所述的靶向结合剂的核酸分子。在一个实施方案中，为编码上文所述的抗体的轻链或重链的核酸分子。在一个实施方案中，所述的核酸分子编码了全人源单克隆抗体的轻链或重链。另一个实施方案为编码选自抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1和6A6中的全人源单克隆抗体的轻链或重链的核酸分子。 
本发明的另一个实施方案为包含一个或多个上文所述的核酸分子的载体，其中所述的载体编码了上文所述的靶向结合剂。在本发明的一个实施方案中，为包含一个或多个上文所述的核酸分子的载体，其中所述的载体编码了上文所述的抗体的轻链和/或重链。 
本发明的另一个实施方案为包含上文所述的载体的宿主细胞。可选择地，所述的宿主细胞可以包含多于一个的载体。 
此外，本发明的一个实施方案为通过在其中核酸分子被表达从而产生所述的靶向结合剂、然后回收所述的靶向结合剂的条件下培养宿主细胞来制备本发明的靶向结合剂的方法。在本发明的一个实施方案中卫通过在核酸分子被表达从而产生所述的抗体、然后回收所述的抗体的条件下培养宿主细胞来制备本发明的抗体的方法。 
在一个实施方案中，本发明包括通过用编码上文所述的靶向结合剂的至少一个核酸分子转染至少一个宿主细胞、在所述的宿主细胞中表达所述的核酸分子以及分离所述的靶向结合剂来制备靶向结合剂的方法。在一个实施方案中，本发明包括通过用编码上文所述的抗体的至少一个核酸分子转染至少一个宿主细胞、在所述的宿主细胞中表达所述的核酸分子以及分离所述的抗体来制备抗体的方法。 
根据另一个方面，本发明包括通过给药本文所述的拮抗剂来拮抗CD105的生物学活性的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗血管生成和/或增殖的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的CD105的生物学活性的拮抗剂。 
本发明的另一个方面包括通过给药上文所述的靶向结合剂来拮抗CD105的生物学活性的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗血管生成 和/或增殖的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗CD105的生物学活性的靶向结合剂。 
本发明的另一个方面包括通过给药上文所述的抗体来拮抗CD105的生物学活性的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗血管生成和/或增殖的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗CD105的生物学活性的抗体。 
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的CD105的生物学活性的拮抗剂来治疗动物中细胞增殖的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗血管生成和/或增殖的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的CD105的生物学活性的拮抗剂。 
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的拮抗CD105的生物学活性的靶向结合剂来治疗动物中血管生成和/或增殖的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗血管生成和/或增殖的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗CD105的生物学活性的靶向结合剂。所述的靶向结合剂可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。 
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的拮抗CD105的生物学活性的抗体来治疗动物中血管生成和/或增殖的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗血管生成和/或增殖的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗CD105的生物学活性的抗体。所述的抗体可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。 
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的CD105的生物学活性的拮抗剂来治疗动物癌症的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗癌症的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗CD105的生物学活性的拮抗剂。所述的拮抗剂可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。 
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的拮抗CD105的生物学活性的靶向结合剂来治疗动物癌症的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗癌症的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗CD105的生物学活性的靶向结合剂。所述的靶向结合剂可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。 
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的拮抗CD105的生物学活性的抗体来治疗动物癌症的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗癌症的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗CD105的生物学活性的抗体。所述的抗体可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。 
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的拮抗CD105的生物学活性的抗体来减轻或抑制动物肿瘤细胞的增殖、粘附、侵入和/或血管生成的方法。所述的方法可以包括选择需要减轻或抑制增殖、粘附、侵入和/或血管生成的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗CD105的生物学活性的抗体。所述的抗体可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。 
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的拮抗CD105的生物学活性的抗体来减缓动物肿瘤的生长和/或转移的方法。所述的方法可以包括选择需要减缓肿瘤的生长和/或转移的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗CD105的生物学活性的抗体。所述的抗体可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。 
根据本发明的另一个方面，提供了CD105的生物学活性拮抗剂在用于制造***血管生成和/或细胞增殖的药剂中的用途。在一个实施方案中，所述的CD105的生物学活性拮抗剂为本发明的靶向结合剂。在一个实施方案中，所述的CD105的生物学活性拮抗剂为本发明的抗体。 
根据本发明的另一个方面，提供了用作用于***血管生成和/或细胞增殖的药剂的CD105的生物学活性拮抗剂。在一个实施方案中，所述的CD105的生物学活性拮抗剂为本发明的靶向结合剂。在一个实施方案中，所述的CD105的生物学活性拮抗剂为本发明的抗体。 
根据本发明的另一个方面，提供了拮抗所述的CD105的生物学活性的靶向结合剂或抗体在用于制造治疗血管生成和/或增殖的药剂中的用途。 
根据本发明的另一个方面，提供了用作用于治疗血管生成和/或增殖的药剂的、拮抗所述的CD105的生物学活性的靶向结合剂或抗体。 
根据本发明的另一个方面，提供了拮抗所述的CD105的生物学活性的靶向结合剂或抗体在用于制造治疗疾病相关性血管生成和/或增殖的药剂 中的用途。 
根据本发明的另一个方面，提供了用作用于治疗疾病相关性血管生成和/或增殖的药剂的、拮抗所述的CD105的生物学活性的抗体。 
根据本发明的另一个方面，提供了所述的CD105的生物学活性的拮抗剂在用于制造用于治疗哺乳动物癌症的药剂中的用途。在一个实施方案中，所述的CD105的生物学活性拮抗剂为本发明的靶向结合剂。在一个实施方案中，所述的CD105的生物学活性拮抗剂为本发明的抗体。 
根据本发明的另一个方面，提供了用作用于治疗哺乳动物癌症的药剂的CD105的生物学活性拮抗剂。在一个实施方案中，所述的CD105的生物学活性拮抗剂为本发明的靶向结合剂。在一个实施方案中，所述的CD105的生物学活性拮抗剂为本发明的抗体。 
根据本发明的另一个方面，提供了拮抗所述的CD105的生物学活性的靶向结合剂在用于制造用于治疗哺乳动物癌症的药剂中的用途。 
根据本发明的另一个方面，提供了用作用于治疗哺乳动物癌症的药剂的、拮抗所述的CD105的生物学活性的靶向结合剂。 
根据本发明的另一个方面，提供了拮抗所述的CD105的生物学活性的抗体在用于制造用于治疗哺乳动物癌症的药剂中的用途。 
根据本发明的另一个方面，提供了用作用于治疗哺乳动物癌症的药剂的、拮抗所述的CD105的生物学活性的抗体。 
根据另一个方面，提供了拮抗所述的CD105的生物学活性的靶向结合剂或抗体在用于制造用于减缓或抑制动物增殖和/或血管生成的药剂中的用途。 
根据另一个方面，提供了用作用于减缓或抑制动物中增殖和/或血管生成的药剂的、拮抗所述的CD105的生物学活性的靶向结合剂或抗体。 
根据另一个方面，提供了拮抗所述的CD105的生物学活性的靶向结合剂或抗体在用于制造用于减缓动物肿瘤生长和/或转移的药剂中的用途。 
根据另一个方面，提供了用作用于减缓动物中肿瘤生长和/或转移的药剂的、拮抗所述的CD105的生物学活性的靶向结合剂或抗体。 
在一个实施方案中，本发明特别适用于在患有单独依赖于或部分依赖于CD105受体信号传导的肿瘤患者中拮抗CD105。 
根据本发明的另一个方面，提供了包含CD105的生物学活性的拮抗剂以及可药用的载体的药物组合物。在一个实施方案中，所述的拮抗剂包含抗体。根据本发明的另一个方面，提供了包含CD105的生物学活性的拮抗剂以及可药用的载体的药物组合物。在一个实施方案中，所述的拮抗剂包含抗体。 
在一些实施方案中，在给药特异性结合CD105的抗体之后，给药清除剂，从而移除血液中过量的循环抗体。 
抗CD105的抗体可以用于消除患者样品中的CD105，并因此可以用作用于本文所述的疾病状态的诊断工具。此外，基于抗CD105抗体的显著抑制由CD105介导的信号传导活性(如以下实施例中所表明的那样)的能力，所述的抗CD105的抗体在治疗由CD105的表达所导致的症状和状况中具有治疗作用。在具体的实施方案中，本文所述的抗体和方法涉及治疗由CD105诱导的血管生成、增殖和/或细胞内信号传导所导致的症状。另一个实施方案涉及采用本文所述的抗体和方法来治疗血管生成和/或增殖相关性疾病，包括赘生性疾病，例如黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、干细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、胃部(胃)癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌以及胰腺癌。所述的抗体还可用于治疗细胞粘附和/或关节炎侵入、动脉硬化症和涉及血管生成的疾病。 
本发明的另一个实施方案包括用于检测哺乳动物组织、细胞或体液中的CD105以筛查细胞粘附、侵入、血管生成或增殖相关性疾病的测试试剂盒。所述的试剂盒包括与CD105相结合的靶向结合剂以及用于表明所述的靶向结合剂与CD105(如果存在的话)的反应情况的手段。在一个实施方案中，与CD105相结合的靶向结合剂被标记。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂为未标记的，而所述的试剂盒还包含用于检测所述靶向结合剂的手段。优选的是，所述的靶向结合剂可以用选自荧光色素、酶、放射性核以及辐射非透过性材料的标志物来标记。 
本发明的另一个实施方案包括用于检测哺乳动物组织、细胞或体液中的CD105以筛查细胞粘附、侵入、血管生成或增殖相关性疾病的测试试剂盒。所述的试剂盒包括与CD105相结合的抗体以及用于表明所述抗体与 CD105(如果存在的话)的反应情况的手段。所述的抗体可以为单克隆抗体。在一个实施方案中，与CD105相结合的抗体被标记。在另一个实施方案中，所述的抗体为未标记的初级抗体，而所述的试剂盒还包含用于检测所述初级抗体的手段。在一个实施方案中，所述的手段包括作为抗免疫球蛋白的经标记的第二抗体。优选的是，所述的抗体可以用选自荧光色素、酶、放射性核以及辐射非透过性材料的标志物来标记。 
在以下另外的详细材料中提供了本文所公开的、关于所述抗体的其他实施方案、特征等。 
序列列表
本发明的实施方案包括以下表1中所列的特异性抗体。该表格分别报告了各种抗CD105的抗体的识别编号，以及相应重链和轻链的基因和多肽的可变结构域的SEQ ID编号。各种抗体已经给出了识别编号。 
表1 
Figure BPA00001373578600391
Figure BPA00001373578600401
表2为将抗体的重链区与它们的同族种系重链区、以及抗体的轻链区与它们的同族种系轻链区进行比较的表。 
Figure BPA00001373578600411
Figure BPA00001373578600431
Figure BPA00001373578600441
定义
除非另作说明，否则本文所用的科学及技术术语具有本领域的普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非内容需要，否则单数的术语包含复数的含义而复数的术语也包含单数的含义。通常与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白质和寡或多核苷酸化学及杂交相关使用的***命名法，以及本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白质和寡或多核苷酸化学及杂交的技术都是公知的那些，并且在本领域中常用。 
标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂转染)。根据供应商提供的说明书、或者本领域的常规完成方法、或者本文所述的方法来进行酶反应和纯化技术。通常，根据本领域公知的常规方法以及按照本发明的整个说明书中所引用和讨论的多个通常且更具体的参考中所述的方法来实施之前所述的技术和程序。例如参见Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))，该文献以引用方式并入本文。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学相关使用的***命名法，以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是公知的那些，并在本领域中常用。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、传递以及患者的治疗。 
如本发明公开所用，以下属于除非另作说明，否则应该理解为具有以下含义： 
拮抗剂或抑制剂可以为多肽、核酸、碳水化合物、脂质、小分子量的化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干扰(RNAi)、反义物(antisense)、重组蛋白质、抗体、或其片段或其缀合物或其融合蛋白质。就RNAi的综述，参见Milhavet O，Gary DS，Mattson MP.(Pharmacol Rev.2003 Dec；55(4)：629-48.Review)，而反义物(参见Opalinska JB，Gewirtz AM.(Sci STKE.2003 Oct 28；2003(206)：pe47.))。 
化合物是指分子量小于大约2000道尔顿的任何小分子量化合物。 
术语“CD105”是指CD105蛋白分子，也称为CD105抗原，END，内皮因子，FLJ41744，HHT1，ORW和ORW1。 
术语“中和性”或“抑制”当用于指靶向结合剂(例如抗体)时，是指抗体消除、降低或显著降低靶向抗原的活性的能力。因此，本发明的“中和性”抗CD105的抗体能够消除或显著降低CD105的活性。中和性CD105抗体可以例如通过阻断CD105配体例如TGF-β与CD105的结合来起作用。通过阻断这种结合，CD105信号介导的活性显著或完全消除。理想的是，对抗CD105的中和性抗体抑制肿瘤血管生成和/或细胞增殖。 
“CD105的生物学活性的拮抗剂”能够消除、降低或显著降低CD105的活性。“CD105的生物学活性的拮抗剂”能够消除、降低或显著降低CD105的信号传导。“CD105的生物学活性的拮抗剂”可以消除或显著降低肿瘤血管生成和/或细胞增殖。 
“降低CD105的信号传导”涵盖了与缺乏本发明的靶向结合剂、抗体或拮抗剂而产生的信号传导的水平相比，CD105的信号传导降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％。 
“优化的”序列是指这样的抗体序列(本文中所述的任何抗体的可变重链或轻链)，其已经突变，使得在一个或多个残基使非种系序列突变回种系序列，并且还可以包含由所述的序列中除去结构倾向，例如糖基化位点或未配对的半胱氨酸。 
术语“多肽”在本文中用作常规术语，是指天然蛋白质、片段或者多肽序列的类似物。因此，天然蛋白质、片段以及类似物为多肽类型的一些种类。根据本发明的优选多肽包括人源重链免疫球蛋白分子和人源γ轻链免疫球蛋白分子、和通过包含重链免疫球蛋白分子和轻链免疫球蛋白分子(例如γ或λ轻链免疫球蛋白分子)的组合所形成的抗体分子，及上述情况的相反情况，以及它们的片段或类似物。根据本发明的优选多肽还可以仅仅包含人源重链免疫球蛋白分子或其片段。 
如本文所用，适用于对象的术语“天然”或“天然存在”是指这样的事实，即，对象可以在自然界中找到。例如，可以在由自然界来源分离得到的有机体(包括病毒)中存在的、并且并未经人在实验室中有意地修饰或以其他方式修饰的多肽或多核苷酸是天然存在的。 
如本文所用，术语“可操作地连接”是指这样的元件位置，如此描述的元件位置具有允许它们按照它们所需的方式发挥作用的关系。例如，对照序列与编码序列“可操作地连接”是指以这样的方法进行连接，所述的方式为编码序列的表达是在与对照序列相容的条件下完成的。 
术语“多核苷酸”在本文中是指长度为至少10个碱基的聚合物形式的核苷酸，为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者任何一种核苷酸的修饰形式，或者为RNA-DNA异源双链。所述的术语包括单链和双链形式的DNA。 
术语“寡核苷酸”在本文中包括通过天然存在和非天然存在的键而连接在一起的天然存在和修饰的核苷酸。寡核苷酸为多核苷酸的子集，通常包含长度为200个或更少的碱基。优选的是，寡核苷酸的长度为10至60个碱基，并且最优选的是长度为12、13、14、15、16、17、18、19或者20至40个碱基。寡核苷酸通常为单链的，例如可用于探针；但是寡核苷酸可以为双链的，例如用于基因突变体的构建。寡核苷酸可以为正义或反义寡核苷酸。 
术语“天然存在的核苷酸”在本文中包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。术语“修饰的核苷酸”在本文中包括具有修饰的或取代的糖基等的核苷酸。术语“寡核苷酸键”在本文中包括寡核苷酸键，例如硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、硒代磷酸酯键、二硒代磷酸酯键、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、氨基磷酸酯键等。例如参见LaPlanche et al.Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec et al.J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Stein et al.Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon et al.Anti-Cancer Drug Design 6：539(1991)；Zon et al.Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，pp.87-108(F.Eckstein，Ed，Oxford University Press，Oxford England(1991))；Stec et al.美国专利No.5,151,510；Uhlmann和Peyman Chemical Reviews 90：543(1990)，这些公开均以引用方式并入本文。如果需要的话，寡核苷酸可以包括用于检测的标记。 
术语“选择性杂交”在本文中是指可检测的且特异性的结合。多核苷酸、寡核苷酸及其片段在杂交和洗涤条件(该条件将非特异性核酸的可检测结合的可估测的量降至最低)下选择性地与核酸链杂交。高度的严格条件可以用于得到本领域已知的及本文所讨论的选择性杂交条件。通常，在 所关注的多核苷酸、寡核苷酸或其抗体片段和核酸序列之间的核酸序列同源性为至少80％，并且更通常的是同源性优选地增加至至少85％、90％、95％、99％和100％。 
严格的杂交条件包括但不限于在大约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)(0.9M NaCl，90mM柠檬酸钠，pH 7.0)与过滤器结合的DNA杂交，然后在大约50-65℃下在0.2XSSC，0.1％SDS中进行一次或多次洗涤；高度严格的条件例如为在大约45℃下在6XSSC中与过滤器结合的DNA杂交，然后在大约60℃下在0.1XSSC，0.2％SDS中进行一次或多次洗涤；或者本领域的技术人员已知的其他严格的杂交条件(例如参见Ausubel，F.M.et al，eds.1989 Current Protocols in Molecular Biology，vol.1，Green Publishing Associates，Inc.and John Wiley and Sons，Inc，NY，页6.3.1至6.3.6和2.10.3)。如果在两个氨基酸的序列之间具有部分或完全的一致性，则这两个氨基酸序列是“同源的”。例如，85％的同源性是指当两条序列被比对以达到最大程度的匹配时，85％的氨基酸是一致的。在达到最大匹配的条件下允许存在缺口(在两条匹配序列的任何一条中)；缺口长度为5或更少是优选的，并且缺口长度为2或更少是更优选的。可选择的且优选的是，如果两条蛋白质序列(或者由长度为至少大约30个氨基酸衍生得到的多肽序列)的比对得分超过5分(以标准偏差单元)(使用具有突变数据矩阵的程序ALIGN)而缺口罚分为6或更高，则这两条蛋白质序列是同源的(该术语如本文所用)。参见Dayhoff，M.O，in Atlas of Protein Sequence and Structure，pp.101-110(Volume 5，National Biomedical Research Foundation(1972))和Supplement 2 to this volume，pp.1-10。如果当使用ALIGN程序对两条序列或其部分进行最佳比对时，它们的氨基酸为大约或等于50％的一致性，则更优选的是这两条序列或其部分是同源的。应该理解的是在两条定向进化同源序列中可以存在有不同的同源性区域。例如，与非功能区域相比，小鼠和人的直系同源物的功能位点可以具有更高度的同源性。 
术语“相应于”在本文中用于指多核苷酸序列与参照多核苷酸序列的全部或部分是同源的(即，是一致的，并不具有严格的进化相关性)，或者指多肽序列与参照多肽序列是一致的。 
对比而言，术语“与......互补”在本文中用于指互补序列与参照多核苷酸序列的全部或部分是同源的。为了说明，核苷酸序列“TATAC”相应于参照序列“TATAC”，并且与参照序列“GTATA”互补。 
术语“序列一致性”是指在比较窗口内两条多核苷酸或氨基酸序列是一致的(即，基于核苷酸对核苷酸、或残基对残基)。术语“序列一致性的百分率”是通过以下方式计算得到的，将比较窗口内的两条最佳比对序列进行比较，测定其中在两条序列中都具有一致的核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)或氨基酸残基的位置的数量从而得到匹配位置的数量，将在比较窗口内匹配位置的数量除以位置的总数量(即，窗口尺寸)，以及将所得的结合乘以100从而得到序列一致性的百分率。术语“基本一致性”在本文中用于指多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中与比较窗口为至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置内、通常窗口为至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置内的参照序列相比，所述的多核苷酸或氨基酸包含具有至少85％序列一致性、优选的是至少90至95％序列一致性、更优选的是至少99％序列一致性的序列，其中序列一致性的百分率是通过将参照序列与可以在比较窗口内包含总量为参照序列的20％或更少的删除或添加的序列相比较。所述的参照序列可以为较大序列的子集。 
如本文所用，20个常规氨基酸及其缩写跟在常规用途之后。参见Immunology-A Synthesis(2nd Edition，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，该文献以引用方式并入本文。20个常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸(例如α-、α-取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸以及其他非常规氨基酸也可以为用于本发明多肽的合适的元件。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷基丝氨酸、N乙酰基丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-精氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸、以及其他相似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，根据标准用法和常规情况，左手方向为氨基末端方向，而右手方向为羧基末端方向。 
类似地，除非另作说明，否则单链多核苷酸序列的左手末端为5’末端； 双链多核苷酸序列的左手方向被称为5’方向。初始RNA转录物的5’至3’的添加方向被称为转录方向；在具有与RNA相同序列的DNA链上的并且为其5’至RNA转录物的5’末端的序列区域被称为“上游序列”；在具有与RNA相同序列的DNA链上的并且为其3’至RNA转录物的3’末端的序列区域被称为“下游序列”。 
如多肽所用，术语“基本一致性”是指当将两条肽序列通过例如采用了缺省缺口权重(default gap weight)的程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时，这两条肽序列共有至少80％的序列一致性，优选为至少90％的序列一致性，更优选为至少95％的序列一致性，最优选为至少99％的序列一致性。优选的是，并非一致的残基位置可以通过保守的氨基酸取代而不同。保守的氨基酸取代是指具有相同侧链的残基的可交换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含氨基侧链的一组氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守的氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。 
如本文所讨论的那样，认为氨基酸序列中变化较少的抗体或免疫球蛋白分子都被涵盖在本发明的范围内，只要在所述氨基酸序列中的变化与本文所述的抗体或免疫球蛋白分子保持了至少75％、更优选的是至少80％、90％、95％，并且更优选的是99％序列一致性即可。具体而言，考虑了保守的氨基酸的替代。保守的替代为在具有相关侧链的一系列氨基酸中发生的那些。遗传学编码的氨基酸通常被分为几个系列：(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)不带电荷的极性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的系列为：丝氨酸和苏氨酸为脂肪族-羟基系列；天冬酰胺和谷氨酰胺为含氨基系列；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脂肪族系列；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸为芳香族系列。例如，合理的是， 认为亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸被谷氨酸、苏氨酸被丝氨酸的分别的替代或者氨基酸被具有结构相关性的氨基酸的相似的替代不会对所得分子的结合功能或形成产生主要的影响，特别是如果所述的替代不涉及构架位点中的氨基酸时，更是如此。可以通过测试所述多肽衍生物的特定的活性来容易地测定氨基酸的变化是否会得到功能肽。所述的测定方法在本文进行了详细的描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以通过本领域普通的技术人员容易地制备。片段或类似物的优选的氨基或羧基末端在功能结构域的边界附近形成。结构和功能结构域可以通过将所述的核苷酸和/或氨基酸序列数据库与公共或私人的序列数据库相比较来确定。优选的是，可以采用计算机化的比较方法来确定序列基元或者预测在已知结构和/或功能的其他蛋白质中形成的蛋白质构象结构域。确定折叠形成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie et al.Science 253：164(1991)。因此，之前的实例证明本领域的技术人员可以识别可根据本文所述的抗体、用于定义结构和功能结构域的序列基元和结构构象。 
谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基通常会脱去酰胺基，从而分别形成相应的谷氨酰基和天冬酰基残基。所述的这些残基是在中性或碱性条件下脱去酰胺基的。这些残基的脱酰胺基形成也落入本发明的范围。 
通常，蛋白质中的半胱氨酸残基参与半胱氨酸-半胱氨酸二硫键；或者当半胱氨酸残基为折叠蛋白质区域的一部分时，蛋白质中的半胱氨酸残基在空间上被保护以防止二硫键的形成。蛋白质中二硫键的形成是一个复杂的过程，该过程是由环境的氧化还原潜力以及专门的巯基-二硫键交换酶决定的(Creighton，Methods Enzymol.107，305-329，1984；Houee-Levin，Methods Enzymol.353，35-44，2002)。当半胱氨酸残基在蛋白质结构中未成对并且在空间上为被折叠所保护时，该半胱氨酸可以以已知为二硫键缓慢重排的过程与得自溶液中的游离半胱氨酸形成二硫键。在已知为二硫键交换的另一个过程中，游离的半胱氨酸还可以干扰天然存在的二硫键(例如在抗体结构中存在的那些)，并导致结合少、生物学活性低和/或稳定性差。 
优选的氨基酸取代为以下这些：(1)降低对蛋白质水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变用于形成蛋白质络合物的结合亲和性，(4)改变结合亲和性，以及(4)赋予或修改所述类似物的其他物理化学或功能性 质。类似物可以包括除了天然存在的肽序列以为的多种序列突变体。例如，可以在天然存在的序列(优选的是，在形成分子内接触的结构域之外的部分多肽中)中形成单个或多个氨基酸取代(优选的是保守的氨基酸取代)。保守的氨基酸取代不应该较大程度低改变亲代序列的结构特征(例如替代氨基酸不应该倾向于断裂在亲代序列中形成的螺旋结构，或者扰乱表征亲代序列的其他类型的二级结构)。本领域识别的多肽的二级和三级结构的实例在Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze，eds，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton et al.Nature 354：105(1991)中有所描述，这些文献均以引用方式并入本文。 
此外，此类方法可以用于形成氨基酸取代或删除参与链内二硫键的一个或多个可变区的半胱氨酸残基，从而生成缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。 
术语“CDR区域”或“CDR”是指赋予抗体以抗原结合特异性的抗体的重链和轻链的高度可变区。可以根据Kabat***(Kabat，E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Edition.US Department of Health and Human Services，Public Service，NIH，Washington)以及后来的版本来定义CDR。抗体通常包含3个重链CDR和3个轻链CDR。在此使用术语一个CDR或多个CDR，以便根据实际情况表明这些区域中的一个区域或若干个区域，或者甚至是这些区域的全部，其中所述的区域包含了造成抗体通过对其所识别的抗原或抗原决定部位的亲和性而结合的氨基酸残基的大部分。 
重链的第三个CDR(HCDR3)具有更大的尺寸变化性(基本上是由于基因的排布机制而导致的更高的多样性)。虽然已知重链的第三个CDR的最长尺寸为26个氨基酸，但是其可以短至2个氨基酸。CDR的长度还可以根据通过具体的具有下划线的构架所容纳的长度而变化。功能上而言，HCDR3在抗体特异性的确定中起到部分作用(Segal et al，PNAS，71：4298-4302，1974，Amit et al，Science，233：747-753，1986，Chothia et al，J.Mol.Biol，196：901-917，1987，Chothia et al，Nature，342：877-883，1989， Caton et al，J.Immunol，144：1965-1968，1990，Sharon et al，PNAS，87：4814-4817，1990，Sharon et al，J.Immunol，144：4863-4869，1990，Kabat et al，J.Immunol，147：1709-1719，1991)。 
术语“一组CDR”在本文中是指包含CDR1、CDR2和CDR3。因此，一组HCDR是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，而一组LCDR是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。 
本发明的VH和VL结构域以及CDR的变体(包括本文中所列的氨基酸序列的那些，以及可以在针对CD105的靶向剂和抗体中使用的那些)可以通过序列改变或突变、并针对具有所需特征的抗原靶向进行筛查的方法来获得。所需特征的实例包括但不限于：相对于对抗原具有特异性的已知抗体，增加针对这种抗原的结合亲和性；相对于对抗原具有特异性的已知抗体，增加对抗原的活性(如果这种活性是已知的)的中和作用；在特定的摩尔比例下，与针对所述抗原的已知抗体或配体的特定的竞争能力；免疫沉淀配体-受体络合物的能力；与特定的抗原决定部位相结合的能力；线性抗原决定部位，例如采用肽结合扫描方法来鉴定的肽序列(例如在线性和/或束缚构象中筛查得到的肽)；通过非连续的残基形成的构象抗原决定部位；调节CD105的新的生物学活性或下游分子的能力；结合和/或中和CD105的能力；和/或任何其他所需的性质。 
需要在CDR、抗体VH或VL结构域以及抗原结合位点的氨基酸序列中进行取代的技术是本领域可利用的。在本发明中可以制备和使用本文所公开的抗体分子的变体。在将多元数据分析技术应用于结构/性质-活性关系中(Wold，et al.Multivariate data analysis in chemistry.Chemometrics -Mathematics and Statistics in Chemistry(Ed.：B.Kowalski)，D.Reidel Publishing Company，Dordrecht，Holland，1984)，根据计算机化学的指引，可以采用公知的数学技术(例如统计回归方法、模式识别和***)来推导出抗体的活性-性质的定量关系(Norman et al.Applied Regression Analysis.Wiley-Interscience；3rd edition(April 1998)；Kandel，Abraham & Backer，Eric.Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis.Prentice Hall PTR，(May 11，1995)；Krzanowski，Wojtek.Principles of Multivariate Analysis：A User’s Perspective(Oxford Statistical Science Series，No 22(Paper).Oxford University  Press；(December 2000)；Witten，Ian H.& Frank，Eibe.Data Mining：Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations.Morgan Kaufmann；(October 11，1999)；Denison David G.T.(Editor)，Christopher C.Holmes，Bani K.Mallick，Adrian F.M.Smith.Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression(Wiley Series in Probability and Statistics).John Wiley & Sons；(July 2002)；Ghose，Arup K.& Viswanadhan，Vellarkad N.Combinatorial Library Design and Evaluation Principles，Software，Tools，and Applications in Drug Discovery)。在一些情况下，可以由抗体序列、功能和三维结构的经验和理论模型(例如分析可能接触的残基或者计算物理化学性质)来推导出抗体的性质，并且可以单独地以及以结合方式考虑这些性质。 
由VH结构域和VL结构域构成的抗体的抗原结合位点通常由6个多肽环形成：其中3个多肽环来自轻链可变结构域(VL)，3个来自重链可变重链结构域(VH)。对已知的芳香族结构的抗体进行分析解释了抗体结合位点的序列与三维结构之间的关系。这些关系表明，除了VH结构域中的第三个区域(环)之外，结合位点环具有少数主链构造(标准结构(canonical structure))之一。已经显示，在特定的环中形成的标准结构可以通过其尺寸以及在环和构架区域中在关键位点处的某些残基的存在情况来确定。 
序列-结构关系的这种研究可以用于预测已知序列的抗体中的这些残基，而且能够预测未知的三维结构，这对保持CDR环的三维结构是重要的，并因此保持结合特异性。这些预测可以通过比较由先导优化试验得到的结果而得到支持。在结构方法中，可以使用任何可随意利用的或商业化的包装(例如WAM)来创立抗体分子的模型。然后，可以使用蛋白质可视化及分析软件包(例如Insight II(Accelrys，Inc.)或Deep View)来评价在CDR中的各位置处的可能的取代。然后，可以利用这些信息来进行取代，从而有可能对活性产生最小的或有利的效果，或者赋予其他所需的性质。 
如本文所用，术语“多肽片段”是指这样的多肽，该多肽具有删除了的氨基末端和/或羧基末端，但是在所述的末端，剩余的氨基酸序列与由例如全长cDNA序列推导出的天然存在的序列中相应位置处的氨基酸序列一 致。片段通常为至少5、6、8或10个氨基酸的长度，优选的是为至少14个氨基酸的长度，更优选的是为至少20个氨基酸的长度，通常为至少50个氨基酸的长度，甚至更优选的是为至少70个氨基酸的长度。如本文所用，术语“类似物”是指这样的多肽，该多肽由与所推导出的氨基酸序列部分基本一致的至少25个氨基酸的节段构成，并且具有以下性质中的至少一者：(1)在合适的结合条件下，与CD105特异性地结合，(2)阻断合适的TGFβ/CD105结合，或者(3)抑制CD105活性的能力。通常，多肽类似物包含相对于天然存在的序列的保守的氨基酸取代(或者添加或删除)。类似物通常为至少20个氨基酸的长度，优选的是为至少50个氨基酸的长度或更长，并且通常可以与全长的天然存在的多肽一样长。 
如同具有与模板肽的性质相似性质的非肽类药品，肽类似物通常用于制药工业中。这些非肽类化合物的类型被称为“肽模拟物”或“类肽物”(Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber and Freidinger TINS p.392(1985)；和Evans et al.J.Med.Chem.30：1229(1987)，这些文献以引用方式并入本文)。此类化合物通常借助于计算机化的分子模型而研发得到的。与可药用的肽具有结构相似性的肽模拟物可以用于产生相等的治疗或预防效果。通常，类肽物在结构上与范例多肽(即，具有生物化学性质或药理学活性的多肽，例如人类的抗体)相似，但是具有一个或多个可任选地被选自以下的键所替代(通过本领域公知的方法)的肽键：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--以及-CH2SO--。具有相同类型的D-氨基酸的相同序列的一个或多个氨基酸被***性地取代(例如D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可以用于产生更稳定的肽。此外，可以通过本领域已知的方法形成包含相同序列或者基本一致的相同序列的变化的束缚肽(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，该文献以引用方式并且本文)；例如通过加入能够形成分子内二硫键(其使所述的肽环化)的内部半胱氨酸残基。 
抗体可以是单独的或者与通过已知的技术提供的其他氨基酸序列相结合的寡克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、催化性抗体、嵌合抗体、人源化的抗体、全人源的抗体、抗独特型(anti-idiotypic)抗体、以及可以以溶解或结合形 势标记的抗体，以及它们的片段、变体或衍生物。抗体可以得自物种。 
如本文所用，术语“一种抗体”和“多种抗体”(多种免疫球蛋白)涵盖了单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、camelised抗体和嵌合抗体。如本文所用，术语“一种抗体”或“多种抗体”是指由至少一个结合结构域构成的多肽或一类多肽，其中所述的结合结构域是由具有三维结合空间(具有与抗原的抗原决定簇的特征互补的内部表面形状和电荷分布)的多肽链发生折叠而形成的。天然抗体通常为大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。各个轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而在不同免疫球蛋白二硫键同种型的重链之间二硫键的数量发生变化。各种重链和轻链还具有规则的间隔的链内二硫键。各个重链在一个末端处具有可变结构域(VH)，其后跟有多个恒定结构域。各个轻链在一个末端处具有可变结构域(VL)而在另一个末端处具有恒定结构域；所述的轻链的恒定结构域与所述的重链的可变结构域对齐。根据轻链恒定区的氨基酸序列，轻链可以分为λ链或γ链。γ轻链的可变结构域在本文中还可以表示为VK。术语“可变区”还可以用于描述重链或轻链的可变结构域。认为，特定的氨基酸残基在轻链可变结构域和重链可变结构域之间形成了界面。各轻链/重链对的可变区形成了抗体结合位点。这种抗体可以得自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等。 
术语“一种抗体”或“多种抗体”包括本发明抗体的结合片段，示例性的片段包括单链Fvs(scFv)、单链抗体、单结构域的抗体、结构域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段、表现出所需生物学活性的抗体片段、二硫键稳定的可变区(dsFv)、二聚可变区(双功能抗体)、抗独特型抗体(抗-Id)(包括例如针对本发明抗体的抗-Id抗体)、细胞内抗体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段以及上文所述的任何一者的抗原结合片段形成的多特异性抗体。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以为任何一种类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。 
使用酶(木瓜蛋白酶)对抗体进行水解得到两条相同的抗原结合片段 (也称为“Fab”片段)以及“Fc”片段(其不具有抗原结合活性，但具有结晶能力)。使用酶(胃蛋白酶)对抗体进行水解得到F(ab’)2片段，其中所述抗体分子的两个臂保持连接，并包含两个抗原结合位点。F(ab’)2片段具有与抗原交联的能力。 
“Fv”当在本文中用于指保留有抗原识别位点和抗原结合位点的最小的抗体片段。该区域由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的非共价或共价的结合方式而形成的二聚体构成。正是在这种构造中，各个可变结构域的三个CDR相互作用，从而在VH-VL二聚体的表面上定义了抗原结合位点。总体而言，六个CDR赋予所述的抗体以抗原结合特异性。但是，虽然单个的可变结构域(或者仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，但是与完整的结合位点相比，亲和性较低。 
“Fab”当在本文中用于指包含轻链的恒定结构域和重链的CH1结构域的抗体的片段。 
“dAb”当在本文中用于指作为人源抗体的最小功能结合单元的抗体片段。“dAb”为单结构域抗体，并且包含抗体重链的可变结构域(VH结构域)或抗体轻链的可变结构域(VL结构域)。各个dAb都包含六个天然存在的CDR中的三个(Ward et al，Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli.Nature 341，544-546(1989)；Holt，et al，Domain antibodies：protein for therapy，Trends Biotechnol.21，484-49(2003))。它们的分子量为11至15kDa，比抗原结合片段(Fab)2小四倍，并且是单链Fv(scFv)分子的一半。 
“Camelid”当在本文中用于指抗体分子由重链二聚体构成，所述的二聚体缺少轻链，但是具有延伸的抗原结合组库(repertoire)(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R(1993)Naturally occurring antibodies devoid of light chains.Nature 363：446-448)。 
术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述的片段包含与在相同的多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)。通过使用连接体(该连接体太短以至于在 同一链中的两个结构域之间不能配对)，迫使所述的结构域与一个链的互补结构域配对，并创建出两个抗原结合位点。在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中更全面地描述了双功能抗体。 
已经显示，整个抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab(Ward，E.S.et al，(1989)Nature 341，544-546)；由VH和CH1结构域组成的Fd片段(McCafferty et al(1990)Nature，348，552-554)；由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段(Holt et al(2003)Trends in Biotechnology 21，484-490)；以及(iv)dAb片段(Ward，E.S.et al，Nature 341，544-546(1989)，McCafferty et al(1990)Nature，348，552-554，Holt et al(2003)Trends in Biotechnology 21，484-490)，其由VH或VL结构域组成；(v)分离的CDR区域；(vi)F(ab′)2片段，其为包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽连接体连接，其中所述的连接体使得两个结构域相结合，从而形成抗原结合位点(Bird et al，(1988)Science，242，423-426，Huston et al，(1988)PNAS USA，85，5879-5883)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；以及(ix)“双功能抗体”通过基因融合而构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger，P.(1993)et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448)。Fv、scFv或双功能抗体可以通过引入连接VH和VL结构域的二硫化物的键来稳定(Reiter，Y.et al，Nature Biotech，14，1239-1245，1996)。此外，还可以制备包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(Hu，S.et al，(1996)Cancer Res，56，3055-3061)。结合片段的其他实例为Fab’和Fab’-SH，其中Fab’通过在重链CH1结构域的羧基末端加入一些残基(包括得自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同，而Fab’-SH则为恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基基团的Fab’片段。 
术语“可变的”是指这样的事实，即，在抗体的序列中，可变结构域的某些部分有较大不同，并且这些部分是形成各特定抗体对特定抗原具有结合亲和性的原因。但是，所述的变化性并非均匀地分布于抗体的整个可变结构域中。在轻链和重链的可变结构域中，所述的部分集中在被称为互 补性决定区(CDR)的节段中。保守性更高的可变结构域部分被称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域均包含四个FR区域，其主要采用β-片构造，并通过三个CDR连接，其中所述的三个CDR形成了环连接，并且在某些情况下形成了β-片结构的一部分。在各链中的CDR通过FR区域以紧密接近的方式被保持在一起，并且如果具有得自其他链的CDR则有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat et al，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定结构域通常不直接涉及抗原的结合，但是可以影响抗原结合的亲和性并且表现出多种效应器功能，例如在ADCC、CDC和/或细胞凋亡中抗体参与。 
术语“高变区”在本文中用于指与抗体与抗原的结合有关的抗体的氨基酸残基。高变区涵盖了“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域的残基24-46(L1)、50-56(L2)以及89-97(L3)和重链可变区的残基31-35(H1)、50-65(H2)以及95-102(H3)；Kabat et al，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))，和/或得自高变区的那些残基(例如轻链可变结构域的残基26-32(L1)、50-52(L2)以及91-96(L3)和重链可变区的残基26-32(H1)、53-55(H2)以及96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol，196：901-917(1987))。“构架”或“FR”残基为在CDR侧翼的那些可变结构域残基。FR残基存在于嵌合抗体、人源化的抗体、人源抗体、结构域抗体、双特异性抗体、vaccibody、线性抗体以及双功能抗体。 
如本文所用，靶向结合剂、靶向结合蛋白质、特异性结合蛋白质等术语是指优选地与靶向位点结合的抗体或其结合片段。在一个实施方案中，所述的靶向结合剂仅对一个靶向位点是特异性的。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂对多于一个的靶向位点是特异性的。在一个实施方案中，所述的靶向结合剂可以是单克隆抗体，并且所述的靶向位点可以是抗原决定部位。 
“结合片段”是通过重组DNA技术或者通过完整抗体的酶解或化学断裂而制备抗体的。结合片段包括Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，dAb以及单链抗体。除了“双特异性”或“双功能”抗体以外的抗体可以理解为具有其每 个结合位点都是相同的。当过量的抗体将受体与反受体结合的数量减少至少大约20％、40％、60％或80％，并且更通常大于大约85％时(在体外竞争性结合测试方法中测定)，抗体基本上抑制了受体对反受体的附着。 
术语“抗原决定部位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的蛋白质决定簇。抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖的侧链)组成，并且可以但不总是具有特异的三维结构特征以及特异的电荷特征。当解离常数为≤1μM，优选为≤100nM并且最优选为≤10nM时，认为抗体特异性地与抗原结合。 
术语“试剂”在本文中用于指化学化合物、化学化合物的混合物、生物学大分子或者由生物学材料制得的提取物。 
关于CD105多肽的“活性的”或“活性”是指具有天然CD105多肽的生物学或免疫学活性的CD105多肽部分。“生物学”在本文中用于指由天然CD105多肽的活性得到的生物学功能。优选的CD105生物学活性包括例如CD105诱导的细胞粘附和侵入和/或血管生成和/或增殖。 
“哺乳动物”在本文中用于指被认为是哺乳动物的任何动物。优选的是，所述的哺乳动物为人。 
“动物”在本文中涵盖了被认为是哺乳动物的动物。优选的是，所述的动物为人。
术语“mAb”是指单克隆抗体。 
“脂质体”在本文中用于指可以用于将药品传递给哺乳动物的小囊泡，其中所述的药品可以包括本发明的CD105多肽或者是针对这种CD105多肽的抗体。 
“标记”或“标记的”在本文中用于指向多肽中加入可检测的部分，例如放射性标记、荧光标记、酶标记、化学发光标记或生物素基团。放射性同位素或放射性核可以包括3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、 131I；荧光标记可以包括若丹明、镧系元素、磷或FITC；酶标记可以包括辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶。 
其他标记包括(为了说明而并非进行限定)：酶，例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸酯脱氢酶和过氧化物酶；染料； 其他荧光标记或荧光剂，包括例如荧光素及其衍生物、荧光染料、GFP(GFP即“绿色荧光蛋白质”)、丹黄酰类、伞形酮、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛以及荧光胺；荧光团，例如镧系穴状化合物及螯合物，如Europium等(Perkin Elmer和Cis Biointernational)；化学发光标记或化学发光试剂(chemiluminescer)，例如异氨基苯二酰肼、发光氨和二 
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烷；感光剂；辅酶；酶底物；颗粒，例如乳胶颗粒或碳颗粒；金属溶胶；微晶；脂质体；细胞等，其可以进一步用染料、催化剂或其他可检测的基团进行标记；分子，例如生物素、地高辛或5-溴脱氧尿苷；毒素部分，例如选自假单胞菌外毒素(PE、或者其细胞毒素的片段或突变体)、白喉(Diptheria)毒素或者其细胞毒素的片段或突变体、肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E或F、蓖麻毒素或者其细胞毒素的片段(例如蓖麻毒素A)、相思豆毒素或者其细胞毒素的片段、皂草素或者其细胞毒素的片段、商陆抗病毒毒素或者其细胞毒素的片段、异株泻根毒蛋白1(bryodin)或者其细胞毒素的片段中的毒素部分。 
术语“药剂或药品”在本文中用于指当适当地对患者进行给药时能够诱导所需的治疗作用的化学化合物或组合物。根据本领域的常规用法，本文中还是有了其他化学术语，如The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker，S，Ed，McGraw-Hill，San Francisco(1985))(该文献以引用方式并入本文)中举例的那些。 
如本文所用，“基本上为纯的”是指目标物种为存在的主要物种(即，以摩尔计，在所述的组合物中，目标物种比任何其他单个物种都更加丰富)，并且优选的是基本上为纯的部分为其中目标物种包含所有存在的大分子物种的至少大约50％(以摩尔计)的组合物。通常，基本上为纯的组合物包含所述组合物中存在的所有大分子物种的大于大约80％，更优选的是大于大约85％、90％、95％和99％。更优选的是，将目标物种纯化至基本为同质性的(通过常规的检测方法不能再所述的组合物中检测到污染物种)，其中所述的组合物基本由单一的大分子物种组成。 
术语“患者”包括人和兽医的受试对象。 
“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Ig Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤 (NK)细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶向细胞上的结合抗体，并随后使得所述的靶向细胞溶解。用于介导ADCC的首要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII以及FcγRIII。造血细胞上FcR的表达概括于Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的464页表3中。为了估测所关注分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测试，例如在美国专利No.5,500,362或5,821,337中所描述的方法。用于这种测试的可用的效应器细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选择地或此外，可以在体内(例如在Clynes et al.PNAS(USA)95：652-656(1988)如中所公开的动物模型中)估测所关注分子的ADCC活性。“补体依赖的细胞毒性”和“CDC”是指抗体实施它们的细胞杀死功能所采用的机制。该机制是通过C1q(其为补体的第一成分的构成部分)与Igs、IgG或IgM(其与抗原形成络合物)的Fc结构域相结合而引发的(Hughs-Jones，N.C，and B.Gardner.1979.Mol.Immunol.16：697)。C1q为存在于人血清中浓度为70μg/ml的～410kDa的大型络合结构的糖蛋白(Cooper，N.R.1985.Adv.Immunol.37：151)。C1q与两种丝氨酸蛋白酶(C1r和C1s)在一起形成的络合物C1(补体的第一成分)。为了使C1活化，必须使C1q的至少两个N末端球形头与Igs的Fc结合，因此启动补体的级联反应(Cooper，N.R.1985.Adv.Immunol.37：151)。 
如本文所用，术语“抗体的半衰期”是指抗体的药代动力学性质，其为在给药之后抗体分子的平均存活时间的量度。抗体的半衰期可以表示为消除已知量的免疫球蛋白的50％所需要的时间，其中所述的免疫球蛋白得自患者身体或其特定的区室(compartment)(例如在血清或血浆中测定(即，循环半衰期)或在其他组织中)。一种免疫球蛋白或一类免疫球蛋白与另一种免疫球蛋白或一类免疫球蛋白的半衰期可以是不同的。通常，对于所给药的抗体而言，在循环中，抗体半衰期的增长使得平均停留时间(MRT)增长。 
术语“同种型”是指抗体重链或轻链恒定区的分类。抗体的恒定结构域与抗原的结合无关，但是表现出多种效应器功能。根据重链恒定区的氨基酸序列，给定人源抗体或免疫球蛋白可以指定为免疫球蛋白的五个主要 种类(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)中的一种。这些种类中的若干个种类可以进一步分为亚种(同种型)，例如IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)和IgG4(γ4)以及IgA1和IgA2。与免疫球蛋白的不同种类相应的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的结构和三维构造是公知的。在多种人源免疫球蛋白种类中，已知仅有人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM能够活化补体。已知在人类中，人IgG1和IgG3是可以介导的。人源轻链恒定区可以分为两个主要的种类：γ和λ。 
如果需要的话，例如利用不同同种型的生物学性质，特异性结合CD105的抗体的同种型可以被转变。例如，在某些环境下，在关于作为对抗CD105的治疗性抗体的抗体的生成中，可能理想的是所述的抗体能够结合补体并参与补体依赖的细胞毒性(CDC)。存在有大量的能够结合补体并参与依赖的细胞毒性的同种型抗体，包括但不限于以下这些：鼠IgM、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG3、人IgM、人IgA、人IgG1和人IgG3。在另一个实施方案中，在关于作为对抗CD105的治疗性抗体的抗体的生成中，可能里想的是所述的抗体能够结合效应器细胞上的Fc受体，并参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。存在有大量的能够结合效应器细胞上的Fc受体并参与抗体依赖的细胞毒性的同种型抗体，包括但不限于以下这些：鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG3、人IgG1和人IgG3。应该理解的是，所生成的抗体最开始并非必须具有这种同种型，但是所述的所生成的抗体可以具有任何同种型，并且该抗体可以为在采用本领域公知的常规技术之后而被改变的同种型。此类技术包括使用定点重组技术(例如参见美国专利No.4,816,397)、细胞-细胞融合技术(例如参见美国专利No.5,916,771和6,207,418)等。 
例如，本文所讨论的抗CD105的抗体为全人源抗体。如果所具有的抗体需要与CD105相结合，可以在仍具有相同的可变区(其定义了抗体的特异性和部分亲和性)的同时，容易地为被改变从而形成人IgM、人IgG1或人IgG3同种型的同种型。然后，此类分子能够结合补体并参与CDC；和/或能够结合效应器细胞上的Fc受体并参与ADCC。 
“全血测试”使用了未分级的血液作为天然效应器的来源。血液的血浆中包含补体、以及表达FcR的细胞效应器(例如多形性核细胞(PMN)和 单核细胞(MNC))。因此，全血测试可以同时评价体外ADCC和CDC效应器机制的协同作用。 
如本文所用，“治疗有效”量为向受试对象提供某些改善或益处的量。换言之，“治疗有效”量为在至少一个临床症状中提供一定程度的减缓、减轻和/或降低的量。与可以通过本发明的方法治疗的紊乱相关的临床症状是本领域的技术人员所公知的。此外，本领域的技术人员可以理解的是治疗效果并非必须是完全的或治愈的，只要提供给受试对象某些益处即可。 
如本文所用，术语“和/或”被认为是两种特定的特征或成分中的每一种(包括另一种或不包括另一种)的具体的公开。例如“A和/或B”被认识是(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一种的具体公开，如同每一种都在本文中单独列出一样。 
抗体的结构
已知，抗体的基本结构包含四聚体。每个四聚体都由两个相同的多肽链对构成，每个多肽链对都具有一条“轻”链(大约25kDa)和一条“重”链(大约50-70kDa)。每条链的氨基末端都包含主要用于抗原识别的大约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端都定义了主要用于效应器功能的恒定区。人源轻链可以分为γ和λ轻链。重链可以分为μ、δ、γ、α和ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区相连，而重链还包含大约10以上的氨基酸的“D”区。通常参见Fundamental Immunology Ch.7(Paul，W，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.(1989))(该文献以引用方式并入本文以用于所有目的)。各轻链/重链对的可变区形成可抗体的结合位点。 
因此，完整的抗体具有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体以外，所述的两个结合位点是相同的。 
所述的链都表现为相对保守的构架区(FR)通过三个高变区(也称为CDR)相连的相同的常规结构。得自各多肽对的两条链的CDR通过构架区对其，从而能够结合特异性的抗原决定部位。由N末端至C末端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。分 配在各结构域中的氨基酸根据了Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))，或Chothia & Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia et al.Nature 342：878-883(1989)的定义。 
双特异性或双功能抗体为具有两条不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。在一个例子中，本发明的双特异性抗体为具有对于至少两个不同CD105抗原决定部位具有结合特异性的抗体。由于本发明的多种CD105靶向结合剂具有不同抗原决定部位或具有部分或重叠抗原决定部位，因此涵盖本发明的双特异性抗体可包括具有不同或重叠抗原决定部位的CD105靶向结合剂的任意组合。例如，6A6和6B10具有与4D4和10C9不同的抗原决定部位。在一个例子中，双特异性抗体具有6A6或6B10的高变区或与其具有至少50，60，70，80或90％同源性的区域，以及4D4或10C9的可变或高变区或与其具有至少50，60，70，80或90％同源性的区域。 
双特异性或双功能抗体为具有两条不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可以通过多种方法(包括杂交瘤细胞的融合或者链接Fab’片段)制备。例如参见Songsivilai & Lachmann Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)，Kostelny et al.J.Immunol.148：1547-1553(1992)。在具有单结合位点的片段形式(例如Fab、Fab’和Fv)中，不存在双特异性抗体。通常，VH结构域与VL结构域配对，从而提供了抗体的抗原结合位点，但是单独的VH或VL结构域也可以用于结合抗原。VH结构域(参见表2)可以与VL结构域(参见表2)配对，这样形成了包含VH和VL结构域的抗体的抗原结合位点。 
通常，双特异性抗体是具有对于至少两个不同抗原决定部位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可结合CD105蛋白的两个不同抗原决定部位。其他这样的抗体可含有对于另一单位具有结合位点的CD105结合位点。可选择地，抗-CD105臂可联合结合白血球上引发分子的臂，例如T-细胞受体分子(例如CD3)，或IgG(FcγR)的Fc受体例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，以使细胞防御机理聚集和定位至CD105-表达细胞。双特异性抗体还可用于使细胞毒素剂定位至表达CD105的细 胞。这些抗体具有CD105-结合臂与结合细胞毒素剂的臂(例如皂草素、抗-干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的(例如参见Millstein et al.，Nature，305：537-539(1983)；Traunecker et al.，EMBO J.，10：3655-3659(1991)；Suresh et al.，Methods in Enzymology，121：210(1986)；Kostelny et al.，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)；Hollinger et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)；Gruber et al.，J.Immunol.，152：5368(1994)；美国专利No.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；5,731,168；4,676,980；5,897,861；5,660,827；5,811,267；5,849,877；5,948,647；5,959,084；6,106,833；6,143,873与4,676,980，WO 94/04690；和WO 92/20373)。 
全长双特异性抗体的传统制备基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个链具有不同的特异性(Millstein et al.，Nature，305：537-539(1983))。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(quadromas)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(其通常通过亲和色谱步骤来进行)是相当不方便的，并且产物收率较低。类似的工序公开在下列文献中：WO 93/08829和Traunecker et al.，EMBO J.，10：3655-3659(1991)。 
根据不同方案，具有期望的结合特异性(抗体-抗原联合位点)的抗体可变结构域融合免疫球蛋白恒定结构域序列。优选地，融合与Ig重链恒定结构域进行，该结构域包含铰链区CH2和CH3的至少一部分。优选的是，含有用于轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于融合物的至少一种中。编码免疫球蛋白重链(如果需要，免疫球蛋白轻链)融合物的DNA***单独的表达载体中，并且共转染到合适的宿主细胞中。这在下列方面中提供更大的灵活性：当在构建中使用的不相等比例的三种多肽链提供期望的双特异性抗体的最优收率时，调节在这些实施方案中三种多肽片段的相互比例。然而，当相等比例的至少两种多肽链的表达导致较高收率或者当比例对于所述期望的链组合的收率没有显著影响时，可以将用于两种或所有三种多肽链的编码序列***单一表达载体中。 
在该方案的一个实施方案中，双特异性抗体由下列构成：在一个臂具 有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链，和在另一臂的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。该不对称结构可促进期望的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链组合的分离，因为在仅一半双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供一种容易的分离方式。对于产生双特异性抗体的进一步细节，参见例如Suresh et al.，Methods in Enzymology，121：210(1986)。 
根据美国专利No.5,731,168中所述的另一方案，一对抗体分子之间的界面可工程化以从重组细胞培养基中回收的异源二聚体的百分率最大化。优选的界面包含CH3结构域的至少一部分，在该方法中，来自第一抗体分子的界面的一种或多种小氨基酸侧链被更大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代。通过使用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)来取代大氨基酸侧链，和大侧链相同或类似尺寸的补偿“腔”产生在第二抗体分子的界面上。这提供下列机理：相对于其他不需要的最后产物例如同源二聚体，异源二聚体的收率增加。 
双特异性抗体包括交联或“异源缀合物”抗体。例如，异源缀合物中的一种抗体可耦合抗生物素蛋白，另一种则耦合生物素。这些抗体例如已经被提出来靶向免疫***细胞至不需要的细胞(美国专利No.4,676,980)和用于治疗HIV传染(美国专利No.5,897,861)。异源缀合物抗体可使用任何便捷的交联方法来制备。合适的交联剂是本领域已知的，并连同一些交联技术公开在美国专利No.4,676,980。 
从抗体片段来产生双特异性抗体的技术也已经在文献中有所描述。例如，双特异性抗体可使用化学交联来制备。Brennan et al.，Science，229：81(1985)描述了这样的方法，其中完整抗体被蛋白水解***以产生F(ab′)2片段。这些片段在二巯基络合物例如***存在下减少以稳定附近双硫醇并且防止二硫化物形成。然后，产生的Fab′片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后一种Fab′-TNB通过用巯基乙胺还原而重新转化为Fab′-硫醇，并且和等摩尔量的其他Fab′-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作用于选择酶的固定的试剂。 
近年的进展促进了从E.coli直接回收Fab′-SH片段，其可化合耦合以形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了全 人源化双特异性抗体F(ab′)2分子的制备。各Fab′片段单独选自E.coli，并且体外进行指导的化合耦合以形成双特异性抗体。这样形成的双特异性抗体能够结合过度表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及引发人细胞毒性淋巴细胞对于人乳腺瘤靶点的溶胞活性。 
已近描述了直接从重组细胞培养基制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，双特异性抗体使用亮氨酸拉链来制备。Kostelny et al.，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接两种不同抗体的Fab′部分。抗体同源二聚体在铰链区较少以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异源二聚体。该方法还可用于抗体同源二聚体的制备。由Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，90：6444-6448(1993)描述的“双特异抗体(diabody)”技术提供用于制备双特异性抗体片段的可选择的机理。片段包含通过接头连接VL的VH，其太短而不允许在相同链上的两个结构域之间进行配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫使与另一片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原-结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.，152：5368(1994)和美国专利No.5,591,828；4,946,778；5,455,030；和5,869,620。 
人源抗体和抗体的人源化
人源抗体避免了与具有鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体有关的一些问题。这种鼠或大鼠的衍生蛋白质的存在可以使得所述的抗体被快速清除，或者可以使患者产生对抗所述抗体的免疫应答。为了避免使用鼠或大鼠的衍生抗体，可以通过将功能人源抗体的基因座引入到啮齿动物、其他哺乳动物或动物中来生成全人源抗体，使得啮齿动物、其他哺乳动物或动物产生全人源抗体。 
用于生成全人源抗体的一种方法为使用XenoMouse
Figure BPA00001373578600691
品系的小鼠，该小鼠经过基因工程操作而包含人源重链基因座和γ轻链基因座的、至多且少于1000kb尺寸的种系改装片段。参见Mendez et al.Nature Genetics 15：146-156(1997)以及Green and Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)。XenoMouse品系的小鼠得自Amgen公司(Fremont，California，U.S.A)。 
然后，这种小鼠能够产生人源免疫球蛋白分子和抗体，并且在鼠免疫球蛋白分子和抗体的制备中具有缺陷。用于取得上述结果的技术在1996年12月3日提交的美国专利申请系列No.08/759,620和1998年6月11日公开的国际专利申请No.WO 98/24893和2000年12月21日公开的WO 00/76310中有所公开，这些文献的公开内容以引用方式并入本文。此外，参见Mendez et al.Nature Genetics 15：146-156(1997)，该文献的公开内容以引用方式并入本文。 
在1990年1月12日提交的美国专利申请系列No.07/466,008、1990年11月8日提交的07/610,515、1992年7月24日提交的07/919,297、1992年7月30日提交的07/922,649、1993年3月15日提交的08/031,801、1993年8月27日提交的08/112,848、1994年4月28日提交的08/234,145、1995年1月20日提交的08/376,279、1995年4月27日提交的08/430,938、1995年6月27日提交的08/430,938、1995年6月5日提交的08/464,584、1995年6月5日提交的08/464,582、1995年6月5日提交的08/463,191、1995年6月5日提交的08/462,837、1995年6月5日提交的08/486,853、1995年6月5日提交的08/486,857、1995年6月5日提交的08/486,859、1995年6月5日提交的08/462,513、1995年10月2日提交的08/724,752、1996年12月3日提交的08/759,620、2001年11月30日提交的美国公开2003/0093820、以及美国专利No.6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598及日本专利No.3068180 B2、3 068 506 B2和3 068 507 B2中，进一步讨论和描述了XenoMouse 
Figure BPA00001373578600701
品系的小鼠的制备。此外，参见1996年6月12日公开授予的欧洲专利No，EP 0 463 151 B1、1994年2月3日公开的国际专利申请No，WO 94/02602、1996年10月31日公开的国际专利申请No，WO 96/34096、1998年6月11日公开的WO 98/24893、2000年12月21日公开的WO 00/76310。上文所述专利、申请和参考文献的各个公开内容在此均以引用方式全文并入本文。 
在可选择的方法中，其他人(包括GenPharm International公司)采用了“迷你基因座”的方法。在迷你基因座方法中，通过包含得自Ig基因座的片段(单个基因)而模仿了外源Ig基因座。因此，在构建体(construct)中形成一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ 恒定区以及通常的第二恒定区(优选为γ恒定区)，以用于***到动物中。这种方法在Surani et al.的美国专利No.5,545,807、均属于Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806，5,625,825，5,625,126，5,633,425，5,661,016，5,770,429，5,789,650，5,814,318，5,877,397，5,874,299和6,255,458、Krimpenfort和Berns的美国专利No.5,591,669和6,023.010、Berns et al的美国专利No.5,612,205，5,721,367和5,789,215、以及Choi和Dunn的美国专利No.5,643,763；以及1990年8月29日提交的GenPharm国际美国专利申请系列No.07/574,748、1990年8月31日提交的07/575,962、1991年12月17日提交的07/810,279、1992年3月18日提交的07/853,408、19926月23日提交的07/904,068、1992年12月16日提交的07/990,860、1993年4月26日提交的08/053,131、1993年7月22日提交的08/096,762、1993年11月18日提交的08/155,301、1993年12月3日提交的08/161,739、1993年12月10日提交的08/165,699、1994年3月9日提交的08/209,741中有所描述，这些文献的公开内容均以引用方式并入本文。此外，参见欧洲专利No.0 546 073 B1、国际专利申请No.WO 92/03918，WO 92/22645，WO 92/22647，WO 92/22670，WO 93/12227，WO 94/00569，WO 94/25585，WO 96/14436，WO 97/13852和WO 98/24884以及美国专利No.5,981,175，这些文献的公开内容均以引用方式全文并入本文。进一步参见Taylor et al，1992，Chen et al，1993，Tuaillon et al，1993，Choi et al，1993，Lonberg et al，(1994)，Taylor et al，(1994)和Tuaillon et al，(1995)，Fishwild et al，(1996)，这些文献的公开内容均以引用方式全文并入本文。 
Kirin还论证了得自小鼠的人源抗体的生成，其中通过微细胞融合而引入大片段的染色体或整条染色体。参见欧洲专利申请No.773 288和843 961，该文献的公开内容以引用方式并入本文。此外，已经产生了KMTM-小鼠，其为Kirin的Tc小鼠与Medarex的迷你基因座(Humab)小鼠的杂交育种的结果。这些小鼠具有Kirin小鼠的人源IgH导入染色体和Genpharm小鼠的γ链转基因(Ishida et al，Cloning  Stem Cells，(2002)4：91-102)。 
人源抗体还可以通过体外方法衍生得到。合适的实例包括但不限于噬菌体展示(Medimmune，Morphosys，Dyax，Biosite/Medarex，Xoma， Symphogen，Alexion(formerly Proliferon)，Affimed)、核糖体展示(Medimmune)、酵母菌展示等。 
抗体的制备
如本文所述，通过使用XenoMouse 
Figure BPA00001373578600721
技术(下文中详细描述)来制备抗体。这种小鼠能够产生人源免疫球蛋白分子和抗体，并且在鼠免疫球蛋白分子和抗体的产生中是有缺陷的。用于取得上述结果的技术在本文的背景技术部分公开的专利、申请和参考文献中有所公开。但是具体而言，小鼠和所得的抗体的转基因制备的优选实施方案在1996年12月3日提交的美国专利申请系列No.08/759,620、1998年6月11日公开的国际专利申请No.WO 98/24893和2000年12月21日公开的WO 00/76310中有所描述，这些文献的公开内容以引用方式并入本文。此外，参见Mendez et al.Nature Genetics 15：146-156(1997)，该文献的公开内容以引用方式并入本文。 
通过采用这些技术，已经制备出针对多种抗原的全人源单克隆抗体。基本上为，使用所关注的抗原(例如CD105)免疫XenoMouse 
Figure BPA00001373578600722
系小鼠，由超免疫的小鼠中回收淋巴细胞(例如B细胞)，并将回收的淋巴细胞与骨髓类细胞系融合，从而制备得到无限增殖的杂交瘤细胞系。对这些杂交瘤细胞系进行筛查和选择，从而鉴定出能够产生特异性地针对所关注的抗原的抗体的杂交瘤细胞系。本文提供了用于产生能够生成对CD105具有特异性的抗体的多发性杂交瘤细胞系的方法。此外，本文提供了由所述的这种细胞系产生的抗体的特征，包括所述抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。 
可选择地，不采用将B细胞融合到骨髓瘤细胞中以产生杂交瘤细胞的方法，可以直接测试B细胞。例如，可以由超免疫的XenoMouse 小鼠中分离CD19+B细胞，并使其增殖和分化形成分泌抗体的血浆细胞。然后，针对对抗CD105免疫原的反应性，通过ELISA来筛查得自细胞上清液中的抗体。还可以针对对抗CD105的片段的免疫反应性来筛查上清液，从而进一步针对与CD105上的所关注的功能结构域的结合情况来进一步绘制(map)不同的抗体。抗体还可以筛选其他相关人糖苷内切酶和针对大鼠、小鼠与非人灵长动物例如短尾猴、CD105同源物，后者确定种类的交叉反 应性。得自装有所关注抗体的孔中的B细胞可以通过多种方法而形成无限增殖的，包括进行融合从而由单个的或由合并的孔制得杂交瘤细胞，或者使用EBV进行感染或通过已知的无限增殖基因进行转染，然后平板接种于合适的培养基中。可选择地，然后采用CD105特异性的溶血空斑测试来分离具有所需特异性的分泌抗体的单种血浆细胞(例如参见Babcook et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-48(1996))。靶向溶解的细胞优选为使用CD105抗原涂覆的绵羊红血细胞(SRBC)。 
在包含血浆细胞(其分泌所关注的免疫球蛋白和补体)的B细胞培养物存在的条件下，斑点的形成表明包围所关注的血浆细胞的绵羊血液红细胞发生了特异性的CD105介导的水解。可以分离出处于所述斑点中心的单个的抗原特异性血浆细胞，并且由单个的血浆细胞中分离得到编码了抗体的特异性的遗传信息。采用逆转录以及随后的PCR(RT-PCR)，可以克隆编码所述抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA。然后，可以将这种克隆的DNA进一步***到合适的表达载体中，优选的是载体盒，例如pcDNA，更优选的是例如包含免疫球蛋白重链和轻链的恒定结构域的pcDNA载体。然后，可以将所生成的载体转染到宿主细胞(例如HEK293细胞、CHO细胞)中，并在常规营养培养基(按照适用于诱导转录、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的条件进行修改)中进行培养。 
如所理解的那样，特异性结合CD105的抗体可以在除了杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。编码特定抗体的序列可以用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。转化可以通过任何已知的用于将多核苷酸引入到宿主细胞中或通过本领域中已知的转染过程的方法(例如包括将所述的多核苷酸包装到病毒中(或病毒载体中)并用所述的病毒(或载体)转导宿主细胞，如在美国专利No.4,399,216，4,912,040，4,740,461和4,959,455中示例说明的那样，这些专利文献在此以引用方式并入本文)进行。所采用的转化过程取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞中的方法是本领域公知的，并包括右旋糖酐介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核甘酸囊封与脂质体中以及将DNA直接微注射到核中。 
可以用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞是本领域公知的，并且包括 得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)中的许多无限增殖的细胞系，包括但不限于中国仓鼠***(CHO)、HeLa细胞、幼地鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(COS)、人肝细胞的癌细胞(例如Hep G2)、人上皮肾293细胞、以及多种其他细胞系。通过测定哪种细胞系具有高的表达水平并产生具有构成性CD105结合性质的抗体来选择特定优选的细胞系。 
在细胞-细胞融合技术中，制备拥有具有任何所需同种型的重链的骨髓瘤、CHO细胞或其他细胞系，并制备拥有轻链的另一种骨髓瘤、CHO细胞或其他细胞系。因此，这种细胞可以被融合，并且可以分离出表达完整抗体的细胞系。 
因此，当生成满足上文所述的所需“结构”特性的抗体候选物时，通常可以通过同种型改变来提供具有至少某些所需“功能”特性的抗体候选物。 
治疗给药和配制物
本发明的实施方案包括可用作疾病治疗的抗CD105抗体的无菌药物配制物。这种配制物会抑制天然CD105特异性配体例如TGF-β与CD105的结合，从而因此会有效地治疗其中例如血清或组织CD105的表达异常升高的病理学状况。抗CD105的抗体优选的是具有足够的亲和性，从而有效地抑制天然CD105特异性配体例如TGF-β，并且优选的是所述的抗体足够的作用时间，从而在人中较少的进行定量给药。持久的作用时间可以通过交替的肠胃外途径(例如皮下注射或肌肉内注射)而具有较低频率和更加方便的定量给药时间表。 
例如，可以通过在抗体的冻干和再构建之前或之后滤过无菌滤膜而创建得到。所述的抗体通常以冻干形式储存或储存于溶液中。通常，将治疗抗体的组合物放置在具有无菌通道口(例如静脉输液袋)的容器中，或者具有适配器(其可以取回所述的配制物，例如可通过皮下注射针穿孔的阻塞物)的瓶子。 
抗体的给药途径根据已知方法进行，例如通过静脉、腹膜内、大脑内、肌肉内、眼内、动脉内、膜内注射或注入，吸入或病灶内途径，直接注射到肿瘤位点，或者通过以下所述的缓释***。所述的抗体优选的是通过注 入或通过团注而进行连续地给药。 
待治疗用的抗体的有效量取决于(例如)治疗目标、给药途径以及患者的状况。因此，优选的是治疗专家对计量进行效价，并按照需要来修改给药途径以获得最佳的治疗效果。通常，临床医生给药抗体，直到达到取得所需效果的剂量为止。这种治疗过程可以通过常规的测试方法或通过本文所述的测试方法容易地监测。 
可以在具有可药用的载体中制备本文所述的抗体。这种治疗组合物可以通过静脉内给药，或者通过鼻或肺的形式(优选的是以液体或粉末气雾剂(冻干的)的形式)进行给药。还可以根据需要以肠胃外或皮下的方式给药所述的组合物。当进行***给药时，所述的治疗组合物应该是无菌的，无热原的，并且为适当考虑了pH、等渗性和稳定性的可肠胃外用药的溶液形式。所述的这些状况是本领域的技术人员已知的。简言之，制备本文所述化合物的剂量配制物，以用于储存或通过将具有所需纯度的化合物与可药用的载体、赋形剂或稳定剂混合来进行给药。所述的这种材料在所使用的剂量和浓度下对受试者是非独显的，并且包括缓冲剂，例如TRIS HCl、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其他有机酸盐；抗氧化剂，例如聚精氨酸、蛋白质(例如血清白蛋白)、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；抗衡离子，例如钠和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。 
可以根据在Remington：The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.，Lippincott Williams & Wilkens Publishers(2003))中所述的常规的制药实践来配制用于注射的无菌组合物。例如，所述的活性化合物溶解或悬浮于可药用的载体(例如水、天然存在的植物油(如芝麻油、花生油或棉籽油)、或者合成的脂肪媒介物(如油酸乙酯等))中可能是理想的。根据可药用的实践并入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。 
缓释制备物的合适实例包括含有多肽的固态疏水性聚合物的半透性基质，其中所述的基质为成形制品、膜或微囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)如Langer et al，J.Biomed Mater. Res，(1981)15：167-277 and Langer，Chem.Tech，(1982)12：98-105所述，或者聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利No.3,773,919、EP 58,481)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman et al，Biopolymers，(1983)22：547-556)、不可降解的乙烯-醋酸乙烯(Langer et al，上文)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRON DepotTM，由乳酸-乙醇酸共聚物与醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)、以及聚-D-(-)-3-羟丁酸(EP 133,988)。 
虽然诸如乙烯-醋酸乙烯和乳酸-乙醇酸之类的聚合物能够在100天的时间内释放分子，但是某些水凝胶在较短的时间内释放蛋白质。当囊封的蛋白质在体内长时间保持时，作为在37℃下暴露于潮湿环境的结果，它们会变性或聚集，从而导致生物学活性的损失以及免疫原性可能发生的变化。可以根据所涉及的机制，针对蛋白质的稳定来设计合理的策略。例如，如果发现聚集机制为通过二硫键的互换而在分子内形成S-S键，则可以通过对巯基残基进行修饰、由酸性溶液中冻干、控制含水量、使用合适的添加剂以及研发特定的聚合物基质组合物来取得稳定。 
缓释组合物还包括在合适的配制物(能够在悬浮溶液中保持为晶体)中悬浮的抗体晶体的制备。当这些制备物采用皮下或腹膜内的方式进行注射时，其能够产生缓释效果。其他组合物还包括脂质体包封抗体。包含这种抗体的脂质体本身可以通过已知的方法制备：美国专利No.DE 3,218,121；Epstein et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)82：3688-3692；Hwang et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1980)77：4030-4034；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；142,641；日本专利申请83-118008；美国专利No.4,485,045和4,544,545；以及EP 102,324。 
通过主治医生考虑已知的多种因素来修改药品的作用来确定用于给定患者的抗体配制物的剂量，其中所述的因素包括疾病的严重程度和类型、体重、性别、日常饮食、给药的时间和途径、其他药剂以及其他相关的临床因素。可以通过体外或体内方法来确定治疗有效的剂量。 
待治疗用的本文所述的抗体的有效量取决于(例如)治疗目标、给药途径以及患者的状况。因此，优选的是治疗专家对计量进行效价，并按照需要来修改给药途径以获得最佳的治疗效果。根据上文提及的因素，常规的每日剂量可以为患者体重的大约0.0001mg/kg、0.001mg/kg、0.01mg/kg、 0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg至最多100mg/kg、1000mg/kg、10000mg/kg或更多。根据上文提及的因素，所述的剂量可以为患者体重的0.0001mg/kg至20mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001至2mg/kg、0.0001至1mg/kg、0.0001mg/kg至0.75mg/kg、0.0001mg/kg至0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg或者0.01至0.10mg/kg。通常，临床医生给药治疗性的抗体，直到达到取得所需效果的剂量为止。这种治疗过程可以通过常规的测试方法或通过本文所述的测试方法容易地监测。 
本发明抗体的单次剂量可以重复，并且给药操作可以间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。 
应该理解的是，根据本文所述的组合物和方法对治疗实体的给药操作可以与合适的载体、赋形剂以及其他试剂(其被并入到配制物中以提供改善的转移、传递、耐受等)一起给予。这些配制物包括(例如)粉末、糊状物、软膏、胶状物、蜡、油、脂质、包含囊泡(例如LipofectinTM)的脂质(阳离子或阴离子)、DNA缀合物、无水吸附糊状物、水包油及油包水的乳液、聚乙二醇(各种分子量的聚乙烯醇)、半固体凝胶、以及包含聚乙二醇的半固体混合物。根据本发明，在进行处理和治疗中，任何之前所述的混合物都是合适的，只要配制物中的活性组分没有因配制过程而失活并且所述的配制物是生理学相容的并耐受给药途径。此外参见Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development：the need for preclinical guidance.”Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2)：210-8(2000)，Wang W.“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2)：1-60(2000)，Charman WN“Lipids，lipophilic drugs，and oral drug delivery-some emerging concepts.”J Pharm Sci.89(8)：967-78(2000)，Powell et al.“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol.52：238-311(1998)，并且其中用于与配制物、赋形剂和载体有关的其他信息的引文都是药物化学剂所公知的。 
其他疗法的设计和产生
根据本发明并基于本文中针对CD105所产生并表征的抗体的活性，设计抗体部分以外的其他治疗形式是方便的。这种形式包括但不限于改进的抗体疗法，例如双特异性抗体、免疫毒素和放射性标记疗法；单结构域抗体；抗体片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或dAb；肽疗法的形成；新型支架中的CD105结合结构域；基因疗法；特定的细胞内抗体；反义疗法；以及小分子。 
可以通过在非抗体蛋白质支架(例如纤维连接蛋白或细胞色素B等)上排布CDR(Haan & Maggos(2004)BioCentury，12(5)：A1-A6；Koide et al.(1998)Journal of Molecular Biology，284：1141-1151；Nygren et al.(1997)Current Opinion in Structural Biology，7：463-469)，或者通过随机排列或突变位于蛋白质支架中环的氨基酸残基以赋予针对所需靶物的结合特异性来提供抗原结合位点。Nygren et al.对用于蛋白质中的新型结合位点进行基因工程的支架进行了详细的综述(Nygren et al.(1997)Current Opinion in Structural Biology，7：463-469)。用于抗体模拟物的蛋白质支架在WO/0034784(该文献以引用方式全文并入本文)中有所公开，其中发明人描述了具有至少一个随机排列的环的纤维连接蛋白III型结构域的蛋白质(抗体模拟物)。其中移植有一个或多个CDR(例如一组HCDR)的合适的支架可以由免疫球蛋白的基因超家族的任何结构域成员来提供。所述的支架可以为人或非人蛋白质。非抗体蛋白质的优点在于其可以在支架分子中提供抗原结合位点，其中所述的支架分子比至少某些抗体分子更小和/或更容易制造。小尺寸的结合成员可以赋予有用的生理学性质，例如能够进入细胞，深入地渗透到组织中或到达位于其他结构中的靶物中，或者在靶向抗原的蛋白质空腔中结合。在Wess，2004中对抗原结合位点在非抗体蛋白质支架中的用途进行了综述(Wess，L.In：BioCentury，The Bernstein Report on BioBusiness，12(42)，A1-A7，2004)。具有稳定的主链以及一个或多个可变环的蛋白质是典型的，其中所述环的氨基酸序列发生特异性的货随机的突变，从而创建出能够结合靶向抗原的抗原结合位点。所述的这种蛋白质包括得自S.aureus的蛋白质的IgG结合结构域、铁传递蛋白、白蛋白、四连接素、纤维连接蛋白(例如，第10个纤维连接蛋白的III型结构 域)、脂钙蛋白以及γ结晶性和其他AffilinTM支架(Scil蛋白质)。其他方法的实例包括基于具有分子内二硫键的环蛋白-小蛋白质的合成“微体”、微蛋白(VersabodiesTM，Amunix)以及锚蛋白重复蛋白质(DARPins，分子配体)。 
除了抗体序列和/或抗原结合位点以外，根据本发明的靶向结合剂可以包含例如形成肽或多肽(例如支架结构域)或者赋予所述分子除了结合抗原的能力之外的其他功能特征的其他氨基酸。本发明的靶向结合剂可以带有可检测的标记，或者可以与毒素、靶向部分或酶(例如通过肽键或连接体)缀合。例如，靶向结合剂可以包含催化位点(例如在酶结构域中)以及抗原结合位点，其中所述的抗原结合位点与所述的抗原结合并因此使催化位点靶向所述的抗原。所述的催化位点可以抑制所述抗原的生物学功能(例如通过裂解)。 
关于早期抗体疗法(其中补体结合为理想的特性)的产生，可以在通过使用(例如)双特异性抗体、免疫毒素或放射性标记来杀死细胞时避免对补体的依赖。 
例如，可以生成双特异性抗体，其包含(i)两个抗体，其中一个抗体对CD105具有特异性，而与第一个抗体缀合连接的另一个抗体对第二分子具有特异性，(ii)单个抗体，其具有对CD105具有特异性的一条链以及对第二分子具有特异性的第二条链；或者(iii)单链抗体，其对CD105和其他分子具有特异性。可以采用公知的技术来生成这种双特异性抗体，例如(i)和(ii)例如参见Fanger et al.Immunol Methods 4：72-81(1994)and Wright and Harris，上文；以及(iii)例如参见Traunecker et al.Int.J.Cancer(Suppl.)7：51-52(1992)。在各种情况下，可以制得针对重链活性受体的第二特异性，包括但不限于CD16或CD64(例如参见Deo et al.Immunol.Today 18：127(1997))、或者CD89(例如参见Valerius et al.Blood 90：4485-4492(1997))。 
还可以采用本领域公知的技术对抗体进行修饰，从而起到免疫毒素的作用。例如参见Vitetta Immunol Today 14：252(1993)。此外，参见美国专利No.5,194,594。关于放射性标记抗体的制备，还可以采用本领域公知的技术容易地制备这种经过修饰的抗体。例如参见Junghans et al.in Cancer  Chemotherapy and Biotherapy 655-686(2d edition，Chafner and Longo，eds，Lippincott Raven(1996))。此外，参见专利No.4,681,581，4,735,210，5,101,827，5,102,990(RE 35,500)，5,648,471以及5,697,902。各种免疫毒素或放射性标记的分子还可能杀死表达所需多聚体蛋白酶亚基的寡聚结构域的细胞。 
当抗体与试剂(例如放射性同位素、药物组合物或毒素)连接时，预计所述的试剂具有选自抗有丝***剂、烷化剂、抗代谢物试剂、抗血管增生试剂、细胞凋亡试剂、生物碱试剂、COX-2试剂、抗生素试剂以及他们的组合的药物性质。所述的药品可以选自氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝酸类、三氮烯、叶酸类似物、蒽环类抗生素、紫杉烷类、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、抗生素、酶、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、拮抗剂、内皮他丁、紫杉醇、喜树碱、奥沙利铂、阿霉素以及它们的类似物和组合。 
在一个特定例子中，本发明的靶向剂缀合治疗剂或毒素，例如烯二炔分子家族的成员(例如次孢霉素和埃斯培拉霉素)。化学毒素还可以得自倍癌霉素(参见美国专利No.5,703,080和美国专利No.4,923,990)、甲氨蝶呤、阿霉素、美法仑、苯丁酸氮芥、ARA-C、去乙酰长春酰胺、丝裂霉素C、顺铂、依托泊苷、博来霉素以及5-氟尿嘧啶。化学治疗剂的实例还包括阿霉素、亚德里亚霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、塞替派、泰素帝(多西他奇)、白消安、细胞毒素、紫杉醇、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊苷、道诺霉素、洋红霉素、氨喋呤、放线菌素、丝裂霉素、埃斯波霉素(美国专利No.4,675,187)、美法仑和其他相关氮芥。 
在某些实施方案中，本发明的靶向剂缀合细胞抑制、细胞毒性或免疫抑制剂。在一个实施方案中，细胞毒性剂选自：烯二炔、lexitropsin、倍癌霉素、紫杉烷、cryptophysin、巴卡亭衍生物、鬼臼毒素、嘌呤、多拉司他汀、maytansinoid、多拉司他汀和长春花生物碱。在特定实施方案中，细胞毒性剂是紫杉醇、多西紫杉醇、CC-1065、trichothene、SN-38、托泊替康、吗啉-阿霉素、根霉素、cyanomorpholino-阿霉素、多拉司他汀-10、棘霉素、考布他汀、加利车霉素、长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、 VP-16、喜树碱、epithilone A、epithilone B、诺考达唑、coichicine、colcimid、雌氮芥、西马多丁、盘皮海绵内酯、软珊瑚醇、美登素DM-1、auristatin E、AEB、AEVB、AEFP、MMAE或纺锤菌素(US公开No.2005/0238649)、以及它们的衍生物。 
在某些其他实施方案中，细胞毒性剂是美登素或类美登素(Maytansinoid)及其衍生物，其中本发明的靶向剂缀合一个或多个类美登素分子。类美登素是有丝***抑制剂，其通过抑制微管蛋白聚合而发挥作用。美登素首先分离自东部非洲灌木Maytenus serrata(美国专利No. 3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生类美登素，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。合成美登醇及其衍生物和类似物公开在例如美国专利No.4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814； 4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929； 4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254； 4,362,663；和4,371,533。在试图改善它们的治疗指数的过程中，美登素和类美登素缀合特异性结合肿瘤细胞抗原的抗体。含有类美登素的免疫缀合物和它们的治疗用途公开在(例如)美国专利No.5,208,020，5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)描述了免疫缀合物，包含连接单克隆抗体C242的类美登素(表示为DM1)，所述单克隆抗体C242定向针对于人结肠直肠癌。缀合物被发现针对培养的结肠癌细胞具有较高细胞毒性，并且在体内肿瘤生长测定中显示出抗肿瘤活性。Chari et al.Cancer Research 52：127-131(1992)描述了免疫缀合物，其中类美登素通过二硫化物接头缀合鼠抗体A7，所述鼠抗体A7结合人结肠癌细胞系上的抗原，或缀合另一鼠单克隆抗体TA.1，所述鼠单克隆抗体TA.1结合HER-2/neu癌基因。TA.1-类美登素缀合物的细胞毒性在体外在人乳腺癌细胞系SK-BR-3上进行测试，其表达3×105HER-2表面抗原/细胞。药物缀合物获得类似于游离类美登素药物的细胞毒性程度，这可通过增加类美登素分子数/抗体分子来增强。A7-类美登素缀合物在小鼠中显示出较低***细胞毒性。因此，本发明涵盖用于某些癌症的治疗性疗法的缀合类美登素剂的靶向剂。 
在某些其他实施方案中，包含本发明的靶向剂的另一目标免疫缀合物 缀合于一个或多个加利车霉素分子。抗体加利车霉素的家族能够产生在亚皮克(sub-picomolar)浓度的双链DNA断裂。为了制备加利车霉素家族的缀合物，参见美国专利No.5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285， 5,770,701，5,770,710，5,773,001，5,877,296(均是American Cyanamid Company的)。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1 I，γ2 I，γ3 I，N-乙酰基-γ1 I，PSAG和θI 1(Hinman et al.Cancer Research 53：3336-3342(1993)，Lode et al.Cancer Research 58：2925-2928(1998)和American Cyanamid的上述美国专利)。抗体可缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，其是抗叶酸剂。加利车霉素和QFA具有细胞内作用位点，并且不容易穿过质膜。因此，通过抗体介导的内在化，这些药剂的细胞摄取极大地增强了它们的细胞毒性效果。 
可在本发明的缀合物中使用的其他毒素包括有毒凝集素、植物毒素例如蓖麻毒素、相思豆毒素、蒴莲根毒素、肉毒杆菌毒素和白喉毒素。当然，各种毒素的联合也可耦合一种抗体分子，从而容纳可变的细胞毒性。适于本发明的联合疗法的示意性毒素是蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、DNase I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和绿脓杆菌内毒素。例如参见Pastan et al.，Cell，47：641(1986)和Goldenberg et al.，Cancer Journal for Clinicians，44：43(1994)。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、Aleurites fordii蛋白、石竹素蛋白、Phytolaca americana蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、Momordica charantia抑制剂、泻果素、巴豆毒素、Sapaonaria officinalis抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯。 
合适的毒素和化疗剂在Remington’s Pharmaceutical Sciences，19th Ed.(Mack Publishing  Co.1995)中和Goodman And Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，7th Ed.(MacMillan Publishing Co.1985)中有所描述。其他合适的毒素和/或化疗剂是本领域的技术人员所公知的。 
放射性同位素的实例包括可以用于定位和/或治疗的γ-发光器、正电子发光器、以及X射线发光器；以及可以用于治疗的β-发光器和α-发光器。可用于诊断、预防和分期的之前所述的放射性同位素还可以用于治疗。 
抗癌或抗白血病试剂的非限定性实例包括蒽环类抗生素，例如亚德里亚霉素(阿霉素)、道诺霉素(正定霉素)、去甲氧正定霉素、地托比星、洋红霉素、表柔比星、依索比星以及它们的吗啉代和取代衍生物、组合及修饰物。药剂的实例包括顺铂、紫杉醇、烯二炔类抗生素、长春新碱、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、***、道诺霉素、去甲氧正定霉素、氟达拉滨、苯丁酸氮芥、干扰素α、羟基脲、替莫唑胺、镇静剂、博来霉素、以及它们的衍生物、组合物和修饰物。优选的是，所述的抗癌或抗白血病药物为亚德里亚霉素、吗啉代亚德里亚霉素或吗啉代道诺霉素。 
本发明的抗体还涵盖了在哺乳动物(优选为人)中具有半衰期(例如血清半衰期)的抗体(其半衰期大于未经修饰的抗体的半衰期)。所述抗体的半衰期可以大于大约15天、大于大约20天、大于大约25天。大于大约30天、大于大约35天、大于大约40天、大于大约45天、大于大约2个月、大于大约3个月、大于大约4个月或者大于大约5个月。本发明的抗体或其片段在哺乳动物(优选为人)中半衰期的增大使得所述抗体或抗体片段在所述哺乳动物中的血清效价更高，因此，减少了所述抗体或抗体片段的给药频率和/或降低了所述抗体或抗体片段的给药浓度。可以通过本领域的技术人员已知的技术来制备体内半衰期增大的抗体或其片段。例如，通过对氨基酸残基(其按照与Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用有关的方法鉴定)进行修饰(例如取代、删除或添加)来制备体内半衰期增大的抗体或其片段(例如参见国际公开No.WO 97/34631和WO 02/060919，该文献以引用方式全文并入本文)。可以通过将所述的抗体或其片段附着在聚合物分子(例如高分子量的聚乙二醇(PEG))上来制备体内半衰期增大的抗体或其片段。可以通过PEG与所述抗体或抗体片段的N末端或C末端形成位点特异性的缀合或者通过赖氨酸残基上存在的ε氨基而使得PEG附着在具有多功能连接体或不具有多功能连接体的所述抗体或抗体片段。可以使用使得生物学活性损失最小的线性或支状聚合物的衍生物。可以通过SDS-PAGE和质谱来密切监测缀合程度，以确保PEG分 子与所述抗体形成适度的缀合。通过例如尺寸排阻色谱或离子交换色谱来由抗体-PEG缀合物种分离未反应的PEG。 
如本领域的技术人员所理解的那样，在上述实施方案中，尽管亲和性值可能是重要的，但是其他因素可能与亲和性值一样重要或者更重要，这取决于所述抗体的特定功能。例如，对免疫毒素(与抗体有关的毒素)而言，抗体与靶物的结合作用可能是有用的，但是在某些实施方案中，使所述毒素内化入所述的细胞才是所需的最终结果。这样，在这种情况下，具有高的百分内化率的抗体可能是理想的。因此，在一个实施方案中，考虑具有高的内化效率的抗体。可以按照内化抗体的百分率来测定高效的内化率，并且可以为较低的值至100％。例如，在改变的实施方案中，0.1-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-45、45-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-99和99-100％可以为高效的。如本领域的技术人员所理解的那样，在不同的实施方案中，理想的效率可以是不同的，这取决于(例如)相关试剂、可能给药至一定区域的抗体的量、抗体-试剂络合物的副作用、待处理的问题的类型(例如癌症的类型)和严重程度。 
在其他实施方案中，本文所公开的抗体提供了用于检测哺乳动物组织或细胞中CD105的表达情况的测试试剂盒，以便针对与CD105的表达变化相关的疾病或紊乱进行筛查。所述的试剂盒包括与CD105结合的抗体以及用于表明所述抗体与所述抗原(如果存在的话)的反应情况的手段。 
结合物
本文所定义的靶向结合剂或抗体可以以单独疗法的形式施加或者可以涉及常规的手术或者放疗或化疗(除了本发明的化合物以外)。这种化疗可以包括一种或多种以下类别的抗肿瘤试剂： 
(i)如在医学肿瘤学中使用的其他抗增殖/抗赘生药品及其结合物，例如烷化剂(例如顺铂、奥沙利铂、卡波铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、替膜唑胺和亚硝基脲)；抗代谢物(例如2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷和抗叶酸素，如羟基脲(如5-氟尿嘧啶和喃氟啶)、甲氨蝶呤、胞核嘧啶、***糖苷和羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类制剂，如阿霉素、博来霉素、亚德里亚霉素、道诺霉素、表柔比星、去甲氧正定霉素、 丝裂霉素C、放线菌素和光神霉素)；抗有丝***剂(例如长春花生物碱(如长春新碱、长春碱、去乙酰长春酰胺和长春瑞滨)、紫杉烷(如紫杉醇和泰索帝)以及polokinase抑制剂)；以及拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(如依托泊苷和替尼泊苷)、安吖啶、托泊替康和喜树碱)； 
(ii)细胞生长抑制剂，例如抗***(例如三苯氧胺、氟维司群、比卡鲁胺、雷洛昔芬、屈洛昔芬和iodoxyfene)、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他胺、安得乐和醋酸去乙酰环丙氯地孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如性激素阻滞药、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如阿纳托唑、来曲唑、伏氯唑以及依西美坦)以及5-还原酶的抑制剂(例如非那司提)； 
(iii)抗侵入剂(例如c-Src激酶家族的抑制剂，如4-(6-氯-2，3-亚甲基二氧苯胺)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基羟喹唑啉(AZD0530；国际专利申请WO 01/94341)和N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-氨甲酰(dasatinib，BMS-354825；J.Med.Chem，2004，47，6658-6661)；以及金属蛋白酶抑制剂(如马马司他、尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化剂受体功能的抑制剂、组织蛋白酶的抑制剂、丝氨酸蛋白酶(如蛋白裂解酶、hepsin、尿激酶)的抑制剂)、类肝素酶的抑制剂)； 
(iv)细胞毒性剂，例如氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷、苯丁酸氮芥或亚德里亚霉素，以及它们的组合，例如氟达拉滨+环磷酰胺；CVP：环磷酰胺+长春新碱+***；ACVBP：亚德里亚霉素+环磷酰胺+去乙酰长春酰胺+博来霉素+***；CHOP：环磷酰胺+亚德里亚霉素+长春新碱+***；CNOP：环磷酰胺+米托蒽醌+长春新碱+***；m-BACOD：甲氨蝶呤+博来霉素+亚德里亚霉素+环磷酰胺+长春新碱+***+甲酰四氢叶酸；MACOP-B：甲氨蝶呤+亚德里亚霉素+环磷酰胺+长春新碱+固定剂量的***+博来霉素+甲酰四氢叶酸；或者ProMACE CytaBOM：***+亚德里亚霉素+环磷酰胺+依托泊苷+阿糖胞苷+博来霉素+长春新碱+甲氨蝶呤+甲酰四氢叶酸。 
(v)生长因子功能的抑制剂，例如这种抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体(例如抗erbB2抗体曲妥单抗[HerceptinTM]、抗EGFR抗体 帕尼单抗、抗erbB1抗体西妥昔单抗[Erbitux，C225]以及Stern et al.Critical reviews in oncology/haematology，2005，Vol.54，pp 11-29所公开的任何生长因子或生长因子受体抗体)；这种抑制剂还包括酪氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，ZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(埃罗替尼，OSI-774)以及6-丙烯氨基N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉-4-胺(CI 1033)；erbB2酪氨酸激酶抑制剂，如拉帕替尼；肝细胞生长因子家族的抑制剂；血小板衍生的生长因子家族的抑制剂，如伊马替尼；丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如Ras/Raf信号传导抑制剂，如法呢基转移酶抑制剂，如索拉非尼(BAY 43-9006))；通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号传导的抑制剂；肝细胞生长因子家族的抑制剂；c-kit抑制剂；ab1激酶抑制剂；IGF受体(***)激酶抑制剂；aurora激酶抑制剂(例如AZD1152，PH739358，VX-680，MLN8054，R763，MP235，MP529，VX-528和AX39459)；细胞周期依赖的激酶抑制剂，例如CDK2和/或CDK4抑制剂；以及存活信号传导蛋白质的抑制剂，例如Bcl-1、Bcl-XL(如ABT-737)； 
(vi)抗血管增生的试剂，例如抑制血管内皮生长因子的作用的那些[例如抗血管内皮细胞生长因子的抗体贝伐单抗(AvastinTM)；苹果酸舒尼替尼(SutentTM)；索拉非尼(NexavarTM)以及VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，例如4-(4-溴-2-氟苯氨基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474；WO 01/32651的实施例2)；4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171；WO 00/47212的实施例240)；瓦他拉尼碱(PTK787；WO 98/35985)；SU11248(舒尼替尼；WO 01/60814)；化合物，如在国际专利申请WO97/22596，WO 97/30035，WO 97/32856，WO 98/13354，WO00/47212和WO01/32651中所公开的那些；以及通过其他机制工作的化合物(例如利诺胺、干扰素αvβ3功能的抑制剂以及血管增生抑制素)]或集落刺激因子1(CSF1)或CSF1受体； 
(vii)血管破坏试剂，例如考布他汀A4以及在国际专利中请WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434以及WO 02/08213中公开的化合物； 
(viii)反义疗法，例如定向于上文所列的靶物的那些，例如G-3139(Genasense)，抗bcl2的反义疗法； 
(ix)基因疗法，包括例如替代畸变基因的方法，例如畸变p53或畸变BRCA1或BRCA2、GDEPT(基因定向酶前体药品疗法)；使用了胞核嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些方法；以及增加患者对化疗或放疗的耐受性的疗法，例如多药品抗性基因疗法；以及 
(x)免疫疗法，包括例如使用阿仑单抗(campath-1HTM，其为定位于CD52的单克隆抗体)的治疗或者使用定位于CD22的抗体的治疗；增加患者肿瘤细胞的免疫原性的体外和体内方法；使用诸如白细胞介素2、白细胞介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子之类的细胞因子进行的转染；降低T细胞无效能的方法，例如使用单克隆抗体抑制CTLA-4的功能的治疗；使用转染的免疫细胞(例如细胞因子转染的支状细胞)的方法；使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法以及使用抗独特型抗体的方法。 
(xi)蛋白质降解的抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂，如Velcade(硼替佐米)。 
(xii)生物治疗的治疗方法，例如使用了肽或蛋白质(例如抗体或可溶性外部受体结构域的构建体)的那些，其中肽或蛋白质隔断了受体与配体(阻断配体与受体的结合)或者降低受体的信号传导(例如由于受体降解的增强或者表达水平的降低)。 
在一个实施方案中，本文所定义的抗肿瘤治疗除了本发明的化合物以外，还涉及使用其他抗增殖/抗赘生药品及其结合物的治疗，如在医学肿瘤学中使用的那些，例如烷化剂(例如顺铂、奥沙利铂、卡波铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、替膜唑胺和亚硝基脲)；抗代谢物(例如2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷和抗叶酸素(如氟嘧啶，如5-氟尿嘧啶和喃氟啶)、雷替曲塞、甲氨蝶呤、胞核嘧啶、***糖苷以及羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类抗生素，如阿霉素、博来霉素、亚德里亚霉素、道诺霉素、表柔比星、去甲氧正定霉素、丝裂霉素C、放线菌素和光神霉素)；抗有丝***剂(例如长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、去乙酰长春酰胺和长春瑞滨；紫杉烷，如紫杉醇和泰素帝；以及polokinase抑制剂)；以及拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(如依托泊苷和替尼泊苷)、安吖啶、 托泊替康和喜树碱)。 
在一个实施方案中，本文所定义的抗肿瘤治疗除了本发明的化合物外，还涉及2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷的治疗。 
通过同时、依次或间隔定量给药所述治疗的单个成分可以取得所述的结合治疗。这种结合产品使用了本发明的化合物或其剂量范围如上文所述的可药用的盐，以及其剂量范围被认可的其他药物活性试剂。 
实施例
提供以下实施例(包括所实施的试验以及所取得的结果)仅是为了说明的目的，不能解释为通过本文的教导进行了限定。 
实施例1 
免疫和效价 
细胞和转染
小鼠前B细胞系B300-19培养在RPMI 1640培养基中，其含有10％胎牛血清，50μM 2-巯基乙醇，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。HEK 293F细胞生长在DMEM/F12(50/50混合物)培养基中，其补充有10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，50μM BME，100单位青霉素-g/ml，100单位MCG链霉素/ml。根据生产商的说明，使用LipofectAMINE 2000试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)将人CD105表达质粒转染到HEK 293F或B300.19细胞中。转染进行48小时，然后使用1mg/ml G418(Invitrogen，Carlsbad，CA)选择两星期。稳定的G418耐性克隆用初次小鼠抗-人CD105单克隆抗体染色，并通过FACS进行分析。B300.19稳定的转染子用于免疫，而HEK293F稳定的转染子用于筛选。 
免疫
使用重组可溶性CD105(R&D Systems，Catalog Number：1097-EN-025/CF)或稳定转染的B300.19细胞表达人CD105来进行免疫。 
为了使用重组可溶性CD105进行免疫，使用XenoMouseTM strains  XM3B3L3:IgG1KL和XM3C1L3:IgG4KL对10μg可溶性蛋白/小鼠进行依次免疫，然后对5μg/小鼠进行加强免疫。对于使用B300.19转染子细胞稳定地表达人CD105进行免疫，单克隆抗体通过顺序免疫XenoMouseTM strains XM3C1L3:IgG4KL和XMG2L3:IgG2KL来显色。对于所有注射，XenoMouse动物通过足垫途径经过常规方式来免疫。各注射的总体积为50μl/小鼠，25μl/足垫。 
根据下列文献中公开的方法来进行免疫：于1996年12月3日提交的美国专利申请序列No.08/759,620、以及于1998变6月11日提交的国际专利申请No.WO 98/24893和于2000年12月21日提交的WO 00/76310，公开内容通过引用的方式并入本文。免疫程序概括于表3中。 
通过效价选择收获动物
使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)通过用于天然抗原结合的FACS染色来测试抗体针对人CD105的效价。在免疫程序结束时，借助于实施例2中所述的电穿孔，使用从免疫小鼠的脾脏和***中分离的小鼠骨髓瘤细胞和淋巴细胞来进行融合。 
表3：免疫程序概述 
Figure BPA00001373578600891
“IP”是指“腹膜内” 
“BIP”是指“尾巴/腹膜内的基础” 
实施例2 
淋巴细胞的回收、B细胞的分离以及杂交瘤细胞的融合和生成 
通过颈椎脱臼法处死免疫小鼠，收获引流***，并将各组(cohort) 汇集起来。该过程实施了四次获取。 
通过在DMEM中研磨以便从所述的组织中释放所述的细胞来离解淋巴细胞，并将所述的细胞悬浮在DMEM中。计数所述的细胞，并将0.9mlDMEM/100百万淋巴细胞加入到细胞球中，从而使细胞温和且完整地重新悬浮。使用100μl CD90+磁珠/100百万细胞，通过在4℃下与磁珠温育15分钟来标记所述的细胞。将包含最多108个(或者总细胞个数最多2X109)阳性细胞的磁性标记细胞悬浮溶液加载到LS+柱上，并用DMEM洗涤该柱。收集总的流出液作为CD90的阴性部分(预计这些细胞的大部分为B细胞)。 
通过将经过洗涤并富集的第6天的B细胞与得自ATCC，编号# CRL 1580(Kearney et al，J.Immunol.123，1979，1548-1550)的非分泌性骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞以1∶4的比例相混合来进行融合。通过在400Xg下离心4分钟使得所述的细胞混合物通常形成球状。在倒出上清液之后，使用1ml的吸管温和地进行混合。缓慢加入预热的PEG(1ml/106个B细胞)并温和搅拌1分钟，然后混合1分钟。然后，在2分钟内加入预热的IDMEM(2ml/106个B细胞)，并温和搅拌。最后，在3分钟内加入预热的IDMEM(8ml/106个B细胞)。 
将融合细胞在400Xg下旋转离心6分钟，并且每106个B细胞悬浮于20ml选择培养基[DMEM(Invitrogen)，15％的FBS(Hyclone)，补充有L-谷氨酸、青霉素/链霉素、MEM非必需氨基酸、丙酮酸钠、2-巯基乙醇(均得自Invitrogen)，HA-重氮丝氨酸次黄嘌呤和OPI(草酰乙酸盐、丙酮酸盐和牛胰岛素)(均得自Sigma)，以及IL-6(Boehringer Mannheim)]中。将细胞在37℃下温育20-30分钟，然后悬浮于200ml的选择培养基中，并在T175的烧瓶中培养3-4天。 
在融合后3天时，收集所述的细胞，在400xg旋转离心8分钟，并且每106个融合B细胞再次悬浮于10ml选择培养基中。对杂交瘤细胞的群体进行FACS分析，然后将该细胞冷冻。 
杂交瘤细胞以常规方式在选择培养基中生长。将全部的上清液(得自潜在地产生抗人源CD105抗体的杂交瘤细胞)经历随后的筛查测试。 
实施例3 
通过FMAT和FACS选择候选抗体 
在培养14天后，通过微量荧光检测技术(FMAT)来筛选杂交瘤上清液的CD105-特异性抗体。针对HEK293F转染子细胞稳定表达人CD105筛选杂交瘤上清液，并且针对亲本HEK293F细胞进行反向筛选。 
除去来自CD105-阳性杂交瘤细胞的培养上清液(基于初次筛选)，并且将CD105阳性杂交瘤细胞用新鲜杂交瘤培养基悬浮，并且转移至24孔板。在培养基中2天后，这些上清液在次级确认筛选中进行评价。在次级确认筛选中，之前鉴定阳性的细胞利用两组或三组单独使用的检测抗体在HUVEC细胞上通过FMAT和/或FACS进行筛选：对于人gamma链检测，1.25ug/ml GAH-Gamma Cy5(JIR#109-176-098)；对于人kappa轻链检测，1.25ug/ml GAH-Kappa PE(S.B.#2063-09)，对于人lambda轻链检测，1.25ug/ml GAH-lambda PE(S.B.#2073-09)，从而证实抗-CD105抗体是完全人源的。 
如通过FMAT使用HEK293F转染子细胞稳定表达人CD105所确定的，从第一活动中鉴定总共824个全人源抗-CD105抗体。对于次级免疫活动，如通过FMAT使用HEK293F转染子细胞稳定表达人CD105所确定的，产生总共788个全人源抗-CD105抗体。对于两种活动，抗体随后在HUVEC细胞上通过FMAT和/或FACS进行筛选，并且评价和食蟹猴与鼠CD105直向同源物的交叉反应性。衍生自直向同源猴和小鼠的CD105被克隆并表达在HEK293F细胞的表面上以用于交叉反应性研究。表现出对食蟹猴和小鼠具有交叉反应性的抗体继续进行并进一步在功能测定中评价。 
表4.全人源CD105特异性单克隆抗体. 
Figure BPA00001373578600911
实施例4 
抗-增殖活性 
为了筛选和鉴定在HUVEC细胞系中表现出抗增殖活性的抗体系，进行Alamar Blue测定。简言之，HUVEC细胞得自Cambrex Corp.并保持在EGM2培养基中，其补充有0.5％FBS。在96孔板中以1000细胞/孔(90μl/孔)的浓度接种细胞。将细胞在37℃和5％CO2下孵育72小时。72小时后终止反应，加入抗体并进行Alamar Blue测定。将细胞用浓度为50μg/ml的抗体进行处理。处理样品的存活百分率的测定基于使对照样品(即未处理)归一化至100％可行性。 
分析揭示出大部分抗-CD105抗体杂交瘤系不表现出抗增殖活性。如图1中所示，来自活动1，鉴定两种杂交瘤，表示为4.120和4.37，在50μg/ml的浓度下表现出细胞增殖的显著抑制。 
从活动2，8种另外的细胞系被鉴定并在增殖测定中进行测试。如图2和表5所示，细胞增殖抑制率的范围为8％至20％。 
表5 
Figure BPA00001373578600921
实施例5 
SMAD2磷酸化测定 
为了确定是否抗-CD105抗体介导Smad2磷酸化的增加，进行Smad2磷酸化测定。简言之，将90,000HUVEC细胞接种在6孔板上。将细胞在EGM2培养基中培养，其补充有0.5％FBS。将细胞用浓度增加的抗体(0.5，1.0和2.0μg/ml)处理24小时，然后进行Western印迹分析。磷酸-Smad2 的检测使用pSmad2特异性抗体(Cell Signaling Cat #3101)来进行。使用特异性特异性抗体(Cell Signaling Cat #3102)检测全部Smad2水平。结果显示，抗体4.37介导Smad2磷酸化的剂量依赖性抑制。这些发现证实4.120，4D4，6B10，6A6和9H10也是如此。重要的是注意，已经报道Smad2磷酸化以抑制内皮细胞增殖和转移(Goumans M-J et al.，EMBO J 2002；21：1743-1753)。 
实施例6 
CD105抑制抗体减少体外管的形成 
测试CD105抑制抗体在体外共培养测定中减小内皮细胞管的形成的能力(TCS Cell Works Cat no.ZHA-1000)。在第1天，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人二倍体成纤维细胞在24孔板中获得为共培养物。CD105阻断抗体在第1天引入培养基中，并且在11天内以50μg/mL的抗体浓度的规则间隔。培养基在第4，7和9天补充。共培养模型保持在TCS优化的培养基(供应共培养测定)或MCDB131培养基(补充2％胎牛血清(FCS)，1％谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素)中(下文中称为2％FS MCDB131培养基)。共培养模型保持在37℃、湿润的5％CO2/95％空气气氛中。 
在第11天进行管的形成，然后固定并根据生产商的说明使用小管染色试剂盒(TCS Cell Works Cat no.ZHA-1225)来进行对小管CD31的染色。简言之，细胞用冰冷的70％乙醇在室温(RT)下固定30分钟。当细胞被抗-人CD31在RT下处理60分钟后，细胞被阻断。将板洗涤，并且用缀合碱性磷酸酶(AP)的山羊抗-小鼠IgG在RT下处理60分钟。在和AP-缀合的次级抗体孵育后，见板洗涤并加入5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/氮蓝四唑(BCIP/NBT)底物约10分钟。在10分钟内暗紫色的显色反映管的形成。随后将板洗涤并放置风干。 
管生长的定量通过全细胞图像分析法使用Zeiss KS400 3.0图像分析仪来进行。在定量方法学中测定的形态学参数是总管的长度。在各24孔内所有管的形成都被测量，除了100μm深度的边缘以避免边缘收缩的人工制品。 
如图3中所示，mAb 6B10体外有效地抑制内皮细胞管的形成。相对于同种型对照，该抗体抑制血管长度约24％，并抑制分叉数量47％。数据显示该抗体在模拟生成血管过程的功能测定中是有效的。 
实施例7 
肌动蛋白调制测定 
为了确定是否来自活动1和2的抗-CD105抗体组影响人内皮细胞的细胞支架结构，进行肌动蛋白调制测定。简言之，将HUVEC细胞接种到4-孔腔式载玻片中(40,000细胞/孔)，并保持在补充有0.5％FBS的EGM2培养基中。抗-CD105抗体和HUVEC细胞在30μg/ml的抗体浓度下孵育72小时。在抗体孵育后，将细胞用4％甲醛固定10分钟，然后用0.5％Triton X-100透化10分钟。在透化后，将细胞在室温下用Alexa Fluor 488毒伞素(Phalloidin，Molecular Probes，#A12379)染色30分钟。将细胞用PBS洗涤，然后染色和使用聚焦显微镜进行检查。单克隆抗体10C9，3C1，6B1，4.120，4.37和6B10在HUVEC细胞中介导肌动蛋白细胞支架结构的显著调制。 
实施例8 
和抗体sn6(HUVEC)相比，xenomouse单克隆抗-CD105抗体的抗原决定部位结合 
在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上进行FACS-基结合分析以确定是否xenomouse抗体的组交叉竞争市售SN6抗体。Seon实验室首先产生SN6抗体；该抗体是mAbs的组中的一种，表示为SN6系列，其报道以剂量依赖性方式抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的生长(She X et al.，Int.J.Cancer，2004，108：251-7)。 
简言之，使用用FITC荧光标记的SN6抗体(Abcam)来对HUVEC细胞进行滴定。用于结合的EC50浓度确定为2μg/ml。随后，HUVEC细胞和未标记的xenomouse抗-CD105mAbs的滴定物孵育，洗涤，然后用2μg/ml的SN6抗体孵育。如图4中所示，SN6抗体的结合百分率表示在存在50μg/ml的未标记xenomouse mAbs的条件下。 
惊奇地，抗体6A6和6B10证实SN6结合的显著抑制，从而表明这些mAbs竞争相同抗原决定部位。其他抗体部分竞争SN6，这表明部分或重叠抗原决定部位。抗体4D4和10C9显示出较弱阻断，从而暗示这些mAbs可能并不和SN6抗体享有相同的抗原决定部分。同样重要的是，这些结果表明，该xenomouse抗-CD105抗体和SN6抗体享有相同的抗原决定部分。同样重要的是，这些结果表明，该组的xenomouse显示出宽的抗原决定部分特异性。 
实施例9 
在cd105ki/ko小鼠中的Colo205基质胶塞测定 
为了检查xenomouse mAbs的体内活性，进行基质胶塞测定。由于缺少抗-CD105抗体的小鼠的交叉反应性，该研究在CD105 KI/KO-SCID动物中进行。 
简言之，将混合matrigelTM的五百万Colo205肿瘤细胞移植到CD105 KI/KO-SCID小鼠中。小鼠在10mpk的抗体剂量下i.p.使小鼠接受每周两次的抗体处理。在第8天分离塞并通过IHC和血红蛋白含量来分析CD31表达。IHC染色使用抗-CD31抗体(BD，Cat 550274)来进行。将样品在锌固定剂中固定，并嵌入石蜡块中。使用Ventana automation将组织切片使用CD31抗体来染色。使用Aperio成像***来扫描图像。IHC-阳性染色使用Aperio颜色卷积成像软件来进行分析。 
对于血红蛋白含量，基于塞的重量(5.0ml/g)，将去离子水加入基质胶样品管中。然后基质胶样品使用Polytron匀浆机来匀化。随后将样品以3700rpm离心10min。使250uL等分上清液混合等体积的2x Drabkin’s溶液。将混合物涡旋并再次离心。将200uL的等分该混合物置于96孔板中以用于分析。在540nm处测定吸光度。平行地，使用在1x Drabkin’s溶液中的血红蛋白标准品来进行标准曲线稀释。从标准曲线来确定样品浓度。 
如图5中所示，该研究的结果证实mAbs 4D4，6B10，4.120和4.37介导血红蛋白含量降低。抗体6B10和4.37还介导CD31染色的降低(图6)，这表示这些抗体在体内显示出抗血管原活性。 
实施例10 
CD105抗体的结构分析 
抗体的可变重链和可变轻链被测序以确定它们的DNA序列。抗-CD105抗体的全部序列信息提供具有用于各gamma和kappa链组合的核苷酸和氨基酸序列的序列表中。可变重链序列被分析以确定VH家族、D-区域序列和J-区域序列。然后，所述序列被翻译以确定初级氨基酸序列，并比较种系VH、D和J-区域序列以评价体细胞高度突变。 
表2是这样的表，其比较抗体重链区域和它们的同源种系重链区域，以及比较抗体kappa轻链区域和它们的同源种系轻链区域。还应该意识到，如果特定抗体在氨基酸水平上不同于其各自的种系序列，抗体序列可突变回到种系序列。这些矫正突变可使用标准的分子生物学技术发生在1、2、3或更多个位置或任何突变位置的组合。通过非限制性例子的方式，表5示出了4.37的重链序列(SEQ ID NO.：26)，其通过位31的D至S(突变1)和位102的F至Y(突变2)而不同于相应的种系序列(参见表2)。因此，编码4.37的重链的氨基酸或核苷酸序列可在所有这些位点中的任一个进行修饰。下面表5-9示出从4.37，6B10，4.120的种系的这些变化的位置。各行表示种系和非种系残基在由粗体表示的位置的独特组合。 
在另一个实施方案中，本发明包括取代序列中的任何的结构文库，所述序列可能影响本发明的抗体的异源性。这些文库包括糖基化位点、未配对的半胱氨酸、表面暴露的蛋氨酸等。为了减少这种异源性的风险，建议进行改变以除去这些结构文库中的一个或多个。 
“优化的”序列本文中是指公开在表2中的抗体序列，所述序列已经突变使得非种系序列在一个或多个残基处突变回到种系序列，并且可进一步被修饰以从序列例如糖基化位点中除去结构文库。 
在本发明的一些实施方案中，靶向结合剂或抗体包含具有SEQ ID NO.：26的序列。在某些实施方案中，SEQ ID NO.：26包含由表5的各行表示的种系和非种系残基的组合中的任一种。在一些实施方案中，SEQ ID NO：26包含由表5中表示的种系残基中的任一个、任两个或所有两个。在某些实施方案中，SEQ ID NO.：26包含由表5的各行表示的种系和非种系残基的独特组合中的任一个。在其他实施方案中，靶向结合剂或抗体衍生自具有VH3-33，D6-13和JH6结构域的种系序列，其中一个或多个残基突变以在 该位置产生相应的种系残基。 
表6：在表示的残基号4.37重链(SEQ ID NO：26)示例性突变至种系 
  31   102
  D   F
  S   F
  D   Y
  S   Y
在本发明的一些实施方案中，靶向结合剂或抗体包含具有SEQ ID NO.：28的序列。在某些实施方案中，SEQ ID NO.：28包含由表6的各行表示的种系和非种系残基的组合中的任一种。在一些实施方案中，SEQ ID NO：28包含由表6中表示的种系残基中的任一个、任两个、所有两个、任三个或所有三个。在某些实施方案中，SEQ ID NO.：28包含由表6的各行表示的种系和非种系残基的独特组合中的任一个。在其他实施方案中，靶向结合剂或抗体衍生自具有VK A3/A19和JK3结构域的种系序列，其中一个或多个残基突变以在该位置产生相应的种系残基。
表7：在表示的残基号4.37轻链(SEQ ID NO：28)示例性突变至种系 
  31   90   95
  Y   L   R
  H   L   R
  Y   V   R
  H   V   R
  Y   L   Q
[0456] 
 H  L  Q
 Y  V  Q
 H  V  Q
在本发明的一些实施方案中，靶向结合剂或抗体包含具有SEQ ID NO.：30的序列。在某些实施方案中，SEQ ID NO.：30包含由表7的各行表示的种系和非种系残基的组合中的任一种。在一些实施方案中，SEQ ID NO：30包含由表7中表示的种系残基中的任一个、任两个、任三个、任四个、任五个、任六个、任七个或所有七个。在某些实施方案中，SEQ ID NO.：30包含由表7的各行表示的种系和非种系残基的独特组合中的任一个。在其他实施方案中，靶向结合剂或抗体衍生自具有VH3-30*01，D3-10和JH4结构域的种系序列，其中一个或多个残基突变以在该位置产生相应的种系残基。
表8：在表示的残基号6B10重链(SEQ ID NO：30)示例性突变至种系 
  2   23   31   34   49   57   109
  E   T   N   I   T   K   Y
  V   T   N   I   T   K   Y
  E   A   N   I   T   K   Y
  V   A   N   I   T   K   Y
  E   T   S   I   T   K   Y
  V   T   S   I   T   K   Y
  E   A   S   I   T   K   Y
  V   A   S   I   T   K   Y
  E   T   N   M   T   K   Y
  V   T   N   M   T   K   Y
  E   A   N   M   T   K   Y
  V   A   N   M   T   K   Y
  E   T   S   M   T   K   Y
  V   T   S   M   T   K   Y
  E   A   S   M   T   K   Y
  V   A   S   M   T   K   Y
  E   T   N   I   A   K   Y
[0460] 
  V   T   N   I   A   K   Y
  E   A   N   I   A   K   Y
  V   A   N   I   A   K   Y
  E   T   S   I   A   K   Y
  V   T   S   I   A   K   Y
  E   A   S   I   A   K   Y
  V   A   S   I   A   K   Y
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  V   T   S   M   A   K   Y
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  E   A   N   I   T   N   Y
  V   A   N   I   T   N   Y
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  V   A   S   I   T   N   Y
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  V   T   N   M   T   N   Y
  E   A   N   M   T   N   Y
  V   A   N   M   T   N   Y
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  V   T   S   M   T   N   Y
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[0461] 
  E   A   N   M   A   N   Y
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  E   A   N   I   T   N   H
[0462] 
  V   A   N   I   T   N   H
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  E   A   N   M   T   K   Y
  V   A   N   M   T   K   Y
[0463] 
  E   T   S   M   T   K   Y
  V   T   S   M   T   K   Y
  E   A   S   M   T   K   Y
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[0464] 
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[0465] 
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  V   T   S   I   T   K   Y
  E   A   S   I   T   K   Y
[0466] 
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[0467] 
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[0468] 
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在本发明的一些实施方案中，靶向结合剂或抗体包含具有SEQ ID NO.： 32的序列。在某些实施方案中，SEQ ID NO.：32包含由表8的各行表示的种系和非种系残基的组合中的任一种。在一些实施方案中，SEQ ID NO：32包含由表8中表示的种系残基中的任一个、任两个、任三个、任四个、任五个、任六个、任七个、任八个、任九个、或所有九个。在某些实施方案中，SEQ ID NO.：32包含由表8的各行表示的种系和非种系残基的独特组合中的任一个。在其他实施方案中，靶向结合剂或抗体衍生自具有Vk，Vk08/018和JK4结构域的种系序列，其中一个或多个残基突变以在该位置产生相应的种系残基。
表9：在表示的残基号6B10轻链(SEQ ID NO：32)示例性突变至种系 
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在本发明的一些实施方案中，靶向结合剂或抗体包含具有SEQ ID NO.：2的序列。在某些实施方案中，SEQ ID NO.：2包含由表9的各行表示的种系和非种系残基的组合中的任一种。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2包含由表9中表示的种系残基中的任一个、任两个、任三个、任四个、任五个、任六个、或所有六个。在某些实施方案中，SEQ ID NO.：2包含由表9的各行表示的种系和非种系残基的独特组合中的任一个。在其他实施方案中，靶向结合剂或抗体衍生自具有VH4-59，D5-12，JH4结构域的种系序列，其中一个或多个残基突变以在该位置产生相应的种系残基。 
表10：在表示的残基号4.120重链(SEQ ID NO：2)示例性突变至种系 
Figure BPA00001373578601202
Figure BPA00001373578601211
Figure BPA00001373578601221
本领域技术人员将知道有可选择的方法来限定CDR边界。表2a中的VH CDR1的起始残基已经根据Scaviner D，Barbie V，Ruiz M，Lefranc M-P.Protein Displays of the Human Immunoglobulin Heavy，Kappa and Lambda Variable and Joining Regions.Exp Clin Immunogenet 1999，16：234-240中所述的方法来限定。表2中残留CDR边界根据Kabat定义来限定。 
表2中的所有CDR边界根据Kabat定义来限定。 
实施例11 
FACS KD测定 
抗-CD105抗体的亲和性通过FACS来测定。简言之，HUVEC细胞表达CD105以约5百万细胞/mL的浓度重新悬浮在FACS缓冲液(2％FBS，0.05％NaN3)中。细胞保持在冰上。纯化的抗体以过滤的1xPBS(2x)穿过96-孔板中的11个孔来连续稀释。各行中的第12个孔只含缓冲液。细胞和1xPBS加入各mAb孔，使得最终体积为30μL/孔，并且各孔含有约100,000 细胞。将板在4℃下放置在板振摇器上3小时，然后旋转并用PBS洗涤3次。荧光染料标记的二次山羊α-人多克隆抗体以200μL体积加入各孔中。然后将板在4℃下孵育40分钟，然后旋转并用PBS洗涤3次。 
各mAb浓度的10,000细胞的几何平均荧光数(GMF)使用FACSCalibur仪器来确定。GMF作为分子mAb的浓度的函数的非线性图使用下列等式利用Scientist软件来拟合： 
F = P ′ · ( K D + L T + 1 ) - ( ( K D + L T + 1 ) ) 2 - 4 ( L T ) 2
在上式中，F＝几何平均荧光数，LT＝总分子mAb浓度，P’＝涉及结合mAb的任意荧光单位的比例常数，以及KD＝平衡解离常数。对于各mAb，估计用于KD的值获得为P’，并且KD被允许在非线性分析中自由地浮动。下表列出各mAb的所得KD。 
  mAb   KD(pM)
  4D4.1   622.2
  3C1.1   871.5
  6A6.2   ＜1150
  6B1.1   2300
  6B10.1   ＜149.06
  9H10.2   ＜583.75
  10C9.2   ＜748.01
  11H2.1   337.7
  4.12   770.1
  4.37κ   ＜716.79
[0498] 实施例12 
CD105抗体的ADCC和CDC活性 
(1)ADCC测定
使用RosetteSep 
Figure BPA00001373578601241
Human NK cell enrichment cocktail和方案(StemCell Technologies Inc.，Vancouver，BC来进行从PMBC的NK的富集。简言之，来自供体的全血收集在肝素化或EDTA涂覆的管中，并且根据RosetteSep 
Figure BPA00001373578601242
方案，和2.25ml的RosetteSep 
Figure BPA00001373578601243
Human NK Cell Enrichment cocktail(StemCell Technologies Inc.，Vancouver，BC)在室温下孵育20分钟。然后样品使用相同体积的PBS来稀释，所述PBS含有2％FBS和30mL血液混合物，其在15mL Ficoll(Amersham Biosciences)锥形管内分层。管以2150rpm在室温下离心30分钟，并且界面层转移至干净50ml锥形管中。加入含有2％FBS的PBS，然后在1200rpm离心10分钟。抛弃上清液，沉淀重新悬浮在1ml PBS中并且储存在冰上。使用血球计来对细胞进行计数，并且测定NK受体在每毫升溶液中的浓度。 
钙黄绿素-AM是钙黄绿素的细胞可透视形式。当钙黄绿素-AM渗透到细胞质中时，其通过细胞中的酯酶水解为保留在细胞内部的钙黄绿素。使用的可变测量是可靠的，并且和标准51Cr-释放测定非常关联。简言之，靶细胞(HUVEC细胞)被收获并以1x106细胞/ml收获并重新悬浮在培养基中。钙黄绿素-AM(Sigma C1359)加入至最终浓度为10μM(在2mL细胞内孔的5μl)。细胞在37℃下孵育45分钟。然后细胞以1200RPM旋转10分钟，丢弃上清液，沉淀重新悬浮在新鲜生长培养基(2x)中。所述沉淀重新悬浮至10,000细胞/75μl的生长介质。靶细胞以75μl(10,000细胞/孔)接种在圆底烧瓶。然后抗体以10μg/ml在培养基中以50μl孔稀释加入靶细胞，并且使其在室温下孵育30分钟。孵育后，75μl的效应子细胞已经以100,000细胞/孔加入，并且允许在37℃孵育4小时。在接种后，将板以1200RPM旋转5分钟。将上清液(100μL)转移到平坦、黑色、清澈圆底板(Costar，cat.no.3603)并且测量一些荧光数。洋地黄皂苷用作阳性对照以测量最大钙黄 绿素释放。 
数据(示于图7)表示所有10个mAbs曲线都显示出ADCC活性，其中mAbs 4D4，9H10和6B10显示出最高水平的溶胞活性。 
(2)CDC测定
由于CD105的表达已经记录在白血病细胞中(Haruta，Y.et al，1986，PNAS，83：7898-7902)，我们制得抗-CD105mAbs对于穿过数个白血病细胞系的互补活性的曲线。简言之，白血病细胞系(KG1，REH，KG1a，U937)以100,000细胞/孔接种到Costar 96孔平坦圆底板(Corning Inc.Life Sciences，Lowell，MA)。10种抗-CD105 mAb(10μg/ml)加入组织培养基中，并且使其在室温下孵育10分钟。正常人血清以10至50％之间的浓度加入，并且使用生长培养基来稀释。血清允许在37℃孵育1小时。将CellTiter Glo试剂(Promega Corp.，Madison，WI)加入细胞中，并且在室温下以黑暗和可读的方式按照方案说明来孵育10分钟。数据(图8)表示仅mAb 4.120穿过所有检查的白血病细胞系引诱互补活性。 
实施例13 
CD105抗体的抗体内在化 
进行抗体内在化研究以确定是否抗-CD105mAbs可以诱导CD105在HUVEC细胞中的内在化。进行下列内在化测定。HUVEC细胞以300,000细胞/反应等分，并且和10μg/ml的各抗-CD105mAbs的在4℃下孵育1小时。细胞用FACS缓冲液(2％FCS，在PBS中)洗涤两次，随后在4℃在FACS缓冲液中和缀合FITC的5μg/ml山羊Fab抗-人(重链+轻链)次级抗体孵育45分钟。然后HUVEC细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤。两管各个样品在4℃孵育1小时，一管在37℃下孵育，之后细胞用200μL FACS缓冲液洗涤一次。然后，100μL的200mM Tris(2-羧基以及)膦盐酸盐(TCEP)在4℃下加入一个样品中，在37℃下加入另一样，并且样品在4℃孵育30分钟。最后，细胞使用FACS缓冲液洗涤一次，并且通过流式细胞术来读取。内在化百分率从下式的几何平均数来确定：内在化百分率＝((37℃ +TCEP)-(4℃+TCEP))/((4℃-TCEP)-(4℃+TCEP))x[100]。 
结果表示，所有抗-CD105mAbs介导内在化，并且约25至30％的细胞表面抗体通过其和CD105在一小时内的相互作用而内在化(参见图9)。快速内在化1C1抗体用作阳性对照(Jackson，D.et al.，2008，Cancer Res.，68：9367-74)。结果表示约40％的细胞表面抗体用1C1抗体内在化。 
因此，这些数据暗示上述抗-CD105mAbs可以是用于递送毒素至细胞表达CD105抗原的免疫缀合物的有效药剂。 
引用并入 
本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、书籍等，以及其中所引用的参考文献，在尚未的情况下在此均以引用方式全文并入本文。 
同等原则 
认为之前所写的说明书足以使本领域的技术人员实施本发明。之前的说明书和实施例详细描述了本发明某些优选的实施方案，并且描述了本发明人认为的最佳模式。但是，应该意识到，无论文中之前的描述看起来有多详细，都可以以多种方式实施本发明，并且应该根据所附的权利要求书及其等价形式来解释本发明。 
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Claims (38)

1.一种与CD105特异性结合的经分离的抗体，其中所述的抗体表现出一种或多种以下所述的性质，包括：
以小于1nM的KD与人源CD105相结合；
使HUVEC细胞的细胞增殖的抑制大于5％；
增强SMAD2磷酸化；
表现为抗血管原活性；以及
表现为ADCC活性。
2.根据权利要求1所述的经分离的抗体，其中所述的抗体抑制哺乳动物中肿瘤的生长和/或转移。
3.根据之前权利要求中的任意一项所述的经分离的抗体，其中所述的抗体以低于500pM的KD与CD105相结合。
4.根据之前权利要求中的任意一项所述的经分离的抗体，其中所述的抗体为抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1，或6A6中的任意一者。
5.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述的抗体为单克隆抗体4.120。
6.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述的抗体为单克隆抗体4.37。
7.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述的抗体为单克隆抗体6B10。
8.根据权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述的抗体为单克隆抗体4D4.1。
9.根据之前权利要求中的任意一项所述的经分离的抗体，其中所述的抗体包含SEQ ID NO.：26序列，其中SEQ ID NO.：26包含表6的各行所示的种系残基和非种系残基的独特组合中的任意一者。
10.根据之前权利要求中的任意一项所述的经分离的抗体，其中所述的抗体包含SEQ ID NO.：28序列，并且其中SEQ ID NO.：28包含表7的各行所示的种系残基和非种系残基的独特组合中的任意一者。
11.根据之前权利要求中的任意一项所述的经分离的抗体，其中所述的抗体包含SEQ ID NO.：30序列，其中SEQ ID NO.：30包含表8的各行所示的种系残基和非种系残基的独特组合中的任意一者。
12.根据之前权利要求中的任意一项所述的经分离的抗体，其中所述的抗体包含SEQ ID NO.：32序列，其中SEQ ID NO.：32包含表9的各行所示的种系残基和非种系残基的独特组合中的任意一者。
13.一种全人源单克隆抗体，其与下列抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1或6A6中任意一者竞争结合CD105。
14.一种全人源单克隆抗体，其与以下抗体中的任意一者结合CD105上的相同的抗原决定部位，其中所述的抗体为抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1或6A6。
15.一种包含氨基酸序列的经分离的抗体，其中所述的氨基酸序列包含：
a)如表2中所示的CDR3序列；
b)如表2中所示的CDR1、CDR2或CDR3序列中的任何一者；
c)如表2中所示的可变轻链序列的CDR1、CDR2或CDR3序列；或者
d)如表2中所示的可变重链序列的CDR1、CDR2或CDR3序列。
16.一种抗体，其免疫特异性地结合CD105并包含：
(a)SEQ ID NO：2的VH CDR1，其具有与SEQ ID NO：2的VH CDR1相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：2的VH CDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；
(b)SEQ ID NO：2的VH CDR2，其具有与SEQ ID NO：2的VH CDR2相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：2的VH CDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；
(c)SEQ ID NO：2的VH CDR3，其具有与SEQ ID NO：2的VH CDR3相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：2的VH CDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；
(d)SEQ ID NO：4的VL CDR1，其具有与SEQ ID NO：4的VL CDR1相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：4的VL CDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；
(e)SEQ ID NO：4的VL CDR2，其具有与SEQ ID NO：4的VL CDR2相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：4的VL CDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；以及
(f)SEQ ID NO：4的VL CDR3，其具有与SEQ ID NO：4的VL CDR3相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：4的VL CDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代。
17.根据权利要求16所述的经分离的抗体，其中所述的抗体包含：
(a)SEQ ID NO：2的VH CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)SEQ ID NO：4的VL CDR1、CDR2和CDR3。
18.一种抗体，其免疫特异性地结合CD105并包含：
(a)SEQ ID NO：26的VH CDR1，其具有与SEQ ID NO：26的VH CDR1相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：26的VH CDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；
(b)SEQ ID NO：26的VH CDR2，其具有与SEQ ID NO：26的VH CDR2相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：26的VH CDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；
(c)SEQ ID NO：26的VH CDR3，其具有与SEQ ID NO：26的VH CDR3相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：26的VH CDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；
(d)SEQ ID NO：28的VL CDR1，其具有与SEQ ID NO：28的VL CDR1相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：28的VL CDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；
(e)SEQ ID NO：28的VL CDR2，其具有与SEQ ID NO：28的VL CDR2相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：28的VL CDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；以及
(f)SEQ ID NO：28的VL CDR3，其具有与SEQ ID NO：28的VL CDR3相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：28的VL CDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代。
19.根据权利要求18所述的经分离的抗体，其中所述的试剂包含：
(a)SEQ ID NO：26的VH CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)SEQ ID NO：28的VL CDR1、CDR2和CDR3。
20.一种抗体，其免疫特异性地结合CD105，并且包含与SEQ IDNO：26的氨基酸具有至少90％的一致性的重链可变结构域，以及包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少90％的一致性的轻链可变结构域，其中所述抗体具有结合CD105的活性。
21.一种抗体，其免疫特异性地结合CD105并包含：
(a)SEQ ID NO：30的VH CDR1，其具有与SEQ ID NO：30的VH CDR1相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：30的VH CDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；
(b)SEQ ID NO：30的VH CDR2，其具有与SEQ ID NO：30的VH CDR2相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：30的VH CDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；
(c)SEQ ID NO：30的VH CDR3，其具有与SEQ ID NO：30的VH CDR3相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：30的VH CDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；
(d)SEQ ID NO：32的VL CDR1，其具有与SEQ ID NO：32的VL CDR1相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：32的VL CDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；
(e)SEQ ID NO：32的VL CDR2，其具有与SEQ ID NO：32的VL CDR2相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：32的VL CDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；以及
(f)SEQ ID NO：32的VL CDR3，其具有与SEQ ID NO：32的VL CDR3相同的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：32的VL CDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代。
22.根据权利要求21所述的经分离的抗体，其中所述的抗体包含：
(a)SEQ ID NO：30的VH CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)SEQ ID NO：32的VL CDR1、CDR2和CDR3。
23.一种抗体，其免疫特异性地结合CD105，并且包含与SEQ IDNO：30的氨基酸具有至少90％的一致性的重链可变结构域，以及包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少90％的一致性的轻链可变结构域，其中所述抗体具有结合CD105的活性。
24.根据之前权利要求中的任意一项所述的经分离的抗体，其中所述的抗体为单克隆抗体的结合片段。
25.根据之前权利要求中的任意一项所述的经分离的抗体，其中所述的抗体为全人源单克隆抗体。
26.根据权利要求10所述的经分离的抗体，其中所述的结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和dAb片段。
27.具有氨基酸序列的抗体包含以下序列中的任何一者，其中所述的序列为：
包含由命名为Mab4.120VH的质粒中的多核苷酸所编码的重链CDR中的至少一者、至少二者或者至少三者的可变重链氨基酸序列，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9514；
包含由命名为Mab4.120VL的质粒中的多核苷酸所编码的轻链CDR中的至少一者、至少二者或者至少三者的可变轻链氨基酸序列，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9513；或者
包含由命名为Mab4.120VH的质粒中的多核苷酸所编码的重链CDR中的至少一者、至少二者或者至少三者的可变重链氨基酸序列，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9514；以及包含由命名为Mab4.120VL的质粒中的多核苷酸所编码的轻链CDR中的至少一者、至少二者或者至少三者的可变轻链氨基酸序列，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9513。
28.具有氨基酸序列的抗体包含以下序列中的任何一者，其中所述的序列为：
包含由命名为Mab4.37VH的质粒中的多核苷酸所编码的重链CDR中的至少一者、至少二者或者至少三者的可变重链氨基酸序列，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9517；
包含由命名为Mab4.37VL的质粒中的多核苷酸所编码的轻链CDR中的至少一者、至少二者或者至少三者的可变轻链氨基酸序列，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9512；或者
包含由命名为Mab4.37VH的质粒中的多核苷酸所编码的重链CDR中的至少一者、至少二者或者至少三者的可变重链氨基酸序列，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9517；以及包含由命名为Mab4.37VL的质粒中的多核苷酸所编码的轻链CDR中的至少一者、至少二者或者至少三者的可变轻链氨基酸序列，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9512。
29.具有氨基酸序列的抗体包含：
包含由命名为Mab6B10VH的质粒中的多核苷酸所编码的重链CDR中的至少一者、至少二者或者至少三者的可变重链氨基酸序列，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9510；
包含由命名为Mab6B10VL的质粒中的多核苷酸所编码的轻链CDR中的至少一者、至少二者或者至少三者的可变轻链氨基酸序列，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9499；或者
包含由命名为Mab6B10VH的质粒中的多核苷酸所编码的重链CDR中的至少一者、至少二者或者至少三者的可变重链氨基酸序列，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9510；以及包含由命名为Mab6B10VL的质粒中的多核苷酸所编码的轻链CDR中的至少一者、至少二者或者至少三者的可变轻链氨基酸序列，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9499。
30.一种包含之前权利要求中的任意一项所述的靶向试剂或抗体的组合物。
31.一种包含之前权利要求中的任意一项所述的抗体或抗体的药物组合物。
32.一种编码之前权利要求中的任意一项所述的抗体或抗体的核酸分子。
33.一种治疗动物中恶性肿瘤的方法，包括：选择需要治疗恶性肿瘤的动物；以及向所述的动物给药治疗有效剂量的之前权利要求中的任意一项所述的抗体。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述的动物为人。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述的抗体选自全人源单克隆抗体4.120，9H10，10C9，4D4，11H2，6B1，4.37，6B10，3C1或6A6。
36.根据权利要求33-35所述的方法，其中所述的恶性肿瘤选自：黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、胃部(胃)癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、头部和颈部的癌症、间皮瘤、肉瘤、胆管癌(胆管细胞癌)、小肠腺癌、小儿恶性肿瘤以及扁平上皮癌。
37.用于治疗恶性肿瘤的根据权利要求30所述的组合物的用途。
38.根据权利要求37所述的组合物的用途，其中所述的恶性肿瘤选自：黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、胃部(胃)癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、头部和颈部的癌症、间皮瘤、肉瘤、胆管癌(胆管细胞癌)、小肠腺癌、小儿恶性肿瘤以及扁平上皮癌。
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