CN102264763B - 定向于dll4的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对抗DLL4的靶向结合剂以及这种试剂的用途。更具体而言，本发明涉及定向于DLL4的全人源单克隆抗体。所述的靶向结合剂可用于治疗与DLL4的活性和/或过量生产有关的疾病，并且可以用作诊断工具。

Description

定向于DLL4的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及对抗DLL4的靶向结合剂以及这种试剂的用途。更具体而言，本发明涉及定向于DLL4的全人源单克隆抗体。所述的靶向结合剂可用于治疗与DLL4的活性和/或过量生产有关的疾病，并且可用作诊断工具。
背景技术
Notch信号传导级联反应是进化保守的途径，其涉及细胞命运决定、干细胞维持以及在发育过程中许多组织的分化。因此，在哺乳动物中，已经识别4种Notch受体配基(Notch1-4)以及5种配基(Jagged-1/2以及Delta样配基(Dll)1/3/4)。Notch受体以异二聚体的形式存在，其由两个非共价结合的细胞外和跨膜亚基构成。配基与细胞外亚基结合引发了通过诸如TNFα转化酶(TACE)和γ-分泌酶之类的酶进行的蛋白裂解，其中所述的γ-分泌酶导致Notch细胞内结构域(NICD)的产生，该结构域转移至核中，并与转录因子结合，由此最终导致下游靶向基因的活化(参见Bray，2006，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.，7，678)。
现有证据表明，多种Notch途径的成分是在血管***中表达的，并且在正常Notch信号传导中发生异常可以导致血管表现型。例如，Jagged1和Notch3的突变导致Alagille综合症以及分别伴有皮层下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病的两种紊乱(均表现处血管缺陷)。此外，小鼠中Notch1和DLL4的基因缺陷都会导致伴有血管异常的胚胎致死性。此外，在大多数的遗传背景下，小鼠中DLL4的单个等位基因的缺陷会导致伴有严重血管缺陷的胚胎致死性(Duarteetal.，2004，GenesDev.，18，2474；Galeetal.，2004，Proc.Nat.Acad.Sci.，101，15949)。这种表现性之前仅针对VEGF-A报道过，并且表明DLL4在血管发育中可能起到重要的作用。
此外，还报道了在得自人透明细胞肾细胞癌、成胶质细胞瘤以及乳腺和膀胱癌的肿瘤血管上DLL4有所表达(Mailhosetal.，2001，Differentiation，69，135；Pateletal.，2005，CancerRes.，65，8690；Pateletal.，2006，Clin.CancerRes.，12，4836；Lietal.，2007，CancerRes.，67，11244)。近期研究还表明，在人成胶质细胞瘤中，DLL4可以在一小部分的肿瘤细胞上表达(Lietal.，2007，CancerRes.，67，11244)。此外，在多种癌症的临床前模型中，已经评价了封阻关于肿瘤生长的DLL4信号传导的作用，其中在免疫缺陷型小鼠中，肿瘤细胞系以皮下方式生长(Ridgwayetal.，2006，Nature，444，1083；Noguera-Troiseetal.，Nature，444，1032)。在这些研究中，已经报道了肿瘤生长的减少。这些抗肿瘤作用与肿瘤中功能较差的脉管密度的增加(伴有组织缺氧的增加)有关。总而言之，这些数据表明，除了DLL4在血管发育中的作用之外，其还在肿瘤血管***的发育中起作用。
除了对血管生成具有一定的作用之外，Notch信号传导还与得自多种类型的肿瘤的癌症干细胞有关(Dontuetal.，2004，BreastCan.Res.，6，R605；Wilson&Radtke，2006，FEBSLett.，580，2860)。已经由多种造血和实体肿瘤中分离的到癌症干细胞(Al-Hajjetal.，2003，Proc.Nat.Acad.Sci.，100，3983；Lapidotetal.，1994，Nature，17，645；Tanetal.，2006，LaboratoryInvestigation，86，1203)，并且DLL4在一小群肿瘤细胞上的存在进一步表明DLL4还涉及癌症干细胞生物学，并且DLL4的拮抗剂可以通过与这些类型的细胞相互作用而部分地调节抗肿瘤作用。
发明概述
本发明涉及特异性地与DLL4结合并抑制DLL4的生物学活性的靶向结合剂。本发明的实施方案涉及特异性地与DLL4结合并抑制DLL4与Notch受体(例如Notch1、2、3或4)相结合的靶向结合剂。
本发明的实施方案涉及特异性地与DLL4结合并抑制DLL4与Notch受体(例如Notch1或4)相结合的靶向结合剂。在本发明的一个实施方案中，所述的靶向结合剂特异性地与DLL4结合，并抑制与Notch受体(例如Notch1)相结合。在各一实施方案中，与缺少靶向结合剂的条件下所发生的结合情况相比，所述的靶向结合剂抑制了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的DLL4与Notch受体(例如Notch1)的结合。
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂以低于5纳摩尔(nM)的结合亲和性(KD)与DLL4结合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂以低于4nM、3nM、2nM或1nM的KD进行结合。在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂以低于950兆摩尔(pM)的KD与DLL4结合。在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂以低于900pM的KD与DLL4结合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂以低于800pM、700pM或600pM的KD进行结合。在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂以低于500pM的KD与DLL4结合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂以低于400pM的KD进行结合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂以低于300pM的KD进行结合。在一些其他的实施方案中，所述的靶向结合剂以低于200pM的KD进行结合。在一些其他的实施方案中，所述的靶向结合剂以低于150pM的KD进行结合。在一些其他的实施方案中，所述的靶向结合剂以低于100pM的KD进行结合。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂以低于50pM的KD进行结合。在一个特定的实施方案中，本发明的靶向结合剂可以以低于10pM的亲和性KD与人源DLL4相结合。在另一个特定的实施方案中，本发明的靶向结合剂可以以低于1pM的亲和性KD与人源DLL4相结合。可以采用本文所述的方法或本领域的任一技术人员已知的方法来估测KD(例如BIAcore测试，ELISA，FACS)(BiacoreInternationalAB，Uppsala，Sweden)。
本发明的靶向结合剂或抗体的结合性质还可以通过参照解离速率或结合速率(分别为koff和kon)来测定。
在本发明的一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以具有至少104M-1s-1、至少5X104M-1s-1、至少105M-1s-1、至少2X105M-1s-1、至少5X105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5X106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5X107M-1s-1、或者至少108M-1s-1的kon速率(抗体(Ab)+抗原(Ag)kon→Ab-Ag)。
在本发明的另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以具有低于5x10-1s-1、低于10-1s-1、低于5x10-2s-1、低于10-2s-1、低于5x10-3s-1、低于10-3s-1、低于5x10-4s-1、低于4x10-4s-1、低于3x10-4s-1、低于2x10-4s-1、低于10-4s-1、低于5x10-5s-1、低于10-5s-1、低于5x10-6s-1、低于10-6s-1、低于5x10-7s-1、低于10-7s-1、低于5x10-8s-1、低于10-8s-1、低于5x10-9s-1、低于10-9s-1、或者低于10-10s-1的koff速率((Ab-Ag)koff→抗体(Ab)+抗原(Ag))。
本发明的靶向结合剂与人源DLL4相结合。在一些实例中，本发明的靶向结合剂对得自其他物种的其他DLL4蛋白质具有交叉反应性。在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂对猕猴DLL4具有交叉反应性，但是对得自其他物种的DLL4蛋白质仅具有微弱的交叉反应性，例如所述的靶向结合剂以高于360nM的KD(通过BIAcore技术估测)与小鼠DLL4相结合。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂对得自其他物种的DLL4蛋白质具有几乎相等的亲和性。在一个特定的实例中，本发明的人源DLL4靶向结合剂对猕猴DLL4具有几乎相等的亲和性。对于相等水平的亲和性，我们是指当对于人源DLL4的亲和性为1时，所述抗体与猕猴DLL4的亲和性为0.2-5或0.2-2。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂对人源DLL4具有特异性，但是不能结合其他Notch配基。在一个实例中，本发明的靶向结合剂对人源DLL4具有特异性，但是不能显著地结合DLL1，例如，如通过测试本文所述的靶向结合剂(15-300μg/ml)结合人源DLL1瞬间转染的293T细胞或者Dll1稳定转染的HEK293细胞的能力中所测定的那样，DLL1/模拟物的比例为小于2.5。在另一个实例中，本发明的靶向结合剂对人源DLL4具有特异性，但是不能显著地结合Jagged1，例如，如通过测试本文所述的靶向结合剂(5μg/ml)结合人源Jagged1瞬间转染的293T细胞或者人源Jagged1稳定转染的HEK293细胞的能力中所测定的那样，DLL1/模拟物的比例为小于1。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂抑制了DLL4-Notch1受体-配基的结合。在一个实例中，可以证明所述靶向结合剂所具有的活性为IC50浓度(取得50％抑制程度的浓度)低于10μM。在另一个实例中，本发明的靶向结合剂可以具有低于50、40、30、20、10、5、4、2、1、0.8、0.7、0.6、0.5或0.4nM的IC50浓度。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂具有体外活性和体内活性。在一个特定例子中，在2D培养物中，靶向结合剂反向HUVEC细胞增殖的DLL4-刺激的抑制率。在一个例子中，与对照相比，本发明的抗体可反向HUVEC细胞增殖的DLL4-刺激的抑制率70％或超过例如75％、80％、85％、90％或95％(使用实施例9的测定，其中不加入DLL4)。
在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂(例如本发明的抗体)可以抑制2D培养物中HUVEC管的形成。例如，与对照(所述的对照为使用20μg/ml的相同抗体所测定的最大抑制作用)相比，本发明的抗体在0.08μg/ml的浓度下可以表现出大于50％的抑制率，例如50％、60％、70％、80％、90％或95％的抑制率。
在另一个实施方案中，与t＝0对照相比，本发明的靶向结合剂在4小时时可以表现为小于50％的内化作用，例如45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的内化作用。在另一个实施方案中，与t＝0对照相比，本发明的靶向结合剂在4小时时可以表现为5-50％、10-40％或者20-40％的内化作用(参见实施例15)。
在一个实施方案中，特异性地结合DLL4的本发明的靶向结合剂可以表现出一种或多种以下性质，包括：以低于200pM的KD与人源DLL4相结合；与猕猴DLL4交叉反应；与小鼠DLL4有微弱的交叉反应；以几乎相等的亲和性与猕猴DLL4相结合；不会显著地结合DLL1或Jagged1；在2D培养物中，与对照相比，表现出超过85％的HUVEC细胞增殖的反向DLL4-刺激的抑制率；在2D培养物中，在0.08μg/ml的浓度下，与对照相比，表现出对HUVEC细胞管形成的抑制率高于50％；以及在4小时时，相对于t＝0的对照，表现出内化率小于50％。
在另一个实施方案中，本文所公开的靶向结合蛋白质具有优异有效的、代谢和/或药效动力学性质。
在本发明的另一个实施方案中，所述的靶向结合剂与全人源单克隆抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK中的任意一者竞争结合Notch1。
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂抑制了哺乳动物中肿瘤细胞的生长和/或转移。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂可以治疗与血管生成有关的状况。
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂为抗体。在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂为单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，所述的靶向结合剂为全人源单克隆抗体。在本发明的另一个实施方案中，所述的靶向结合剂为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的全人源单克隆抗体。在本发明的另一个实施方案中，所述的靶向结合剂为IgG2同种型的全人源单克隆抗体。与其他同种型相比，所述的IgG2同种型具有降低的引发效应器功能的潜力，这可以使得毒性降低。在本发明的另一个实施方案中，所述的靶向结合剂为IgG1同种型的全人源单克隆抗体。与其他同种型相比，所述的IgG1同种型具有升高的引发ADCC的潜力，这可以使得效力得到改善。与其他同种型(例如IgG4)相比，IgG1同种型具有改善的稳定性，这可以使得生物利用率得到改善，或者使制造的方便程度得到改善或者得到更长的半衰期。在一个实施方案中，IgG1同种型的全人源单克隆抗体为z、za或f同种异型。
另一个实施方案为特异性地与DLL4结合并包含以下序列的靶向结合剂或抗体，其中所述的序列包含表2所示的互补性决定区(CDR)的序列。本发明的实施方案包含具有以下序列的靶向结合剂或抗体，其中所述的序列包含：如表2所示的CDR1、CDR2或CDR3序列中的任何一者。另一个实施方案为特异性地与DLL4结合并包含以下序列的靶向结合剂或抗体，其中所述的序列包含表2所示的CDR序列中的两个。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体具有这样的序列，该序列包含表2所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体具有这样的序列，该序列包含表2所示的CDR序列中的一者。本发明的实施方案包含具有以下序列的靶向结合剂或抗体，其中所述的序列包含：表2所示的CDR1、CDR2或CDR3序列中的任何一者。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体具有这样的序列，该序列包含表2所示的CDR序列中的两个。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体具有这样的序列，该序列包含表2所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体可以具有这样的序列，该序列包含表2所示的可变重链序列或可变轻链序列的CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些实施方案中，所述的靶向结合剂为抗体。在某些实施方案中，所述的靶向结合剂为全人源单克隆抗体。在某些其他的实施方案中，所述的靶向结合剂为全人源单克隆抗体的结合片段。
在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂包含：表2中所示的VHCDR1，其中所述的VHCDR1具有与表2中所示的VHCDR1相同的氨基酸序列，或者包含与表2中所示的VHCDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；表2中所示的VHCDR2，其中所述的VHCDR2具有与表2中所示的VHCDR2相同的氨基酸序列，或者包含与表2中所示的VHCDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；表2中所示的VHCDR3，其中所述的VHCDR3具有与表2中所示的VHCDR3相同的氨基酸序列，或者包含与表2中所示的VHCDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；表2中所示的VLCDR1，其中所述的VLCDR1具有与表2中所示的VLCDR1相同的氨基酸序列，或者包含与表2中所示的VLCDR1相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；表2中所示的VLCDR2，其中所述的VLCDR2具有与表2中所示的VLCDR2相同的氨基酸序列，或者包含与表2中所示的VLCDR2相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代；以及表2中所示的VLCDR3，其中所述的VLCDR3具有与表2中所示的VLCDR3相同的氨基酸序列，或者包含与表2中所示的VLCDR3相比具有1、2或3个氨基酸残基的取代。
在一个实施方案中，所述的靶向结合剂包含表2中所示的VHCDR1、CDR2和CDR3，以及表2中所示的VLCDR1、CDR2和CDR3。
在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂免疫特异性地结合DLL4，并包含表2中所示的重链可变结构域和表2中所示的轻链可变结构域，其中所述的重链可变结构域具有与表2中所示的氨基酸至少90％的一致性，而所述的轻链可变结构域具有与表2中所示的氨基酸序列至少90％的一致性，其中所述的抗体具有结合DLL4的活性。
在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂可以包含这样的序列，该序列包含由命名为Mab2H10VHOP、Mab9G8VH、Mab21H3VH和Mab4B4VH的质粒中的多核苷酸所编码的可变重链序列的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(Americantypeculturecollection(ATCC))中，编号分别为2008年9月17日的PTA-9502、PTA-9517、PTA-9501或PTA-9508。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂可以包含这样的序列，该序列包含由命名为Mab9G8VLOPT1、Mab21H3VLOP和Mab4B4VL的质粒中的多核苷酸所编码的可变轻链序列的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号分别为2008年9月17日的PTA-9516、PTA-9500或PTA-9520；以及由命名为Mab2H10VLOP的质粒中的多核苷酸所编码的可变轻链序列的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号分别为2009年7月7日的PTA-10181。
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab2H10VHOP的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9502。
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab2H10VHOP的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9502；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab2H10VLOP的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2009年7月7日的PTA-10181。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab2H10VHOP的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9502。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变轻链氨基酸序列，该可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab2H10VLOP的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2009年7月7日的PTA-10181。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab2H10VHOP的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9502；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab2H10VLOP的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2009年7月7日的PTA-10181。
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab9G8VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为PTA-9517。
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab9G8VH的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9517；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab9G8VLOPT1的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9516。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab9G8VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9517。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变轻链氨基酸序列，该可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab9G8VLOPT1的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9516。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab9G8VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9517；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab9G8VLOPT1的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9516。
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab21H3VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9501。
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab21H3VH的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9501；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab21H3VLOP的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9500。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab21H3VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9501。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变轻链氨基酸序列，该可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab21H3VLOP的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9500。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab21H3VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9501；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab21H3VLOP的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9500。
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab4B4VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9508。
在一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab4B4VH的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9508；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab4B4VL的质粒中的多核苷酸所编码的CDR3，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9520。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列，该可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab4B4VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9508。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变轻链氨基酸序列，该可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab4B4VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9520。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含可变重链氨基酸序列和可变轻链氨基酸序列，其中所述的可变重链氨基酸序列包含由命名为Mab4B4VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9508；其中所述的可变轻链氨基酸序列包含由命名为Mab4B4VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体CDR中的至少一者、至少二者或至少三者，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9520。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab2H10VHOP的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9502。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab9G8VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9517。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab21H3VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9501。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab4B4VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9508。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab2H10VLOP的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2009年7月7日的PTA-10181。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab9G8VLOPT1的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9516。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab21H3VLOP的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9500。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab4B4VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链，其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9520。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab2H10VHOP的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链(其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9502)，以及由命名为Mab2H10VLOP的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链(其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2009年7月7日的PTA-10181)。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab9G8VLOPT1的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链(其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9516)，以及由命名为Mab9G8VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链(其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9517)。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab21H3VH的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变重链(其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9501)，以及由命名为Mab21H3VLOP的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链(其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9500)。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含由命名为Mab4B4VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链(其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9520)，以及由命名为Mab4B4VL的质粒中的多核苷酸所编码的抗体的可变轻链(其中所述的质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，编号为2008年9月17日的PTA-9520)。
应该注意，本领域的普通技术人员可以容易地完成CDR的测定。例如参见Kabatetal，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，FifthEdition，NIHPublication91-3242，BethesdaMD(1991)，vols.1-3。Kabat提供了得自多个物种的同种型抗体的免疫球蛋白链的多个序列比对。根据单一的编号***(Kabat编号***)对比对的序列进行编号。Kabat序列从1991的出版物开始更新，并且可以用作电子序列数据库(最近的可下载的版本1997)。可以根据Kabat通过与Kabat参照序列进行比对来对任何免疫球蛋白序列进行编码。因此，Kabat编码***提供了用于编码免疫球蛋白链的统一的***。
在一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有表2所示重链序列中的任何一者的序列。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有抗体20G8，21H3，14B1，18B7，17B6，17F3，12A1，17G12，19G9，21F7，20D6，1D4，4B4，2H10或21H3RK的重链序列；或者如表5、7、9、11或13中所示的这些抗体的重链序列的任何优化版本中的任何一者的序列。轻链混杂(promiscuity)在本领域中是良好建立的，因此靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列包含抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK的轻链序列；或者如表6、8、10、12或13中所示的这些抗体的轻链序列的任何优化版本；或者如本文所公开的任何其他抗体中的任何一者。在一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列包含如表2中所示的重链序列；或者如表5、7、9、11或13中所示的这些抗体的重链序列的任何优化版本中的任何一者，并且还可以进一步包含表6、8、10、12或13中所示的轻链序列；或者本文中所公开的另一种抗体的轻链序列中的任何一者。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述的靶向结合剂为选自以下的单克隆抗体：4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK。在一个实施方案中，所述的靶向结合剂包含全人源单克隆抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK中的一者或多者。在某些实施方案中，所述的靶向结合剂为单克隆抗体4B4。在某些实施方案中，所述的靶向结合剂为单克隆抗体21H3。在某些实施方案中，所述的靶向结合剂为单克隆抗体2H10。在某些实施方案中，所述的靶向结合剂为单克隆抗体9G8。在某些其他实施方案中，所述的靶向结合剂为单克隆抗体21H3RK。
在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有选自表2中所示序列中的任何一者的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有选自表2中所示序列中的任何一者的轻链CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有选自抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK的CDR中的任何一者的重链CDR1、CDR2和CDR3。在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有选自抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK的CDR中的任何一者的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体4B4或21H3，2H10，9G8或21H3RK中的任何一者的可变重链序列的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一者。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体4B4或21H3，2H10，9G8或21H3RK中的任何一者的可变轻链的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一者。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体可以包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体4B4或21H3，2H10，9G8或21H3RK的CDR1、CDR2或CDR3；以及表2中所示的全人源单克隆抗体4B4或21H3，2H10，9G8或21H3RK的CDR1、CDR2或CDR3序列。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。
在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体4B4的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及表2中所示的全人源单克隆抗体4B4的CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体21H3的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及表2中所示的全人源单克隆抗体21H3的CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列具有表2中所示的全人源单克隆抗体2H10的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及表2中所示的全人源单克隆抗体2H10的CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。
本发明的另一个实施方案为包含以下序列的靶向结合剂或抗体，其中所述的序列具有跨越表2或表13中所示序列的任何一者的构架区和CDR(具体而言为FR1至FR4、或者CDR1至CDR3)的临近序列。在一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列具有跨越表2或表13中所示的单克隆抗体4B4或21H3，2H10，9G8或者21H3RK序列的任何一者的构架区和CDR(具体而言为FR1至FR4、或者CDR1至CDR3)的临近序列。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。
在另一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分包含具有SEQIDNO.：2序列的重链多肽。在一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分还包含具有SEQIDNO.：4序列的轻链多肽。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。
一个实施方案提供靶向结合剂或抗体、或者其抗原结合部分，其中所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分包含具有SEQIDNO.：6序列的重链多肽。在一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分还包含具有SEQIDNO.：8序列的轻链多肽。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。
在另一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分包含具有SEQIDNO.：22序列的重链多肽。在另一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分还包含具有SEQIDNO.：24序列的轻链多肽。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。
在另一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分包含具有SEQIDNO.：30序列的重链多肽。在另一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分还包含具有SEQIDNO.：32序列的轻链多肽。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。
在另一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分包含具有SEQIDNO.：30序列的重链多肽。在另一个实施方案中，所述的试剂或抗体、或者其抗原结合部分还包含具有SEQIDNO.：50序列的轻链多肽。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。
在一个实施方案中，在所公开的CDR、或者重链或轻链序列中，所述的靶向结合剂或抗体包含多达20、16、10、9或更少(例如1、2、3、4或5个)的氨基酸添加、取代、删除和/或***。这种修饰可以潜在地在CDR范围内的任何残基处形成。在一些实施方案中，所述的抗体为全人源单克隆抗体。
在一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含本文所公开的CDR的变体或衍生物、跨越构架区和CDR的临近序列(具体而言为FR1至FR4、或者CDR1至CDR3)、本文所公开的轻链或重链序列、或者本文所公开的抗体。变体包含这样的靶向结合剂或抗体，该靶向结合剂或抗体具有在表2或表13中所示的CDR1、CDR2或CDR3的任何一者中具有多达20、16、10、9或更少(例如1、2、3、4、5或6个)的氨基酸添加、取代、删除和/或***的序列；跨越表2或表13中所示的构架区和CDR(具体而言为FR1至FR4、或者CDR1至CDR3)的临近序列；本文所公开的轻链或重链序列；或者本文所公开的单克隆抗体。变体包含这样的靶向结合剂或抗体，该靶向结合剂或抗体具有表2或表13中所示的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一者具有至少大约60、70、80、85、90、95、98或大约99％氨基酸序列一致性的序列；跨越表2或表13中所示的构架区和CDR(具体而言为FR1至FR4、或者CDR1至CDR3)的临近序列；本文所公开的轻链或重链序列；或者本文所公开的单克隆抗体。两个氨基酸序列的百分率一致性可以通过本领域的技术人员已知的任何方法来测定，包括但不限于成对的蛋白质比对。在一个实施方案中，变体包含在CDR序列中或者在本文所公开的轻链或重链多肽中的变化，所述的变化是天然形成的，或者采用重组DNA技术或诱变技术对天然序列进行体外基因工程处理而诱导得到的。天然形成的变体包括在针对外源抗原产生抗体的过程中相对于种系核苷酸序列而在体内产生的那些。在一个实施方案中，所述的衍生物可以为异种抗体，其为其中两个或多个抗体被连接到一起而形成的抗体。衍生物包括经过化学修饰的抗体。实例包括一种或多种聚合物形成的共价连接物，例如水溶性的聚合物，N-连接或O-连接的碳水化合物，糖，磷酸酯和/或其他此类分子。所述的衍生物按照不同于天然形成的或起始抗体的方式进行修饰(按照所附分子的种类或位置)。衍生物还包含删除天然存在于所述抗体上的一个或多个化学基团。
在一个实施方案中，所述的靶向结合剂为双特异性抗体。双特异性抗体为对至少两个不同的抗原决定部位具有结合特异性的抗体。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。(例如参见，Millsteinetal，Nature，305：537-539(1983)；Trauneckeretal，EMBOJ，10：3655-3659(1991)；Sureshetal，MethodsinEnzymology，121：210(1986)；Kostelnyetal，J.Immunol，148(5)：1547-1553(1992)；Hollingeretal，Proc.NatlAcad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)；Gruberetal，J.Immunol，152：5368(1994)；美国专利No.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,81；95,731,168；4,676,980；和4,676,980，WO94/04690；WO91/00360；WO92/200373；WO93/17715；WO92/08802；与EP03089.)
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体具有通过将其非种系的残基突变成种系残基和/或除去结构倾向性而优化的序列。在一个实施方案中，本发明包含SEQIDNO.：6。在某些实施方案中，SEQIDNO.：6包含表7的各行中所示的种系和非种系残基的组合中的任何一者。在一些实施方案中，SEQIDNO.：6包含表7中所示的种系残基的任何一者、任何二者、任何三者、任何四者、任何五者、任何六者或者所有六者。在某些实施方案中，SEQIDNO.：6包含表7的各行所示的种系和非种系残基的独特组合中的任何一者。
在其他实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体衍生自具有VH3-33、6-13和JH4结构域的种系序列，其中一个或多个残基已经突变，从而在相应的位置处产生相应的种系残基。在某些实施方案中，SEQIDNO.：24可以进一步包含多种修饰(其包括除去结构倾向性)。例如，除了形成种系之外，C33可以突变成S。因此，SEQIDNO.：24可以包含表10中的各行所示的种系残基和非种系残基的独特组合的任何一种，并且还可以进一步包含C33至S的突变。
本发明的另一个实施方案为竞争性地结合DLL4的靶向结合剂或抗体。在另一个实施方案中，本发明涉及与天然DLL4竞争性地结合Notc1或Notch4受体的靶向结合剂或抗体。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体与全人源单克隆抗体4B4或21H3，2H10，9G8或者21H3RK的任何一者竞争性地结合Notch1。“竞争”是指所述的靶向结合剂或抗体与全人源单克隆抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或者21H3RK的任何一者竞争性地结合Notch1，即，竞争是非单向性的。
本发明的实施方案包含与全人源单克隆抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK中的任何一者交叉竞争以结合DLL4的靶向结合剂或抗体。“交叉竞争”是指与全人源单克隆抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK中的任何一者竞争性地结合Notch1的靶向结合剂或抗体，反之，即，竞争是指双向性的。
本发明的另一个实施方案为与本发明的靶向结合剂或抗体结合DLL4上相同的抗原决定部位的靶向结合剂或抗体。本发明的实施方案还包括与全人源单克隆抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK中的任何一者结合DLL4上相同的抗原决定部位的靶向结合剂或抗体。由交叉竞争分析清楚得知，本发明的抗体具有不同的或者部分重叠的抗原决定部位。例如，4B4与21H3RK和21H3交叉竞争。此外，在还原和变性条件下，4B4和21H3不结合DLL4，而9G8和2H10则显示结合补体的抗原决定部位。
在某些实施方案中，所述的抗原决定部位由DLL4的至少一个细胞外部分构成。所述的至少一个特定的抗原决定部位(例如21H3、21H3RK或4B4)可以包含由至少3个氨基酸残基构成的至少一个氨基酸序列与在DLL4中的氨基酸147-224(即，ICSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYCQQPICLSGCHEQNGYCSKPAECLCRPGWQGRLC(SEQIDNO：90))之间形成的临近氨基酸的完整特定部分的任何组合。在一个实施方案中，所述的抗原决定部位为SEQIDNO：90中的至少4个氨基酸残基、至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少30个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少60个氨基酸残基、至少70个氨基酸残基、至少75个氨基酸残基、至少76个氨基酸残基或者至少77个氨基酸残基。在另一个实施方案中，所述的抗原决定部位在人员DLL4的氨基酸187-201(TGEYCQQPICLSGCH(SEQIDNO：91))中形成。在一个实施方案中，所述的抗原决定部位为SEQIDNO：91中的至少4个氨基酸残基、至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基、至少13个氨基酸残基、至少14个氨基酸残基或者至少15个氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明包括本文所公开的抗体的小鼠交叉反应性抗体。在一个实施方案中，改变所述抗体的可变区，使得该抗体能够结合小鼠DLL4。通常，所述的小鼠交叉反应性抗体具有与本文所公开的抗体的相似的性质，例如，能够结合DLL4，并且能够抑制DLL4与Notch受体的结合。在一个实例中，改变21H3RK抗体的可变区，使得该抗体能够结合小鼠DLL4，例如所述的重链可以具有以下改变：H31Asn变为Lys，H52aAla变为Pro，H97Val变为Thr，H100bVal变为Trp，以及H100eGlu变为Ala(参见SEQIDNO：84)；而所述的轻链可以具有以下改变：L30Ser变为Asn，以及L93Asp变为Ser(参见SEQIDNO：85)。在另一个实施方案中，所述的重链具有以下改变：H30Thr变为Ile，H31Asn变为Met，H52aAla变为Pro，H100bVal变为Trp，以及H100eGlu变为Ala(参见SEQIDNO：86)；而所述的轻链具有以下改变：L93Asp变为Ser(参见SEQIDNO：87)。在另一个实施方案中，所述的重链具有以下改变：H30Thr变为Ile，H31Asn变为His，H100bVal变为Trp，以及H100eGlu变为Ala(参见SEQIDNO：88)；而所述的轻链具有以下改变：L30Ser变为Asn，以及L93Asp变为Ser(参见SEQIDNO：89)。
本发明的其他实施方案包括编码本文所述的靶向结合剂或抗体中的任何一者的经分离的核酸分子、具有编码本文所述的靶向结合剂或抗体的经分离的核酸分子的载体、或者使用这种核酸分子的任何一者的转化的宿主细胞。本发明的实施方案包括这样的核酸分子，该核酸分子编码特异性地与DLL4相结合并抑制DLL4与Notch受体相结合的全人源经分离的靶向结合剂。本发明还涵盖了在如本文所定义的严谨或严谨程度较低的杂交条件下与编码本文所述的靶向结合剂或抗体中的任何一者的多核苷酸相杂交的多核苷酸。本发明的实施方案还包括具有编码所述结合剂的核酸分子的载体。其他实施方案包括具有所述载体(包含所述的核酸分子)的宿主细胞。
如本领域已知的那样，抗体可以有利地为(例如)多克隆、寡克隆、单克隆、嵌合的、人源的和/或全人源的抗体。
应该理解的是，本发明的实施方案不限于任何特定形式的抗体或者生成或制备方法。在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂为全人源单克隆抗体的结合片段。例如，所述的靶向结合剂可以为全长的抗体(例如具有完整的人源Fc区域)或者抗体结合片段(例如Fab、Fab’或F(ab’)2、FV或者dAb)。此外，所述的抗体可以为单一结构域的抗体，例如与DLL4结合的骆驼或人源单一VH或VL结构域(例如dAb片段)。
本文所述的本发明的实施方案还提供了用于制备所述这些抗体的细胞。细胞的实例包括杂交瘤细胞、重组创建的细胞(例如中国仓鼠***(CHO))、CHO细胞的变体(例如DG44)以及产生对抗DLL4的抗体的NS0细胞。关于CHO细胞的变体的其他信息可以在Andersen和Reilly(2004)CurrentOpinioninBiotechnology15，456-462中找到，该文献以引用方式全文并入本文。所述的抗体可以由分泌所述抗体的杂交瘤细胞、或者由重组的基因工程细胞(其经编码所述抗体的基因转化或转染)制得。
此外，本发明的一个实施方案为通过在核酸分子被表达从而制得所述抗体、然后回收所述抗体的条件下培养宿主细胞来制备本发明的抗体的方法。应该认识到，本发明的实施方案还包括可以编码本发明的抗体或抗体片段的任何核酸分子(包括当被转染到用于抗体制备的宿主细胞中时被优化用于提高抗体及其片段的核酸序列的产量)。
本发明的另一个实施方案包括通过使用表达人源DLL4的细胞免疫哺乳动物、分离含有人源DLL4的细胞膜、纯化出人源DLL4或其片段和/或一个或多个定向进化同源序列或其片段来制备与DLL4特异性结合并抑制DLL4的生物学活性的抗体的方法。
在其他实施方案中，本发明提供了组合物，该组合物包含本发明的靶向结合剂或抗体或者其结合片段、以及可药用的载体或稀释剂。
本发明的其他实施方案包括通过对动物给药治疗有效剂量的、特异性结合DLL4的靶向结合剂来有效地治疗患有血管原增殖性疾病的动物的方法。在某些实施方案中，所述的方法还包括选择需要***、癌症和/或细胞增殖紊乱的动物，以及向这些动物给药治疗有效剂量的、特异性结合DLL4的靶向结合剂。
本发明的另一个实施方案包括通过对动物给药治疗有效剂量的、特异性结合DLL4的靶向结合剂来有效地治疗患有赘生性疾病的动物的方法。在某些实施方案中，所述的方法还包括选择需要治疗赘生性疾病的动物，以及向这些动物给药治疗有效剂量的、特异性结合DLL4的靶向结合剂。
本发明的另一个实施方案包括通过对动物给药治疗有效剂量的、特异性结合DLL4的靶向结合剂来有效地治疗患有恶性肿瘤的动物的方法。在某些实施方案中，所述的方法还包括选择需要治疗恶性肿瘤的动物，以及向这些动物给药治疗有效剂量的、特异性结合DLL4的靶向结合剂。
本发明的另一个实施方案包括通过对动物给药治疗有效剂量的、特异性结合DLL4的靶向结合剂来有效地治疗患有与DLL4表达有关的疾病或状况的动物的方法。在某些实施方案中，所述的方法还包括选择需要治疗与DLL4表达有关的疾病或状况的动物，以及向这些动物给药治疗有效剂量的、特异性结合DLL4的靶向结合剂。
恶性肿瘤可以选自：黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、胃部(胃)癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、头部和颈部的癌症、间皮瘤、肉瘤、胆管癌(胆管细胞癌)、小肠腺癌、小儿恶性肿瘤(pediatricmalignancy)以及扁平上皮癌。
可治疗的增殖性或血管原疾病包括赘生性疾病，例如黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、胃部(胃)癌、胆囊癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、食管癌、头部和颈部的癌症、间皮瘤、肉瘤、胆管癌(胆管细胞癌)、小肠腺癌、小儿恶性肿瘤、扁平上皮癌和白血病(包括慢性粒细胞白血病)。
在一个实施方案中，本发明适用于抑制患有单取决于或部分取决于DLL4的肿瘤的患者中的DLL4。
本发明的另一个实施方案包括本发明的靶向结合剂或抗体在制备用于治疗患有增殖或血管原相关性疾病的动物的药剂中的用途。在某些实施方案中，所述的用途还包括选择需要治疗增殖或血管原相关性疾病的动物。
本发明的另一个实施方案包括本发明的靶向结合剂或抗体在制备用于治疗患有赘生性疾病的动物的药剂中的用途。在某些实施方案中，所述的用途还包括选择需要治疗赘生性疾病的动物。
本发明的另一个实施方案包括本发明的靶向结合剂或抗体在制备用于治疗患有非赘生性疾病的动物的药剂中的用途。在某些实施方案中，所述的用途还包括选择需要治疗非赘生性疾病的动物。
本发明的另一个实施方案包括本发明的靶向结合剂或抗体在制备用于治疗患有恶性肿瘤的动物的药剂中的用途。在某些实施方案中，所述的用途还包括选择需要治疗恶性肿瘤的动物。
本发明的另一个实施方案包括本发明的靶向结合剂或抗体在制备用于治疗患有DLL4表达相关性疾病或状况的动物的药剂中的用途。在某些实施方案中，所述的用途还包括选择需要治疗DLL4表达相关性疾病或状况的动物。
本发明的另一个实施方案包括用作用于治疗患有增殖或血管原相关性疾病的动物的药剂的、本发明的靶向结合剂或抗体。
本发明的另一个实施方案包括用作用于治疗患有赘生性疾病的动物的药剂的、本发明的靶向结合剂或抗体。
本发明的另一个实施方案包括用作用于治疗患有恶性肿瘤的动物的药剂的、本发明的靶向结合剂或抗体。
本发明的另一个实施方案包括用作用于治疗患有DLL4表达相关性疾病或状况的动物的药剂的、本发明的靶向结合剂或抗体。
本发明的另一个实施方案包括用作用于治疗患有DLL4诱导疾病的动物的药剂的、本发明的靶向结合剂或抗体。
在一个实施方案中，治疗
增殖性或血管原相关性疾病；
赘生性疾病；
恶性肿瘤；或
与DLL4表达有关的疾病或状况；或者
包括管理、减轻、抑制任何上述疾病或状况。
在一个实施方案中，赘生性疾病的治疗包括肿瘤生长的抑制、肿瘤生长的延迟、肿瘤的衰退、肿瘤的收缩、在治疗终止时肿瘤再次生长的时间的增长、肿瘤复发的时间的增长、疾病进程的减慢。
在本发明的一些实施方案中，所述的待治疗的动物为人。
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂为全人源单克隆抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂选自全人源单克隆抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK。
本发明的实施方案包括含有本文所述的靶向结合剂与治疗剂的缀合物。在本发明的一些实施方案中，所述的治疗剂为毒素。在其他实施方案中，所述的治疗剂为放射性同位素。在其他实施方案中，所述的治疗剂为药物组合物。
在另一个方面中，提供了选择性地杀死患者中的癌细胞的方法。所述的方法包括向患者给药全人源抗体缀合物。该全人源抗体缀合物包括可以与DLL4结合的抗体、以及试剂。所述的试剂为毒素、放射性同位素，或者会杀死癌细胞的另一种物质。因此，所述的抗体缀合物选择性地杀死癌细胞。
在一个方面中，提供了特异性地结合DLL4的缀合全人源抗体。所述的抗体附着在试剂上，并且抗体与细胞相结合使得所述的试剂被传递给细胞。在一个实施方案中，上述缀合全人源抗体与DLL4的细胞外结构域结合。在另一个实施方案中，所述的抗体与缀合的毒素被表达DLL4的细胞内化。在另一个实施方案中，所述的试剂为细胞毒性试剂。在另一个实施方案中，所述的试剂为(例如)皂草素、auristatin、假单胞菌外毒素、白树毒素、蓖麻毒素、刺孢毒素、或者基于美登素的免疫缀合物等。在另一个实施方案中，所述的试剂为放射性同位素。
本发明的靶向结合剂或抗体可以单独给药，或者可以与其他的抗体、化疗药品或放疗结合给药。例如，封阻细胞粘连、入侵、血管生成或增殖的DLL4抗体的单克隆、寡克隆或多克隆混合物可以与表现出可抑制肿瘤细胞增殖的药品结合给药。
本发明的另一个实施方案包括诊断疾病或状况的方法，其中本文所述的抗体用于检测患者或患者样品中DLL4的水平。在一个实施方案中，所述的患者样品为血液、血清或尿液。在另一个实施方案中，列出了检测风险因子、诊断疾病以及疾病分段的方法，其中涉及使用抗DLL4抗体检测DLL4的表达和/或过表达。在一些实施方案中，所述的方法包括向患者给药与细胞上的DLL4选择性地结合的全人源抗体缀合物。所述的抗体缀合物包含特异性地与DLL4相结合的抗体以及标记。所述的方法还包括观察患者中所述标记的存在情况。标记的量相对高表明所述疾病的风险相对高，而标记的量相对低表明所述疾病的风险相对低。在一个实施方案中，所述的标记为绿色荧光蛋白质。
本发明还提供了测定患者样品中DLL4水平的方法，包括将本文所述的抗体与得自患者的生物学样品相接处，以及检测所述样品中所述抗体与DLL4之间的结合水平。在更具体的实施方案中，所述的生物学样品为血液、血浆或血清。
本发明的另一个实施方案包括通过将所述的血清或细胞与本文所述的抗体相接触、然后检测DLL4的存在情况来诊断与细胞中DLL4的表达有关的状况的方法。在一个实施方案中，所述的状况可以为增殖、血管生成、细胞粘连或入侵相关性疾病，包括但不限于赘生性疾病。
在另一个实施方案中，本发明包括用于检测哺乳动物组织、细胞或体液中的DLL4以筛查DLL4相关性疾病的测试试剂盒。所述的试剂盒包括本文所述的抗体以及用于表明所述抗体与DLL4(如果存在的话)的反应情况的手段。在一个实施方案中，与DLL4相结合的抗体被标记。在另一个实施方案中，所述的抗体为未标记的初级抗体，而所述的试剂盒还包含用于检测所述初级抗体的手段。在一个实施方案中，所述的检测手段包括作为抗免疫球蛋白的经标记的第二抗体。所述的抗体可以用选自荧光色素、酶、放射性核以及非透过性材料的标志物来标记。
在一些实施方案中，可以对本文所公开的靶向结合剂或抗体进行修饰，从而增强它们结合补体及参与补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力。在其他实施方案中，可以对所述的靶向结合剂或抗体进行修饰，从而增强它们活化效应器细胞及参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的能力。在其他实施方案中，可以对本文所述的靶向结合剂或抗体进行修饰，从而增强它们活化效应器细胞及参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的能力，以及增强它们结合补体及参与补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力。
在一些实施方案中，可以对本文所公开的靶向结合剂或抗体进行修饰，从而降低它们结合补体及参与补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力。在其他实施方案中，可以对所述的靶向结合剂或抗体进行修饰，从而降低它们活化效应器细胞及参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的能力。在其他实施方案中，可以对本文所述的靶向结合剂或抗体进行修饰，从而降低它们活化效应器细胞及参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的能力，以及降低它们结合补体及参与补体依赖的细胞毒性(CDC)的能力。
在某些实施方案中，本文所公开的靶向结合剂或抗体的半衰期以及本发明的组合物的半衰期为至少大约4至7天。在某些实施方案中，本文所公开的靶向结合剂或抗体的平均半衰期以及本发明的组合物的平均半衰期为至少大约2至5天、3至6天、4至7天、5至8天、6至9天、7至10天、8至11天、8至12天、9至13天、10至14天、11至15天、12至16天、13至17天、14至18天、15至19天、或者16至20天。在其他实施方案中，本文所公开的靶向结合剂或抗体的平均半衰期以及本发明的组合物的平均半衰期为至少大约17至21天、18至22天、19至23天、20至24天、21至25天、22至26天、23至27天、24至28天、25至29天、或者26至30天。在另一个实施方案中，本文所公开的靶向结合剂或抗体的半衰期以及本发明的组合物的半衰期可以为至多大约50天。在某些实施方案中，抗体的半衰期以及本发明的组合物的半衰期可以通过本领域已知的方法延长。这种延长转而可以降低所述抗体组合物的定量给药的量和/或频率。具有改善的体内半衰期的抗体以及制备这些抗体的方法在美国专利No.6,277,375、以及国际公开No.WO98/23289和WO97/3461中有所公开。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有容器的制造制品。所述的容器包含装有本文所公开的靶向结合剂或抗体的组合物，以及表明所述组合物可以用于治疗细胞粘连、入侵、血管生成和/或增殖相关性疾病(包括但不限于由DLL4表达或过表达所表征的疾病)的包装***物或标记。
在其他实施方案中，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包含装有本文所公开的靶向结合剂或抗体的组合物、以及向需要治疗的受试对象给药所述组合物的说明书。
本发明提供了包含变体Fc区域的蛋白质的配制物。即，非天然形成的Fc区域，例如包含一个或多个非天然形成的氨基酸残基的Fc区域。此外，本发明的变体Fc区域还涵盖了包含氨基酸删除、添加和/或修饰的Fc区域。
可以通过增加Fc区域对FcRn的结合亲和性来增长包含Fc区域的蛋白质的血清半衰期。在一个实施方案中，与同类分子相比，Fc变体蛋白质增长了血清半衰期。
在另一个实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述的Fc区域在选自239、330和332(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含至少一个非天然形成的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述的Fc区域包含至少一个选自239D、330L和332E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然形成的氨基酸。可选地，所述的Fc区域还可以在选自252、254和256(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含添加的非天然形成的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述的Fc区域包含至少一个选自239D、330L和332E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然形成的氨基酸，以及在选自252Y、254T和256E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处的至少一个非天然形成的氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述的Fc区域在选自234、235和331(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含至少一个非天然形成的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述的Fc区域包含至少一个选自234F、235F、235Y和331S(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然形成的氨基酸。在另一个具体的实施方案中，本发明的Fc变体包含234F、235F和331S(按照Kabat列出的EU索引编号)非天然形成的氨基酸残基。在另一个具体的实施方案中，本发明的Fc变体包含234F、235Y和331S(按照Kabat列出的EU索引编号)非天然形成的氨基酸。可选地，所述的Fc区域还可以在选自252、254和256(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含添加的非天然形成的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体，其中所述的Fc区域包含至少一个选自234F、235F、235Y和331S(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然形成的氨基酸；以及在选自252Y、254T和256E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处的至少一个非天然形成的氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了Fc变体蛋白质配制物，其中所述的Fc区域在选自239、330和332(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含至少一个非天然形成的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体蛋白质配制物，其中所述的Fc区域包含至少一个选自239D、330L和332E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然形成的氨基酸。可选地，所述的Fc区域还可以在选自252、254和256(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含添加的非天然形成的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体蛋白质配制物，其中所述的Fc区域包含至少一个选自239D、330L和332E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然形成的氨基酸，以及在选自252Y、254T和256E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处的至少一个非天然形成的氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了Fc变体蛋白质配制物，其中所述的Fc区域在选自234、235和331(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含至少一个非天然形成的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体蛋白质配制物，其中所述的Fc区域包含至少一个选自234F、235F、235Y和331S(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然形成的氨基酸。可选地，所述的Fc区域还可以在选自252、254和256(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处包含添加的非天然形成的氨基酸。在具体的实施方案中，本发明提供了Fc变体蛋白质配制物，其中所述的Fc区域包含至少一个选自234F、235F、235Y和331S(按照Kabat列出的EU索引编号)中的非天然形成的氨基酸；以及在选自252Y、254T和256E(按照Kabat列出的EU索引编号)中的一个或多个位置处的至少一个非天然形成的氨基酸。
用于生成非天然形成的Fc区域的方法是本领域已知的。例如，氨基酸的取代和/或删除可以通过突变方法生成，包括但不限于定点突变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492(1985))、PCR突变(Higuchi，in″PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications″，AcademicPress，SanDiego，pp.177-183(1990))、盒式突变(Wellsetal，Gene34：315-323(1985))。优选的是，定点突变是通过重叠延伸PCR方法来进行的(Higuchi，in″PCRTechnology：PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification″，StocktonPress，NewYork，pp.61-70(1989))。重叠延伸PCR(Higuchi，ibid.)技术还可以用于向靶向序列(起始DNA)中引入任何所需的突变。例如，在重叠延伸方法中PCR的第一个循环涉及使用外引物(引物1)和内突变引物(引物3)、以及分开的第二外引物(引物4)和内引物(引物2)来扩增靶向序列，从而产生两条PCR节段(节段A和B)。内突变引物(引物3)被设计成包含与靶向序列的错配，从而指定了所需的突变。在PCR的第二个循环中，通过使用所述的两个外引物(引物1和4)进行PCR而扩增得到第一个PCR循环的产物(节段A和B)。使用限定性酶对所得的全长PCR节段(节段C)进行水解，并将所得的限制性片段克隆到合适的载体中。作为突变的第一个步骤，将起始DNA(例如编码Fc融合蛋白质、抗体或者简单的Fc区域)可操作地克隆到突变载体中。所述的引物被设计成反应了所需的氨基酸取代。用于生成变体Fc区域的其他方法是本领域已知的(例如参见美国专利No.5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,528,624；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；美国专利公开No.2004/0002587以及PCT公开WO94/29351；WO99/58572；WO00/42072；WO02/060919；WO04/029207；WO04/099249；WO04/063351)。
在本发明的一些实施方案中，本文所提供的抗体的糖基化模式被修改，以增强ADCC和CDC效应器的功能。参见ShieldsRLetal，(2002)JBC.277：26733；ShinkawaTetal，(2003)JBC.278：3466和OkazakiAetal，(2004)J.Mol.Biol.，336：1239。在一些实施方案中，Fc变体蛋白质包含一个或多个基因工程化的糖型，即，碳水化合物组合物以共价方式与包含Fc区域的分子相连。基因工程化的糖型可以用于多种目的，包括但不限于增强或降低效应器的功能。基因工程化的糖型可以通过本领域的技术人员已知的任何方法生成，例如通过采用基因工程化的或变体表达的菌株，通过与一种或多种酶(例如DIN-乙酰基氨基葡糖转移酶III(GnTI11))共表达，通过在多种有机体或得自多种有机体的细胞系中表达包含Fc区域的分子，或者通过在包含Fc区域的分子已经被表达之后对碳水化合物进行修饰。用于生成基因工程化的糖型的方法是本领域已知的，并且包括但不限于在Umanaetal，1999，Nat.Biotechnol17：176-180；Daviesetal，20017BiotechnolBioeng74：288-294；Shieldsetal，2002，JBiolChem277：26733-26740；Shinkawaetal，2003，JBiolChem278：3466-3473)美国专利No.6,602,684；美国系列号No.10/277,370；美国系列号No.10/113,929；PCTWO001/61739A1；PCTWO01/292246A1；PCTWO02/311140A1；PCTWO02/30954A1；PotillegentTMtechnology(Biowa，Inc.Princeton，N.J.)；GlycoMAbTMglycosylationengineeringtechnology(GLYCARTbiotechnologyAG，Zurich，Switzerland)。例如参见WO00061739；EA01229125；US20030115614；Okazakietal，2004，JMB，336：1239-49中所描述的那些。
此外，本领域已知Fc区域的糖基化可以被修饰，以增强或降低效应器的功能(例如参见Umanaetal，1999，Nat.Biotechnol17：176-180；Daviesetal，2001，BiotechnolBioeng74：288-294；Shieldsetal，2002，JBiolChem277：26733-26740；Shinkawaetal，2003，JBiolChem278：3466-3473)U.S.Pat.No.6,602,684；美国序列No.10/277,370；美国序列No.10/113,929；PCTWO00/61739A1；PCTWO01/292246A1；PCTWO02/311140A1；PCTWO02/30954A1；PotillegentTMtechnology(Biowa，Inc.Princeton，N.J.)；GlycoMAbTMglycosylationengineeringtechnology(GLYCARTbiotechnologyAG，Zurich，Switzerland))。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体的Fc区域包含糖基化被改变的氨基酸残基。在另一个实施方案中，糖基化被改变的氨基酸使得效应器的功能降低。在另一个实施方案中，糖基化被改变的氨基酸残基使得效应器的功能增强。在具体的实施方案中，所述的Fc区域具有减少的岩藻糖基化。在另一个实施方案中，所述的Fc区域为岩藻糖基化的(例如参见美国专利申请公开No.2005/0226867)。
附图简述
图1描绘了显示IgG1DLL4抗体对于HUVEC增殖的DLL4-刺激的抑制的作用的柱状图。数据表示n＞2个独立试验。
图2描绘了显示IgG2/4DLL4抗体在体外对HUVEC管的形成的作用(通过测量血管长度(mm)和#分支来估测)的柱状图。
图3描绘了显示未标记的抗DLL4的抗体在0.1μg/ml的浓度下替代Alex-647标记的21H3RK来进行结合的作用(通过FACS分析测定)的柱状图。
图4描绘了12种嵌合DLL4/DLL1变体的图示线性图。所有的变体都编码了人源DLL4的细胞外结构域，并且人源DLL1替代了所描绘的单个亚结构域或结合结构域节段。
图5描绘了显示21H3RK与编码DLL4的嵌合敲除(“KO”)变体的结合情况的线性图，其中所述的DLL4具有使用相应的DLL1结构域取代的细胞外结构域节段。
图6描绘了显示21H3RK与编码DLL4的嵌合敲除(“KO”)变体和嵌合敲入(“KI”)变体的结合情况的线性图，其中所述的DLL4具有使用相应的DLL1结构域取代的细胞外结构域节段，而其中所述的变体编码了具有使用DLL4对应物取代的区域的DLL1。
发明详述
本发明的实施方案涉及能够抑制Notch受体信号传导的一组新型的DLL4封阻分子，例如抗体。这种分子可以以单一试剂的形式使用、或者可选择地与其他结合抗体/试剂组合使用。此外，它们还可以与任何标准品或新型抗癌试剂组合使用。
本发明的实施方案涉及与DLL4相结合的靶向结合剂。在一些实施方案中，所述的靶向结合剂与DLL4相结合，并抑制DLL4与其受体Notch(例如Notch1、Notch2、Notch3和/或Notch4)相结合。在一些实施方案中，这种结合可以中和、封阻、抑制、消除或干扰DLL4相关作用的一个或多个方面。在一个实施方案中，所述的靶向结合剂为单克隆抗体或其结合片段。本文中，这种单克隆抗体可以被称为抗DLL4的抗体。
本发明的其他实施方案包括全人源抗DLL4的抗体，以及具有治疗用途的抗体制备物。在一个实施方案中，本发明的抗DLL4抗体的制备物具有所需的治疗性质，包括对DLL4的强的结合亲和性、封阻DLL4受体-配基相互作用的能力、封阻DLL4介导的信号传导的能力、促进内皮细胞增殖和非功能性血管形成的能力、调节周细胞对血管的补充的能力、抑制肿瘤生长的能力、增加肿瘤氧不足/坏疽的能力、改变内皮顶端/柄细胞命运的能力，以及调节肿瘤细胞生存或癌症干细胞生存及自我更新的能力。
此外，本发明的实施方案包括使用本文所述的抗体来治疗疾病的方法。本发明的抗DLL4的抗体可以用于预防DLL4介导的健康组织的肿瘤发生和肿瘤入侵。此外，DLL4抗体可以用于治疗与肿瘤发生(例如眼部疾病(如AMD)、炎性紊乱(如风湿性关节炎)、心脑血管疾病、败血症以及赘生性疾病)有关的疾病。可以表征为任何类型的恶性肿瘤(包括转移性癌症、淋巴肿瘤以及血癌)的任何疾病也都可以通过这种抑制机制来进行治疗。人类中示例性的癌症包括***、乳腺肿瘤、***肿瘤、基细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌(例如神经胶质肿瘤)、***、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、***癌、消化***的癌症；子宫内膜癌、食管癌；眼癌；头部和颈部的癌症；胃部的癌症；上皮内赘生物；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞)；淋巴瘤，包括Hodgkin或非Hodgkin淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌、视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌、肾癌、呼吸***的癌症；肉瘤、皮肤癌；胃癌、睾丸癌、甲状腺癌；子宫癌、泌尿***的癌症以及其他癌症和肉瘤。通常在狗、猫和其他宠物中诊断的恶性紊乱包括但不限于淋巴肉瘤、骨肉瘤、***肿瘤、肥大细胞瘤、脑肿瘤、黑素瘤、腺鳞癌、良性的肺部肿瘤、支气管腺肿瘤、细支气管腺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺部肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、刺瘤、视网膜母细胞瘤、Ewing肉瘤、Wilm肿瘤、Burkitt淋巴瘤、小神经胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、破骨细胞瘤、口腔瘤形成、纤维肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、传染性性病肿瘤、睾丸肿瘤、***瘤、Sertoli细胞肿瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿色瘤(例如粒细胞肉瘤)、角膜刺瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基细胞肿瘤、胸腺瘤、胃部肿瘤、肾上腺癌、口腔多发性***瘤、血管内皮瘤和囊腺瘤、毛囊淋巴瘤、小肠淋巴瘤、纤维肉瘤和肺部鳞状细胞癌。在啮齿动物(例如雪貂)中，示例性的癌症包括胰岛瘤、淋巴瘤、肉瘤、神经瘤、胰腺岛细胞肿瘤、胃部MALT淋巴瘤和胃腺瘤。影响农业牲畜的瘤形成包括白血病、血管外皮细胞瘤和牛眼部的瘤形成(在牛中)；***纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、***癌、***瘤形成和肥大细胞瘤(在马中)；肝细胞癌(在猪中)；淋巴瘤和肺部腺瘤病(在羊中)；肺部肉瘤、淋巴瘤、Rous肉瘤、成血细胞综合症、纤维肉瘤、肾母细胞瘤、B细胞淋巴瘤和淋巴白血性增生(在鸟类物种中)；视网膜母细胞瘤、肝脏的瘤形成、淋巴肉瘤(成淋巴细胞的淋巴瘤)、类浆细胞白血病和浮囊肉瘤(在鱼中)、干酪样***炎(CLA)；由细菌假结核棒杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)引起的绵羊和山羊的慢性、感染性、传染病、以及由南非羊肺炎引起的绵羊的传染性肺部肿瘤。
本发明的其他实施方案包括用于特异性检测生物学样品中DLL4的数量的诊断性测试。所述的测试试剂盒可以包括本文所公开的靶向结合剂或抗体、以及用于检测这些抗体的必要性的标记。这些诊断性测试可用于筛查细胞粘连、入侵、血管生成或增殖相关性疾病，包括但不限于赘生性疾病。
本发明的另一个方面为DLL4的生物学活性的拮抗剂，其中所述的拮抗剂能够与DLL4结合。在一个实施方案中，所述的拮抗剂为靶向结合剂，例如抗体。所述的拮抗剂可以选自本文所述的抗体，例如抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK。
在一个实施方案中，所述的DLL4的生物学活性的拮抗剂可以与DLL4相结合，并由此抑制或阻止DLL4与Notch相结合，由此抑制细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖。
一个实施方案为与全人源单克隆抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK相同的一个或多个抗原决定部位相结合的靶向结合剂。
一个实施方案为与全人源单克隆抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK相同的一个或多个抗原决定部位相结合的抗体。
一个实施方案为能够产生上文所述的靶向结合剂的杂交瘤细胞。在一个实施方案中，为能够产生上文所述的抗体的轻链和/或重链的杂交瘤细胞。在一个实施方案中，所述的杂交瘤细胞能够产生全人源单克隆抗体的轻链和/或重链。在另一个实施方案中，所述的杂交瘤细胞能够产生全人源单克隆抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK的轻链和/或重链。可选择地，所述的杂交瘤细胞可以产生这样的抗体，该抗体能够与全人源单克隆抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK相同的一个或多个抗原决定部位相结合。
另一个实施方案为编码上文所述的靶向结合剂的核酸分子。在一个实施方案中，为编码上文所述的抗体的轻链或重链的核酸分子。在一个实施方案中，所述的核酸分子编码了全人源单克隆抗体的轻链或重链。另一个实施方案为编码选自抗体4B4，2H10，21F7，12A1，17F3，9G8，20G8，21H3，1E4，3A7，4B3，1D4或21H3RK中的全人源单克隆抗体的轻链或重链的核酸分子。
本发明的另一个实施方案为包含一个或多个上文所述的核酸分子的载体，其中所述的载体编码了上文所述的靶向结合剂。在本发明的一个实施方案中，为包含一个或多个上文所述的核酸分子的载体，其中所述的载体编码了上文所述的抗体的轻链和/或重链。
本发明的另一个实施方案为包含上文所述的载体的宿主细胞。可选择地，所述的宿主细胞可以包含多于一个的载体。
此外，本发明的一个实施方案为通过在其中核酸分子被表达从而产生所述的靶向结合剂、然后回收所述的靶向结合剂的条件下培养宿主细胞来制备本发明的靶向结合剂的方法。在本发明的一个实施方案中卫通过在核酸分子被表达从而产生所述的抗体、然后回收所述的抗体的条件下培养宿主细胞来制备本发明的抗体的方法。
在一个实施方案中，本发明包括通过用编码上文所述的靶向结合剂的至少一个核酸分子转染至少一个宿主细胞、在所述的宿主细胞中表达所述的核酸分子以及分离所述的靶向结合剂来制备靶向结合剂的方法。在一个实施方案中，本发明包括通过用编码上文所述的抗体的至少一个核酸分子转染至少一个宿主细胞、在所述的宿主细胞中表达所述的核酸分子以及分离所述的抗体来制备抗体的方法。
根据另一个方面，本发明包括通过给药本文所述的拮抗剂来拮抗DLL4的生物学活性的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的DLL4的生物学活性的拮抗剂。
本发明的另一个方面包括通过给药上文所述的靶向结合剂来拮抗DLL4的生物学活性的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗DLL4的生物学活性的靶向结合剂。
本发明的另一个方面包括通过给药上文所述的抗体来拮抗DLL4的生物学活性的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗DLL4的生物学活性的抗体。
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的DLL4的生物学活性的拮抗剂来治疗动物中疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的DLL4的生物学活性的拮抗剂。
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的拮抗DLL4的生物学活性的靶向结合剂来治疗动物中疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗DLL4的生物学活性的靶向结合剂。所述的靶向结合剂可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的拮抗DLL4的生物学活性的抗体来治疗动物中疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗DLL4的生物学活性的抗体。所述的抗体可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的DLL4的生物学活性的拮抗剂来治疗动物癌症的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗癌症的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗DLL4的生物学活性的拮抗剂。所述的拮抗剂可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的拮抗DLL4的生物学活性的靶向结合剂来治疗动物癌症的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗癌症的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗DLL4的生物学活性的靶向结合剂。所述的靶向结合剂可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的拮抗DLL4的生物学活性的抗体来治疗动物癌症的方法。所述的方法可以包括选择需要治疗癌症的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗DLL4的生物学活性的抗体。所述的抗体可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的拮抗DLL4的生物学活性的抗体来减轻或抑制动物肿瘤细胞的增殖、粘连、入侵和/或血管生成的方法。所述的方法可以包括选择需要减轻或抑制增殖、细胞粘连、入侵和/或血管生成的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗DLL4的生物学活性的抗体。所述的抗体可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。
根据另一个方面，提供了通过给药治疗有效量的拮抗DLL4的生物学活性的抗体来减缓动物肿瘤的生长和/或转移的方法。所述的方法可以包括选择需要减缓肿瘤的生长和/或转移的动物，以及向所述的动物给药治疗有效剂量的、拮抗DLL4的生物学活性的抗体。所述的抗体可以单独给药，或者与其他抗体或者化疗药品或放疗结合给药。
根据本发明的另一个方面，提供了DLL4的生物学活性的拮抗剂在用于制造治疗疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的药剂中的用途。在一个实施方案中，所述的DLL4的生物学活性拮抗剂为本发明的靶向结合剂。在一个实施方案中，所述的DLL4的生物学活性拮抗剂为本发明的抗体。
根据本发明的另一个方面，提供了用作用于治疗疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的药剂的、DLL4的生物学活性拮抗剂。在一个实施方案中，所述的DLL4的生物学活性拮抗剂为本发明的靶向结合剂。在一个实施方案中，所述的DLL4的生物学活性拮抗剂为本发明的抗体。
根据本发明的另一个方面，提供了拮抗DLL4的生物学活性的靶向结合剂或抗体在用于制造治疗疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的药剂中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了用作用于治疗疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的药剂的、拮抗DLL4的生物学活性的靶向结合剂或抗体。
根据本发明的另一个方面，提供了拮抗DLL4的生物学活性的靶向结合剂或抗体在用于制造治疗疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的药剂中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了用作用于治疗疾病相关性细胞粘连和/或入侵和/或血管生成和/或增殖的药剂的、拮抗DLL4的生物学活性的抗体。
根据本发明的另一个方面，提供了DLL4的生物学活性的拮抗剂在用于制造治疗动物癌症的药剂中的用途。在一个实施方案中，DLL4的生物学活性的拮抗剂为本发明的靶向结合剂。在一个实施方案中，DLL4的生物学活性的拮抗剂为本发明的抗体。
根据本发明的另一个方面，提供了DLL4的生物学活性的拮抗剂在用于治疗动物癌症的药剂中的用途。在一个实施方案中，DLL4的生物学活性的拮抗剂为本发明的靶向结合剂。在一个实施方案中，DLL4的生物学活性的拮抗剂为本发明的抗体。
根据本发明的另一个方面，提供了拮抗DLL4的生物学活性的靶向结合剂在用于制造治疗动物癌症的药剂中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了用作用于治疗动物癌症的药剂的、拮抗DLL4的生物学活性的靶向结合剂。
根据本发明的另一个方面，提供了拮抗DLL4的生物学活性的抗体在用于制造治疗动物癌症的药剂中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了用作用于治疗动物癌症的药剂的、拮抗DLL4的生物学活性的抗体。
根据本发明的另一个方面，提供了拮抗DLL4的生物学活性的靶向结合剂或抗体在用于制造减轻或抑制动物增殖、细胞粘连、入侵和/或血管生成的药剂中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了用作用于制造减轻或抑制动物增殖、细胞粘连、入侵和/或血管生成的药剂的、拮抗DLL4的生物学活性的靶向结合剂或抗体。
根据另一个方面，提供了拮抗所述的DLL4的生物学活性的靶向结合剂或抗体在用于制造用于减缓动物肿瘤生长和/或转移的药剂中的用途。
根据另一个方面，提供了用作用于减缓动物肿瘤生长和/或转移的药剂的、拮抗所述的DLL4的生物学活性的靶向结合剂或抗体。
在一个实施方案中，本发明特别适用于在患有单独依赖于或部分依赖于DLL4的肿瘤患者中拮抗DLL4。
根据本发明的另一个方面，提供了包含DLL4的生物学活性的拮抗剂以及可药用的载体的药物组合物。在一个实施方案中，所述的拮抗剂包含抗体。根据本发明的另一个方面，提供了包含DLL4的生物学活性的拮抗剂以及可药用的载体的药物组合物。在一个实施方案中，所述的拮抗剂包含抗体。
在一些实施方案中，在给药特异性结合DLL4的抗体之后，给药清除剂，从而移除血液中过量的循环抗体。
抗DLL4的抗体可以用于消除患者样品中的DLL4，并因此可以用作用于本文所述的疾病状态的诊断工具。此外，基于抗DLL4抗体的显著抑制由DLL4介导的信号传导活性(如以下实施例中所表明的那样)的能力，所述的抗DLL4的抗体在治疗由DLL4的表达所导致的症状和状况中具有治疗作用。在具体的实施方案中，本文所述的抗体和方法涉及治疗由DLL4诱导的细胞粘连、入侵、血管生成、增殖和/或细胞内信号传导所导致的症状。另一个实施方案涉及采用本文所述的抗体和方法来治疗细胞粘连、入侵、血管生成和/或增殖相关性疾病，包括赘生性疾病，例如黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、干细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、胃部(胃)癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌以及胰腺癌。所述的抗体还可以用于治疗关节炎、动脉粥样硬化以及与血管生成有关的疾病中的细胞粘连和/或入侵。
在一个具体的实施方案中，所述的抗DLL4的抗体或靶向结合剂可以在治疗实体肿瘤中具有治疗作用，其中所述的实体肿瘤的发展依赖于具有增殖能力并且能够有效地对其他肿瘤干细胞(例如急性髓细胞白血病(AML)和乳腺肿瘤)产生所述的抗体和所述的靶向结合剂的一小群干细胞。
本发明的另一个实施方案包括用于检测哺乳动物组织、细胞或体液中的DLL4以筛查细胞粘连、入侵、血管生成或增殖相关性疾病的测试试剂盒。所述的试剂盒包括与DLL4相结合的靶向结合剂以及用于表明所述的靶向结合剂与DLL4(如果存在的话)的反应情况的手段。在一个实施方案中，与DLL4相结合的靶向结合剂被标记。在另一个实施方案中，所述的靶向结合剂为未标记的，而所述的试剂盒还包含用于检测所述靶向结合剂的手段。优选的是，所述的靶向结合剂可以用选自荧光色素、酶、放射性核以及辐射非透过性材料的标志物来标记。
本发明的另一个实施方案包括用于检测哺乳动物组织、细胞或体液中的DLL4以筛查细胞粘连、入侵、血管生成或增殖相关性疾病的测试试剂盒。所述的试剂盒包括与DLL4相结合的抗体以及用于表明所述抗体与DLL4(如果存在的话)的反应情况的手段。所述的抗体可以为单克隆抗体。在一个实施方案中，与DLL4相结合的抗体被标记。在另一个实施方案中，所述的抗体为未标记的初级抗体，而所述的试剂盒还包含用于检测所述初级抗体的手段。在一个实施方案中，所述的手段包括作为抗免疫球蛋白的经标记的第二抗体。优选的是，所述的抗体可以用选自荧光色素、酶、放射性核以及辐射非透过性材料的标志物来标记。
在以下另外的详细材料中提供了本文所公开的、关于所述抗体的其他实施方案、特征等。
序列列表
本发明的实施方案包括以下表1中所列的特异性抗体。该表格分别报告了各种抗DLL4的抗体的识别编号，以及相应重链和轻链的基因和多肽的可变结构域的SEQID编号。各种抗体已经给出了识别编号。
表1
表2为将所述抗体的重链区域与其同源种系的重链区域、以及γ轻链区域与其同源种系的轻链区域进行对比的表。
定义
除非另作说明，否则本文所用的科学及技术术语具有本领域的普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非内容需要，否则单数的术语包含复数的含义而复数的术语也包含单数的含义。通常与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白质和寡或多核苷酸化学及杂交相关使用的***命名法，以及本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白质和寡或多核苷酸化学及杂交的技术都是公知的那些，并且在本领域中常用。
标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂转染)。根据供应商提供的说明书、或者本领域的常规完成方法、或者本文所述的方法来进行酶反应和纯化技术。通常，根据本领域公知的常规方法以及按照本发明的整个说明书中所引用和讨论的多个通常且更具体的参考中所述的方法来实施之前所述的技术和程序。例如参见Sambrooketal.MolecularCloning：ALaboratoryManual(3rded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(2001))，该文献以引用方式并入本文。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学相关使用的***命名法，以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是公知的那些，并在本领域中常用。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、传递以及患者的治疗。
如本发明公开所用，以下属于除非另作说明，否则应该理解为具有以下含义：
拮抗剂或抑制剂可以为多肽、核酸、碳水化合物、脂质、小分子量的化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干扰(RNAi)、反义物(antisense)、重组蛋白质、抗体、或其片段或其缀合物或其融合蛋白质。就RNAi的综述，参见MilhavetO，GaryDS，MattsonMP.(PharmacolRev.2003Dec；55(4)：629-48.综述)，而反义物(参见OpalinskaJB，GewirtzAM.(SciSTKE.2003Oct28；2003(206)：pe47.))。
化合物是指分子量小于大约2000道尔顿的任何小分子量化合物。
术语“DLL4”是指作为DLL4蛋白质的分子，也称为Delta样蛋白质4前体、果蝇Delta同系物4、hdelta2、MGC126344或UNQ1895/PRO4341。术语“中和性”或“抑制”当用于指靶向结合剂(例如抗体)时，是指抗体消除、降低或显著降低靶向抗原的活性的能力。因此，本发明的“中和性”抗DLL4的抗体能够消除或显著降低DLL4的活性。中和性DLL4抗体可以例如通过封阻天然DLL4与其受体Notch(例如Notch1或Notch4)的结合来起作用。通过封阻这种结合，DLL4信号介导的活性显著或完全消除。理想的是，对抗DLL4拮抗作用的中和性抗体会促进EC增殖。中和性DLL4抗体可以例如通过促进非功能性血管的形成来增加血管生成。
“DLL4的生物学活性的拮抗剂”能够消除、降低或显著降低DLL4的活性。“DLL4的生物学活性的拮抗剂”能够消除、降低或显著降低DLL4的信号传导。“DLL4的生物学活性的拮抗剂”可以消除或显著降低血管生成和/或增殖。
“降低DLL4的信号传导”涵盖了与缺乏本发明的靶向结合剂、抗体或拮抗剂而产生的信号传导的水平相比，DLL4的信号传导降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％。
“优化的”序列为这样的抗体序列(本文所述的任一种抗体的可变重链或轻链)，该抗体序列已经突变使得非种系序列在一个或多个残基处突变回种系序列，并且可以进一步除去所述序列所具有的结构倾向性(例如糖基化位点或未配对的半胱氨酸)。
术语“多肽”在本文中用作常规术语，是指天然蛋白质、片段或者多肽序列的类似物。因此，天然蛋白质、片段以及类似物为多肽类型的一些种类。根据本发明的优选多肽包括人源重链免疫球蛋白分子和人源γ轻链免疫球蛋白分子、和通过包含重链免疫球蛋白分子和轻链免疫球蛋白分子(例如γ或λ轻链免疫球蛋白分子)的组合所形成的抗体分子，及上述情况的相反情况，以及它们的片段或同系物。根据本发明的优选多肽还可以仅仅包含人源重链免疫球蛋白分子或其片段。
如本文所用，适用于对象的术语“天然”或“天然形成”是指这样的事实，即，对象可以在自然界中找到。例如，可以在由自然界来源分离得到的有机体(包括病毒)中存在的、并且并未经人在实验室中有意地修饰或以其他方式修饰的多肽或多核苷酸是天然形成的。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指这样的元件位置，如此描述的元件位置具有允许它们按照它们所需的方式发挥作用的关系。例如，对照序列与编码序列“可操作地连接”是指以这样的方法进行连接，所述的方式为编码序列的表达是在与对照序列相容的条件下完成的。
术语“多核苷酸”在本文中是指长度为至少10个碱基的聚合物形式的核苷酸，为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者任何一种核苷酸的修饰形式，或者为RNA-DNA异源双链。所述的术语包括单链和双链形式的DNA。
术语“寡核苷酸”在本文中包括通过天然形成和非天然形成的键而连接在一起的天然形成和修饰的核苷酸。寡核苷酸为多核苷酸的子集，通常包含长度为200个或更少的碱基。优选的是，寡核苷酸的长度为10至60个碱基，并且最优选的是长度为12、13、14、15、16、17、18、19或者20至40个碱基。寡核苷酸通常为单链的，例如可用于探针；但是寡核苷酸可以为双链的，例如用于基因突变体的构建。寡核苷酸可以为正义或反义寡核苷酸。
术语“天然形成的核苷酸”在本文中包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。术语“修饰的核苷酸”在本文中包括具有修饰的或取代的糖基等的核苷酸。术语“寡核苷酸键”在本文中包括寡核苷酸键，例如硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、硒代磷酸酯键、二硒代磷酸酯键、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、氨基磷酸酯键等。例如参见LaPlancheetal.Nucl.AcidsRes.14：9081(1986)；Stecetal.J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Steinetal.Nucl.AcidsRes.16：3209(1988)；Zonetal.Anti-CancerDrugDesign6：539(1991)；Zonetal.OligonucleotidesandAnalogues：APracticalApproach，pp.87-108(F.Eckstein，Ed，OxfordUniversityPress，OxfordEngland(1991))；Stecetal.美国专利No.5,151,510；UhlmannandPeymanChemicalReviews90：543(1990)，这些公开均以引用方式并入本文。如果需要的话，寡核苷酸可以包括用于检测的标记。
术语“选择性杂交”在本文中是指可检测的且特异性的结合。多核苷酸、寡核苷酸及其片段在杂交和洗涤条件(该条件将非特异性核酸的可检测结合的可估测的量降至最低)下选择性地与核酸链杂交。高度的严谨条件可以用于得到本领域已知的及本文所讨论的选择性杂交条件。通常，在所关注的多核苷酸、寡核苷酸或其抗体片段和核酸序列之间的核酸序列同源性为至少80％，并且更通常的是同源性优选地增加至至少85％、90％、95％、99％和100％。
严格的杂交条件包括但不限于在大约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)(0.9MNaCl，90mM柠檬酸钠，pH7.0)与过滤器结合的DNA杂交，然后在大约50-65℃下在0.2XSSC，0.1％SDS中进行一次或多次洗涤；高度严格的条件例如为在大约45℃下在6XSSC中与过滤器结合的DNA杂交，然后在大约60℃下在0.1XSSC，0.2％SDS中进行一次或多次洗涤；或者本领域的技术人员已知的其他严格的杂交条件(例如参见Ausubel，F.M.etal，eds.1989CurrentProtocolsinMolecularBiology，vol.1，GreenPublishingAssociates，Inc.和JohnWileyandSons，Inc，NY，第6.3.1至6.3.6和2.10.3页)。如果在两个氨基酸的序列之间具有部分或完全的一致性，则这两个氨基酸序列是“同源的”。例如，85％的同源性是指当两条序列被比对以达到最大程度的匹配时，85％的氨基酸是一致的。在达到最大匹配的条件下允许存在缺口(在两条匹配序列的任何一条中)；缺口长度为5或更少是优选的，并且缺口长度为2或更少是更优选的。备选的且优选的是，如果两条蛋白质序列(或者由长度为至少大约30个氨基酸衍生得到的多肽序列)的比对得分超过5分(以标准偏差单元)(使用具有突变数据矩阵的程序ALIGN)而缺口罚分为6或更高，则这两条蛋白质序列是同源的(该术语如本文所用)。参见Dayhoff，M.O，inAtlasofProteinSequenceandStructure，pp.101-110(Volume5，NationalBiomedicalResearchFoundation(1972))和Supplement2tothisvolume，pp.1-10。如果当使用ALIGN程序对两条序列或其部分进行最佳比对时，它们的氨基酸为大约或等于50％的一致性，则更优选的是这两条序列或其部分是同源的。应该理解的是在两条定向进化同源序列中可以存在有不同的同源性区域。例如，与非功能区域相比，小鼠和人的直系同源物的功能位点可以具有更高度的同源性。
术语“相应于”在本文中用于指多核苷酸序列与参照多核苷酸序列的全部或部分是同源的(即，是一致的，并不具有严格的进化相关性)，或者指多肽序列与参照多肽序列是一致的。
对比而言，术语“与互补”在本文中用于指互补序列与参照多核苷酸序列的全部或部分是同源的。为了说明，核苷酸序列“TATAC”相应于参照序列“TATAC”，并且与参照序列“GTATA”互补。
术语“序列一致性”是指在比较窗口内两条多核苷酸或氨基酸序列是一致的(即，基于核苷酸对核苷酸、或残基对残基)。术语“序列一致性的百分率”是通过以下方式计算得到的，将比较窗口内的两条最佳比对序列进行比较，测定其中在两条序列中都具有一致的核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)或氨基酸残基的位置的数量从而得到匹配位置的数量，将在比较窗口内匹配位置的数量除以位置的总数量(即，窗口尺寸)，以及将所得的结合乘以100从而得到序列一致性的百分率。术语“基本一致性”在本文中用于指多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中与比较窗口为至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置内、通常窗口为至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置内的参照序列相比，所述的多核苷酸或氨基酸包含具有至少85％序列一致性、优选的是至少90至95％序列一致性、更优选的是至少99％序列一致性的序列，其中序列一致性的百分率是通过将参照序列与可以在比较窗口内包含总量为参照序列的20％或更少的删除或添加的序列相比较。所述的参照序列可以为较大序列的子集。
如本文所用，20个常规氨基酸及其缩写跟在常规用途之后。参见Immunology-ASynthesis(2ndEdition，E.S.GolubandD.R.Gren，Eds.，SinauerAssociates，Sunderland，Mass.(1991))，该文献以引用方式并入本文。20个常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸(例如α-、α-取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸以及其他非常规氨基酸也可以为用于本发明多肽的合适的元件。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷基丝氨酸、N乙酰基丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-精氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸、以及其他相似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，根据标准用法和常规情况，左手方向为氨基末端方向，而右手方向为羧基末端方向。
类似地，除非另作说明，否则单链多核苷酸序列的左手末端为5末端；双链多核苷酸序列的左手方向被称为5方向。初始RNA转录物的5至3的添加方向被称为转录方向；在具有与RNA相同序列的DNA链上的并且为其5至RNA转录物的5末端的序列区域被称为“上游序列”；在具有与RNA相同序列的DNA链上的并且为其3至RNA转录物的3末端的序列区域被称为“下游序列”。
如多肽所用，术语“基本一致性”是指当将两条肽序列通过例如采用了缺省缺口权重(defaultgapweight)的程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时，这两条肽序列共有至少80％的序列一致性，优选为至少90％的序列一致性，更优选为至少95％的序列一致性，最优选为至少99％的序列一致性。优选的是，并非一致的残基位置可以通过保守的氨基酸取代而不同。保守的氨基酸取代是指具有相同侧链的残基的可交换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含氨基侧链的一组氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守的氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所讨论的那样，认为氨基酸序列中变化较少的抗体或免疫球蛋白分子都被涵盖在本发明的范围内，只要在所述氨基酸序列中的变化与本文所述的抗体或免疫球蛋白分子保持了至少75％、更优选的是至少80％、90％、95％，并且更优选的是99％序列一致性即可。具体而言，考虑了保守的氨基酸的替代。保守的替代为在具有相关侧链的一系列氨基酸中发生的那些。遗传学编码的氨基酸通常被分为几个系列：(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)不带电荷的极性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的系列为：丝氨酸和苏氨酸为脂肪族-羟基系列；天冬酰胺和谷氨酰胺为含氨基系列；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脂肪族系列；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸为芳香族系列。例如，合理的是，认为亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸被谷氨酸、苏氨酸被丝氨酸的分别的替代或者氨基酸被具有结构相关性的氨基酸的相似的替代不会对所得分子的结合功能或形成产生主要的影响，特别是如果所述的替代不涉及构架位点中的氨基酸时，更是如此。可以通过测试所述多肽衍生物的特定的活性来容易地测定氨基酸的变化是否会得到功能肽。所述的测定方法在本文进行了详细的描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以通过本领域普通的技术人员容易地制备。片段或类似物的优选的氨基或羧基末端在功能结构域的边界附近形成。结构和功能结构域可以通过将所述的核苷酸和/或氨基酸序列数据库与公共或私人的序列数据库相比较来确定。优选的是，可以采用计算机化的比较方法来确定序列基元或者预测在已知结构和/或功能的其他蛋白质中形成的蛋白质构象结构域。确定折叠形成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowieetal.Science253：164(1991)。因此，之前的实例证明本领域的技术人员可以识别可根据本文所述的抗体、用于定义结构和功能结构域的序列基元和结构构象。
谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基通常会拖去酰胺基，从而分别形成相应的谷氨酰基和天冬酰基残基。所述的这些残基是在中性或碱性条件下拖去酰胺基的。这些残基的脱酰胺基形成也落入本发明的范围。
通常，蛋白质中的半胱氨酸残基参与半胱氨酸-半胱氨酸二硫键；或者当半胱氨酸残基为折叠蛋白质区域的一部分时，蛋白质中的半胱氨酸残基在空间上被保护以防止二硫键的形成。蛋白质中二硫键的形成是一个复杂的过程，该过程是由环境的氧化还原潜力以及专门的巯基-二硫键交换酶决定的(Creighton，MethodsEnzymol.107，305-329，1984；Houee-Levin，MethodsEnzymol.353，35-44，2002)。当半胱氨酸残基在蛋白质结构中未成对并且在空间上为被折叠所保护时，该半胱氨酸可以以已知为二硫键缓慢重排的过程与得自溶液中的游离半胱氨酸形成二硫键。在已知为二硫键交换的另一个过程中，游离的半胱氨酸还可以干扰天然形成的二硫键(例如在抗体结构中存在的那些)，并导致结合少、生物学活性低和/或稳定性差。
优选的氨基酸取代为以下这些：(1)降低对蛋白质水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变用于形成蛋白质络合物的结合亲和性，(4)改变结合亲和性，以及(4)赋予或修改所述类似物的其他物理化学或功能性质。类似物可以包括除了天然形成的肽序列以为的多种序列突变体。例如，可以在天然形成的序列(优选的是，在形成分子内接触的结构域之外的部分多肽中)中形成单个或多个氨基酸取代(优选的是保守的氨基酸取代)。保守的氨基酸取代不应该较大程度低改变亲代序列的结构特征(例如替代氨基酸不应该倾向于断裂在亲代序列中形成的螺旋结构，或者扰乱表征亲代序列的其他类型的二级结构)。本领域识别的多肽的二级和三级结构的实例在Proteins，StructuresandMolecularPrinciples(Creighton，Ed，W.H.FreemanandCompany，NewYork(1984))；IntroductiontoProteinStructure(C.BrandenandJ.Tooze，eds，GarlandPublishing，NewYork，N.Y.(1991))；和Thorntonetal.Nature354：105(1991)中有所描述，这些文献均以引用方式并入本文。
此外，此类方法可以用于形成氨基酸取代或删除参与链内二硫键的一个或多个可变区的半胱氨酸残基，从而生成缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。
术语“CDR区域”或“CDR”是指赋予抗体以抗原结合特异性的抗体的重链和轻链的高度可变区。可以根据Kabat***(Kabat，E.A.etal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，5thEdition.USDepartmentofHealthandHumanServices，PublicService，NIH，Washington)以及后来的版本来定义CDR。抗体通常包含3个重链CDR和3个轻链CDR。在此使用术语一个CDR或多个CDR，以便根据实际情况表明这些区域中的一个区域或若干个区域，或者甚至是这些区域的全部，其中所述的区域包含了造成抗体通过对其所识别的抗原或抗原决定部位的亲和性而结合的氨基酸残基的大部分。
重链的第三个CDR(HCDR3)具有更大的尺寸变化性(基本上是由于基因的排布机制而导致的更高的多样性)。虽然已知重链的第三个CDR的最长尺寸为26个氨基酸，但是其可以短至2个氨基酸。CDR的长度还可以根据通过具体的具有下划线的构架所容纳的长度而变化。功能上而言，HCDR3在抗体特异性的确定中起到部分作用(Segaletal，PNAS，71：4298-4302，1974，Amitetal，Science，233：747-753，1986，Chothiaetal，J.Mol.Biol，196：901-917，1987，Chothiaetal，Nature，342：877-883，1989，Catonetal，J.Immunol，144：1965-1968，1990，Sharonetal，PNAS，87：4814-4817，1990，Sharonetal，J.Immunol，144：4863-4869，1990，Kabatetal，J.Immunol，147：1709-1719，1991)。
术语“一组CDR”在本文中是指包含CDR1、CDR2和CDR3。因此，一组HCDR是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，而一组LCDR是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明的VH和VL结构域以及CDR的变体(包括本文中所列的氨基酸序列的那些，以及可以在针对DLL4的靶向剂和抗体中使用的那些)可以通过序列改变或突变、并针对具有所需特征的抗原靶向进行筛查的方法来获得。所需特征的实例包括但不限于：相对于对抗原具有特异性的已知抗体，增加针对这种抗原的结合亲和性；相对于对抗原具有特异性的已知抗体，增加对抗原的活性(如果这种活性是已知的)的中和作用；在特定的摩尔比例下，与针对所述抗原的已知抗体或配基的特定的竞争能力；免疫沉淀配基-受体络合物的能力；与特定的抗原决定部位相结合的能力；线性抗原决定部位，例如采用肽结合扫描方法来鉴定的肽序列(例如在线性和/或束缚构象中筛查得到的肽)；通过非连续的残基形成的构象抗原决定部位；调节DLL4的新的生物学活性或下游分子的能力；结合和/或中和DLL4的能力；和/或任何其他所需的性质。
需要在CDR、抗体VH或VL结构域以及抗原结合位点的氨基酸序列中进行取代的技术是本领域可利用的。在本发明中可以制备和使用本文所公开的抗体分子的变体。在将多元数据分析技术应用于结构/性质-活性关系中(Wold，etal.Multivariatedataanalysisinchemistry.Chemometrics-MathematicsandStatisticsinChemistry(Ed.：B.Kowalski)，D.ReidelPublishingCompany，Dordrecht，Holland，1984)，根据计算机化学的指引，可以采用公知的数学技术(例如统计回归方法、模式识别和***)来推导出抗体的活性-性质的定量关系(Normanetal.AppliedRegressionAnalysis.Wiley-Interscience；3rdedition(April1998)；Kandel，Abraham&Backer，Eric.Computer-AssistedReasoninginClusterAnalysis.PrenticeHallPTR，(May11，1995)；Krzanowski，Wojtek.PrinciplesofMultivariateAnalysis：AUser’sPerspective(OxfordStatisticalScienceSeries，No22(Paper).OxfordUniversityPress；(December2000)；Witten，IanH.&Frank，Eibe.DataMining：PracticalMachineLearningToolsandTechniqueswithJavaImplementations.MorganKaufmann；(October11，1999)；DenisonDavidG.T.(Editor)，ChristopherC.Holmes，BaniK.Mallick，AdrianF.M.Smith.BayesianMethodsforNonlinearClassificationandRegression(WileySeriesinProbabilityandStatistics).JohnWiley&Sons；(July2002)；Ghose，ArupK.&Viswanadhan，VellarkadN.CombinatorialLibraryDesignandEvaluationPrinciples，Software，Tools，andApplicationsinDrugDiscovery)。在一些情况下，可以由抗体序列、功能和三维结构的经验和理论模型(例如分析可能接触的残基或者计算物理化学性质)来推导出抗体的性质，并且可以单独地以及以结合方式考虑这些性质。
由VH结构域和VL结构域构成的抗体的抗原结合位点通常由6个多肽环形成：其中3个多肽环来自轻链可变结构域(VL)，3个来自重链可变重链结构域(VH)。对已知的芳香族结构的抗体进行分析解释了抗体结合位点的序列与三维结构之间的关系。这些关系表明，除了VH结构域中的第三个区域(环)之外，结合位点环具有少数主链构造(标准结构(canonicalstructure))之一。已经显示，在特定的环中形成的标准结构可以通过其尺寸以及在环和构架区域中在关键位点处的某些残基的存在情况来确定。
序列-结构关系的这种研究可以用于预测已知序列的抗体中的这些残基，而且能够预测未知的三维结构，这对保持CDR环的三维结构是重要的，并因此保持结合特异性。这些预测可以通过比较由先导优化试验得到的结果而得到支持。在结构方法中，可以使用任何可随意利用的或商业化的包装(例如WAM)来创立抗体分子的模型。然后，可以使用蛋白质可视化及分析软件包(例如InsightII(Accelrys，Inc.)或DeepView)来评价在CDR中的各位置处的可能的取代。然后，可以利用这些信息来进行取代，从而有可能对活性产生最小的或有利的效果，或者赋予其他所需的性质。
如本文所用，术语“多肽片段”是指这样的多肽，该多肽具有删除了的氨基末端和/或羧基末端，但是在所述的末端，剩余的氨基酸序列与由例如全长cDNA序列推导出的天然形成的序列中相应位置处的氨基酸序列一致。片段通常为至少5、6、8或10个氨基酸的长度，优选的是为至少14个氨基酸的长度，更优选的是为至少20个氨基酸的长度，通常为至少50个氨基酸的长度，甚至更优选的是为至少70个氨基酸的长度。如本文所用，术语“类似物”是指这样的多肽，该多肽由与所推导出的氨基酸序列部分基本一致的至少25个氨基酸的节段构成，并且具有以下性质中的至少一者：(1)在合适的结合条件下，与DLL4特异性地结合，(2)封阻合适的VEGF/DLL4结合的能力，或者(3)抑制DLL4受体酪氨酸激酶活性的能力。通常，多肽类似物包含相对于天然形成的序列的保守的氨基酸取代(或者添加或删除)。类似物通常为至少20个氨基酸的长度，优选的是为至少50个氨基酸的长度或更长，并且通常可以与全长的天然形成的多肽一样长。
如同具有与模板肽的性质相似性质的非肽类药品，肽类似物通常用于制药工业中。这些非肽类化合物的类型被称为“肽模拟物”或“类肽物”(Fauchere，J.Adv.DrugRes.15：29(1986)；VeberandFreidingerTINSp.392(1985)；和Evansetal.J.Med.Chem.30：1229(1987)，这些文献以引用方式并入本文)。此类化合物通常借助于计算机化的分子模型而研发得到的。与可药用的肽具有结构相似性的肽模拟物可以用于产生相等的治疗或预防效果。通常，类肽物在结构上与范例多肽(即，具有生物化学性质或药理学活性的多肽，例如人类的抗体)相似，但是具有一个或多个可任选地被选自以下的键所替代(通过本领域公知的方法)的肽键：--CH2NH--，--CH2S--，--CH2-CH2--，--CH＝CH--(顺式和反式)，--COCH2--，--CH(OH)CH2--，以及-CH2SO--。具有相同类型的D-氨基酸的相同序列的一个或多个氨基酸被***性地取代(例如D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可以用于产生更稳定的肽。此外，可以通过本领域已知的方法形成包含相同序列或者基本一致的相同序列的变化的束缚肽(Rizo和GieraschAnn.Rev.Biochem.61：387(1992)，该文献以引用方式并且本文)；例如通过加入能够形成分子内二硫键(其使所述的肽环化)的内部半胱氨酸残基。
抗体可以是单独的或者与通过已知的技术提供的其他氨基酸序列相结合的寡克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、催化性抗体、嵌合抗体、人源化的抗体、全人源的抗体、抗独特型(anti-idiotypic)抗体、以及可以以溶解或结合形势标记的抗体，以及它们的片段、变体或衍生物。抗体可以得自物种。
如本文所用，术语“一种抗体”和“多种抗体”(多种免疫球蛋白)涵盖了单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、camelised抗体和嵌合抗体。如本文所用，术语“一种抗体”或“多种抗体”是指由至少一个结合结构域构成的多肽或一类多肽，其中所述的结合结构域是由具有三维结合空间(具有与抗原的抗原决定簇的特征互补的内部表面形状和电荷分布)的多肽链发生折叠而形成的。天然抗体通常为大约150000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。各个轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而在不同免疫球蛋白二硫键同种型的重链之间二硫键的数量发生变化。各种重链和轻链还具有规则的间隔的链内二硫键。各个重链在一个末端处具有可变结构域(VH)，其后跟有多个恒定结构域。各个轻链在一个末端处具有可变结构域(VL)而在另一个末端处具有恒定结构域；所述的轻链的恒定结构域与所述的重链的可变结构域对齐。根据轻链恒定区的氨基酸序列，轻链可以分为λ链或γ链。γ轻链的可变结构域在本文中还可以表示为VK。术语“可变区”还可以用于描述重链或轻链的可变结构域。认为，特定的氨基酸残基在轻链可变结构域和重链可变结构域之间形成了界面。各轻链/重链对的可变区形成了抗体结合位点。这种抗体可以得自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等。
术语“一种抗体”或“多种抗体”包括本发明抗体的结合片段，示例性的片段包括单链Fvs(scFv)、单链抗体、单结构域的抗体、结构域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段、表现出所需生物学活性的抗体片段、二硫键稳定的可变区(dsFv)、二聚可变区(双功能抗体)、抗独特型抗体(抗-Id)(包括例如针对本发明抗体的抗-Id抗体)、细胞内抗体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段以及上文所述的任何一者的抗原结合片段形成的多特异性抗体。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含抗原金额和位点的分子。免疫球蛋白分子可以为任何一种类型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、种类(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。
使用酶(木瓜蛋白酶)对抗体进行水解得到两条相同的抗原结合片段(也称为“Fab”片段)以及“Fc”片段(其不具有抗原结合活性，但具有结晶能力)。使用酶(胃蛋白酶)对抗体进行水解得到F(ab’)2片段，其中所述抗体分子的两个臂保持连接，并包含两个抗原结合位点。F(ab’)2片段具有与抗原交联的能力。
“Fv”当在本文中用于指保留有抗原识别位点和抗原结合位点的最小的抗体片段。该区域由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的非共价或共价的结合方式而形成的二聚体构成。正是在这种构造中，各个可变结构域的三个CDR相互作用，从而在VH-VL二聚体的表面上定义了抗原结合位点。总体而言，六个CDR赋予所述的抗体以抗原结合特异性。但是，虽然单个的可变结构域(或者仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，但是与完整的结合位点相比，亲和性较低。
“Fab”当在本文中用于指包含轻链的恒定结构域和重链的CH1结构域的抗体的片段。
“dAb”当在本文中用于指作为人源抗体的最小功能结合单元的抗体片段。“dAb”为单结构域抗体，并且包含抗体重链的可变结构域(VH结构域)或抗体轻链的可变结构域(VL结构域)。各个dAb都包含六个天然形成的CDR中的三个(Wardetal，BindingactivitiesofarepertoireofsingleimmunoglobulinvariabledomainssecretedfromEscherichiacoli.Nature341，544546(1989)；Holt，etal，Domainantibodies：proteinfortherapy，TrendsBiotechnol.21，48449(2003))。它们的分子量为11至15kDa，比抗原结合片段(Fab)2小四倍，并且是单链Fv(scFv)分子的一半。
“骆驼”当在本文中用于指抗体分子由重链二聚体构成，所述的二聚体缺少轻链，但是具有延伸的抗原结合组库(repertoire)(Hamers-CastermanC，AtarhouchT，MuyldermansS，RobinsonG，HamersC，SongaEB，BendahmanN，HamersR(1993)Naturallyoccurringantibodiesdevoidoflightchains.Nature363：446448)。
术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述的片段包含与在相同的多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)。通过使用连接体(该连接体太短以至于在同一链中的两个结构域之间不能配对)，迫使所述的结构域与一个链的互补结构域配对，并创建出两个抗原结合位点。在例如EP404,097；WO93/11161；和Hollingeretal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中更全面地描述了双功能抗体。
已经显示，整个抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab(Ward，E.S.etal，(1989)Nature341，544-546)；由VH和CH1结构域组成的Fd片段(McCaffertyetal(1990)Nature，348，552-554)；由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段(Holtetal(2003)TrendsinBiotechnology21，484-490)；以及(iv)dAb片段(Ward，E.S.etal，Nature341，544-546(1989)，McCaffertyetal(1990)Nature，348，552-554，Holtetal(2003)TrendsinBiotechnology21，484-490)，其由VH或VL结构域组成；(v)分离的CDR区域；(vi)F(ab′)2片段，其为包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽连接体连接，其中所述的连接体使得两个结构域相结合，从而形成抗原结合位点(Birdetal，(1988)Science，242，423-426，，Hustonetal，(1988)PNASUSA，85，5879-5883)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；以及(ix)“双功能抗体”通过基因融合而构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger，P.(1993)etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448)。Fv、scFv或双功能抗体可以通过引入连接VH和VL结构域的二硫化物的键来稳定(Reiter，Y.etal，NatureBiotech，14，1239-1245，1996)。此外，还可以制备包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(Hu，S.etal，(1996)CancerRes，56，3055-3061)。结合片段的其他实例为Fab’和Fab’-SH，其中Fab’通过在重链CH1结构域的羧基末端加入一些残基(包括得自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同，而Fab’-SH则为恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基基团的Fab’片段。
术语“可变的”是指这样的事实，即，在抗体的序列中，可变结构域的某些部分有较大不同，并且这些部分是形成各特定抗体对特定抗原具有结合亲和性的原因。但是，所述的变化性并非均匀地分布于抗体的整个可变结构域中。在轻链和重链的可变结构域中，所述的部分集中在被称为互补性决定区(CDR)的节段中。保守性更高的可变结构域部分被称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域均包含四个FR区域，其主要采用β-片构造，并通过三个CDR连接，其中所述的三个CDR形成了环连接，并且在某些情况下形成了β-片结构的一部分。在各链中的CDR通过FR区域以紧密接近的方式被保持在一起，并且如果具有得自其他链的CDR则有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabatetal，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，5thEd.PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991))。恒定结构域通常不直接涉及抗原的结合，但是可以影响抗原结合的亲和性并且表现出多种效应器功能，例如在ADCC、CDC和/或细胞凋亡中抗体参与。
术语“高变区”在本文中用于指与抗体与抗原的结合有关的抗体的氨基酸残基。高变区涵盖了“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域的残基24-34(L1)、50-56(L2)以及89-97(L3)和重链可变区的残基31-35(H1)、50-65(H2)以及95-102(H3)；Kabatetal，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，5thEd.PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991))，和/或得自高变区的那些残基(例如轻链可变结构域的残基26-32(L1)、50-52(L2)以及91-96(L3)和重链可变区的残基26-32(H1)、53-55(H2)以及96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol，196：901-917(1987))。“构架”或“FR”残基为在CDR侧翼的那些可变结构域残基。FR残基存在于嵌合抗体、人源化的抗体、人源抗体、结构域抗体、双特异性抗体、vaccibody、线性抗体以及双功能抗体。
如本文所用，靶向结合剂、靶向结合蛋白质、特异性结合蛋白质等术语是指优选地与靶向位点结合的抗体或其结合片段。在一个实施方案中，所述的靶向结合剂仅对一个靶向位点是特异性的。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂对多于一个的靶向位点是特异性的。在一个实施方案中，所述的靶向结合剂可以是单克隆抗体，并且所述的靶向位点可以是抗原决定部位。
“结合片段”是通过重组DNA技术或者通过完整抗体的酶解或化学断裂而生产抗体的。结合片段包括Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，dAb以及单链抗体。除了“双特异性”或“双功能”抗体以外的抗体可以理解为具有各自相同的结合位点。当过量的抗体将受体与反受体结合的数量减少至少大约20％、40％、60％或80％，并且更通常大于大约85％时(在体外竞争性结合测试方法中测定)，抗体基本上抑制了受体对反受体的附着。
术语“抗原决定部位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的蛋白质决定簇。抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖的侧链)组成，并且可以但不总是具有特异的三维结构特征以及特异的电荷特征。当解离常数为≤1μM，优选为≤100nM并且最优选为≤10nM时，认为抗体特异性地与抗原结合。
术语“试剂”在本文中用于指化学化合物、化学化合物的混合物、生物学大分子或者由生物学材料制得的提取物。
关于DLL4多肽的“活性的”或“活性”是指具有天然DLL4多肽的生物学或免疫学活性的DLL4多肽部分。“生物学”在本文中用于指由天然DLL4多肽的活性得到的生物学功能。优选的DLL4生物学活性包括例如DLL4诱导的细胞粘连和入侵和/或血管生成和/或增殖。
“哺乳动物”在本文中用于指被认为是哺乳动物的任何动物。优选的是，所述的哺乳动物为人。
“动物”在本文中涵盖了被认为是哺乳动物的动物。优选的是，所述的动物为人。
术语“mAb”是指单克隆抗体。
“脂质体”在本文中用于指可以用于将药品传递给哺乳动物的小囊泡，其中所述的药品可以包括本发明的DLL4多肽或者是针对这种DLL4多肽的抗体。
“标记”或“标记的”在本文中用于指向多肽中加入可检测的部分，例如放射性标记、荧光标记、酶标记、化学发光标记或生物素基团。放射性同位素或放射性核可以包括3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I；荧光标记可以包括若丹明、镧系元素、磷火FITC；酶标记可以包括辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶。
其他标记包括(为了说明而并非进行限定)：酶，例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸酯脱氢酶和过氧化物酶；染料；其他荧光标记或荧光剂，包括例如荧光素及其衍生物、荧光染料、GFP(GFP即“绿色荧光蛋白质”)、丹黄酰类、伞形酮、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛以及荧光胺；荧光团，例如镧系穴状化合物及螯合物，如Europium等(PerkinElmerandCisBiointernational)；化学发光标记或化学发光试剂(chemiluminescer)，例如异氨基苯二酰肼、发光氨和二恶烷；感光剂；辅酶；酶底物；颗粒，例如乳胶颗粒或碳颗粒；金属溶胶；微晶；脂质体；细胞等，其可以进一步用染料、催化剂或其他可检测的基团进行标记；分子，例如生物素、地高辛或5-溴脱氧尿苷；毒素部分，例如选自假单胞菌外毒素(PE、或者其细胞毒素的片段或突变体)、白喉(Diptheria)毒素或者其细胞毒素的片段或突变体、肉毒杆菌毒素A，B，C，D，E或F、蓖麻毒素或者其细胞毒素的片段(例如蓖麻毒素A)、相思豆毒素或者其细胞毒素的片段、皂草素或者其细胞毒素的片段、商陆抗病毒毒素或者其细胞毒素的片段、异株泻根毒蛋白1(bryodin)或者其细胞毒素的片段中的毒素部分。
术语“药物试剂或药品”在本文中用于指当适当地对患者进行给药时能够诱导所需的治疗作用的化学化合物或组合物。根据本领域的常规用法，本文中还是有了其他化学术语，如TheMcGraw-HillDictionaryofChemicalTerms(Parker，S，Ed，McGraw-Hill，SanFrancisco(1985))(该文献以引用方式并入本文)中举例的那些。
如本文所用，“基本上为纯的”是指目标物种为存在的主要物种(即，以摩尔计，在所述的组合物中，目标物种比任何其他单个物种都更加丰富)，并且优选的是基本上为纯的部分为其中目标物种包含所有存在的大分子物种的至少大约50％(以摩尔计)的组合物。通常，基本上为纯的组合物包含所述组合物中存在的所有大分子物种的大于大约80％，更优选的是大于大约85％、90％、95％和99％。更优选的是，将目标物种纯化至基本为同质性的(通过常规的检测方法不能再所述的组合物中检测到污染物种)，其中所述的组合物基本由单一的大分子物种组成。
术语“患者”包括人和兽医的受试对象。
“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达IgFc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶向细胞上的结合抗体，并随后使得所述的靶向细胞溶解。用于介导ADCC的首要细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII以及FcγRIII。造血细胞上FcR的表达概括于RavetchandKinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)的464页表3中。为了估测所关注分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测试，例如在美国专利No.5,500,362或5,821,337中所描述的方法。用于这种测试的可用的效应器细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选择地或此外，可以在体内(例如在Clynesetal.PNAS(USA)95：652-656(1988)如中所公开的动物模型中)估测所关注分子的ADCC活性。“补体依赖的细胞毒性”和“CDC”是指抗体实施它们的细胞杀死功能所采用的机制。该机制是通过C1q(其为补体的第一成分的构成部分)与Igs、IgG或IgM(其与抗原形成络合物)的Fc结构域相结合而引发的(Hughs-Jones，N.C，andB.Gardner.1979.Mol.Immunol.16：697)。C1q为存在于人血清中浓度为70μg/ml的～410kDa的大型络合结构的糖蛋白(Cooper，N.R.1985.Adv.Immunol.37：151)。C1q与两种丝氨酸蛋白酶(C1r和C1s)在一起形成的络合物C1(补体的第一成分)。为了使C1活化，必须使C1q的至少两个N末端球形头与Igs的Fc结合，因此启动补体的级联反应(Cooper，N.R.1985.Adv.Immunol.37：151)。
如本文所用，术语“抗体的半衰期”是指抗体的药代动力学性质，其为在给药之后抗体分子的平均存活时间的量度。抗体的半衰期可以表示为消除已知量的免疫球蛋白的50％所需要的时间，其中所述的免疫球蛋白得自患者身体或其特定的区室(compartment)(例如在血清或血浆中测定(即，循环半衰期)或在其他组织中)。一种免疫球蛋白或一类免疫球蛋白与另一种免疫球蛋白或一类免疫球蛋白的半衰期可以是不同的。通常，对于所给药的抗体而言，在循环中，抗体半衰期的增长使得平均停留时间(MRT)增长。
术语“同种型”是指抗体重链或轻链恒定区的分类。抗体的恒定结构域与抗原的结合无关，但是表现出多种效应器功能。根据重链恒定区的氨基酸序列，给定人源抗体或免疫球蛋白可以指定为免疫球蛋白的五个主要种类(IgA，IgD，IgE，IgG和IgM)中的一种。这些种类中的若干个种类可以进一步分为亚种(同种型)，例如IgG1(γ1)，IgG2(γ2)，IgG3(γ3)和IgG4(γ4)，以及IgA1和IgA2。与免疫球蛋白的不同种类相应的重链恒定区分别被称为α，δ，ε，γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的结构和三维构造是公知的。在多种人源免疫球蛋白种类中，已知仅有人源IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和IgM能够活化补体。已知在人类中，人IgG1和IgG3是可以介导的。人源轻链恒定区可以分为两个主要的种类：γ和λ。
如果需要的话，例如利用不同同种型的生物学性质，特异性结合DLL4的抗体的同种型可以被转变。例如，在某些环境下，在关于作为对抗DLL4的治疗性抗体的抗体的生成中，可能理想的是所述的抗体能够结合补体并参与补体依赖的细胞毒性(CDC)。存在有大量的能够结合补体并参与依赖的细胞毒性的同种型抗体，包括但不限于以下这些：鼠IgM，鼠IgG2a，鼠IgG2b，鼠IgG3，人IgM，人IgA，人IgG1和人IgG3。在另一个实施方案中，在关于作为对抗DLL4的治疗性抗体的抗体的生成中，可能里想的是所述的抗体能够结合效应器细胞上的Fc受体，并参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。存在有大量的能够结合效应器细胞上的Fc受体并参与抗体依赖的细胞毒性的同种型抗体，包括但不限于以下这些：鼠IgG2a，鼠IgG2b，鼠IgG3，人IgG1和人IgG3。应该理解的是，所生成的抗体最开始并非必须具有这种同种型，但是所述的所生成的抗体可以具有任何同种型，并且该抗体可以为在采用本领域公知的常规技术之后而被改变的同种型。此类技术包括使用定点重组技术(例如参见美国专利No.4,816,397)、细胞-细胞融合技术(例如参见美国专利No.5,916,771和6,207,418)等。
例如，本文所讨论的抗DLL4的抗体为全人源抗体。如果所具有的抗体需要与DLL4相结合，可以在仍具有相同的可变区(其定义了抗体的特异性和部分亲和性)的同时，容易地为被改变从而形成人IgM、人IgG1或人IgG3同种型的同种型。然后，此类分子能够结合补体并参与CDC；和/或能够结合效应器细胞上的Fc受体并参与ADCC。
“全血测试”使用了未分级的血液作为天然效应器的来源。血液的血浆中包含补体、以及表达FcR的细胞效应器(例如多形性核细胞(PMN)和单核细胞(MNC))。因此，全血测试可以同时评价体外ADCC和CDC效应器机制的协同作用。
如本文所用，“治疗有效”量为向受试对象提供某些改善或益处的量。换言之，“治疗有效”量为在至少一个临床症状中提供一定程度的减缓、减轻和/或降低的量。与可以通过本发明的方法治疗的紊乱相关的临床症状是本领域的技术人员所公知的。此外，本领域的技术人员可以理解的是治疗效果并非必须是完全的或治愈的，只要提供给受试对象某些益处即可。
如本文所用，术语“和/或”被认为是两种特定的特征或成分中的每一种(包括另一种或不包括另一种)的具体的公开。例如“A和/或B”被认识是(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一种的具体公开，如同每一种都在本文中单独列出一样。
抗体的结构
已知，抗体的基本结构包含四聚体。每个四聚体都由两个相同的多肽链对构成，每个多肽链对都具有一条“轻”链(大约25kDa)和一条“重”链(大约50-70kDa)。每条链的氨基末端都包含主要用于抗原识别的大约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端都定义了主要用于效应器功能的恒定区。人源轻链可以分为γ和λ轻链。重链可以分为μ、δ、γ、α和ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM，IgD，IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区相连，而重链还包含大约10以上的氨基酸的“D”区。通常参见FundamentalImmunologyCh.7(Paul，W，ed.，2nded.RavenPress，N.Y.(1989))(该文献以引用方式并入本文以用于所有目的)。各轻链/重链对的可变区形成可抗体的结合位点。
因此，完整的抗体具有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体以外，所述的两个结合位点是相同的。
所述的链都表现为相对保守的构架区(FR)通过三个高变区(也称为CDR)相连的相同的常规结构。得自各多肽对的两条链的CDR通过构架区对其，从而能够结合特异性的抗原决定部位。由N末端至C末端，轻链和重链都包含结构域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。分配在各结构域中的氨基酸根据了KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1987和1991))或Chothia&LeskJ.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothiaetal.Nature342：878-883(1989)的定义。
双特异性或双功能抗体为具有两条不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可以通过多种方法(包括杂交瘤细胞的融合或者链接Fab’片段)制备。例如参见Songsivilai&LachmannClin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)，Kostelnyetal.J.Immunol.148：1547-1553(1992)。在具有单结合位点的片段形式(例如Fab，Fab’和Fv)中，不存在双特异性抗体。
通常，VH结构域与VL结构域配对，从而提供了抗体的抗原结合位点，但是单独的VH或VL结构域也可以用于结合抗原。VH结构域(参见表2)可以与VL结构域(参见表2)配对，这样形成了包含VH和VL结构域的抗体的抗原结合位点。
人源抗体和抗体的人源化
人源抗体避免了与具有鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体有关的一些问题。这种鼠或大鼠的衍生蛋白质的存在可以使得所述的抗体被快速清除，或者可以使患者产生对抗所述抗体的免疫应答。为了避免使用鼠或大鼠的衍生抗体，可以通过将功能人源抗体的基因座引入到啮齿动物、其他哺乳动物或动物中来生成全人源抗体，使得啮齿动物、其他哺乳动物或动物产生全人源抗体。
用于生成全人源抗体的一种方法为使用XenoMouse品系的小鼠，该小鼠经过基因工程操作而包含人源重链基因座和γ轻链基因座的、至多且少于1000kb尺寸的种系改装片段。参见Mendezetal.NatureGenetics15：146-156(1997)和GreenandJakobovitsJ.Exp.Med.188：483-495(1998)。XenoMouse品系的小鼠得自Amgen公司(Fremont，California，U.S.A)。
然后，这种小鼠能够产生人源免疫球蛋白分子和抗体，并且在鼠免疫球蛋白分子和抗体的生产中具有缺陷。用于取得上述结果的技术在1996年12月3日提交的美国专利申请系列No.08/759,620和1998年6月11日公开的国际专利申请No.WO98/24893和2000年12月21日公开的WO00/76310中有所公开，这些文献的公开内容以引用方式并入本文。此外，参见Mendezetal.NatureGenetics15：146-156(1997)，该文献的公开内容以引用方式并入本文。
在1990年1月12日提交的美国专利申请系列No.07/466,008、1990年11月8日提交的07/610,515、1992年7月24日提交的07/919,297、1992年7月30日提交的07/922,649、1993年3月15日提交的08/031,801、1993年8月27日提交的08/112,848、1994年4月28日提交的08/234,145、1995年1月20日提交的08/376,279、1995年4月27日提交的08/430,938、1995年6月27日提交的08/430,938、1995年6月5日提交的08/464,584、1995年6月5日提交的08/464,582、1995年6月5日提交的08/463,191、1995年6月5日提交的08/462,837、1995年6月5日提交的08/486,853、1995年6月5日提交的08/486,857、1995年6月5日提交的08/486,859、1995年6月5日提交的08/462,513、1995年10月2日提交的08/724,752、1996年12月3日提交的08/759,620、2001年11月30日提交的美国公开2003/0093820、以及美国专利No.6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598及日本专利No.3068180B2、3068506B2和3068507B2中，进一步讨论和描述了XenoMouse品系的小鼠的生产。此外，参见1996年6月12日公开授予的欧洲专利No，EP0463151B1、1994年2月3日公开的国际专利申请No，WO94/02602、1996年10月31日公开的国际专利申请No，WO96/34096、1998年6月11日公开的WO98/24893、2000年12月21日公开的WO00/76310。上文所述专利、申请和参考文献的各个公开内容在此均以引用方式全文并入本文。
在备选的方法中，其他人(包括GenPharmInternational公司)采用了“迷你基因座”的方法。在迷你基因座方法中，通过包含得自Ig基因座的片段(单个基因)而模仿了外源Ig基因座。因此，在构建子(construct)中形成一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区以及通常的第二恒定区(优选为γ恒定区)，以用于***到动物中。这种方法在Suranietal.的美国专利No.5,545,807、均属于Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806，5,625,825，5,625,126，5,633,425，5,661,016，5,770,429，5,789,650，5,814,318，5,877,397，5,874,299和6,255,458、Krimpenfort和Berns的美国专利No.5,591,669和6,023.010、Bernsetal的美国专利No.5,612,205，5,721,367和5,789,215、以及Choi和Dunn的美国专利No.5,643,763；以及1990年8月29日提交的GenPharm国际美国专利申请系列No.07/574,748、1990年8月31日提交的07/575,962、1991年12月17日提交的07/810,279、1992年3月18日提交的07/853,408、19926月23日提交的07/904,068、1992年12月16日提交的07/990,860、1993年4月26日提交的08/053,131、1993年7月22日提交的08/096,762、1993年11月18日提交的08/155,301、1993年12月3日提交的08/161,739、1993年12月10日提交的08/165,699、1994年3月9日提交的08/209,741中有所描述，这些文献的公开内容均以引用方式并入本文。此外，参见欧洲专利No.0546073B1、国际专利申请No.WO92/03918，WO92/22645，WO92/22647，WO92/22670，WO93/12227，WO94/00569，WO94/25585，WO96/14436，WO97/13852和WO98/24884以及美国专利No.5,981,175，这些文献的公开内容均以引用方式全文并入本文。进一步参见Tayloretal，1992，Chenetal，1993，Tuaillonetal，1993，Choietal，1993，Lonbergetal，(1994)，Tayloretal，(1994)，和Tuaillonetal，(1995)，Fishwildetal，(1996)，这些文献的公开内容均以引用方式全文并入本文。
Kirin还论证了得自小鼠的人源抗体的生成，其中通过微细胞融合而引入大片段的染色体或整条染色体。参见欧洲专利申请No.773288和843961，该文献的公开内容以引用方式并入本文。此外，已经产生了KMTM-小鼠，其为Kirin的Tc小鼠与Medarex的迷你基因座(Humab)小鼠的杂交育种的结果。这些小鼠具有Kirin小鼠的人源IgH导入染色体和Genpharm小鼠的γ链转基因(Ishidaetal，CloningStemCells，(2002)4：91-102)。
人源抗体还可以通过体外方法衍生得到。合适的实例包括但不限于噬菌体展示(MedImmune，Morphosys，Dyax，Biosite/Medarex，Xoma，Symphogen，Alexion(formerlyProliferon)，Affimed)、核糖体展示(MedImmune)、酵母菌展示等。
抗体的制备
如本文所述，通过使用XenoMouse技术(下文中详细描述)来制备抗体。这种小鼠能够产生人源免疫球蛋白分子和抗体，并且在鼠免疫球蛋白分子和抗体的产生中是有缺陷的。用于取得上述结果的技术在本文的背景技术部分公开的专利、申请和参考文献中有所公开。但是具体而言，小鼠和所得的抗体的转基因生产的优选实施方案在1996年12月3日提交的美国专利申请系列No.08/759,620、1998年6月11日公开的国际专利申请No.WO98/24893和2000年12月21日公开的WO00/76310中有所描述，这些文献的公开内容以引用方式并入本文。此外，参见Mendezetal.NatureGenetics15：146-156(1997)，该文献的公开内容以引用方式并入本文。
通过采用这些技术，已经生产出针对多种抗原的全人源单克隆抗体。基本上为，使用所关注的抗原(例如DLL4)免疫XenoMouse系小鼠，由超免疫的小鼠中回收淋巴细胞(例如B细胞)，并将回收的淋巴细胞与骨髓类细胞系融合，从而制备得到无限增殖的杂交瘤细胞系。对这些杂交瘤细胞系进行筛查和选择，从而鉴定出能够产生特异性地针对所关注的抗原的抗体的杂交瘤细胞系。本文提供了用于产生能够生成对DLL4具有特异性的抗体的多发性杂交瘤细胞系的方法。此外，本文提供了由所述的这种细胞系产生的抗体的特征，包括所述抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。
可选择地，不采用将B细胞融合到骨髓瘤细胞中以产生杂交瘤细胞的方法，可以直接测试B细胞。例如，可以由超免疫的XenoMouse小鼠中分离CD19+B细胞，并使其增殖和分化形成分泌抗体的血浆细胞。然后，针对对抗DLL4免疫原的反应性，通过例如ELISA、FACS或FMAT来筛查得自细胞上清液中的抗体。还可以针对对抗DLL4的片段的免疫反应性来筛查上清液，从而进一步针对与DLL4上的所关注的功能结构域的结合情况来进一步绘制(map)不同的抗体。抗体还可以筛选其他相关人DLL4和针对大鼠、小鼠与非人灵长动物例如短尾猴、DLL4同源物，后者确定种类的交叉反应性。得自装有所关注抗体的孔中的B细胞可以通过多种方法而形成无限增殖的，包括进行融合从而由单个的或由合并的孔制得杂交瘤细胞，或者使用EBV进行感染或通过已知的无限增殖基因进行转染，然后平板接种于合适的培养基中。可选择地，然后采用DLL4特异性的溶血空斑测试来分离具有所需特异性的分泌抗体的单种血浆细胞(例如参见Babcooketal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：7843-48(1996))。靶向溶解的细胞优选为使用DLL4抗原涂覆的绵羊红血细胞(SRBC)。
在包含血浆细胞(其分泌所关注的免疫球蛋白和补体)的B细胞培养物存在的条件下，斑点的形成表明包围所关注的血浆细胞的绵羊血液红细胞发生了特异性的DLL4介导的水解。可以分离出处于所述斑点中心的单个的抗原特异性血浆细胞，并且由单个的血浆细胞中分离得到编码了抗体的特异性的遗传信息。采用逆转录以及随后的PCR(RT-PCR)，可以克隆编码所述抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA。然后，可以将这种克隆的DNA进一步***到合适的表达载体中，优选的是载体盒，例如pcDNA，更优选的是例如包含免疫球蛋白重链和轻链的恒定结构域的pcDNA载体。然后，可以将所生成的载体转染到宿主细胞(例如HEK293细胞、CHO细胞)中，并在常规营养培养基(按照适用于诱导转录、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的条件进行修改)中进行培养。
如所理解的那样，特异性结合DLL4的抗体可以在除了杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。编码特定抗体的序列可以用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。转化可以通过任何已知的用于将多核苷酸引入到宿主细胞中或通过本领域中已知的转染过程的方法(例如包括将所述的多核苷酸包装到病毒中(或病毒载体中)并用所述的病毒(或载体)转导宿主细胞，如在美国专利No.4,399,216，4,912,040，4,740,461和4,959,455中示例说明的那样，这些专利文献在此以引用方式并入本文)进行。所采用的转化过程取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞中的方法是本领域公知的，并包括右旋糖酐介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核甘酸囊封与脂质体中以及将DNA直接微注射到核中。
可以用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞是本领域公知的，并且包括得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)中的许多无限增殖的细胞系，包括但不限于中国仓鼠***(CHO)、HeLa细胞、幼地鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(COS)、人肝细胞的癌细胞(例如HepG2)、人上皮肾293细胞、以及多种其他细胞系。通过测定哪种细胞系具有高的表达水平并产生具有构成性DLL4结合性质的抗体来选择特定优选的细胞系。
在细胞-细胞融合技术中，制备拥有具有任何所需同种型的重链的骨髓瘤、CHO细胞或其他细胞系，并制备拥有轻链的另一种骨髓瘤、CHO细胞或其他细胞系。因此，这种细胞可以被融合，并且可以分离出表达完整抗体的细胞系。
因此，当生成满足上文所述的所需“结构”特性的抗体候选物时，通常可以通过同种型改变来提供具有至少某些所需“功能”特性的抗体候选物。
治疗给药和配制物
本发明的实施方案包括可用作疾病治疗的抗DLL4抗体的无菌药物配制物。这种配制物会抑制结合Notch1或Notch4受体的天然DLL4的结合，因此会有效地治疗其中例如血清或阻止DLL4的表达异常升高的病理学状况。抗DLL4的抗体优选的是具有足够的亲和性，从而有效地抑制天然DLL4与Notch1或Notch4受体的结合，并且优选的是所述的抗体足够的作用时间，从而在人中较少的进行定量给药。持久的作用时间可以通过交替的肠胃外途径(例如皮下注射或肌肉内注射)而具有较低频率和更加方便的定量给药时间表。
例如，可以通过在抗体的冻干和再构建之前或之后滤过无菌滤膜而创建得到。所述的抗体通常以冻干形式储存或储存于溶液中。通常，将治疗抗体的组合物放置在具有无菌通道口(例如静脉输液袋)的容器中，或者具有适配器(其可以取回所述的配制物，例如可通过皮下注射针穿孔的阻塞物)的瓶子。
抗体的给药途径根据已知方法进行，例如通过静脉、腹膜内、大脑内、肌肉内、眼内、动脉内、膜内注射或注入，吸入或病灶内途径，直接注射到肿瘤位点，或者通过以下所述的缓释***。所述的抗体优选的是通过注入或通过团注而进行连续地给药。
待治疗用的抗体的有效量取决于(例如)治疗目标、给药途径以及患者的状况。因此，优选的是治疗专家对计量进行效价，并按照需要来修改给药途径以获得最佳的治疗效果。通常，临床医生给药抗体，直到达到取得所需效果的剂量为止。这种治疗过程可以通过常规的测试方法或通过本文所述的测试方法容易地监测。
可以在具有可药用的载体中制备本文所述的抗体。这种治疗组合物可以通过静脉内给药，或者通过鼻或肺的形式(优选的是以液体或粉末气雾剂(冻干的)的形式)进行给药。还可以根据需要以肠胃外或皮下的方式给药所述的组合物。当进行***给药时，所述的治疗组合物应该是无菌的，无热原的，并且为适当考虑了pH、等渗性和稳定性的可肠胃外用药的溶液形式。所述的这些状况是本领域的技术人员已知的。简言之，制备本文所述化合物的剂量配制物，以用于储存或通过将具有所需纯度的化合物与可药用的载体、赋形剂或稳定剂混合来进行给药。所述的这种材料在所使用的剂量和浓度下对受试者是非独显的，并且包括缓冲剂，例如TRISHCl、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其他有机酸盐；抗氧化剂，例如聚精氨酸、蛋白质(例如血清白蛋白)、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；抗衡离子，例如钠和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。
可以根据在Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy(20thed.，LippincottWilliams&WilkensPublishers(2003))中所述的常规的制药实践来配制用于注射的无菌组合物。例如，所述的活性化合物溶解或悬浮于可药用的载体(例如水、天然形成的植物油(如芝麻油、花生油或棉籽油)、或者合成的脂肪媒介物(如油酸乙酯等))中可能是理想的。根据可药用的实践并入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。
缓释制备物的合适实例包括含有多肽的固态疏水性聚合物的半透性基质，其中所述的基质为成形制品、膜或微囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)如Langeretal，J.BiomedMater.Res，(1981)15：167-277和Langer，Chem.Tech，(1982)12：98-105所述，或者聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利No.3,773,919、EP58,481)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidmanetal，Biopolymers，(1983)22：547-556)、不可降解的乙烯-醋酸乙烯(Langeretal，上文)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRONDepotTM，由乳酸-乙醇酸共聚物与醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)、以及聚-D-(-)-3-羟丁酸(EP133,988)。
虽然诸如乙烯-醋酸乙烯和乳酸-乙醇酸之类的聚合物能够在100天的时间内释放分子，但是某些水凝胶在较短的时间内释放蛋白质。当囊封的蛋白质在体内长时间保持时，作为在37℃下暴露于潮湿环境的结果，它们会变性或聚集，从而导致生物学活性的损失以及免疫原性可能发生的变化。可以根据所涉及的机制，针对蛋白质的稳定来设计合理的策略。例如，如果发现聚集机制为通过二硫键的互换而在分子内形成S-S键，则可以通过对巯基残基进行修饰、由酸性溶液中冻干、控制含水量、使用合适的添加剂以及研发特定的聚合物基质组合物来取得稳定。
缓释组合物还包括在合适的配制物(能够在悬浮溶液中保持为晶体)中悬浮的抗体晶体的制备。当这些制备物采用皮下或腹膜内的方式进行注射时，其能够产生缓释效果。其他组合物还包括脂质体包封抗体。包含这种抗体的脂质体本身可以通过已知的方法制备：美国专利No.DE3,218,121；Epsteinetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1985)82：3688-3692；Hwangetal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1980)77：4030-4034；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；142,641；日本专利申请83-118008；美国专利No.4,485,045和4,544,545；以及EP102,324。
通过主治医生考虑已知的多种因素来修改药品的作用来确定用于给定患者的抗体配制物的剂量，其中所述的因素包括疾病的严重程度和类型、体重、性别、日常饮食、给药的时间和途径、其他药剂以及其他相关的临床因素。可以通过体外或体内方法来确定治疗有效的剂量。
待治疗用的本文所述的抗体的有效量取决于(例如)治疗目标、给药途径以及患者的状况。因此，优选的是治疗专家对计量进行效价，并按照需要来修改给药途径以获得最佳的治疗效果。根据上文提及的因素，常规的每日剂量可以为患者体重的大约0.0001mg/kg，0.001mg/kg，0.01mg/kg，0.1mg/kg，1mg/kg，10mg/kg至最多100mg/kg，1000mg/kg，10000mg/kg或更多。根据上文提及的因素，所述的剂量可以为患者体重的0.0001mg/kg至20mg/kg，0.0001mg/kg至10mg/kg，0.0001mg/kg至5mg/kg，0.0001至2mg/kg，0.0001至1mg/kg，0.0001mg/kg至0.75mg/kg，0.0001mg/kg至0.5mg/kg，0.0001mg/kg至0.25mg/kg，0.0001至0.15mg/kg，0.0001至0.10mg/kg，0.001至0.5mg/kg，0.01至0.25mg/kg或者0.01至0.10mg/kg。通常，临床医生给药治疗性的抗体，直到达到取得所需效果的剂量为止。这种治疗过程可以通过常规的测试方法或通过本文所述的测试方法容易地监测。
本发明抗体的单次剂量可以重复，并且给药操作可以间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
应该理解的是，根据本文所述的组合物和方法对治疗实体的给药操作可以与合适的载体、赋形剂以及其他试剂(其被并入到配制物中以提供改善的转移、传递、耐受等)一起给予。这些配制物包括(例如)粉末、糊状物、软膏、胶状物、蜡、油、脂质、包含囊泡(例如LipofectinTM)的脂质(阳离子或阴离子)、DNA缀合物、无水吸附糊状物、水包油及油包水的乳液、聚乙二醇(各种分子量的聚乙烯醇)、半固体凝胶、以及包含聚乙二醇的半固体混合物。根据本发明，在进行处理和治疗中，任何之前所述的混合物都是合适的，只要配制物中的活性组分没有因配制过程而失活并且所述的配制物是生理学相容的并耐受给药途径。此外参见BaldrickP.“Pharmaceuticalexcipientdevelopment：theneedforpreclinicalguidance.”Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2)：210-8(2000)，WangW.“Lyophilizationanddevelopmentofsolidproteinpharmaceuticals.”Int.JPharm.203(1-2)：1-60(2000)，CharmanWN“Lipids，lipophilicdrugs，andoraldrugdelivery-someemergingconcepts.”JPharmSci.89(8)：967-78(2000)，Powelletal.“Compendiumofexcipientsforparenteralformulations”PDAJPharmSciTechnol.52：238-311(1998)，并且其中用于与配制物、赋形剂和载体有关的其他信息的引文都是药物化学剂所公知的。
其他疗法的设计和产生
根据本发明并基于本文中针对DLL4所产生并表征的抗体的活性，设计抗体部分以外的其他治疗形式是方便的。这种形式包括但不限于改进的抗体疗法，例如双特异性抗体、免疫毒素和放射性标记疗法；单结构域抗体；抗体片段，例如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv或dAb；肽疗法的形成；新型支架中的DLL4结合结构域；基因疗法；特定的细胞内抗体；反义疗法；以及小分子。
可以通过在非抗体蛋白质支架(例如纤维连接蛋白或细胞色素B等)上排布CDR(Haan&Maggos(2004)BioCentury，12(5)：A1-A6；Koideetal.(1998)JournalofMolecularBiology，284：1141-1151；Nygrenetal.(1997)CurrentOpinioninStructuralBiology，7：463-469)，或者通过随机排列或突变位于蛋白质支架中环的氨基酸残基以赋予针对所需靶物的结合特异性来提供抗原结合位点。Nygrenetal.对用于蛋白质中的新型结合位点进行基因工程的支架进行了详细的综述(Nygrenetal.(1997)CurrentOpinioninStructuralBiology，7：463-469)。用于抗体模拟物的蛋白质支架在WO/0034784(该文献以引用方式全文并入本文)中有所公开，其中发明人描述了具有至少一个随机排列的环的纤维连接蛋白III型结构域的蛋白质(抗体模拟物)。其中移植有一个或多个CDR(例如一组HCDR)的合适的支架可以由免疫球蛋白的基因超家族的任何结构域成员来提供。所述的支架可以为人或非人蛋白质。非抗体蛋白质的优点在于其可以在支架分子中提供抗原结合位点，其中所述的支架分子比至少某些抗体分子更小和/或更容易制造。小尺寸的结合成员可以赋予有用的生理学性质，例如能够进入细胞，深入地渗透到组织中或到达位于其他结构中的靶物中，或者在靶向抗原的蛋白质空腔中结合。在Wess，2004中对抗原结合位点在非抗体蛋白质支架中的用途进行了综述(Wess，L.In：BioCentury，TheBernsteinReportonBioBusiness，12(42)，A1-A7，2004)。具有稳定的主链以及一个或多个可变环的蛋白质是典型的，其中所述环的氨基酸序列发生特异性的货随机的突变，从而创建出能够结合靶向抗原的抗原结合位点。所述的这种蛋白质包括得自S.aureus的蛋白质的IgG结合结构域、铁传递蛋白、白蛋白、四连接素、纤维连接蛋白(例如，第10个纤维连接蛋白的III型结构域)、脂钙蛋白以及γ结晶性和其他AffilinTM支架(Scil蛋白质)。其他方法的实例包括基于具有分子内二硫键的环蛋白-小蛋白质的合成“微体”、微蛋白(VersabodiesTM，Amunix)以及锚蛋白重复蛋白质(DARPins，MolecularPartners)。
除了抗体序列和/或抗原结合位点以外，根据本发明的靶向结合剂可以包含例如形成肽或多肽(例如支架结构域)或者赋予所述分子除了结合抗原的能力之外的其他功能特征的其他氨基酸。本发明的靶向结合剂可以带有可检测的标记，或者可以与毒素、靶向部分或酶(例如通过肽键或连接体)缀合。例如，靶向结合剂可以包含催化位点(例如在酶结构域中)以及抗原结合位点，其中所述的抗原结合位点与所述的抗原结合并因此使催化位点靶向所述的抗原。所述的催化位点可以抑制所述抗原的生物学功能(例如通过裂解)。关于早期抗体疗法(其中补体结合为理想的特性)的产生，可以在通过使用(例如)双特异性抗体、免疫毒素或放射性标记来杀死细胞时避免对补体的依赖。
例如，可以生成双特异性抗体，其包含(i)两个抗体，其中一个抗体对DLL4具有特异性，而与第一个抗体缀合连接的另一个抗体对第二分子具有特异性，(ii)单个抗体，其具有对DLL4具有特异性的一条链以及对第二分子具有特异性的第二条链；或者(iii)单链抗体，其对DLL4和其他分子具有特异性。可以采用公知的技术来生成这种双特异性抗体，例如(i)和(ii)例如参见Fangeretal.ImmunolMethods4：72-81(1994)andWrightandHarris，上文.；以及(iii)例如参见Trauneckeretal.Int.J.Cancer(Suppl.)7：51-52(1992)。在各种情况下，可以制得针对重链活性受体的第二特异性，包括但不限于CD16或CD64(例如参见Deoetal.Immunol.Today18：127(1997))、或者CD89(例如参见Valeriusetal.Blood90：4485-4492(1997))。
还可以采用本领域公知的技术对抗体进行修饰，从而起到免疫毒素的作用。例如参见VitettaImmunolToday14：252(1993)。此外，参见美国专利No.5,194,594。关于放射性标记抗体的制备，还可以采用本领域公知的技术容易地制备这种经过修饰的抗体。例如参见Junghansetal.inCancerChemotherapyandBiotherapy655-686(2dedition，ChafnerandLongo，eds，LippincottRaven(1996))。此外，参见专利No.4,681,581，4,735,210，5,101,827，5,102,990(RE35,500)，5,648,471以及5,697,902。各种免疫毒素或放射性标记的分子还可能杀死表达所需多聚体蛋白酶亚基的寡聚结构域的细胞。
当抗体与试剂(例如放射性同位素、药物组合物或毒素)连接时，预计所述的试剂具有选自抗有丝***剂、烷化剂、抗代谢物试剂、抗血管增生试剂、细胞凋亡试剂、生物碱试剂、COX-2试剂、抗生素试剂以及他们的组合的药物性质。所述的药品可以选自氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝酸类、三氮烯、叶酸类似物、蒽环类抗生素、紫杉烷类、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、抗生素、酶、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、拮抗剂、内皮他丁、紫杉醇、喜树碱、奥沙利铂、阿霉素以及它们的类似物和组合。
毒素的实例进一步包含白树毒素、假单胞菌外毒素(PE)、PE40、PE38、白喉毒素、蓖麻毒素、红豆因、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(Rnase)、DnaseI、葡萄球菌外毒素-A、商陆抗病毒蛋白质、白树毒素、假单胞菌外毒素、烯二炔分子家族的成员(例如次孢霉素和埃斯培拉霉素)、以及它们的衍生物、组合物和修饰物。化学毒素还可以得自倍癌霉素(例如参见美国专利No.5,703,080和美国专利No.4,923,990)、甲氨蝶呤、阿霉素、美法仑、苯丁酸氮芥、ARA-C、去乙酰长春酰胺、丝裂霉素C、顺铂、依托泊苷、博来霉素以及5-氟尿嘧啶。化学治疗剂的实例还包括阿霉素、亚德里亚霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、塞替派、泰素帝(多西他奇)、白消安、细胞毒素、紫杉醇、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊苷、道诺霉素、洋红霉素、氨喋呤、放线菌素、丝裂霉素、埃斯波霉素(参见美国专利No.4,675,187)、美法仑和其他相关氮芥。合适的毒素和化疗剂在Remington’sPharmaceuticalSciences，19thEd.(MackPublishingCo.1995)中和GoodmanAndGilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics，7thEd.(MacMillanPublishingCo.1985)中有所描述。其他合适的毒素和/或化疗剂是本领域的技术人员所公知的。
放射性同位素的实例包括可以用于定位和/或治疗的γ-发光器、正电子发光器、以及X射线发光器；以及可以用于治疗的β-发光器和α-发光器。可用于诊断、预防和分期的之前所述的放射性同位素还可以用于治疗。
抗癌或抗白血病试剂的非限定性实例包括蒽环类抗生素，例如亚德里亚霉素(阿霉素)、道诺霉素(正定霉素)、去甲氧正定霉素、地托比星、洋红霉素、表柔比星、依索比星以及它们的吗啉代和取代衍生物、组合及修饰物。药物试剂的实例包括顺铂、紫杉醇、烯二炔类抗生素、长春新碱、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺、***、道诺霉素、去甲氧正定霉素、氟达拉滨、苯丁酸氮芥、干扰素α、羟基脲、替莫唑胺、镇静剂、博来霉素、以及它们的衍生物、组合物和修饰物。优选的是，所述的抗癌或抗白血病药物为亚德里亚霉素、吗啉代亚德里亚霉素或吗啉代道诺霉素。
本发明的抗体还涵盖了在哺乳动物(优选为人)中具有半衰期(例如血清半衰期)的抗体(其半衰期大于未经修饰的抗体的半衰期)。所述抗体的半衰期可以大于大约15天、大于大约20天、大于大约25天。大于大约30天、大于大约35天、大于大约40天、大于大约45天、大于大约2个月、大于大约3个月、大于大约4个月或者大于大约5个月。本发明的抗体或其片段在哺乳动物(优选为人)中半衰期的增大使得所述抗体或抗体片段在所述哺乳动物中的血清效价更高，因此，减少了所述抗体或抗体片段的给药频率和/或降低了所述抗体或抗体片段的给药浓度。可以通过本领域的技术人员已知的技术来生产体内半衰期增大的抗体或其片段。例如，通过对氨基酸残基(其按照与Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用有关的方法鉴定)进行修饰(例如取代、删除或添加)来生产体内半衰期增大的抗体或其片段(例如参见国际公开No.WO97/34631和WO02/060919，该文献以引用方式全文并入本文)。可以通过将所述的抗体或其片段附着在聚合物分子(例如高分子量的聚乙二醇(PEG))上来生产体内半衰期增大的抗体或其片段。可以通过PEG与所述抗体或抗体片段的N末端或C末端形成位点特异性的缀合或者通过赖氨酸残基上存在的ε氨基而使得PEG附着在具有多功能连接体或不具有多功能连接体的所述抗体或抗体片段。可以使用使得生物学活性损失最小的线性或支状聚合物的衍生物。可以通过SDS-PAGE和质谱来密切监测缀合程度，以确保PEG分子与所述抗体形成适度的缀合。通过例如尺寸排阻色谱或离子交换色谱来由抗体-PEG缀合物种分离未反应的PEG。
如本领域的技术人员所理解的那样，在上述实施方案中，尽管亲和性值可能是重要的，但是其他因素可能与亲和性值一样重要或者更重要，这取决于所述抗体的特定功能。例如，对免疫毒素(与抗体有关的毒素)而言，抗体与靶物的结合作用可能是有用的，但是在某些实施方案中，使所述毒素内化入所述的细胞才是所需的最终结果。这样，在这种情况下，具有高的百分内化率的抗体可能是理想的。因此，在一个实施方案中，考虑具有高的内化效率的抗体。可以按照内化抗体的百分率来测定高效的内化率，并且可以为较低的值至100％。例如，在改变的实施方案中，0.1-5，5-10，10-20，20-30，30-40，40-45，45-50，50-60，60-70，70-80，80-90，90-99和99-100％可以为高效的。如本领域的技术人员所理解的那样，在不同的实施方案中，理想的效率可以是不同的，这取决于(例如)相关试剂、可能给药至一定区域的抗体的量、抗体-试剂络合物的副作用、待处理的问题的类型(例如癌症的类型)和严重程度。
在其他实施方案中，本文所公开的抗体提供了用于检测哺乳动物组织或细胞中DLL4的表达情况的测试试剂盒，以便针对与DLL4的表达变化相关的疾病或紊乱进行筛查。所述的试剂盒包括与DLL4结合的抗体以及用于表明所述抗体与所述抗原(如果存在的话)的反应情况的手段。
结合
本文所定义的靶向结合剂或抗体可以以单独疗法的形式施加或者可以涉及常规的手术或者放疗或化疗(除了本发明的化合物以外)。这种化疗可以包括一种或多种以下类别的抗肿瘤试剂：
(i)如在医学肿瘤学中使用的其他抗增殖/抗赘生药品及其结合物，例如烷化剂(例如顺铂、奥沙利铂、卡波铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、替膜唑胺和亚硝基脲)；抗代谢物(例如2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷和抗叶酸素，如羟基脲(如5-氟尿嘧啶和喃氟啶)、甲氨蝶呤、胞核嘧啶、***糖苷和羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类制剂，如阿霉素、博来霉素、亚德里亚霉素、道诺霉素、表柔比星、去甲氧正定霉素、丝裂霉素C、放线菌素和光神霉素)；抗有丝***剂(例如长春花生物碱(如长春新碱、长春碱、去乙酰长春酰胺和长春瑞滨)、紫杉烷(如紫杉醇和泰索帝)以及polokinase抑制剂)；以及拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(如依托泊苷和替尼泊苷)、安吖啶、托泊替康和喜树碱)；
(ii)细胞生长抑制剂，例如抗***(例如三苯氧胺、氟维司群、比卡鲁胺、雷洛昔芬、屈洛昔芬和iodoxyfene)、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他胺、安得乐和醋酸去乙酰环丙氯地孕酮)、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如性激素阻滞药、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如阿纳托唑、来曲唑、伏氯唑以及依西美坦)以及5-还原酶的抑制剂(例如非那司提)；
(iii)抗侵入剂(例如c-Src激酶家族的抑制剂，如4-(6-氯-2，3-亚甲基二氧苯胺)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基羟喹唑啉(AZD0530；国际专利申请WO01/94341)和N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-氨甲酰(dasatinib，BMS-354825；J.Med.Chem，2004，47，6658-6661)；以及金属蛋白酶抑制剂(如马马司他、尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化剂受体功能的抑制剂、组织蛋白酶的抑制剂、丝氨酸蛋白酶(如蛋白裂解酶、hepsin、尿激酶)的抑制剂)、类肝素酶的抑制剂)；
(iv)细胞毒性剂，例如氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷、苯丁酸氮芥或亚德里亚霉素，以及它们的组合，例如氟达拉滨+环磷酰胺；CVP：环磷酰胺+长春新碱+***；ACVBP：亚德里亚霉素+环磷酰胺+去乙酰长春酰胺+博来霉素+***；CHOP：环磷酰胺+亚德里亚霉素+长春新碱+***；CNOP：环磷酰胺+米托蒽醌+长春新碱+***；m-BACOD：甲氨蝶呤+博来霉素+亚德里亚霉素+环磷酰胺+长春新碱+***+甲酰四氢叶酸；MACOP-B：甲氨蝶呤+亚德里亚霉素+环磷酰胺+长春新碱+固定剂量的***+博来霉素+甲酰四氢叶酸；或者ProMACECytaBOM：***+亚德里亚霉素+环磷酰胺+依托泊苷+阿糖胞苷+博来霉素+长春新碱+甲氨蝶呤+甲酰四氢叶酸。
(v)生长因子功能的抑制剂，例如这种抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体(例如抗erbB2抗体曲妥单抗[HerceptinTM]、抗EGFR抗体帕尼单抗、抗erbB1抗体西妥昔单抗[Erbitux，C225]以及Sternetal.Criticalreviewsinoncology/haematology，2005，Vol.54，pp11-29所公开的任何生长因子或生长因子受体抗体)；这种抑制剂还包括酪氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，ZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(埃罗替尼，OSI-774)以及6-丙烯氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉-4-胺(CI1033)；erbB2酪氨酸激酶抑制剂，如拉帕替尼；肝细胞生长因子家族的抑制剂；血小板衍生的生长因子家族的抑制剂，如伊马替尼；丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如Ras/Raf信号传导抑制剂，如法呢基转移酶抑制剂，如索拉非尼(BAY43-9006))；通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号传导的抑制剂；肝细胞生长因子家族的抑制剂；c-kit抑制剂；abl激酶抑制剂；IGF受体(***)激酶抑制剂；aurora激酶抑制剂(例如AZD1152，PH739358，VX-680，MLN8054，R763，MP235，MP529，VX-528和AX39459)；细胞周期依赖的激酶抑制剂，例如CDK2和/或CDK4抑制剂；以及存活信号传导蛋白质的抑制剂，例如Bcl-1、Bcl-XL(如ABT-737)；
(vi)抗血管增生的试剂，例如抑制血管内皮生长因子的作用的那些[例如抗血管内皮细胞生长因子的抗体贝伐单抗(AvastinTM)；血管生成素-2抑制剂；以及VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，例如4-(4-溴-2-氟苯氨基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474；WO01/32651的实施例2)；4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171；WO00/47212的实施例240)；瓦他拉尼碱(PTK787；WO98/35985)；SU11248(舒尼替尼；WO01/60814；SutentTM)；索拉菲尼(NexxavarTM)；化合物，如在国际专利申请WO97/22596，WO97/30035，WO97/32856，WO98/13354，WO00/47212和WO01/32651中所公开的那些；以及通过其他机制工作的化合物(例如利诺胺，干扰素αvβ3功能的抑制剂以及血管增生抑制素)]或集落刺激因子1(CSF1)或CSF1受体；
(vii)血管破坏试剂，例如考布他汀A4以及在国际专利申请WO99/02166，WO00/40529，WO00/41669，WO01/92224，WO02/04434以及WO02/08213中公开的化合物；
(viii)反义疗法，例如定向于上文所列的靶物的那些，例如G-3139(Genasense)，抗bcl2的反义疗法；
(ix)基因疗法，包括例如替代畸变基因的方法，例如畸变p53或畸变BRCA1或BRCA2、GDEPT(基因定向酶前体药品疗法)；使用了胞核嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些方法；以及增加患者对化疗或放疗的耐受性的疗法，例如多药品抗性基因疗法；以及
(x)免疫疗法，包括例如使用阿仑单抗(campath-1HTM，其为定位于CD52的单克隆抗体)的治疗或者使用定位于CD22的抗体的治疗；增加患者肿瘤细胞的免疫原性的体外和体内方法；使用诸如白细胞介素2、白细胞介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子之类的细胞因子进行的转染；降低T细胞无效能的方法，例如使用单克隆抗体抑制CTLA-4的功能的治疗；使用转染的免疫细胞(例如细胞因子转染的支状细胞)的方法；使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法以及使用抗独特型抗体的方法。
(xi)蛋白质降解的抑制剂，例如蛋白酶体抑制剂，如Velcade(硼替佐米)。
(xii)生物治疗的治疗方法，例如使用了肽或蛋白质(例如抗体或可溶性外部受体结构域的构建子)的那些，其中肽或蛋白质隔断了受体与配基(封阻配基与受体的结合)或者降低受体的信号传导(例如由于受体降解的增强或者表达水平的降低)。
在一个实施方案中，本文所定义的抗肿瘤治疗除了本发明的化合物以外，还涉及使用其他抗增殖/抗赘生药品及其结合物的治疗，如在医学肿瘤学中使用的那些，例如烷化剂(例如顺铂、奥沙利铂、卡波铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、替膜唑胺和亚硝基脲)；抗代谢物(例如2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷和抗叶酸素(如氟嘧啶，如5-氟尿嘧啶和喃氟啶)、雷替曲塞、甲氨蝶呤、胞核嘧啶、***糖苷以及羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类抗生素，如阿霉素、博来霉素、亚德里亚霉素、道诺霉素、表柔比星、去甲氧正定霉素、丝裂霉素C、放线菌素和光神霉素)；抗有丝***剂(例如长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、去乙酰长春酰胺和长春瑞滨；紫杉烷，如紫杉醇和泰素帝；以及polokinase抑制剂)；以及拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素(如依托泊苷和替尼泊苷)、安吖啶、托泊替康和喜树碱)。
在一个实施方案中，本文所定义的抗肿瘤治疗除了本发明的化合物外，还涉及2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷的治疗。
通过同时、依次或间隔定量给药所述治疗的单个成分可以取得所述的结合治疗。这种结合产品使用了本发明的化合物或其剂量范围如上文所述的可药用的盐，以及其剂量范围被认可的其他药物活性试剂。
实施例
提供以下实施例(包括所实施的试验以及所取得的结果)仅是为了说明的目的，不能解释为通过本文的教导进行了限定。
实施例1
免疫和效价
免疫原
将在中国仓鼠***(CHO)中瞬间表达的人源DLL4的细胞外结构域(氨基酸1-524)和重组人源DLL4用作用于免疫的抗原。就CHO转染子的形成而言，将人源全长DLL4cDNA(Yoneyaetal.，2001，J.Biochem.，129，27-34)***到pcDNA3.1载体中，并脂转染到CHO细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号#CCL-61)中。通过荧光激活细胞分离技术(FACS)分析方法来证明适用于免疫水平的细胞表面的人源DLL4的表达。使用正向5-AAGCTGGCTAGCGCGAATGGCGGCAGCGTCCCGGAG和反向5-CAGCCTCGAGCGGCCGCCCAGGGGAAGCTGGGCGGCAAGC引物，由全长DLL4亚克隆人源DLL4的细胞外结构域。纯化PCR产物，并与得自Invitrogen的pSecTag表达载体连接。随后，使用293fectin转染试剂，将克隆子转染到293T细胞中。7天后，收获包含靶向蛋白质的细胞上清液，并在预平衡的HisTrap柱(GEHealthcare，编号#17-5247)上流经过夜。使用包含20mM磷酸钠、500mM氯化钠和5mM咪唑的结合缓冲剂(pH7.4)洗涤所述的柱，然后在包含20mM磷酸钠、500mM氯化钠和500mM咪唑的缓冲剂(pH7.4)中稀释his-标记蛋白质。在4℃下，将蛋白质样品在结合缓冲剂中透析1小时，然后在PBS(pH7.4)中再透析2小时，随后进行过滤除菌，通过SDS-PAGE进行数量和纯度的评估，然后使用Gelcode(Pierce，编号#24950)进行染色。
免疫
通过对具有DLL4的细胞外结构域或者如实施例1中所述的过表达重组人源DLL4的CHO细胞的XenoMouse小鼠(XenoMouse品系：XMG2(IgG2κ/λ)和XMG4(IgG4κ/λ)Amgen，Inc.Vancouver，BritishColumbia，Canada)进行依次免疫而形成对抗DLL4的单克隆抗体。采用常规方法，对于所有注射而言，通过腹膜内及基于鼠尾途径对XenoMouse动物进行免疫。佐剂包括TitermaxGoldTM(Sigma，编号#T2684)，磷酸铝凝胶佐剂，HCLBiosector，(编号#1452-250)以及ImmuneEasy小鼠佐剂(qCpG，Qiagen编号#303105)。对于可溶性免疫原而言，第一次注射给药具有TitermaxGoldTM的10μgDLL4细胞外结构域(第0天)，并使用磷酸铝凝胶佐剂和qCpG、或者TitermaxGoldTM与5μgDLL4细胞外结构域进行交替加强给药。对于基于细胞的免疫原而言，第一次注射给药磷酸铝凝胶佐剂和2E6细胞。在随后的加强中，使用相同的佐剂给药1E6细胞。对于两种强化免疫而言，加强给药在第2、6、10、16、23、30、37、44、50、64、71、75、89、104和108天进行。
通过效价选择收获动物
采用荧光测量微体积测试技术(FMAT)细胞测试装置(AppliedBiosystems)通过针对在293T细胞中表达的人源和小鼠DLL4的结合情况来测试针对人源DLL4的抗体的效价。该分析表明，一些小鼠具有表现为对DLL4具有特异性的效价。因此，在免疫过程的末期，选择收获的17只小鼠，并按照以下实施例2所述的方法由免疫小鼠的脾和***中分离淋巴细胞。
实施例2
淋巴细胞的回收、B细胞的分离以及杂交瘤细胞的融合和生成
通过颈椎脱臼法处死免疫小鼠，收获引流***，并将各组(cohort)汇集起来。通过在DMEM中研磨以便从所述的组织中释放所述的细胞来分离淋巴细胞，并将所述的细胞悬浮在DMEM中。通过使用CD19标记的Dynal珠来进行阳性选择而富集B细胞。通过将经过洗涤并富集的上述B细胞与得自ATCC(编号#CRL1580)(Kearneyetal，J.Immunol.123，1979，1548-1550)的非分泌性骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞以1∶1的比例相混合来进行融合。通过在800xg下离心使得所述的细胞混合物通常形成球状。在完全除去上清液之后，使用2-4ml的链霉蛋白酶溶液(CalBiochem，编号#53702；0.5mg/ml溶于PBS)对所述的细胞处理不超过2分钟。然后，加入3-5ml的FBS，以终止酶活性，并用电转细胞融合溶液(ECFS)(0.3M蔗糖，Sigma，编号#S7903；0.1mM醋酸镁，Sigma，编号#M2545；0.1mM醋酸钙，Sigma，编号#C4705)将悬浮液调整至总体积为40ml。在离心后除去上清液，并将所得的细胞悬浮在40ml的ECFS中。重复该洗涤步骤，并将所得的细胞再次悬浮于ECFS中至浓度为2E6个细胞/ml。使用融合器(ECM2001型，Genetronic，Inc.，SanDiego，CA)进行电转细胞融合。所用的融合室的尺寸为2.0ml，采用以下装置设定：比对条件：电压：50V，时间：50秒；膜破裂条件：电压：3000V；时间：30μ秒；融合后的保持时间：3秒。在ECF之后，在无菌条件下，将细胞悬浮液小心地由融合室中移出，并转移至装有相同体积的杂交瘤细胞培养基(DMEM(JRHBiosciences)，15％FBS(Hyclone)，补充有2mML-谷氨酰胺(Sigma，编号#G2150)，10U/ml青霉素/0.1mg/ml链霉素(Sigma，编号#P7539)，1瓶/LOPI(草酰乙酸酯、丙酮酸酯、牛胰岛素；Sigma编号#O5003)以及10U/ml重组人源IL-6(BoehringerMannheim，编号#1131567))的无菌管中。在37℃下，将所得的细胞温育15-30分钟，然后再400xg下离心5分钟。将所得的细胞温和地再次悬浮于较少体积的杂交瘤细胞选择性培养基(杂交瘤细胞选择性培养基，补充有0.5xHA(Sigma，编号#A9666))中，并根据每个96孔板的最终平板接种5E6B细胞的总量以及200μ/孔来将所述的体积用较多的杂交瘤细胞选择性培养基进行适当的调整。将所述的细胞温和地混合，然后吸入到96孔板中并使其生长。由潜在地产生抗DLL4的抗体的细胞中收集全部的上清液，并经历随后的筛查测试，如以下实施例所示。
实施例3
与结合有人源和猕猴DLL4、以及人源Jagged1的细胞的结合
对由收获的细胞中收集来的上清液进行测试，以评估所分泌抗体结合瞬间过表达全长人源或猕猴DLL4、或者人源Jagged1的293T细胞的能力。将模拟物转染的293T细胞系用作阴性对照。将在包含2％FBS的PBS中稀释的细胞以3000个表达细胞和15000个模拟物转染细胞/孔的密度接种于384孔板(CorningCostar，编号#3712)中。在平板接种后即刻加入15或20μl/孔的杂交瘤细胞上清液和10μl/孔的第二抗体(山羊抗人源IgGFcCy5，最终浓度为750ng/ml)，并将所述平板在室温下温育3小时，然后再FMAT8200装置(AppliedBiosystems)上读取荧光强度。将由2.86μg/ml的浓度以1∶2稀释得到的人源Notch1/Fc嵌合体(R&Dsystems，编号#3647-TK)对DLL4的结合情况用作阳性对照，并将由10μg/ml稀释得到的人源Notch3/Fc嵌合体对Jagged1的结合情况用作阳性对照。显示出杂交瘤细胞上清液与人源/猕猴DLL4和人源Jagged的结合情况的12个杂交瘤细胞上清液的结果示于表3中。
表3
实施例4
对Notch1-DLL4受体-配基的结合的抑制
为了测定包含抗体的上清液的相对效力，对上清液抑制在293T细胞中瞬间过表达的人源Notch1/Fc与人源DLL4的结合的能力进行评价。在包含2％FCS的PBS中再次构建转染的和未转染的293T细胞，并将20μl5000个转染的和17500个未转染的细胞平板接种于384孔的组织培养板(CorningCostar，编号#3712)的孔中。随后，加入20μl杂交瘤细胞上清液，并将所述的平板在4℃下温育1小时，此时，加入20μlAlexa-647标记的人源Notch1/Fc，其最终浓度为6.7ng/ml。在4℃下再次温育3小时之后，通过使用FMAT8200装置(AppliedBiosystems)读取各孔中的荧光强度来测定结合的Notche1/Fc的量。12个杂交瘤细胞上清液的结果示于表4中。结果以％抑制率来表示，通过按照实施例2所述的相同的方式制备的非DLL4结合上清液的效果来测定所述测试中的最小抑制率，并且最大抑制率定义为在饱和浓度的未标记Notch1/Fc存在下所获得的信号。N.T.＝未测试。
表4
实施例5
抗DLL4的抗体的结构分析
对所述抗体的可变重链和可变轻链进行测序，以确定它们的DNA序列。在具有针对各γ和κ链的组合的核苷酸和氨基酸序列的序列列表中提供了用于抗DLL4的抗体的完整序列信息。分析可变重链的序列以确定VH家族、D区域序列以及J区域序列。然后，翻译该序列以确定一级氨基酸序列，并所述的序列与种系VH、D和J区域的序列进行比较以评估体细胞的过度突变。
表2为将抗体的重链区与它们的同族种系重链区、以及κ轻链区与它们的同族种系轻链区进行比较的表。免疫球蛋白的可变区(V)是由多个种系DNA的节段所编码的，这些节段在B细胞的个体发育过程中相连而形成功能可变区(VHDJH或VKJK)。对响应于DLL4的抗体的分子和基因多样性进行详细研究。
此外，应该注意的是，在特定的抗体在氨基酸水平上不同于其各自的种系序列的情况下，所述的抗体序列可以突变回种系序列。可以采用标准的分子生物学技术在一个、两个、三个或多个位置处或者任何突变位置处的组合发生这种纠正突变。例如非限定性实例，表8示出了2H10的轻链序列(SEQIDNO.：6)通过在位置18处的V变为A(突变1)、在位置32处的V变为A(突变2)、在位置50处的E变为D(突变3)、在位置65处的S变为N(突变4)、在位置89处的T变为A(突变5)以及在位置94处的L变为T(突变6)而不同于相应的种系序列(参见表2)。因此，可以在这些位点的任何位点处或所有位点处修饰编码2H10的轻链的氨基酸或核苷酸序列。下表2-9说明了得自2H10、9G8、21H3和4B4的种系的这些变化的位置。各行表示在由黑体字所示的位置处种系残基和非种系残基的独特组合。
在另一个实施方案中，本发明包括替代在可能影响本发明抗体的异质性的序列中的任何结构倾向性。这种倾向性包括糖基化位点、未配对的半胱氨酸、表面暴露的蛋氨酸等。为了降低这种异质性的风险，建议进行变化以除去一个或多个这种结构倾向性。
在一个实例中，未配对的半胱氨酸可以单独替代，或者与其他结构变化结合替代。未配对的半胱氨酸的实例在抗体2H10或9G8的轻链CDR1的位置33处形成。这种未配对的半胱氨酸可以突变为具有相似侧链性质的合适的氨基酸，例如丝氨酸。在另一个实例中，未配对的半胱氨酸在抗体20G8的重链FR4的位置203处形成。同样，这种未配对的半胱氨酸可以突变为具有相似侧链性质的合适的氨基酸，例如丝氨酸。
表5.在所示的残基编号处21H3重链(SEQIDNO：30)变为种系重链的示例性突变
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有SEQIDNO.：30的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO.：30包含表5中的各行所示的种系和非种系残基的任何一种组合。在一些实施方案中，SEQIDNO.：30包含表5中的各行所示的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或者所有六种种系残基。在某些实施方案中，SEQIDNO.：30包含表5中的各行所示的种系和非种系残基的任何一种独特的组合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体衍生自具有VH1-18，D2-15和JH3结构域的种系序列，其中一种或多种残基已经突变，从而在相应的位置处形成相应的种系残基。如表13所示，已经突变为特定种系序列的21H3可变重链结构域的具体实例包括21H3VHOP(其被优化，在位置45处非种系序列已经突变为L，在位置70处非种系序列已经突变为M)。
表6.在所示的残基编号处21H3轻链(SEQIDNO：32)变为种系轻链的示例性突变
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有SEQIDNO.：32的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO.：32包含表6中的各行所示的种系和非种系残基的任何一种组合。在一些实施方案中，SEQIDNO.：32包含表6中的各行所示的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种或者所有五种种系残基。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体衍生自具有VL、1g、JL2结构域的种系序列，其中一种或多种残基已经突变，从而在相应的位置处形成相应的种系残基。已经突变为特定种系序列的21H3可变轻链结构域的具体实例包括21H3VLOP(其被优化，在位置107处非种系序列已经突变为K)和21H3VLOP2(其被优化，在位置67和107处非种系序列已经突变为K)。参见表13。
表7.在所示的残基编号处4B4重链(SEQIDNO：2)变为种系重链的示例性突变
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有SEQIDNO.：2的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO.：2包含表7中的各行所示的种系和非种系残基的任何一种组合。在一些实施方案中，SEQIDNO.：2包含表7中的各行所示的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种、任何七种、任何八中、任何九种、任何十种、任何十一种或者所有十一种种系残基。在某些实施方案中，SEQIDNO.：2包含表7中的各行所示的种系残基和非种系残基的任何一种独特的组合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体衍生自具有VH1-18、D7-27和JH4结构域的种系序列，其中一种或多种残基已经突变，从而在相应的位置处形成相应的种系残基。
表8.在所示的残基编号处4B4轻链(SEQIDNO：4)变为种系轻链的示例性突变
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有SEQIDNO.：4的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO.：4包含表8中的各行所示的种系和非种系残基的任何一种组合。在一些实施方案中，SEQIDNO.：4包含表8中所示的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种或者所有五种种系残基。在某些实施方案中，SEQIDNO.：4包含表8中的各行所示的种系残基和非种系残基的任何一种独特的组合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体衍生自具有VL、3p和JL2结构域的种系序列，其中一种或多种残基已经突变，从而在相应的位置处形成相应的种系残基。
表9.在所示的残基编号处2H10重链(SEQIDNO：6)变为种系重链的示例性突变
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有SEQIDNO.：6的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO.：6包含表9中的各行所示的种系和非种系残基的任何一种组合。在一些实施方案中，SEQIDNO.：6包含表9中所示的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或者所有六种种系残基。在某些实施方案中，SEQIDNO.：6包含表9中的各行所示的种系残基和非种系残基的任何一种独特的组合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体衍生自具有Vh3-33、D6-13和JH4结构域的种系序列，其中一种或多种残基已经突变，从而在相应的位置处形成相应的种系残基。已经突变的序列的实例为在位置93处M已经突变为V的2H10VHOP。参见表13。
表10.在所示的残基编号处2H10轻链(SEQIDNO：8)变为种系轻链的示例性突变
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有SEQIDNO.：8的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO.：8包含表10中的各行所示的种系和非种系残基的任何一种组合。在一些实施方案中，SEQIDNO.：8包含表10中的各行所示的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或者所有六种种系残基。在某些实施方案中，SEQIDNO.：8包含表10中的各行所示的种系和非种系残基的任何一种独特的组合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体衍生自具有VL、3r和JL2结构域的种系序列，其中一种或多种残基已经突变，从而在相应的位置处形成相应的种系残基。在某些实施方案中，SEQIDNO.：8包含其他修饰(包括除去结构倾向性)。例如，除了形成种系残基，C33可以突变为S，参见例如表13中的2H10VLOP1。因此，SEQIDNO.：8可以包含表10中的各行所示的种系残基和非种系残基的任何一种独特的组合，并且还包含C33变为S的突变。其中轻链C33处已经突变从而除去结构倾向性、并且进一步突变回种系序列的序列的实例为2H10VLOP2，如表13所示，其中C33已经突变为S，位置18处的V已经突变为A，而位置65处的S已经突变为N。
表11.在所示的残基编号处9G8重链(SEQIDNO：22)变为种系重链的示例性突变
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有SEQIDNO.：22的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO.：22包含表11中的各行所示的种系和非种系残基的任何一种组合。在一些实施方案中，SEQIDNO.：22包含表11中的各行所示的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种、任何七种或者所有七种种系残基。在某些实施方案中，SEQIDNO.：22包含表11中的各行所示的种系和非种系残基的任何一种独特的组合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体衍生自具有VH4-39、D4-23和JH3结构域的种系序列，其中一种或多种残基已经突变，从而在相应的位置处形成相应的种系残基。其中重链已经突变回种系序列的序列的实例为9G8VHOP1，如表13所示，其中位置38处的L已经突变为W。其中重链已经突变回种系序列的序列的另一个实例为9G8VHOP2，如表13所示，其中位置21处的S已经突变为T，位置38处的L已经突变为W，位置70处的S已经突变为T，而位置96处的F已经突变为Y。
表12.在所示的残基编号处9G8轻链(SEQIDNO：24)变为种系轻链的示例性突变
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体包含具有SEQIDNO.：8的序列。在某些实施方案中，SEQIDNO.：24包含表12中的各行所示的种系和非种系残基的任何一种组合。在某些实施方案中，SEQIDNO.：24包含表12中所示的任何一种、任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种、任何七种、任何八种、任何九种、任何十种、任何十一种或者所有十一种种系残基。在某些实施方案中，SEQIDNO.：24包含表12中的各行所示的种系和非种系残基的任何一种独特的组合。在其他实施方案中，所述的靶向结合剂或抗体衍生自具有VL、3r和JL2结构域的种系序列，其中一种或多种残基已经突变，从而在相应的位置处形成相应的种系残基。在某些实施方案中，SEQIDNO.：24可以包含其他修饰(包括除去结构倾向性)。例如，SEQIDNO.：24可以包含表12的各行所示的种系和非种系残基的任何一种独特的组合，并且进一步包含C33变为S的突变。实例为9G8VLOP1，其中轻链已经突变，从而除去了C33处的结构倾向性，并且可以在位置7处进一步突变回种系序列，其中S已经突变，从而在位置79处P和V已经突变为A。另一个实例为9G8VLOP2，其中C33已经突变为S，在位置2处的S已经突变为Y，在位置7处的S已经突变为P，在位置19处的R已经突变为S，在位置39处的T已经突变为P，而在位置79处的V已经突变为A。具体参见表13。
技术人员会意识到，存在定义CDR边界的备选方法。表2和13中所有CDR边界都是根据Kabat的定义而定义得到的。
实施例6
抑制Notch-DLL4受体-配基相结合的DLL4抗体的效力测定
为了根据纯化抗体抑制全长重组DLL4与可溶性Notch1/Fc之间的相互作用的能力来分辨纯化的抗体，实施以下测试。在包含2％FCS的PBS中再次构建转染的和未转染的293T细胞，并将30μl5000个转染的和17500个未转染的细胞平板接种于384孔的组织培养板(CorningCostar，编号#3712)的孔中。随后，加入30μl纯化的抗体(由5μg/ml杂交瘤细胞上清液经过系列稀释得到)，并将所述的平板在4℃下温育1小时，此时，加入20μl100ng/ml的Alexa-647标记的人源Notch1/Fc。在4℃下再次温育3小时之后，通过使用FMAT8200装置(AppliedBiosystems)读取各孔中的荧光强度来测定结合的Notche1/Fc的量。12个纯化抗体的数据示于表14中，其表明了纯化抗体具有抑制重组全长人源DLL4与Notch1/Fc嵌合体之间的相互作用的能力。
此外，实施相似的试验，并使用FACSCalibur装置(BDBiosciences)进行定量。对于这些试验而言，在包含2％FCS的PBS中再次构建亲代293T细胞或者使用人源DLL4瞬间转染的细胞，并以25000个细胞/孔的浓度加入到包含纯化抗体的孔中，其最终浓度为10μg/ml、1μg/ml或0.1μg/ml。在4℃下温育1小时之后，加入Alexa-647标记的人源Notch1/Fc，其最终浓度为227ng/ml，并将平板在4℃下温育2小时。在使用包含2％FCS的PBS洗涤之后，通过使用FACSCalibur装置读取各孔中的荧光强度来测定结合的Notche1/Fc的量。在这些条件下，20种纯化抗体抑制DLL4-Notch1的相互作用的能力与使用FMAT装置中观察到的结果(数据未示出)相似。当在ELISA方法中使用可溶性人源DLL4和可溶性人源Notch1来实施试验时，也可以得到相似的结果(数据未示出)。
使用由人源、小鼠或猕猴DLL4稳定转染的HEK293细胞(使用了逆转录构建子)针对所选抗体实施进一步的试验。在这些试验中，将在包含2％FCS的PBS中稀释的抗DLL4的抗体(最终浓度：10-0.01μg/ml)加入到表达DLL4的HEK293细胞(50000个细胞/孔，稀释于包含2％FCS的PBS中)中，并在4℃下温育1小时。随后，加入Alexa-647标记的人源、大鼠或APC标记的小鼠Notch1/Fc(例如，R&DSystems，编号分别为#3647-TK-050，1057-TK-050，5267-TK-050)，其最终浓度为0.01-0.5μg/ml，并将平板在4℃下再次温育2小时，然后进行洗涤，并在FACSCalibur装置上读取数据。表15示出了不同同种型的纯化抗体抑制重组全长人源、猕猴和小鼠DLL4与0.1或0.25ug/ml人源、大鼠或0.5ug/ml小鼠Notch1/Fc嵌合体之间的相互作用(通过FACS分析测定)的能力。
表14
表15.*人源Notch1/Fc的浓度为0.25μg/ml。N.T.＝未测试
实施例7
DLL4抗体与人源Jagged1和DLL1的交叉反应性
通过FACS分析测试纯化抗体结合人源Jaggd1和Dll1的能力。简言之，293T细胞为模拟物转染的，或者为采用Lipofectamine2000用人源Jagged1(编号#：NM_000214)或Dll1(编号#：NM_005618)瞬间转染的。将细胞再次悬浮于包含2％FCS的PBS中，并以50000个细胞/孔的量接种于V底平板中。加入在包含2％FCS的PBS中稀释的抗DLL4抗体，其最终浓度为5或15μg/ml，并将平板在4℃下温育1小时。在使用包含2％FCS的PBS洗涤之后，加入第二抗体(山羊抗人源FcCy5，JacksonImmunoresearch，编号#109-175-098，5μg/ml)和7-AAD(5μg/ml)，并将平板在4℃下温育15分钟，然后用包含2％FCS的PBS再次洗涤，并在FACSCalibur装置上读取数据。将小鼠抗人源Jagged1抗体(R&Dsystems，编号#mAB1277；使用抗小鼠FcCy5第二抗体(5μg/ml)进行测试，JacksonImmunoresearch编号#115-175-164)、人源Notch3/Fc嵌合体(R&Dsystems，编号#1559-NT-050，使用上文所述的山羊抗人源FcCy5抗体进行测试)或山羊抗人源Dll1抗体(R&Dsystems编号#AF1818，使用抗山羊FcCy5进行测试；JacksonImmunoresearch，编号#305-175-046(5μg/ml))用作对照，以证明转染情况。通过比较在模拟物转染的细胞中几何平均荧光强度的位移与在Jagged1或Dll1转染的细胞中所观察到的情况来对数据进行分析，并示于表16和17中。表16示出了纯化抗体(5ug/ml)结合使用人源Jagged1瞬间转染的293T细胞的能力。表17示出了纯化抗体(15μg/ml)结合使用人源Dll1瞬间转染的293T细胞的能力。使用浓度至多为300μg/ml的21H3RK，4B4，9G8或2H10进行其他FACS结合研究表明与稳定过表达人源Jagged1或人源Dll1的HEK-293细胞的结合最少(＜背景的2.5倍)。
表16
表17
抗体 Dll1/293T 模拟物/293T Dll1/模拟物的比值
X几何平均值 X几何平均值
1D4 35.3 32.2 1.09
1E4 31.7 27.7 1.15
4B4 25.9 21.1 1.23
2H10 44.1 40.1 1.10
3A7 36.8 34.6 1.06
4B3 30.6 26.0 1.17
9G8 32.3 26.3 1.23
12A1 47.0 42.1 1.12
17F3 47.0 41.3 1.14
21F7 30.2 26.8 1.13
20G8 40.0 30.0 1.34
21H3 32.4 27.9 1.16
Dll1 Ab 5μg/ml 1840 239 7.68
Dll1 Ab 1μg/ml 1240 197 6.33
Dll1 Ab 0.2μg/ml 565 81.4 6.94
实施例8
DLL4抗体对DLL4介导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用的测定
评价DLL4抗体阻断HUVEC增殖的DLL4-刺激的抑制的能力。制备DLL4细胞外结构域(R&Dsystems，编号#1506-D4/CF)作为50ug/ml的原液，溶于含有0.1％BSA的PBS中。在于重碳酸盐缓冲剂(Sigma#C3041-50CAP)中稀释至1μg/ml之后，以100μl/孔加入到黑色壁的96孔板(PerkinElmer，编号#6005182)中，并在4℃下温育过夜。此外，对照孔为使用包含0.1％BSA的PBS涂覆的模拟物。在使用PBS洗涤之后，将溶于包含10％FCS和2mM谷氨酰胺的MCDB113(Gibco编号#10372)中的、浓度为4E4个细胞/孔的100μlHUVEC细胞加入到各孔中。其后立即将系列稀释的抗DLL4抗体(20-0.027μg/ml)加入到DLL4/模拟物涂覆的孔中，并做三个重复，并将细胞在37℃/5％CO2下温育96小时。在此次温育之后，将15μl细胞技术试剂盒8(CCK8，NBS，编号#CK-04-11)加入到各孔中，并将平板在37℃/5％CO2下温育4小时。为了测定各孔中相对细胞的数量，在平板读取器(TecanUltra)上测量450nm下的吸光值。抗DLL4抗体的作用详细列于表18中。此外，当形成为IgG1抗体的形式时，4B4、21H3和21H3RK还是DLL4介导的作用的有效抑制剂(参见图1)。
此外，通过Western印记评价抗DLL4抗体(10μg/ml)抑制Notch信号传导的能力。简言之，将DLL4-His(R&Dsystems，编号#1506-D4-050/CF)在包含0.1％BSA的PBS中稀释至50μg/ml。然后，将该溶液进一步在50mM重碳酸盐缓冲剂(Sigma编号#C-3041)中稀释至1μg/ml(pH9.6)，并以1ml/孔的量加入到12孔板中，然后在4℃下温育过夜。采用相同的过程对不包含DLL4的其他孔进行模拟物涂覆。在使用PBS洗涤之后，以12000个细胞/孔的量接种在MCDB131中制备得到的HUVEC细胞。在接种之后，立即加入适量的处理液(例如，抗DLL4的抗体，10μg/ml)，并将平板在37℃/5％CO2下温育24小时。在温育完成后，在RIPA缓冲剂中收获细胞。然后加入4x的包含B-巯基乙醇和溴酚蓝的样品缓冲剂，并将样品在70℃下煮沸5分钟，然后加载到处于MOPS缓冲剂(Invitrogen编号#NP0001)中的4-12％NuPAGE凝胶上。在印记电泳转移至硝酸纤维素中之后，将印记在包含5％牛奶的PBST中封闭1小时，然后与溶于包含5％牛奶的PBS中的、分别以1∶1000或1∶10,000的比例稀释的酶切抗Notch1(Cellsignalingtechnology，编号#2421)或GAPDH(AdvancedImmunochemical，clone6C5，编号#2-RGM2)抗体温育。在4℃下在轨道式摇拌器上温育过夜之后，将印记用PBST洗涤，并在RT下与溶于包含5％牛奶的PBST中的、浓度为1∶2000的抗小鼠HRP第二抗体(CellSignalingTechnology，编号#7072)温育1小时。在使用PBST洗涤之后，使用PiercePico(编号#34080；GAPDH)或Femto(编号#34075；酶切Notch1)底物试剂使印记显色，并在装置上对结果进行分析。由这些研究得到的结果表明抗DLL4的抗体能够阻断HUVEC细胞中的DLL4刺激的Notch信号传导(数据未示出)。
表18.N/A＝不可用的。N.T.＝未测试的
实施例9
DLL4抗体对HUVEC管体外形成的作用
在内外共培养测试中，针对降低内皮细胞管的形成的能力来测试DLL4抑制性抗体(例如TCSCellWorks编号ZHA-1000)。在24孔板(TCS孔工作编号ZHA-1000)中，获得人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与人二倍体成纤维细胞作为共培养物，或者按照以下方式制备平板：在37℃/5％CO2下使用抗原(1∶10的比例在蒸馏水中稀释，Sigma，编号#C8919)将24孔组织培养板涂覆4小时。在使用PBS洗涤之后，将成纤维细胞(例如Promocell#C-12300)以15000个细胞/孔的比例加入到FGM(Promocell#C-23010)中。在37℃/5％CO2下温育3天后，由平板中除去介质，并以30000个细胞/孔的量加入溶于EGM2(Promocell#C-22111)中的HUVEC细胞。在37℃/5％CO2下再次温育3天后，认为平板已经做好了使用的准备，并认为第1天的平板用于测试。在11天的周期中，从第1天起以规律的间隔将浓度范围为20至0.027μg/ml的DLL4封闭抗体引入到培养物中。在第4、7和9天补充介质。将共培养物模型保持在TCS优化培养基(与共培养测试提供)或补充有2％胎牛血清(FCS)、1％谷氨酰胺以及1％青霉素/链霉素的MCDB131培养基(下文中称为2％FSMCDB131培养基)中。在37℃下，将共培养物模型保持在潮湿的5％CO2/95％空气气氛中。使用微管染色试剂盒根据供应商提供的说明书(TCS孔工作编号#ZHA-1225)，在针对CD31固定并使微管染色后，在第11天检测微管的形成。简言之，在室温(RT)下，将细胞用冰冷的70％乙醇固定30分钟。将细胞封闭，然后在RT下用抗人源CD31处理这些细胞达60分钟。在RT下，洗涤平板，并用与碱性磷酸酶(AP)缀合的山羊抗小鼠IgG进行处理。在与AP缀合的第二抗体温育之后，洗涤平板，并在大约10分钟内加入5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基氯化四氮唑蓝(BCIP/NBT)底物。在10分钟内显色为紫黑色反应了微管形成。随后洗涤平板，然后放置在干燥的空气中。使用ZeissKS4003.0ImageAnalyser，通过全孔壁成像分析方法对微管的生长情况进行定量。在定量方法中测量的形态学参数为微管的全长。在一些实施方案中，还估测了管内分支的数量。排除100μm深的边缘(以避免边缘回缩制品(edgeretractionartifact))测量24孔的每一个孔中的所有微管的形成情况。
如图2所示，所述的抗体可以有效地抑制体内内皮细胞管的形成。此外，测定所述测试中多种抗体的效力。这些数据概括于表19中。总而言之，这些数据表明所述的抗体在模仿血管生成过程的功能测试中是具有活性的。
表19
实施例10
纯化抗体的结合亲和性的测定
采用FACS和BIAcore技术估测纯化抗体对DLL4的结合亲和性。对于FACS亲和性测试而言，以大约85,000-104,000个细胞/孔的量接种过表达人源或猕猴DLL4的HEK293细胞，并在4℃下与纯化抗体的效价物温育5小时。然后洗涤细胞，并在4℃下与山羊抗人源IgG-Fc-Cy5+5μg/ml的7-氨基-放线菌素(7AAD)温育30分钟。使用FACS测试结合的DLL4，并将数据拟合以下等式(参见Drake&Klakamp，2007，J.Immunol.Methods，318，157-162以供推导)：
F = P ′ ( K D + L T + n · M ) - ( K D + L T + n · M ) 2 - 4 n · M · L T 2 + B
在该等式中，F＝平均荧光强度，LT＝分子mAb的总浓度，P’＝将任意荧光强度单元与结合mAb联系起来的比例常数，M＝细胞的摩尔浓度，n＝每个细胞的受体数，B＝背景信号，而KD＝平衡解离常数。对于各mAb效价曲线而言，针对KD的估值作为P’，在非线性分析中，n、B和KD可以为任意的浮点数值。表20概括了抗DLL4抗体对使用上文所述的方法衍生得到的人源和猕猴DLL4的亲和性估值。
对于Biacore分析而言，采用标准的氨基偶联技术，将各纯化的抗DLL4抗体固定CM5传感器芯片上的T100内。固定水平保持在200RU以下。通过UV-VIS光谱仪，在110,440M-1cm-1的280nm下采用摩尔吸光率(该值是采用Paceetal.研究的方法由蛋白质序列计算得到的(G.R.GrimsleyandC.N.Pace(2003)inCurrentProtocolsinProteinScience(JohnWiley&Sons，Inc.)，3.1.1-3.1.9))，测定DLL4的浓度。将抗原DLL4稀释至32-64nM的起始浓度，并在3倍的系列稀释液中进行测试，并做三个重复。电泳缓冲剂包含具有0.1mg/mlBSA的HBS-P，并在23℃下收集结合应答情况。在10mM氢氧化钠的15秒脉冲条件下，再次生成结合络合物。采用简单的1∶1相互作用模型全局拟合应答数据，并且表20概括了当估测抗DLL4抗体与人源可溶性DLL4的结合情况时所获得的ka、kd和KD估值。此外，采用BIAcore，还产生了可溶性小鼠DLL4针对21H3、21H3RK和4B4的亲和性估值。IgG形式的所有抗体对可溶性小鼠DLL4的亲和性为360nM或更小。
表20.N.T.＝未测试
表21
抗体ID 同种型 Ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(pM)
21H3RK IgG1 3.37X105 1.66X10-4 493
21H3RK IgG2 2.22X105 1.60X10-4 721
21H3 IgG1 2.88X105 1.71X10-4 594
21H3 IgG2 2.59X105 1.55X10-4 598
21H3 IgG4 3.17X105 1.52X10-4 481
4B4 IgG1 1.18x105 2.01X10-5 170
4B4 IgG2 1.07x105 3.60X10-5 336
4B4 IgG4 1.18X105 3.33X10-5 283
9G8 IgG4 1.03X105 1.36X10-5 132
2H10 IgG4 4.09X104 4.02X10-5 981
实施例11
通过FACS分析对交叉竞争DLL4的测定
使用FACS测试估测纯化DLL4抗体抑制其他DLL4抗体与人源DLL4结合的能力。简言之，使用购得的标记试剂盒(例如MolecularProbes编号#A30009，A-20186)，根据供应商提供的说明书，用Alexa-647直接标记抗体。为了测定交叉竞争的水平，将稀释于包含2％FCS的PBS中的未标记的抗DLL4抗体(最终浓度：10-0.01μg/ml)加入到表达DLL4的HEK293细胞中，并在4℃下温育1小时。随后，加入Alexa-647标记的抗DLL4抗体，其最终浓度为0.1μg/ml，并将平板在4℃下再温育1小时，然后进行洗涤，并在FACSCalibur装置上读取数据。概括了未标记抗体(10、1、0.1μg/ml)与标记21H3RK竞争结合人源DLL4的能力的数据包括于图3中。概括了未标记抗体与标记21H3RK和4B4竞争结合人源DLL4的能力的其他数据包括于表22中。
此外，还采用标准技术通过Western印记测定抗体检测在HEK293细胞中表达的重组DLL4(R&Dsystems，编号#1506-D4-050/CF)和天然DLL4(参见实施例3)的能力。简言之，在包含蛋白酶抑制剂混合物1(Roche，编号#11873580001)和蛋白质(Pierce，编号#23227)(采用BCA蛋白质测试方法，根据供应商提供的说明书)的RIPA缓冲剂(Thermo，编号#89900)中收获表达DLL4的HEK293细胞。就Western印记而言，将蛋白质样品在冰上解冻，并在100℃下温育2分钟，然后加入10xNupage样品还原剂(Invitrogen，编号#NP0004)和4x样品缓冲剂，然后加载到处于MES缓冲剂(Invitrogen，编号#NP0002)中的预制4-12％NuPageBisTris凝胶(Invitrogen，编号#NP0321B0X)上。在印记电泳转移至硝酸纤维素中之后，将印记在包含5％牛奶的含0.05％吐温20(TBST)的TRIS缓冲盐水(100mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.5)中封闭1小时，然后与9G8，2H10，21H3，4B4或20G8(均为2ug/ml)或者购得的抗DLL4抗体(R&DSystems，编号#MAB1389；Abcam，编号#ab7280，均为1ug/ml)在包含5％牛奶的TBST中温育。在4℃下在轨道式摇拌器上温育过夜之后，将印记用PBST洗涤，并在RT下与溶于包含5％牛奶的抗大鼠、抗兔或抗人源HRP缀合的第二抗体(JacksonImmunochemicals，编号#112-035-003和111-035-003，1∶20,000稀释比例；或者KPL，编号#074-1006，1∶10,000稀释比例)TBST温育1小时。在使用PBST洗涤之后，使用PiercePico(编号#34080；GAPDH)或Femto(编号#34075；酶切Notch1)底物试剂使印记显色，并在装置上对结果进行分析。由这些研究得到的结果表明抗DLL4的抗体能够封阻HUVEC细胞中的DLL4刺激的Notch信号传导(数据未示出)。按照上文所述通过洗涤出去过量的抗体，并通过增强化学发光检测法，根据供应商的说明书使免疫络合物显像(Pierce，编号#34076)，并在HyperfilmECL(Amersham，编号#28906839)或BiomaxMR(Kodak，编号#8952855)膜上进行检测。结果证明，在这些条件下，可以通过购得的抗体和9G8/2H10而非21H3/20G8或4B4检测重组和天然DLL4，表明抗体可以与DLL4上不同的抗原决定部位相互作用(数据未示出)。
表22
实施例12
对9G8和2H10的序列修饰
在免疫应答成熟期间，免疫球蛋白基因发生了多种修饰，包括V、D和J基因节段之间的再结合；同种型的转换；以及可变区的过度突变。再结合以及体细胞过度突变是产生抗体多样性和亲和性成熟的基础，而且它们还可以产生序列倾向性，这种倾向性使得这种免疫球蛋白难以作为治疗剂以商业规模生产，或者增大了抗体的免疫原性的风险。总体而言，CDR区的突变可能会有助于亲和性和功能的改善，而构架区的突变可能会增大免疫原性的风险。可以通过将构架突变复原回种系来降低这种风险，同时确保抗体的活性未受到不利的影响。可以通过多样化过程来产生某些结构倾向性，或者这种倾向性可以存在种系序列中，从而有助于重链可变结构域和轻链可变结构域。不管其来源如何，理想的是除去可能导致产物不稳定、聚集、产物的异质性或者免疫原性增大的潜在结构倾向性。不理想的倾向性的实例包括未配对的半胱氨酸(其可能导致二硫键不规则，或者可变的巯基加成物的形成)，N连接的糖基化位点(导致结构和活性的异质性)，以及脱酰胺(例如NG、NS)、异构化(DG)、氧化(暴露的蛋氨酸)和水解(DP)位点。在努力降低免疫原性风险以及改善前导抗体的药物性质的过程中，产生了多种变体，并针对结合情况和活性进行了测试。使用StratageneQuickChangeII试剂盒，根据供应商所述，实施定点突变。通过瞬间转化(根据供应商建议的方法)在InVitrogenFreestyle***中表达变体序列，并通过蛋白质A亲和性层析进行纯化。
以两种方式估测突变抗体的活性：第一，测定抗体封阻可溶性Notch1/Fc与全长人源DLL4(如实施例3中所述，在HEK293细胞中稳定地表达)的结合的能力；以及第二，测定抗体与在受体-配基竞争研究中使用的相同细胞系的结合情况。就结合研究而言，将稳定过表达人源DLL4的HEK293细胞以50,000个细胞/孔的浓度再次悬浮于包含2％FCS的PBS中，并在4℃下与抗体的效价物(最终浓度为0.01-10μg/ml)温育1小时。然后洗涤细胞，并在4℃下与0.31μg/ml的抗人源IgG-Fc-FITC(BDPharmingen，编号#555786)温育30分钟。采用FACS分析检测结合的DLL4。这些研究的结果总结于表23中，其表明特定突变成9G8和2H10序列对抗体与Notch1竞争结合人源DLL4或者结合人源DLL4的能力的影响(相对于未突变的抗体)。
表23
实施例13
在基于球体的体内血管生成测试中对抗血管生成的效力的评价
按照早期材料(Korff和Augustin：J.Cell.Biol.143：1341-52，1998)所述通过吸入100个内皮细胞(EC)并悬滴在塑料盘上使其过夜从而使球体形成，由此制得人脐静脉内皮细胞(HUVEC)球体。第二天，采用之前所述的方法(Alajatietal.，NatureMethods5：439-445，2008)，收获EC球体，并与单个HUVEC混合于基质胶/纤维蛋白溶液中，从而使球体的最终数目为100000EC并且每个注射栓(injectedplug)为200000单个的EC。加入VEGF-A和FGF-2，其最终浓度为1000ng/ml。将500ul的细胞/基质悬浮液以皮下方式注射给雄性SCID小鼠(5-8周龄)。第二天(第1天)，开始处理。在第21天，结束研究。除去基质栓，并固定于4％的PFA中。所有的基质栓都被嵌入到石蜡中，并切至8-10μm厚以用于组织检测。通过针对人源CD34和平滑肌肌动蛋白(SMA)进行染色，以使血管显像，并测定血管密度和周细胞包裹情况。IgG1和IgG2抗体在体内调节血管形成和抑制周细胞补充方面是有效的。所得的数据表明，使用抗DLL4的抗体(21H3RK或4B4)在抗体浓度低达1mg/kg的条件下进行处理会诱导人类血管形成增高至少100％(高于未经处理的对照)。此外，在抗体剂量为5mg/kg的条件下，人类血管形成的增多与周细胞包裹降(通过人源CD34阳性血管的百分率来估测，所述的血管还与表达αSMA的细胞有关)低至少50％相关。概括了每周以腹膜内两次给药21H3RKIgG1(1、0.2和0.04mg/kg)的效果的数据示于表24中。总而言之，所述的数据表明所述抗体在血管生成的体内测试中是具有活性的。
实施例14
21H3RK的抗原决定部位的绘制
单克隆21H3RK特异性地结合人源DLL4，但是不识别人源DLL1。这种特异性用于推导Mab21H3RK对人源DLL4的结合抗原决定部位。通过DLL4的细胞外结构域的一部分被DLL1的相应节段所替代而对嵌合变体进行基因工程操作。在重叠延伸的PCR中，人源DLL4(Yoneyaetal.，2001，J.Biochem.，129，27-34，室内克隆)和人源DLL1(编号#NM_005618，Origene，MD)用作模板，从而构建包含用于重组蛋白质的表面表达的DLL4跨膜结构域的一系列变体。将所得变体克隆到编码了人巨细胞病毒主要即刻早期(hCMVie)增强子、启动子以及用于哺乳动物瞬间表达的5′-非翻译区的哺乳动物表达载体。所述的嵌合变体在HEK293F细胞中瞬间表达为具有Mab21H3RK的流式细胞仪特征的膜结合蛋白质。在转染48小时候，将HEK293F转染子与1μg/mlMab21H3RK在PBS中在冰上温育1小时，然后进行洗涤，接着与山羊抗人源IgG-FITC(JacksonImmunoResearchLaboratories，PA)温育，再使用LSRII流逝细胞仪(BDBiosciences，CA)进行分析。通过与山羊抗小鼠DLL4(其还识别人源DLL4)和山羊抗人源DLL1多克隆抗体(二者均得自R&DSystems.，MN)的混合物一起温育来监测所有嵌合变体的表达水平，然后使用猪的抗山羊IgG-PE(Invitrogen，CA)来进行检测。
尽管人源Dll1和Dll4在氨基酸水平上共有53％的一致性，但是Mab21H3RK特异性地识别Dll4，但是不识别Dll1。对编码人源Dll1的一小部分的人源Dll4的嵌合变体进行构建，从而识别造成所述特异性的区域。通过使用人源Dll1的相应残基来取代人源Dll4的亚结构域来构建12种敲除的嵌合变体。图4示出了DLL4的细胞外部分是如何分为结构上定义的亚结构域的。成熟DLL4蛋白质的较大氨基末端(N末端)分为两个较小的节段。KO变体N末端1用人源DLL1替代了成熟DLL4蛋白质的开始的86个氨基酸(AA)，而KO变体N末端2用人源DLL1替代了氨基酸87-146。图中所描绘的其他敲除变体包括Dll1的取代物：完整的N末端结构域(AA1-146)，DSL结构域(AA147-191)，EGF1结构域(AA192-224)，EGF1和2结构域(AA192-255)，EGF3和4结构域(AA256-333)，以及4个EGF5-8结构域(AA334-503)。此外，对结合的结构域取代变体进行基因工程操作：N末端和DSL结构域(AA1-191)、N末端加上DSL和EGF1-2结构域(AA1-255)、DSL和EGF1-2结构域(AA147-255)、以及DSL和EGF1结构域(AA147-224)。如抗Dll4和Dll1多克隆抗体所监控的那样，所有重组蛋白质都在细胞表面上良好表达(图5中，两行中上面的一组)，但是Mab21H3RK不能识别由DSL和EGF1人源Dll1结构域组成的构建子(图5中，下面的一组)。此外，Dll1构建子编码了使Mab21H3RK与Dll1结合的Dll4DSL和EGF1结构域(敲入突变体)(参见图6)。因此，21H3RK的结合抗原决定部位定位于DSL和EGF1结构域中。
为了精制所述蛋白质节段中的结合抗原决定部位以及识别造成Mab21H3RK的结合特异性的重要残基，对3种其他变体进行基因工程操作。使用相应的Dll1残基取代Dll4的DSL和/或EGF1结构域中3个的15个氨基酸节段：片段A(AA187-201)、片段B(AA200-214)和片段C(AA210-224)仅编码了较少的氨基酸取代，其中Dll1和Dll4序列并非是保守的。片段A跨越了DSL结构域的至少5个氨基酸，DSL和EGF1结构域之间的4个氨基酸连接体，以及EGF1结构域的6个氨基酸。取代Dll1残基中的这些15个氨基酸使得Mab21H3RK的结合有所损失。当片段B和C中的Dll4残基被Dll1所替代时，未观察到有任何效果。这些数据表明，包含DSL的C末端和EGF1的N末端的15个氨基酸(AA187-201)对于结合是重要的，针对具有定位于DSL的C末端和EGF1的N末端的重要区域(AA187-201)的DSL和EGF1结构域(AA147-224)，绘制21H3RK的抗原决定部位。
实施例15
通过FACS分析对DLL4抗体导致DLL4内化进行的测定
通过FACS分析对纯化抗体诱导DLL4内化的能力的研究。使稳定表达DLL4的HEK293细胞分离，并在FACS缓冲剂(PBS+2％FCS)中洗涤，然后以每孔50000-100000个细胞的量平板接种于V底平板中。在温暖的37℃的FACS缓冲剂中，将初级抗体(抗DLL4抗体或者合适的同种型对照)稀释成最终浓度为10μg/ml，并在30、60、120或240分钟时将所述的抗体加入到处于组织培养温育器(37℃/5％CO2)的细胞中。在合适的时间点时，将所述的细胞在预冷至4℃的离心机中在500g下离心，并在冰冷的FACS缓冲剂中洗涤，然后与FITC标记的抗人源IgG第二抗体(1μg/ml，JacksonLabs，编号#109-096-098)在冰上温育10分钟。在温育后，将细胞在预冷的离心机中在500g下再次离心，然后用冰冷的FACS缓冲剂洗涤，并用2％低聚甲醛固定20分钟。通过在FACSCalibur上进行读取来估测内化情况。在这些测试条件下，21H3RK在上述时间点处发生了＜10％的内化。此外，可以通过与DLL4的非交叉竞争的抗体(并非为第二抗人源IgG抗体)温育来测定内化情况。在某些试验中，按照上文所述，将稀释于FACS缓冲剂中的初级抗体(10ug/ml)与过表达DLL4的细胞在冰上预温育30分钟，然后在温暖的37℃FACS缓冲剂中洗涤，再在组织培养温育器中将细胞温育30、60、120或240分钟。在这些温育操作之后，洗涤细胞，并与第二抗体温育，在按照上文所述固定，然后再FACSCalibur上进行读取。在这些条件下，对于21H3RK和4B4而言，在t＝60和240分钟时观察到，相对于t＝0时内化率分别为＜15％和＜35％。还可以通过与DLL4的非交叉竞争的抗体(并非为第二抗人源IgG抗体)温育来测定在上述条件下的内化率。
实施例16
抗DLL4的抗体在血管生成的小鼠基质胶栓模型中的活性
可以采用基质胶栓测试方法估测调节血管生成的抗DLL4抗体的能力。在该测试中，可以将诱导血管生成的化合物(例如bFGF、VEGF或肿瘤细胞)引入到液态基质胶中，在皮下注射后，所述的基质胶固化，并可以通过内皮和血管平滑肌细胞渗透，并可以形成新的血管。简言之，在4℃下为液态形式的基质胶可以与载体(例如PBS)或生长因子/肿瘤细胞(例如LL2、MCF7、A431、Colo205、KNRK、Calu-6、SW620、Panc1)混合，并将0.5ml的基质胶以皮下方式注射到雌性129s1/SvlmJ小鼠(6-8周龄，n＝5/组)的下腹区域。可以通过腹膜内注射的方式每周两次给药抗DLL4的抗体。在5-10天之后，可以人性化地对动物实施安乐死，并回收所述的基质胶栓以用于估测血管生成的情况，其可以通过对血管密度和壁细胞恢复情况(例如估测CD31和α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的免疫染色情况，测量血红蛋白的含量以及测量血管的灌注情况(例如采用FITC-右旋糖酐))进行组织学评分来测定。由此，测定抗DLL4的抗体的调节血管生成的能力。
实施例17
抗DLL4的抗体在得自早期肿瘤患者的样品的人肿瘤异种移植物模型中的活性
本实施例描述了抗DLL4的抗体在抑制或预防得自早期患者样品的肿瘤生长(当在小鼠中作为异种移植物生长)中的用途。简言之，可以通过吸入异氟醚将受体小鼠麻醉，直到达到外科手术的麻醉水平。然后，可以使用补充有抗体和10％FCSi的RPMI漂洗早期肿瘤，然后用外科手术刀将肿瘤切碎，从而产生“泥状混合物”，并分成合适的体积以用于移植(例如300mg肿瘤可以移植给4只小鼠)。可以将肿瘤混合物加载到13个计量癌症移植物套针中。套针的杆可以完全充满肿瘤混合物，并且以皮下的方式***到右侧腹中，并且内容物分散在背部脂肪垫以下。然后使小鼠返回至其笼中，并监测恢复情况。
在第一代中，通常将早期肿瘤混合物移植给3-5只小鼠。当肿瘤达到800-1000mm3时，将它们切成大约3x3x3mm片段，并继代接种给5只小鼠，每只小鼠1个片段。除了进行H&E染色和DNA/RNA提取之外，剩余的肿瘤材料保藏在RecoveryTM细胞培养冻存培养基(Gibco，编号#12648-010)中。第2代之后的肿瘤可以用于移植以用于效力研究。在效力试验中，每只动物移植给1个肿瘤片段。
通过测量2个垂直的直径来跟踪肿瘤的生长。在初始治疗之后，每周可以记录两次肿瘤的测量值和体重，并持续2周。用于计算肿瘤体积的公式如下：(LxW2)/2。
DLL4拮抗抗体可以制成溶液剂量。可以在肿瘤的平均体积达到大约100-200mm3时，或者在肿瘤移植的同时，开始进行治疗。治疗时间可以由总天数为28天组成。DLL4拮抗抗体可以以例如5、10或20mg/kg/天(ip，qd，2x/wk)以单一试剂形式或者与其他试剂的组合形式进行给药。在初始治疗之后，每周记录两次肿瘤的测量值和体重，并持续4周。由此，测定DLL4抗体单独抑制或者以组合方式抑制由患者样品衍生的肿瘤异种移植物的生长的能力。

Claims (21)

1.一种与DLL4特异性结合的经分离的抗体或其结合片段，其中所述的抗体或其结合片段含有：
(a)由氨基酸序列NYGIT，即SEQIDNO:30的第31-35位氨基酸残基组成的重链可变区(VH)的互补性决定区(CDR)1；由氨基酸序列WISAYNGNTNYAQKLQD，即SEQIDNO:30的第50-66位氨基酸残基组成的VHCDR2；和由氨基酸序列DRVPRIPVTTEAFDI，即SEQIDNO:30的第99-113位氨基酸残基组成的VHCDR3；和
(b)由氨基酸序列SGSSSNIGSYFVY，即SEQIDNO:32的第23-35位氨基酸残基组成的轻链可变区(VL)的CDR1；由氨基酸序列RNNQRPS，即SEQIDNO:32的第51-57位氨基酸残基组成的VLCDR2；和由氨基酸序列AAWDDSLSGHWV，即SEQIDNO:32的第90-101位氨基酸残基组成的VLCDR3；其中，所述抗体是全人源单克隆抗体或所述结合片段是全人源单克隆抗体的结合片段。
2.根据权利要求1所述的抗体或其结合片段，其中，所述的抗体或其结合片段选自Fab,Fab’,F(ab’)2,Fv和dAb。
3.一种组合物，该组合物含有权利要求1所述的抗体或其结合片段。
4.一种药物组合物，该组合物含有权利要求1所述的抗体或其结合片段。
5.一种与DLL4特异性结合的经分离的抗体或其结合片段，其中所述抗体是全人源单克隆抗体或所述结合片段是全人源单克隆抗体的结合片段，其中所述的抗体或其结合片段含有：
(a)重链可变区(VH)序列，该序列由SEQIDNO:30所示的氨基酸序列组成；和(b)轻链可变区(VL)序列，该序列由SEQIDNO:32或50所示的氨基酸序列组成。
6.如权利要求5所述的抗体或其结合片段，其中所述VL序列由SEQIDNO:32所示的氨基酸序列组成。
7.如权利要求5所述的抗体或其结合片段，其中所述VL序列由SEQIDNO:50所示的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求6或7所述的抗体或其结合片段，其中，所述的抗体或其结合片段选自Fab,Fab’,F(ab’)2,Fv和dAb。
9.一种组合物，该组合物含有权利要求6所述的抗体或其结合片段。
10.一种药物组合物，该组合物含有权利要求6所述的抗体或其结合片段。
11.一种组合物，该组合物含有权利要求7所述的抗体或其结合片段。
12.一种药物组合物，该组合物含有权利要求7所述的抗体或其结合片段。
13.与DLL4特异性结合的全人源抗体或其抗原结合片段在制备治疗需要治疗由DLL4介导的恶性肿瘤的动物中的由DLL4介导的恶性肿瘤的药物中的用途，其中所述抗体是全人源单克隆抗体或所述结合片段是全人源单克隆抗体的结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段含有：
(a)重链可变区(VH)，其中VH的互补性决定区(CDR)1由氨基酸序列NYGIT组成，VHCDR2由氨基酸序列WISAYNGNTNYAQKLQD组成，且VHCDR3由氨基酸序列DRVPRIPVTTEAFDI组成；和
(b)轻链可变区(VL)，其中VL的CDR1由氨基酸序列SGSSSNIGSYFVY组成，VLCDR2由氨基酸序列RNNQRPS组成，且VLCDR3由氨基酸序列AAWDDSLSGHWV组成。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述动物是人。
15.如权利要求13所述的用途，其中所述恶性肿瘤选自：黑素瘤、神经胶质瘤、肝细胞癌、甲状腺肿瘤、胃部癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、成胶质细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、头部和颈部的癌症、间皮瘤、肉瘤、胆管癌、小肠腺癌以及扁平上皮癌。
16.如权利要求13所述的用途，其中所述肺癌是小细胞肺癌或非小细胞肺癌。
17.如权利要求13所述的用途，其中所述恶性肿瘤是肝癌。
18.如权利要求13所述的用途，其中所述恶性肿瘤是胆管细胞癌。
19.如权利要求13所述的用途，其中所述恶性肿瘤是小儿恶性肿瘤。
20.如权利要求13所述的用途，其中所述抗体含有：
(a)由SEQIDNO:30的氨基酸序列组成的VH；和
(b)由SEQIDNO:32的氨基酸序列组成的VL。
21.如权利要求13所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段含有：
(a)由SEQIDNO:30的氨基酸序列组成的VH；和
(b)由SEQIDNO:50的氨基酸序列组成的VL。
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