CN102387816A

CN102387816A - 两个microRNA分子在肺癌预后及药物制备中的用途

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Publication number: CN102387816A
Application number: CN2009801586718A
Authority: CN
Inventors: 詹启敏; 王绿化; 毕楠; 宋咏梅; 曹建忠; 刘文扬
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2009-07-09
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2029-07-09
Also published as: CA2767367A1; EP2462951A1; JP2012532149A; JP5546064B2; US8664191B2; CN102387816B; CA2767367C; EP2462951B1; US20120220644A1; EP2462951A4; WO2011003237A1

Abstract

提供了一种包含microRNA-150和microRNA-886-3p的组合物、包含该组合物的用于检测肺癌预后的装置以及上述组合物在制备抑制哺乳动物和人肺癌转移的药物中的用途。microRNA-150和microRNA-886-3p的表达水平能够用作肺癌预后的诊断指标，并且高的表达水平指示良好的治疗效果。还提供了一种检测样品中microRNA-150和microRNA-886-3p表达水平的方法。

Description

两个 microRNA分子在肺癌预后及药物制备中的用途

技术领域

本发明涉及包含两种小 R A分子 microR A-150和 microR A-886-3p的组合物、包含所述组合物的用于检测肺癌预后的装置及所述组合物在制备抑制哺乳动物及人肺癌转化的药物中的用途。具体的，小 R A 分子 microRNA-150 和 microRNA-886-3p的表达情况作为肺癌预后判断的标志，其中测试样本中含有该基因组合高表达指示良好的治疗效果。本发明还涉及一种用于检测哺乳动物及人肺癌患者体内小 R A分子 microRNA-150和 microRNA-886-3P表达状况的装置及检测待测样品中 microR A-150、 microR A-886-3p表达情况的方法。发明背景

利用分子生物学技术，能够有效地进行分子水平检测来判断恶性肿瘤患者预后，进而为个体化治疗这些疾病提供便利。肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，发病率占男性 18%，女性 21%。 2005年估计我国肺癌的新发病例大约 500， 000 例（男性约 330， 000例，女性约 170， 000例）。死亡率高，每年死于肺癌超过 900,000 例 (Parkin DM 1999)。其中小细胞肺癌占肺癌 15-20%，同非小细胞肺癌相比，具有独特的形态、亚结构、免疫组化特征，被归为神经内分泌肿瘤 (Morita T 1990)。其病程进展快，对首程化放疗敏感，有效率达 60-80%，但是治疗后很快复发，复发后对化、放疗产生抗拒，仅有 15-25%局限期、不足 5%广泛期小细胞肺癌患者通过治疗后获得 5年以上的生存 (Sandler AB 2003)。另夕卜，确诊时有 25-40%小细胞肺癌患者属于 70岁以上的老年患者，由于合并症等原因化疗耐受性差，而治疗手段又有限，预后不佳，中位生存期仅为 10个月左右 (Sekine 1 2004)。因此，新的治疗策略为改善小细胞肺癌预后所迫切需要。

分子靶向治疗为近年来研究热点，并在部分恶性肿瘤治疗中取得突破性进展。如吉非替尼（irresa) 治疗非小细胞肺癌，尤其女性、不吸烟、腺癌患者预后更佳；伊马替尼治疗胃肠道间质瘤，特别是对于有 Kit外显子 11突变者可获得更好的疗效 (Nilsson B 2007)； C225联合放疗治疗局部晚期头颈部癌，较单纯放疗，生存率提高近 1倍 (Bonner JA 2006)。因此，进一步了解小细胞肺癌分子机制对改善预后有很大的帮助。 Fischer等 (Fischer B 2007)就近 20年来这方面研究进行了总结：小细胞肺癌分子通路主要由 PBK/Akt/mTOR和 RAS/MAPK两条通路组成，通路主要依赖于细胞表面受体酪氨酸激酶（RTK) 和相应的细胞外生长因子结合而激活，其中 RTK主要包括 IGF-IR、 EGFR、 VEGFR、 PDGFR、 c-MET。由此，理论上讲抑制 RTK或者通路中的关键靶点可以达到抑制小细胞肺癌生长的目的。但令人遗憾的是临床上并未取得期望的疗效。鉴于此，从其它方面了解小细胞肺癌分子机制或许是治疗的突破点。

小 R A分子（MicroR A)—般由 18-25个核苷酸组成，是非编码 R A分子，可以通过和 mR A结合抑制 mR A功能，调节翻译过程。自 2005年以来有为数不多关于 microRNA与预后关系的文献发表，分别在慢性淋巴瘤，急性髓细胞样白血病，非小细胞肺癌，胰腺癌及神经母细胞瘤，结肠癌中得到证实： micraR A 对预后影响显著。而关于小细胞肺癌预后的研究未见报道。

MicroRNA-150 (简称 miR-150) 定位于 19号染色体，含有 22个核苷酸，其序列如 SEQ ID NO. 1 : 5'-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3'所示， GenBank登录号为： NT_011109.15 第 22272232〜22272315 bp序列，其在成熟的淋巴细胞中常见表达，据 Xiao C 2007年报道，其功能主要为通过调节 c-Myb转录因子控制 B淋巴细胞的生长分化。 microR A-886-3p (简称 miR-886-3p)定位于 5号染色体，含有 21个核苷酸，其序列如 SEQ ID No. 2： 5 '-CGCGGGUGCUUACUGACCCUU-3 ' 所示， GenBank登录号为： NT_034772.5第 3783， 1310〜3783， 1190 bp, 其功能在文献中未见相关报道。发明内容

因此，本发明的第一方面涉及一种组合物，其包含治疗有效量的两种小 R A 分子 microR A-150和 microR A-886-3p，其中 microR A-150和 microR A-886-3P 的序列分别如 SEQ ID NO. 1： 5'-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3'和 SEQ ID NO. 2： 5'-CGCGGGUGCUUACUGACCCUU-3'所示。更特别地，所述组合物还包括用于防止所述小 R A分子降解的防腐剂和药学上可接受的载体。

本发明的第二方面涉及包含第一方面所述的组合物的用于检测肺癌预后的装置。具体的，小 R A分子 microRNA-150和 microR A-886-3p的表达情况作为肺癌预后判断的标志，当所述两种小 R A分子表达量高时，所述患者的预后好。更特别地，所述肺癌为小细胞肺癌。更特别地，所述装置为基因芯片或试剂盒。

本发明的第三方面涉及如第一方面所述的组合物在制备抑制哺乳动物及人肺癌转化的药物中的用途。特别地，所述肺癌为小细胞肺癌。

本发明的第四方面涉及一种用于检测哺乳动物及人肺癌患者体内小 R A分子 microRNA-150和 microRNA-886-3P的表达状况的试剂盒，其包含下述成分： 1 ) 可选地，用于提取所述患者 microRNA的试剂，

2) 用于 microRNA反转录的引物 SEQ ID NO.3 :

5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' ,

3 ) micraRNA通用正义引物 SEQ ID NO.4:

ACTGG-3' (用于 microR A150)，

SEQ ID NO.5: AAGGGT-3' (用于 microR A886-3p)

4) 特异反义引物 SEQ IDN0.6:

5'-GTCTCCCAACCCTTGTACCA-3' (用于 microR A150),

SEQ ID N0.7:

5'-CACGCGGGTGCTTACTGAC-3' (用于 microRNA886-3p: )，

5 ) 可选地，用于反转录 PCR或 PCR的其他必需试剂，及

6) 可选地，用于检测所述 microR A、反转录 PCR产物或 PCR产物所需的其他试剂，

其中 microR A-150和 microR A-886-3P的序列分别如 SEQ ID NO. 1和 SEQ

ID NO. 2所示。特别地，所述装置为基因芯片或试剂盒。

本发明的第五方面涉及一种检测待测样品中 microRNA-150、 microRNA-886-3p表达情况的方法，其包括下述步骤：

1 ) 提取患者新鲜离体组织或***石蜡包埋组织中 micraR A,

2 ) 基因芯片检测肿瘤组织标本，筛选预后相关的基因： mi_CrOR A-150、 microRNA-886-3p,

3 ) 芯片数据处理：用单因素 Cox回归模型计算每个 microR A信号表达值与生存率之间关系；将单因素分析所得有统计学差异的 microRNA信号值乘以危险相关系数线性相加定为复合值；利用复合值中位值作为分界点来评价预后，公式如下：复合值 =0.545 X (microR A150表达值 )+0.617 X (microR A886-3 表达值)，

4)预后模型验证：利用根据 microR A-150、 microR A-886-3p基因序列设计的引物行 PCR扩增，取 2〜4微升 PCR产物进行 1.5%非变性（不加甲醛）琼脂糖凝胶电泳检测，

5 ) PCR数据收集及处理：采用 U6 R A作为内标，进行归一化处理。利用芯片所得模型评价预后。

换言之，本发明人运用 microRNA基因芯片及 qRT-PCR技术对我国肺癌特别是小细胞肺癌进行了研究，出人意料的发现， MicroRNA- 150和 microR A-883-3p 在不同预后的患者组织标本中，表达水平不一致，大部分预后好者，这两个基因均呈现高表达，特别重要的是，将两者表达信号线性相加组合后，表达情况与预后之间关系更为密切。在另外一套标本中再次予以检测，得到了相似的结果。因此，该基因组合可以作为一个很好的肺癌特别是小细胞肺癌预后模型。通过该预后模型，可以将肺癌分为惰性、侵袭性两种类型，不同类型采用不同治疗方案，惰性病变可以采用局部手段如手术、放疗等，而对于侵袭性病变，治疗则相对激进，以全身化疗为主。在将该基因组合应用于相应的基因芯片或试剂盒后，可快速地对哺乳动物包括人的肺癌特别是小细胞肺癌进行预后，从而对肺癌特别是小细胞肺癌治疗模式的改变具有划时代意义。在本发明的一个具体实施方案中描述了含有小 R A分子 microRNA-150 和 microRNA-886-3p 的组合物对肺癌细胞系体外侵袭和粘附能力的影响，结果表明 microRNA- 150 禾卩 microR A-886-3p 可以使肺癌细胞粘附于细胞外基质的能力减弱，抑制肺癌细胞的侵袭转移。因此，本发明所述的小 R A分子 microRNA-150 和 micraR A-886-3p具有应用于肺癌特别是小细胞肺癌治疗的潜力。

在本发明的另一个具体实施方案中描述了本发明涉及的检测方法，其主要包括 microRNA提取、基因芯片制作、杂交及 qRT-PCR验证等步骤。基因芯片检测主要用于筛选与预后相关的基因，筛选出的基因通过 qRT-PCR进行结果验证。鉴于发明人已经找到和小细胞肺癌预后相关的基因，在今后临床应用中，仅运用 microRNA提取及 qRT-PCR两种技术即可。这两种方法对于本领域的技术人员为常规操作。因此，该模型在临床中容易被推广。

在本发明的另一个具体实施方案中还描述了检测待测样品中 microR A-150、 microRNA-886-3p表达情况的方法，其大致如下：

1 ) 提取患者新鲜离体组织或***石蜡包埋组织中 microRNA,

3 ) 芯片数据处理：用单因素 Cox回归模型计算每个 microRNA信号表达值与生存率之间关系；将单因素分析所得有统计学差异的 microRNA信号值乘以危险相关系数线性相加定为复合值；利用复合值中位值作为分界点来评价预后，公式如下：复合值 =0.545 X (microR A150表达值 )+0.617 X (microR A886-3 表达值)，

5 ) PCR数据收集及处理：采用 U6 R A作为内标，进行归一化处理。利用芯片所得模型评价预后。附图说明

图 1 : 显示了 microRNA-150和 microR A-886-3p在小细胞肺癌肿瘤组织中分析的电泳结果，其中

1-40 分别以 145、 146、 147、 148、 151、 152、 156、 157、 158、 160、 162、

163、 165、 167、 168、 169、 170、 172、 174、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 186、 188、 189、 192、 195、 195、 196、 197、 198、 199、 200和 202样品的 Ist-cDNA为模板， RealTime PCR扩增 hsa-miR-let-7i基因；

41-80 分别以 145、 146、 147、 148、 151、 152、 156、 157、 158、 160、 162、 163、 165、 167、 168、 169、 170、 172、 174、 176、 177、 178、 179、 180、 181、 182、 183、 184、 186、 188、 189、 192、 195、 195、 196、 197、 198、 199、 200和 202样品的 Ist-cDNA为模板， RealTime PCR扩增 hsa-miR-150基因；

81-120 分别以 145、 146、 147、 148、 151、 152、 156、 157、 158、 160、 162、

163、 165、 167、 168、 169、 170、 172、 174、 176、 177、 178、 179、 180、 181、

182、 183、 184、 186、 188、 189、 192、 195、 195、 196、 197、 198、 199、 200和 202样品的 Ist-cDNA为模板， RealTime PCR扩增 hsa-miR-886-3p基因，

分子量标记： TaKaRa DL2000,条带大小（从下往上 100bp， 250bp, 500bp, 750bp, lOOObp, 2000bp),

从电泳图结果可以看出 microR A RealTime PCR反应特异性都很好。图 2:显示了根据预后模型表达情况，分析芯片组中小细胞肺癌患者预后情况。图 3: 显示了根据预后模型表达情况，分析 PCR验证组中小细胞肺癌患者预后情况。图 4: 显示了表 1 R A提取质检情况。图 5: 显示了 microR A-886-3p和 microR A-150抑制细胞的体外侵袭能力， A: H446细胞系分别加入 miR对照， miR-150，miR-886-3p，miR-150/miR-886-3p 后，抑制细胞的体外侵袭能力细胞染色示意图，

B: H446细胞系分别加入 miR对照， miR-150，miR-886-3p，miR-150/miR-886-3p 后，抑制细胞的体外侵袭能力柱状示意图。图 6: 显示了 microR A-886-3p和 microRNA-150抑制细胞的体外侵袭能力， A: H1299细胞系分别加入 miR对照， miR-150，miR-886-3p，miR-150/miR-886-3p 后，抑制细胞的体外侵袭能力细胞染色示意图，

B: H1299细胞系分别加入 miR对照， miR-150，miR-886-3p，miR-150/miR-886-3p 后，抑制细胞的体外侵袭能力柱状示意图。图 7: 显示了 microR A-886-3p和 microRNA-150抑制细胞对基质的粘附， A: miR-NC (对照），miR-886-3p，miR-150， miR-886-3p/miR-150转染后， H446 细胞在 30， 60， 90分钟的粘附率柱状示意图 B: miR-NC (对照）， miR-886-3p，miR-150， miR-886-3p/miR-150转染后， H1299细胞在 30， 90分钟的粘附率柱状示意图。具体实施方式

本发明将利用下述实施例进行进一步的描述，但本发明并不局限于这些实施例。

在下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。除非另外指明，本发明实施例中涉及的 RT-PCR、 PCR等操作均按照 "分子克隆实验指南（第三版）"（科学出版社， 2002 [美] J.萨姆布鲁克 D.W拉塞尔著，黄培堂等译）及厂商说明书进行，细胞培养、细胞传代、细胞复苏及冻存、细胞转染及免疫荧光测定等操作均按照 "动物细胞培养--基本技术指南 (第四版)"（科学出版社， 2000， [英]弗雷谢尼 (R.L)著，章静波等译）及厂商说明书进行操作。实施例 1: 检测 microR A-150、 microRNA-886-3p基因表达情况的方法 1、样本总 R A提取 -Trizol法提取组织、细胞总 R A

(1) 样本来源

样本来源于与中国医学科学院肿瘤医院和北京协和医学院肿瘤医院，入组标准：年龄 75岁; KPS评分 80分;行手术士化疗士放疗局限期小细胞肺癌患者;有足够的***石蜡包埋组织，以便获得充足的 miRNA, 有完备的医学书写记录和完整的随访记录。选择 2002-2005年符合入组条件的 42例***固定石蜡包埋小细胞肺癌标本，进行 microRNA芯片检测，筛选和预后相关的 microRNAs。选择 2000-2001年 40例***固定石蜡包埋小细胞肺癌标本，验证芯片结果。具体病例特征见表 1。表 1 病例特点

芯片组验证组

变量 P值

N=42 (%) N=40 (%)

平均士 SD 60.1±11.1 54.3±11.8 0.025 年龄（岁）

范围 33〜74 33〜73

男 30 (71.4) 32 (80.0)

性别 0.445 女 12 (28.6) 8 (20.0)

是 30 (71.4) 29 (72.5)

吸烟 1.000 否 12 (28.6) 11 (27.5)

I 16 (38.1) 6 (15.0)

分期 II 14 (33.3) 10 (25.0) 0.010

III 12 (28.6) 24 (60.0)

上叶 25 (59.5) 21 (52.5)

肿瘤位置 0.657 中下叶 17 (40.5) 19 (47.5)

手术 +化疗 39 (92.9) 32 (80) 治疗手术 +化 +放疗 2 (4.8) 7 (17.5) 0.120 单独手术 1 (2.4) 1 (2.5) (2) 样本处理（细菌、细胞不用研磨）

在铝箔中将 1cm²大小左右的组织样本敲碎，移至已加入钢珠的 Eppendorf管中，使用研磨仪（301/s， 8min) 进行研磨，

注：此步操作应尽可能在低温液氮环境下操作，细菌、细胞样本不用研磨；

(3) 在研磨后的 Eppendorf管中加入 lml Trizol, 振荡混匀；

(4) 将混匀后溶液移至一新 Eppendorf管中，加入 200 μ 1氯仿，振荡混匀；

(5) 离心： 4°C， 12000rpm, 15min_;

(6) 将离心后上清液移至一新 Eppendorf管中，加入 500 μΐ异丙醇，轻轻混匀，室温静置 15min;

(7) 离心： 4°C， 12000rpm, 15min_;

(8) 倒掉上清液，加入 lml 75%乙醇，振荡混匀；

(9) 离心： 4°C， 7500rpm, 5min;

(10) 倒掉上清液，并在超净台中将乙醇挥发干净；

(11) 加入 40〜60 lDEPCH₂O， 65 V 5min助溶；

(12) -20°C冷冻保存。

2、总 R A质量检测

( 1 ) NanoDro 测定总 R A浓度（2 μ 1总 R A上样），

(2) 1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测 R A质量

总 RNA 500ng

5x Loading Buffer 2μ1

DEPC H₂0 to 8〜9μ1

65°C变性 5min，冰浴 5min

EB (500倍稀释） Ι μΐ

总体积约为 6〜8μ1。

甲醛变性琼脂糖凝胶： 30ml 1XTBE Buffer中加入 0.45g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀（肉眼观察无颗粒状悬浮物），冷却至 60°C左右时加入 600μ1甲醛，混匀，倒入 R A专用的制胶器中（7.5X5.5cm)，室温静置 30min左右即可使用。

电泳条件： 120〜130V， 15〜20min。

本发明 40例标本所提取的 R A量，降解情况及大小见表 2及图 4。

表 2 R A质检情况

A260 A280 A260/280 A260/230 浓度（ng/μΐ) 总量 (μ ) 电泳结果

1 62.489 34.048 1.84 2.26 2499.56 499.912 RNA M

2 — ϋ — -L —— —— u —— ? Ji— ——£ί:ί?—?— . RNA降解

3 95.425 52.686 1.81 2.17 3817 763.4 RNA ¾f

、 microRNA逆转录：

(1) 逆转录反应体系

总 R A lOOng microRNA反转录引物 SEQ ID NO.3 1 U 1 (1 Μ)

DEPC H₂Oto 12.3μ1

65°C变性 5min，冰浴 5min

5 1^st Buffer 4μ1

0.1MDTT 2μ 1

dNTPs 0.5 μ 1 (每种 10mM)

R ase Inhibitor 0.2 μ 1 (40U/ l)

共 20μ1体系。

(2) 逆转录程序： 16°C 30min, 37 °C 30min, 70 °C lOmin, 4°C冷藏待用,

4、 microRNARealTimePCR反应

( 1 ) microRNA RealTime PCR反应体系

模版（cDNA) —般是逆转录反应体系 20 μ 1中的 1 μ 1

MgCl₂ 1.6 μΐ

引物 microRNA通用正义引物 0.6μ1 (10μΜ)

对于 microR A150:SEQ ID NO.4

对于 microR A886-3p:SEQ ID NO.5

特异反义引物 0.6 μΐ (10μΜ)

对于 microR A150:SEQ ID NO.6

对于 microR A886-3p:SEQ ID NO.7

DNA Master SYBR Green I MIX 2 μ 1

加无核酸酶 H₂0到 20 μ 1

( 2 ) microRNA RealTime PCR程序

酶激活 95。C， lOmin

扩增反应 95°C， 15s 变性

60°C， 30s 退火、延伸

74 V, 3s 荧光检测

共 40个循环，

熔解曲线 75〜95°C。

(3) microRNA RealTime PCR产物 1.5%非变性（不加甲醛）琼脂糖凝胶电泳检

microRNA RealTime PCR产物 2〜4 μ 1

2x Loading Buffer 4 μ 1

总体积约为 6〜8μ1。

非变性琼脂糖凝胶： 80ml IXTBE Buffer中加入 1.2g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀（肉眼观察无颗粒状悬浮物），冷却至 60°C左右时加入 2 μ 1 ΕΒ (原液）混匀，倒入制胶器中（15 X 15cm)，室温静置 30min左右即可使用。

电泳条件： 100V， 25〜30min。

从电泳图结果可以看出 microR A RealTime PCR反应特异性都很好，见图 1。

5、数据收集及处理：

将 MicroR A表达值转换为代码。按照其表达强度由低到高分为三等份，表达强度位于前 1/3记为 1， 1/3-2/3记为 2，后 1/3记为 3。随后将每个 microR A按代码的形式带入单变量 COX回归模型，寻找和预后相关的基因。预后保护性 microRNA危险比 < 1，预后负相关 microRNA危险比〉 1 [ 18]。通过单变量回归分析寻找到 microRNA后，将每个 microRNA表达值乘以其回归系数（B值）后线型相加作为每个患者的预后危险分数，其中 B值通过单变量 COX回归分析得出。公式如下： Risk score = B1 gl+B2g2+B3g3+...+Bngn (B: 回归系数， g: miR A表达值， miRNA个数） [12， 19]。危险分数越高，其预后越差。然后基于危险分数将 Training组和 Testing组按照中位值作为界值分为高危组和低危组，利用

Kaplan-Meier, log-rank检验方法计算两组生存。采用 U6 RNA作为内标，进行归一化处理。采用单因素 Cox回归模型计算每个 microRNA丰度表达值与生存率之间关系。将单因素分析所得有统计学差异的 microRNA信号值乘以危险相关系数线性相加定为复合值。利用复合值大小来评价患者预后。以复合值中位值作为界值分为两组。低危组和高危组相比，具有更长的生存时间（P=0.005 )，见图 2和 3。图 2示： Training组中，高危组 3、 5年生存率分别为 47. 6%， 28. 6%, 低危组生存率均为 76. 2%。图 3示： Testing组中，高危组 3、 5年生存率分别为 40.0%、 33.6%, 低危组生存率为 74.1%、 68.8%。实施例 2: MicroR A-886-3 和 microR A-150抑制肺癌细胞侵袭和粘附的生物学作用研究

1、实验步骤

( 1 ) 细胞培养

人小细胞肺癌细胞系： NCI-H446,购自中国医学科学院基础细胞中心， 1640培养基，含 10%胎牛血清， 37°C、 5% C0₂培养。

人非小细胞肺癌细胞系： NCI-H1299, 北京大学医学部生化与分子生物学系朱卫国教授馈赠， 1640培养基，含 10%胎牛血清， 37°C、 5% C0₂培养。

(2) miRNA瞬时转染

a. miRNA母液配制：在 5nmol的 miRNA中加入 250μ l x通用缓冲液，得到浓度为 2(^mol/L的 miRNA母液，

b. 取生长状态良好的细胞，于转染前一天将细胞接种于 6孔板中（不加抗生素），细胞密度达到 70%左右时转染，

c 准备以下复合体: A液：将适当浓度的 miRNA稀释于 25(^L无血清培养基中，轻轻混匀。 B 液： Lipofectamine 2 000用前混匀，取 6 L稀释于 25(^L无血清培养基，混匀，室温孵育 5分钟，

d. 将稀释的脂质体与稀释的 miRNA混合，轻轻混匀，室温孵育 20分钟， e. 将混合后的复合物 50(^L加入 6孔板内，加无血清培养基 2mL，轻轻混匀。 6 小时弃去原培养基，换含 10%血清的 RPMI 1640 培养基。 ) miRNA real-time RT-PCR

a. 样本 Total RNA提取 - Trizol法提取细胞 Total R A

(I) 取生长状态良好的细胞，待细胞密度达到 80%-90%时，倾出瓶中的培养液，用 PBS洗 2次；

(II) 加入 lmL Trizol, 轻轻晃动，置于冰上 15分钟；

(III) 将混匀后溶液移至经 DEPC处理的 Eppendorf管中，加入 200μ1氯仿，振荡混匀；

(IV) 离心： 4°C， 12000rpm, 15min_;

(V)将离心后上清液移至一新 Eppendorf管中，加入 500μ1异丙醇，轻轻混匀，室温静置 15min;

(VI) 离心： 4°C， 12000rpm, 15min_;

(VII) 倒掉上清液，加入 lml 75%乙醇，振荡混匀；

(VIII) 离心： 4°C， 7500rpm, 5min;

(IX) 倒掉上清液，并在超净台中将乙醇挥发干净；

(X) 加入 40〜60μ1 ΟΕΡ〔Η2Ο， 65 °C 5min助溶；

(XI) -20°C冷冻保存。

b. Total RNA质量检测

(I) NanoDro 测定 Total RNA浓度（2μ1 Total RNA上样），

(II) 1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测 R A质量，

Total RNA 500ng

5x Loading Buffer 2μ1

DEPC H₂0 to 8〜9μ1

65 °C变性 5min，冰浴 5min

EB ( 500倍稀释） Ιμΐ

总体积约为 6〜8μ1

甲醛变性琼脂糖凝胶： 30ml 1 X TBE Buffer中加入 0.45g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀（肉眼观察无颗粒状悬浮物），冷却至 60°C左右时加入 600μ1甲醛，混匀，倒入 R A专用的制胶器中（7.5 X 5.5cm) ，室温静置 30min左右即可使用。电泳条件： 120〜130V， 15〜20min。

c. miRNA逆转录：

(I) 逆转录反应体系

Total R A lOOng

miRNA反转录引物 Ιμΐ ( ΙμΜ)

DEPC H₂0 至 12.3μ1

65°C变性 5min，冰浴 5min

5 X 1st Buffer 4μ1

0.1M DTT 2μ1

dNTPs 0.5μ1 (各 10mM)

R ase Inhibitor 0.2μ1 (40υ/μ1)

M-MLV Ιμΐ (200υ/μ1) 共 20μ1体系

(II) 逆转录程序： 16°C 30min, 37 °C 30min, 70 °C lOmin, 4°C。

d. miRNA real-time PCR反应

( I ) miRNA real-time PCR反应体系

Template (cDNA) Ιμΐ

MgC12 1.6μ1

miRNA通用 Sense引 0.6μ1 ( ΙΟμΜ)

Primer 物

特异 Anti-Sense引物 0.6μ1 ( ΙΟμΜ)

DNA Master SYBR Green I MIX 2μ1

Nuclease-Free H₂0 至 20μ1

( II ) miRNA real-time PCR程序

酶激活 95°C， lOmin

扩增反应 95°C， 15s 变性

60°C， 30s 退火、延伸

74V， 3s 荧光检测

共 40个循环

溶解曲线 75-95 °C

(III) miRNA real-time PCR产物 1.5%非变性（不加甲醛）琼脂糖凝胶电泳检测

miRNA real-time PCR产物 2〜4μ1

2x Loading Buffer 4μ1

总体积约为 6〜8μ1

非变性琼脂糖凝胶： 80ml 1 X TBE Buffer中加入 1.2g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀（肉眼观察无颗粒状悬浮物），冷却至 60°C左右时加入 2μ1 ΕΒ (原液）混匀，倒入制胶器中（15 X 15cm) ，室温静置 30min左右即可使用。

电泳条件： 100V， 25〜30min。

(4)细胞侵袭能力分析

原理是根据肿瘤细胞侵袭时具有运动性和方向性的特点。肿瘤细胞接触基质面后会通过一系列机制向某一个方向运动。

a. 对于 H446和 H1299细胞，分别稀释 Matrigel至 50(^g/mL和 lmg/mL，将 ΙΟΟμΙ^加在 8μηι孔聚碳酯膜的 transwell小室上室， 37°C 5% C02培养箱中孵育 lh，吸去水相备用，

b. 取转染后 48小时，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，以一定密度重悬， c 分别将 20(^L 含有 10x104或者 5x104个细胞的 H446或者 H1299细胞悬液种植于每个 transwell小室上室，向下室中加入 800μΙ^ 含 10%血清的培养液，于 37°C 5% C0₂培养箱中培养 12小时，

d. 取出小室，刮去上层未发生迁移的细胞，

e. 以 70%的甲醇固定膜上的细胞， 15分钟，

f. 以 0.5%结晶紫（甲醇配制）染色 20分钟，蒸馏水清洗，

g. 显微镜下计数小室下表面的细胞数，进行统计学分析，同时拍照。

(5 ) 肿瘤细胞粘附分析

a. 用预冷的 tip头无菌操作吸取纤粘连蛋白，稀释至 2(^g/mL， b. 向 96孔板每孔加入 5(^L稀释后的纤粘连蛋白，

c 于无菌台内将包被过纤粘连蛋白的 96孔板风干备用，

d. 取 miRNA转染后 48小时的肿瘤细胞，消化，离心，以含 10%血清的培养液重悬细胞，

e. 于预铺纤粘连蛋白的 96孔板每孔加入 5x104细胞，设 5个平行孔， f. 将 H446和 H1299分别于孵育 30、 60、 90分钟后和 30、 60分钟之后用

PBS洗涤以去除未粘附的细胞，完全粘附组均在 3小时后弃去培养基，以 70%甲醇固定 10min，室温下晾干， 0.1 %浓度结晶紫染色 20min， 10 SDS脱色后测定 570nm处的 OD值，代表不同时间的粘附细胞，每一实验组均设立完全粘附组，

g. 以残留细胞计算出粘附率，细胞粘附率 = (实验组 OD值 /完全粘附组 OD 值) xl 00%。

(6) 统计学分析

实验数据采用 SPSS10.0 软件包 (SPSS, Chicago, IL)进行双侧 Student's t检验， p<0.05为差异具有显著性。

2、结果

( 1 ) 用化学合成成熟 miRNA转染肺癌细胞系高表达目的 miRNA 采用 lipofectamine 2000，单独转染时以终浓度为 50nM的 miR-886-3p， miR-150 或 miR-AS-EGFP对 H446和 H1299细胞进行瞬时转染；共转染时以终浓度 37.5nM miR-886-3 和 miR-150或者终浓度 75nM miR-AS-EGFP转染 H446和 H1299细胞， miR-AS-EGFP作为对照。转染后 48小时收集细胞。通过 real-time PCR检测 miR-886-3p和 miR-150表达水平。单独转染和共转染之后二者的表达在 H446细胞系中分别相对对照提高了 2.5倍、 2.9倍，以及 1820.6倍、 101.5倍，在 H1299细胞系中分别提高了 235.4倍、 1723.3倍，以及 2736.3倍、 2052.0倍。结果表明转染之后 miR-886-3p和 miR-150在 H446和 H1299细胞系中表达水平显著提高，表明转染程序及体系适合进行 miRNA高表达的相应研究。

(2) miR-886-3 和 miR-150高表达对 H446和 H1299细胞系的体外侵袭能力的影响

采用 Tnmswell侵袭实验进行肿瘤细胞体外侵袭能力的研究。转染后 24小时，将 H446细胞和 HI 299细胞消化，用无血清的 RPMI 1640重悬，分别以 1 X 105和 5 X 104的数量种植于 Transwell小室上室，将 800μ1含有 10%血清的 RPMI 1640 加入小室下室， 37°C培养 12小时，细胞进入 8μηι孔聚碳酯膜的下层。 0.5 %结晶紫染色，在显微镜下可见膜上被染成紫色的细胞（图 5Α，图 6Α ) ，计数聚碳酯膜下表面的细胞数，经过计算 miR-886-3p、 miR-150以及 miR-886-3p/miR-150转染后的 H446细胞穿过膜的细胞数分别为对照的 55.0%±8.5% 、 65.7%±8.5% 、 71.0%±8.5%, H1299细胞穿过膜的细胞数分别为对照的 73.6%±3.5% 、

61.8%±11.1% 、 83.7%±8.3%.结果表明，与对照细胞相比， miR-886-3p、 miR-150 以及 miR-886-3p/miR-150高表达的 H446和 H1299细胞体外侵袭能力明显减弱（图 5B,6B) ，经统计学分析，差异具有显著性。

(3 ) miR-886-3 和 miR-150高表达对 H446和 H1299细胞系与细胞外基质粘附能力的影响

细胞粘附能力在肿瘤细胞的转移过程中具有重要作用。转染后 48小时，将

H446细胞和 H1299细胞以 5 X 104的数量种植于纤粘连蛋白 (20 g/mL)细胞外基质包被的 96孔板，在不同的时间点进行冲洗，残留的细胞即发生粘附的细胞，用 70 %甲醇固定 10min， 0.1 %结晶紫染色 20min， lOOul 10 %SDS脱色后在 570nm处检测吸光光度值，计算得出粘附细胞的比率，反映了细胞对细胞外基质的粘附能力。检测结果发现， miR-NC,miR-886-3p,miR-150和 miR-886-3p/miR-150转染后， H446 细胞在 30分钟的粘附率分别为 14.9%±0.9%、 11.3%±0.3% 13.3% ±0.1%、 11.4% ±0.3%； 60分钟的粘附率分别为 45.1%±1.9%、 42.8%±2.2%、 45.1%±1.8%、 41.6% ±1.1%； 90分钟的粘附率分别为 56.9%±1.0%、 49.0%±2.0%、 52.8%±0.5%、 47.6% ±0.5% (图 7A) 。 MiR-NC、 miR-886-3p miR-150和 miR-886-3p/miR-150转染后， H1299细胞在 30分钟的粘附率分别为 37.6%±1.5%、 34.7%±2.8% 24.6% ±3.0%、 23.4% ±0.5%； 90分钟的粘附率分别为 47.1%±1.5%、 40.0%±2.1%、 36.6%±2.2% 29.9% ±4.2% (图 7B) 。与对照细胞相比， miR-886-3p、 miR-150以及

miR-886-3p/miR-150转染后的 H446和 H1299细胞粘附率均有所减少，经统计学分析，差异有显著性。结果表明 miR-886-3p、 miR-150以及 miR-886-3p/miR-150高表达的 H446和 H1299细胞粘附于细胞外基质的能力减弱。参考文献

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Sandler AB (2003). "Chemotherapy for small cell lung cancer." Semin Oncol 30: 9-25.

Claims

权利要求书

1、一种组合物，其特征在于其包含治疗有效量的序列如 SEQ ID NO. 1所示的小 RNA分子 microRNA-150和序列如 SEQ ID NO. 2所示的小 RNA分子 microRNA-886-3p。

2、根据权利要求 1所述的组合物，其特征在于其还包括药学上可接受的载体。

3、包含根据权利要求 1所述的组合物的用于检测哺乳动物及人肺癌预后的装置。

4、根据权利要求 3所述的装置，其特征在于所述肺癌为小细胞肺癌。

5、根据权利要求 3所述的装置，其特征在于所述装置为基因芯片或试剂盒。

6、根据权利要求 1所述的组合物在制备抑制哺乳动物及人肺癌转化的药物中的用途。

7、根据权利要求 6所述的用途，其特征在于所述肺癌为小细胞肺癌。

8、一种用于检测哺乳动物及人肺癌患者体内小 RNA分子 microRNA-150和 microRNA-886-3P表达状况的装置，其包含下述成分：

1 ) 可选地，用于提取所述患者 microRNA的试剂，

2) 用于 microRNA反转录的引物 SEQ ID N0.3:

5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，

3 ) microRNA通用正义引物 SEQ ID N0.4:

5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA CCACTGG-3' (用于 microRNA150 )，

SEQ ID NO.5:

5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA CAAGGGT-3' (用于 microRNA886-3p)，

4) 特异反义引物 SEQ IDNO.6:

5，-GTCTCCCAACCCTTGTACCA-3，（用于 microRNA150)，

SEQ ID NO.7 :

5 ' -CACGCGGGTGCTTACTGAC-3 ' (用于 microRNA886-3p ),

5 ) 可选地，用于反转录 PCR或 PCR的其他必需试剂，及 6)可选地，用于检测所述 microRNA、反转录 PCR产物或 PCR产物所需的其他试剂，

其中 microRNA-150禾卩 microRNA-886-3P的序列分别如 SEQ ID NO. 1： 5 ' -UCUCCC AACCCUUGUACCAGUG-3 ' 禾 B SEQ ID NO. 2 ： 5， -CGCGGGUGCUUA- CUGACCCUU-3'所示。

9、根据权利要求 8所述的装置，其特征在于所述装置为基因芯片或试剂盒。

10、一种检测待测样品中 microRNA-150、 microRNA-886-3 表达情况的方法，其包括下述步骤：

1 ) 提取患者新鲜离体组织或***石蜡包埋组织中 microRNA,

2) 基因芯片检测肿瘤组织标本，筛选预后相关的基因： microRNA-150、 microRNA-886-3p,

3) 芯片数据处理：用单因素 Cox回归模型计算每个 microRNA信号表达值与生存率之间关系；将单因素分析所得有统计学差异的 microRNA信号值乘以危险相关系数线性相加定为复合值；利用复合值中位值作为分界点来评价预后，公式如下：复合值 =0.545 X (microRNA150表达值 )+0.617 X (microRNA886-3p表达值)，

4) 预后模型验证：利用根据 microRNA-150、 microRNA-886-3p基因序列设计的引物进行 PCR扩增，取 2〜4微升 PCR产物进行 1.5%非变性（不加甲醛）琼脂糖凝胶电泳检测，

5) PCR数据收集及处理：采用 U6 RNA作为内标，进行归一化处理。利用芯片所得模型评价预后。