CN112980957B - 抑制非小细胞肺癌转移的靶标hsa_circ_0001326及其应用 - Google Patents

抑制非小细胞肺癌转移的靶标hsa_circ_0001326及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明为抑制非小细胞肺癌转移的靶标hsa_circ_0001326及其应用，公开了hsa_circ_0001326的用途：作为非小细胞肺癌转移诊治的靶标，或作为诊治非小细胞肺癌转移的分子标记物。过表达hsa_circ_0001326可以抑制非小细胞肺癌的转移；从而表明hsa_circ_0001326可以作为预防和治疗转移性非小细胞肺癌的潜在靶标。

Description

抑制非小细胞肺癌转移的靶标hsa_circ_0001326及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及抑制非小细胞肺癌(NSCLC)转移的新靶标及其应用。
背景技术
据2018年全球癌症机构的数据显示肺癌的发病率占所有癌症的11.6％，且死亡率占所有癌症的18.4％，其发病率和死亡率均位居各类癌症的首位。在我国肺癌也是威胁全国人民健康最主要的恶性肿瘤，据2015年中国癌症中心的最新数据表明，肺癌发病率高达20.03％，死亡率更是高达26.99％。2020年世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布了全球最新癌症负担数据，预估肺癌发病率全球第二，死亡率却全球第一，反映了肺癌当前形势仍然十分严峻；而在中国，肺癌的发病率和死亡率依旧排在各类癌症的首位。据肺癌组织病理类型及特征可分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中约85％的肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。由于肺癌预防难、发现难、复发转移率高和诊疗均质化程度低等原因，肺癌的发病率和死亡率居高不下，而降低肺癌死亡率的关键是寻找到早期诊断和早期治疗的技术手段。虽然近年来肿瘤免疫与分子靶向治疗研究在肺癌研究中有一定突破性的进展，也有大量肺癌的研究成果用于指导临床治疗，但是由于靶点耐受、脱靶效应、表观遗传耐受、肿瘤微环境变化等因素的影响，目前缺少有效的诊断与治疗方法。肺癌发展相关的分子机制目前也仍未完全阐述清楚，认为是多因素综合的结果，那么探究影响肺癌进展的分子机制显得十分重要，因为这不仅有利于补充肺癌发展过程中的分子机制，更有利于催生新的肺癌相关的治疗手段。
非编码RNA被发现之前，人们一直认为生物在分子层面上的生物学行为是由蛋白质与蛋白质的相互作用实现的。而后来的研究发现，人类基因组转录区高达76％，但转录产物中只有不到2％是编码蛋白质的mRNA，其他均为非编码RNA(miRNA、lncRNA、circRNA等)。起初人们认为这些转录产物都是基因表达的转录“噪声”，本身并不具备任何生物学功能。但是，随着研究的深入，近些年来越来越多的研究发现非编码RNA在生命过程中扮演着极为重要的角色，也参与多种疾病的发生发展。
circRNA是一类特殊的非编码RNA分子，不含5’和3’末端，呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含miRNA结合位点，通过与疾病关联的miRNA相互作用，在疾病中发挥着重要的调控作用。近些年来，人们已发现circRNA与肿瘤细胞的增殖、凋亡、耐药、侵袭和转移密切相关，circRNA表达量的变化也可以影响肺癌的进展。但是在肺癌中，还有许多具有重要作用但是功能未知的circRNA分子未被研究报道，因此新circRNA分子靶标的鉴定及机制阐明，有助于全面了解circRNA的生物学功能，同时也有助于促进新的高效诊治肺癌的标志物及药物的研发。
hsa_circ_0001326被公开发表于期刊“The expression profile of circRNAand its potential regulatory targets in the placentas of severe pre-eclampsia”中，目前已知的用途是：hsa_circ_0001326可作为重度子痫前期的诊断标志物。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种抑制非小细胞肺癌转移的新靶标及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供hsa_circ_0001326的用途：可以作为非小细胞肺癌转移诊治靶标的应用，也可作为诊治非小细胞肺癌转移的分子标记物。
本发明还同时提供了hsa_circ_0001326表达促进剂在制备抑制非小细胞肺癌转移的药物中的应用。
作为本发明应用的改进：抑制非小细胞肺癌细胞体内转移。
作为本发明应用的进一步改进：所述hsa_circ_0001326表达促进剂为hsa_circ_0001326的过表达质粒。
本发明还同时提供了一种预防或/和治疗非小细胞肺癌的组合物，组合物包含：hsa_circ_0001326的表达促进剂，药剂学上能够接受的载体。
本发明还同时提供了一种检测hsa_circ_0001326表达的试剂：所述hsa_circ_0001326表达的试剂包含基于实时荧光定量PCR定量检测方法的试剂，实时荧光定量PCR定量检测方法的试剂包含一对特异性引物，引物序列为
F(上游引物):5’-GGAATGTGCTCTTTTGGATGGA-3’；
R(下游引物):5’-GGTGGTCCCAGTAGATAAGCG-3’。
本发明所采取的技术方案如下：通过高通量测序技术手段，在非小细胞肺癌组织与癌旁组织中筛选差异表达的circRNA。根据下调倍数从高到低以及p＜0.05选择排名靠前的circRNA，通过实时荧光定量PCR(Q-PCR)技术在非小细胞肺癌细胞系中进一步筛选，发现hsa_circ_0001326下调最显著，并且在实验室收集的58对配对的临床组织样本进一步验证其表达。发现相较于正常组织，hsa_circ_0001326在非小细胞肺癌组织中表达水平同样显著下调，与高通量测序结果一致。
同时，将58对临床样本根据病理报告中的分化程度分组，并按照分期标准进行分期并分组，实时荧光定量PCR检测发现，相对于非小细胞肺癌高分化的患者，hsa_circ_0001326在中低分化的患者体内表达更低；即，与高分化的临床组织样本中，hsa_circ_0001326在中低分化的临床组织样本中表达更低；相对于Ⅰ期非小细胞肺癌患者，Ⅱ期和Ⅲ期非小细胞肺癌患者体内hsa_circ_0001326的表达量更低。可见，检测hsa_circ_0001326的表达与非小细胞肺癌转移的进展密切相关。本发明有望为抑制非小细胞肺癌转移提供新的靶点和相应策略。
本发明通过构建hsa_circ_0001326过表达质粒并建立鳞癌细胞系H226和腺癌细胞系H1299的稳定转染细胞株后，通过Transwell实验，体外研究发现，过表达hsa_circ_0001326显著抑制了H226细胞和H1299细胞的迁移与侵袭能力。
采取尾静脉注射的方式建立裸鼠肺转移模型，观察H226细胞在裸鼠体内肺转移情况。研究发现，hsa_circ_0001326显著抑制了非小细胞肺癌细胞H226细胞的体内转移能力。
需要说明的是：hsa_circ_0001326的已知用途--作为重度子痫前期的诊断标志物，与本发明的技术方案没有任何关系。因为子痫前期是一种妊娠并发症，与非小细胞肺癌的进展无因果关系，且目前已知硫酸镁是治疗重度子痫前期的首选药物，该药物也并不能抑制非小细胞肺癌的转移。此外，目前现有的抑制非小细胞肺癌(NSCLC)转移的靶标包括EGFR，ALK，ROS1，BRAF，和PD-L1等，但是这些靶分子与本发明的hsa_circ_0001326在基因来源以及性质特征等方面存在着本质的区别。
本发明具有如下有益效果：
本发明通过高通量测序筛选非小细胞肺癌组织与癌旁组织中差异表达的circRNA，并通过Q-PCR实验技术发现，与正常组织相比，癌组织中hsa_circ_0001326表达显著下调，并且hsa_circ_0001326基因的表达高低与非小细胞肺癌的分化程度相关，在晚期病人中相较于早期病人表达水平显著降低，表明hsa_circ_0001326可以作为非小细胞肺癌诊断标志物，也可以用于治疗标靶的研发。同时，本发明进一步以非小细胞肺癌细胞H226和H1299为模型，过表达hsa_circ_0001326可显著抑制非小细胞肺癌细胞H226和H1299的体内外转移能力，动物实验表明，过表达hsa_circ_0001326可显著抑制非小细胞肺癌细胞H226的体内转移能力，即，过表达hsa_circ_0001326可以抑制非小细胞肺癌的转移；从而表明hsa_circ_0001326可以作为预防和治疗转移性非小细胞肺癌的潜在靶标。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为hsa_circ_0001326在非小细胞肺癌组织和细胞中表达相对下调且与非小细胞肺癌转移相关；
图1中，
A为利用hsa_circ_0001326特异性引物检测hsa_circ_0001326在58对临床样本中的表达情况；
B为利用hsa_circ_0001326特异性引物检测hsa_circ_0001326在非小细胞肺癌细胞系的表达情况；
C为利用hsa_circ_0001326特异性引物检测hsa_circ_0001326在58例不同分化程度的非小细胞肺癌癌组织中的表达情况；
D为利用hsa_circ_0001326特异性引物检测hsa_circ_0001326在58例不同TNM分期的非小细胞肺癌癌组织中的表达情况。
图2的A～B为实时荧光定量PCR检测H226(hsa_circ_0001326)，H1299(hsa_circ_0001326)及其空载稳定转染细胞株中hsa_circ_0001326表达的柱状图，p<0.05。
图3的A～D为通过Transwell实验验证hsa_circ_0001326对非小细胞肺癌细胞H226与H1299体外迁移与侵袭能力的影响。
图4为通过裸鼠肺转移模型验证hsa_circ_0001326对非小细胞肺癌细胞H226体内迁移与侵袭能力的影响；
图4中，
A为采取尾静脉注射的方式建立了裸鼠肺转移模型，造模成功后对裸鼠肺组织进行正反面拍照；
B为通过苏木精-伊红(HE)染色进一步证实肺组织的病理组织学变化；
C为采取尾静脉注射的方式建立了裸鼠肺转移模型，造模成功后计数裸鼠肺表面转移灶，并做出肺表面结节数差异柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
通过Q-PCR检测hsa_circ_0001326在58对临床组织样本中的表达情况以及在细胞系中的表达情况(图1A-1B)；检测hsa_circ_0001326在不同分化程度的非小细胞肺癌组织中的表达差异情况(图1C)；检测hsa_circ_0001326在不同TNM分期的非小细胞肺癌组织中的表达情况(图1D)。
具体如下：
1)筛选高通量测序结果中非小细胞肺癌组织与癌旁组织中的差异表达circRNA，并且在非小细胞肺癌细胞系中验证其表达，发现hsa_circ_0001326下调最显著。
2)利用Q-PCR技术进一步检测hsa_circ_0001326在更多的非小细胞肺癌组织和细胞系的表达情况，发现与正常组织/细胞系相比，hsa_circ_0001326显著下调(图1A-1B)。将临床组织分别根据分化程度和TNM分期进行分组，并分析hsa_circ_0001326在不同分化程度与不同TNM分期的癌组织的表达情况(图1C-1D)。对表达量进行t-test结果分析，P<0.05表明相比较的两组数据有显著性差异。
3)58对临床组织样本
本发明中所用的58对非小细胞肺癌临床组织样本为已确诊并实施手术切除的非小细胞肺癌临床组织样本，由合作医院温州医科大学附属第一医院提供，且组织经过经验丰富的病理医师诊断为非小细胞肺癌。标本采集时选取距离非小细胞肺癌组织最远处(＞5cm)的组织作为正常对照，组织经液氮速冻后保存于-80℃冰箱待用。样本的采集与利用已通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会的伦理批准，并严格遵守相关制度与流程；所有患者资料均包含姓名、性别、年龄、病理诊断等信息。
4)组织总RNA提取(冰上操作，常规技术)
a.从-80℃冰箱中取出非小细胞肺癌临床样本，每个组织样本取约米粒大小的组织块置于去酶Ep管中，加入1mL的TRIzol，剪碎组织并用组织破碎仪充分破碎。
b.加入200μL的氯仿，剧烈震荡30-60s，冰上静置5min。提前预冷离心机至4℃。4℃离心，12000g，15min。
c.用200μL的去酶枪头吸取上清，移至新的去酶Ep管中，约400μL。加入等体积的异丙醇400μL，颠倒混匀，-20℃冰箱静置20min。4℃，12000g，离心10min，弃去上清。
d.用DEPC水配制75％酒精，向上述沉淀中加入1mL配置好的75％酒精，将沉淀轻轻吹起不吹散，4℃，7500g，离心5min，弃去上清，重复此步骤一次。
e.弃去上清后空离2min，用去酶小枪头吸取残留上清，留底部白色沉淀。开盖晾干，待底部白色沉淀透明后加入去酶水。58℃水浴溶解10min，测定RNA浓度。
5)RT-PCR(常规技术)
依照4)中提取并测定完成RNA浓度后，使用购买于Promega公司的GoScriptTM逆转录酶试剂盒(A5001)进行逆转录，根据试剂说明书逆转录反应体系及步骤如下：
a.5μL体系(除RNA外均来自试剂盒)
Figure BDA0002984260690000051
Figure BDA0002984260690000061
200μL去酶Ep管中按上表比例加入各成分，混匀后点离，PCR仪上70℃加热5min，冰上静置5min，为第一步反应所得产物。
b.15μL体系(均来自试剂盒)
Figure BDA0002984260690000062
按上表比例加入各成分混匀并加入到第一步反应所得产物中，进行第二步PCR反应。反应条件如下：
退火 25℃ 5min
延伸 42℃ 1h
灭活 70℃ 15min
得到cDNA后，封口膜密封于-80℃冰箱保存或进行下一步实验后再进行保存处理。
6)Q-PCR
获得所需细胞cDNA后，进行Q-PCR，反应体系如下(冰上操作)：
Figure BDA0002984260690000063
按照以上反应体系将各组分充分混匀，加入384孔板中，每个样本设置3个复孔，加完样品后封口膜封384孔板，离心3000rpm，2min，使各组分混匀并沉于孔底，置于QuantStudioTM6Flex实时荧光定量PCR仪中进行检测。检测引物为检测hsa_circ_0001326表达的特异性引物，
F(上游引物):5’-GGAATGTGCTCTTTTGGATGGA-3’；
R(下游引物):5’-GGTGGTCCCAGTAGATAAGCG-3’。
Q-PCR反应条件如下：
Figure BDA0002984260690000071
所得结果为：hsa_circ_0001326在非小细胞肺癌组织和细胞系中表达显著下调(如图1A-1B所示)；并且hsa_circ_0001326在不同分化程度的癌组织(如图1C所示)和不同TNM分期的癌组织(如图1D所示)中存在差异表达，提示其与非小细胞肺癌转移相关；
根据该结果，可得知：hsa_circ_0001326可以作为非小细胞肺癌的诊断标志物。
实施例2、hsa_circ_0001326显著抑制非小细胞肺癌细胞的体外迁移与侵袭能力
选用H226细胞与H1299细胞，并采用PLC5-ciR质粒载体构建hsa_circ_0001326过表达质粒，在H226细胞与H1299细胞中过表达hsa_circ_0001326，建立稳定转染细胞株H226(hsa_circ_0001326)及其对照细胞H226(Vector)，H1299(hsa_circ_0001326)及其对照细胞H1299(Vector)，Q-PCR实验验证过表达效率，如图2A-2B所示。
根据图2A-2B可得知：在H226和H1299细胞中成功构建过表达hsa_circ_0001326的稳定转染细胞株。
hsa_circ_0001326过表达质粒的构建方法为：基因合成+亚克隆；
稳定转染细胞株H226(hsa_circ_0001326)，H1299(hsa_circ_0001326)的建立方法，在加入circRNA慢病毒表达载体pLC5-ciR要求的序列后，可参照常规的基因合成和亚克隆进行：
(1)由北京Tsingke生物科技有限公司直接合成目的片段克隆至pUC57载体上。根据广州吉赛生物科技有限公司的circRNA慢病毒表达载体pLC5-ciR说明书，目的片段不只包含circRNA序列，还需在circRNA序列的5’端加入EcoRⅠ酶切位点、正向环化介导序列和AG受体；在circRNA序列的3’端加入GT供体、反向环化介导序列和BamHⅠ酶切位点。合成序列为GAATTCTAATACTTTCAG+hsa_circ_0001326序列+GTAAGAACAACTGGATCC，将合成序列直接克隆至pUC57载体上。
(2)将合成的目的片段“GAATTCTAATACTTTCAG+hsa_circ_0001326序列+GTAAGAACAACTGGATCC”从pUC57载体上酶切下来，再亚克隆至PLC5-ciR载体上。
采用Transwell实验，将H226(hsa_circ_0001326)，H1299(hsa_circ_0001326)及其对照细胞用0.1％FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞之后种于migration和invasion小室的上室中，下室采用全培培养，24h后依次采用4％多聚甲醛固定20min，100％甲醇渗透20min，吉姆萨染色液进行避光染色30min后采集图像，并对迁移和浸润的细胞数进行定量分析，如图3A-3D所示，其差异具有统计学意义。
所得结果为：hsa_circ_0001326显著抑制非小细胞肺癌细胞的体外迁移和侵袭能力；因此，hsa_circ_0001326可以作为治疗非小细胞肺癌转移的新靶标。
实施例3、过表达hsa_circ_0001326显著抑制非小细胞肺癌细胞的体内转移能力
1)动物饲养
BALB/C-nu雌性裸鼠，周龄为5-6周，体重14±0.5克，实验动物由温州医科大学实验动物中心统一购入，并饲养于温州医科大学实验动物中心SPF级实验区域。所进行动物实验的开展已通过温州医科大学实验动物伦理委员会的批准且实验过程符合伦理委员会的动物伦理要求。
2)尾静脉注射
0.25％胰蛋白酶(含EDTA)消化处于对数生长期的H226(hsa_circ_0001326)细胞及其对照细胞H226(Vector)细胞；用培养基终止消化，将所有培养皿的细胞收集至15ml离心管中，1500rpm离心5min，弃去上清培养基，用PBS重悬洗涤细胞一次，再次1500rpm离心5min后弃去PBS，加入1ml PBS重悬，按照一定比例稀释细胞后充池计数，计算所需细胞量。每只裸鼠尾静脉注射100μL细胞悬液，每100μL细胞悬液含150万细胞量。裸鼠尾静脉注射部位用75％酒精擦拭消毒处理，接种前将细胞充分混匀，用1mL无菌胰岛素注射器吸取100μl细胞悬液，缓慢尾静脉注射，每组注射5只裸鼠。
3)结果处理
待裸鼠接种肿瘤细胞生长10周左右时，用0.5％戊巴比妥钠麻醉裸鼠后处死，解剖取出裸鼠全肺组织，苦味酸固定36h，拍照(图4A)并脱水包埋肺组织，包埋块切片后进行HE染色确定肺组织的病理变化(图4B)，最后统计照片中全肺表面结节数(图4C)。
所得结果为：过表达hsa_circ_0001326显著抑制非小细胞肺癌细胞的体内转移能力；因此更进一步说明hsa_circ_0001326可以作为抑制非小细胞肺癌转移治疗的新靶标。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 抑制非小细胞肺癌转移的靶标hsa_circ_0001326及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaatgtgct cttttggatg ga 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtggtccca gtagataagc g 21

Claims (3)

1.hsa_circ_0001326表达促进剂在制备抑制非小细胞肺癌转移的药物中的应用，其特征在于：所述hsa_circ_0001326表达促进剂为hsa_circ_0001326的过表达质粒。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制非小细胞肺癌细胞体内转移。
3.一种治疗非小细胞肺癌的组合物，其特征在于：组合物包含hsa_circ_0001326表达促进剂以及药剂学上能够接受的载体；
所述hsa_circ_0001326表达促进剂为hsa_circ_0001326的过表达质粒。
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