CN102363796A

CN102363796A - 一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法

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Publication number: CN102363796A
Application number: CN2011103558726A
Authority: CN
Inventors: 王福清; 徐莉; 张桐
Original assignee: ZHONGKE MEDICAL INDUSTRY PRODUCTIVITY AND PROMOTION CENTER Co Ltd
Current assignee: ZHONGKE MEDICAL INDUSTRY PRODUCTIVITY AND PROMOTION CENTER Co Ltd
Priority date: 2011-11-10
Filing date: 2011-11-10
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2031-11-10
Also published as: CN102363796B

Abstract

本发明提供了一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，包括以下步骤：将黄曲霉Aspergillus flavus，CGMCC No 5144接入固体PDA斜面培养基中培养，然后从斜面上按1％的接种量接种至含新鲜种子培养基中进行培养；将种子培养基所得菌株按照30％的接种量接种至含新鲜发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，得到含甘草次酸的发酵液；采用膜分离联用工艺从发酵液中分离出甘草次酸粗品，再通过纯化工艺得到高纯甘草次酸。通过本发明最后获得甘草次酸的发酵量达到4.38g/L，产品纯度≥98％、转化率≥90％，达到了工艺规模化水平。

Description

一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种用微生物转化生产甘草次酸的技术。

背景技术

甘草为我国传统中药材，素有“国老”之称，味甘、性平。归心、肺、脾、胃。补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒。可缓解药物毒性、烈性。甘草广泛应用于医药、烟草、食品等领域。甘草酸和甘草次酸是甘草的主要有效成分，甘草酸经胃酸水解或经肝中β-葡萄糖醛酸酶分解形成甘草次酸，甘草酸的药理作用实质上是甘草次酸的效用。

甘草次酸(Glycyrrhetinic Acid)的分子式为C₃₀H₄₆O₄，分子量470.64KD，为白色结晶性粉末，熔点为288-297℃，结构式如图1。本品在吡啶中易溶，在乙醇或氯仿中溶解，在汽油或***中微溶，在水中不溶。

近年随着现代中药的发展，各国学者在中医理论的基础上，对甘草有效成分——甘草次酸的药理作用进行了深入研究，以寻找高效低毒的新有效成分应用于临床。研究发现甘草次酸不仅具有抗炎、抗溃疡、抗病毒、降血脂、镇咳、平喘及祛痰等作用，还可用于防治病毒性肝炎、高血脂症和癌症等疾病，是有效的干扰素诱生剂及细胞免疫调节剂。将甘草酸类药物与生物碱、抗生素、氨基酸等复配或制成其金属化合物，还可增加药物的稳定性，提高生物利用度，降低毒副作用。伴随甘草次酸临床应用价值的深入研究，甘草次酸的开发利用也越来越受到国内外医药界的关注。

甘草次酸的制备未见化学合成法。目前多以天然豆科植物甘草经加工提取来生产，即植物提取法。植物提取法以甘草为原料提取甘草酸，再通过酸水解法水解甘草酸制取甘草次酸。

甘草为药用植物，主要分布于北纬30-55度之间的干旱和半干旱地区，近年由于生态环境的恶化，甘草资源日趋匮乏。另外，以甘草为原料制取甘草次酸，工艺繁琐、产品收率低、成本较高，严重制约了甘草次酸的产量。微生物发酵法是利用微生物大规模发酵所产生的葡萄糖醛酸酶，体外转化甘草中的甘草酸生成甘草次酸的方法。微生物发酵生产不受资源制约，具有反应条件温和、产品专一性好、工艺简单、成本低、不造成环境污染和后处理简单等优点，成为近年该领域研究开发的热点，也是解决当前甘草资源短缺问题的最佳方法。

目前，国外有关甘草次酸微生物转化的研究报道不多，国内主要有四川大学、北京中医药大学、湖北工业大学等科研机构进行相关研究，但均还处于实验研究阶段，尚未形成规模化水平。

本发明通过紫外线和Licl复合诱变处理获得高产葡萄糖醛酸酶的微生物菌种，选择甘草煮提液为培养基带渣发酵，采用超滤与纳滤膜联合分离技术，对不同分子量片段的杂质分级去除，大大提高了产品转化率、收率和纯度，达到了工业规模化水平。

发明内容

本发明提供了一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其特征是，所述的微生物为黄曲霉Aspergillus flavus，CGMCC No.5144。

优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，包括以下步骤：

步骤一、将黄曲霉(Aspergillus flavus)CGMCC No 5144接入固体PDA斜面培养基中培养，然后从斜面上按1％的接种量接种至新鲜种子培养基中进行培养；

步骤二、将处于生长期中的经种子培养基培养的菌种按照30％的接种量接种至含新鲜发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵产生含甘草次酸的发酵液；

优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，在步骤二之后还包括步骤三：然后从发酵液中分离出甘草次酸粗品，并进行纯化。

优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，步骤一中种子培养基的质量百分组成为：玉米糖化液0.5～1.5％，麸皮汁4.5～5.5％，酵母膏0.5～0.7％，硫酸铵0.05～0.15％，硫酸镁0.04～0.06％，磷酸二氢钾0.09～0.11％，甘草酸粗品0.09～0.11％，其余为水。

优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，步骤一中种子培养基培养条件为：菌株置于锥形瓶中于转速200rpm的摇床中振摇培养，通气量0.2m³/h，培养时间24小时。

优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，步骤二中发酵培养基的质量百分组成为：甘草酸0.8～1.2％，硫酸铵0.8～1.0％，硫酸镁0.03～0.05％，磷酸氢二钾0.6～0.8％，磷酸二氢钾0.7～0.9％，其余为水，初始pH4～5。

优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，步骤二中发酵罐中发酵培养条件为：发酵培养基50～70L，发酵温度20～40℃，通气量0.3～0.5m³/h，搅拌速度为130～170rmp，发酵2～4d。

优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，甘草次酸的分离包含以下步骤：

通过滤布过滤，收集滤液1，然后将所得滤液1通过超滤膜PES-20，截流粒径在10nm以上，分子量在500～500000范围内的物质，收集滤液2；

采用纳滤膜NF-270过滤上步骤所得滤液2，截流分子量在200～1000左右的低分子物质，收集滤液3。

优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，甘草次酸的纯化包含以下步骤：

先通过大孔吸附树脂H103对所述滤液3进行分离纯化，得到甘草次酸粗品；

然后将所得甘草次酸的粗品制成样品胶后水平安置于硅胶柱表面，先用纯石油醚通柱，再用石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1(体积比)的流动相每次20目洗脱甘草次酸，收集滤液并进行喷雾干燥、分步收集，最后得到甘草次酸纯品。

优选的是，所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法中，黄曲霉Aspergillus flavus，CGMCC No.5144为通过紫外线和Licl复合诱变处理葡萄糖醛酸的曲霉属黄曲霉获得。

本发明提供了一种微生物转化生产甘草次酸的方法，包括以下步骤：

1)先在固体PDA斜面培养基中对黄曲霉(Aspergillus flavus)CGMCC No 5144进行培养，然后用接种铲从斜面上取一环接种至含种子培养基的锥形瓶中，接种量为1％，培养条件为：pH自然，转速200rpm的摇床中振摇培养，通气量0.2m³/h，培养时间24小时。

2)将种子瓶中培养好的菌株按照30％的接种量转接入100L的发酵罐中，发酵罐内装60L经灭菌的发酵培养基，调整发酵温度为30℃，通气量0.4m³/h，搅拌速度为150rmp，发酵3d，得到含甘草次酸的发酵液。

3)将上述所得含甘草次酸的发酵液先通过滤布除去大分子物质，收集滤液1，然后将发酵液1通过超滤膜PES-20，截流粒径在10nm以上，分子量在500～500000范围内的物质，收集滤液2，再采用纳滤NF-270对滤液2进行浓缩过滤，截流分子量在200～1000左右的低分子物质，收集滤液3。

4)将滤液3通过大孔吸附树脂H103进行分离和纯化得到粗提物，量取粗提物200ml浓缩到一定体积放入瓷碗中，加入80～100目的硅胶5g，快速搅拌均匀，置60℃水浴锅上加热并不停搅拌，待溶剂挥发净尽后即制得样品胶，在硅胶柱中加入300～400目的硅胶100g(分离胶)，保持上表面水平，再装入干燥好的样品胶，然后先用纯石油醚通柱，再用石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1(体积比)的流动相每次20目洗脱甘草次酸，收集滤液并进行喷雾干燥、分步收集，最后得到甘草次酸纯品。

本发明提供的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法具有以下突出特点：

(1)采用紫外线和Licl复合诱变处理筛选高产菌株。所得菌株遗传性能稳定，所分泌的葡萄糖醛酸酶能定向高效地酶解甘草酸的β-葡萄糖糖苷键，大大提高了甘草酸的转化率；

(2)选择甘草煮提液为培养基，不仅为菌种生长提供了丰富的碳源、氮源，而且解决了化学酸解法中原料甘草酸必须经过复杂的精制工艺问题，提高了原料利用率，减少了废液排放和环境污染；

(3)采用超滤与纳滤膜联合分离技术，对不同分子量片段的杂质分级去除，提高了产品收率和纯度，降低了成本。

本发明通过优化发酵培养和目标产品的分离纯化工艺，使得甘草次酸的发酵量达到4.38g/L，产品转化率≥90％，大大降低了甘草次酸的工业生产成本。

附图说明

图1本发明提供的微生物转化生产甘草次酸的工艺流程图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

黄曲霉Aspergillus flavus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏号CGMCC No.5144，保藏日期：2011年08月16日。

实施例1：

将黄曲霉(Aspergillus flavus)CGMCC No 5144接种至含种子培养基的锥形瓶中，pH自然，接种量为1％，转速为200rpm，通气量为0.2m³/h，培养时间为24小时。

将以上培养菌株按照30％的接种量转接入100L的发酵罐内(内装60L经灭菌的发酵培养基)，调整发酵温度为10℃，通气量0.4m³/h，搅拌速度150rmp，发酵3d。

考察甘草次酸的产量。用硫酸香草醛法检测甘草次酸：

(1)对照品溶液配制

精密称取100℃干燥至恒重的甘草次酸标准品20mg，置20ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，得到甘草次酸标准液含量为1mg/mL。

(2)标准曲线的制备

精密量取对标准溶液(1mg/mL)0.1，1.5，2.5，4.5ml挥干分别加0.5ml乙酸乙酯于试管中，再依次加入95％乙醇3ml，1％香草醛水溶液0.2ml，放在冰水中，加入80％硫酸2ml将试管塞紧，混合均匀，立即置于50℃水浴上保温10min，再放至室温，稀释到刻度20ml。取5ml于紫外分光光度计上在500-600nm波段扫描吸收光谱，以0.0mg/ml浓度作空白参比。甘草次酸反应液最大吸收峰作为样品测定吸收峰，测O.D值，其结果为绘制标准曲线。

(3)样品准备

甘草液体发酵产物2.5ml，依次加入5ml乙酸乙酯萃取。吸取乙酸乙酯上清液1ml，3ml乙醇溶液，0.2ml1％香草醛及2ml80％硫酸溶液于50℃显色10min，稀释到刻度20ml，测定O.D。

实施例2

将以上培养菌株按照30％的接种量转接入100L的发酵罐内(内装60L经灭菌的发酵培养基)，调整发酵温度为20℃，通气量0.4m³/h，搅拌速度150rmp，发酵3d，菌株发酵浓度达3.1g/L。

甘草次酸检测方法同上。

实施例3

将以上培养菌株按照30％的接种量转接入100L的发酵罐内(内装60L经灭菌的发酵培养基)，调整发酵温度为30℃，通气量0.4m³/h，搅拌速度150rmp，发酵3d，菌株发酵浓度达4.2g/L。

甘草次酸检测方法同上。

实施例4

将以上培养菌株按照30％的接种量转接入100L的发酵罐内(内装60L经灭菌的发酵培养基)，调整发酵温度为40℃，通气量0.4m³/h，搅拌速度150rmp，发酵3d，菌株发酵浓度达3.3g/L。

甘草次酸检测方法同上。

实施例5

将黄曲霉(Aspergillus flavus)CGMCC No 5144接种至含种子培养基的锥形瓶中，种子培养基质量百分组成为：玉米糖化液0.5％，麸皮汁4.5％，酵母膏0.5％，硫酸铵0.05％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.09％，甘草酸粗品0.09％，其余为水pH自然，接种量为1％，转速为180rpm，通气量为0.15m³/h，培养时间为20小时。

将以上培养菌株按照30％的接种量转接入100L的发酵罐内，内含50L发酵培养基，发酵培养基的质量百分组成：为甘草酸0.8％，硫酸铵0.8％，硫酸镁0.03％，磷酸氢二钾0.6％，磷酸二氢钾0.7％，其余为水，初始pH4，调整发酵温度为30℃，通气量0.3m³/h，搅拌速度130rmp，发酵2d，得到含甘草次酸的发酵液。

将上述所得含甘草次酸的发酵液先通过滤布除去大分子物质，收集滤液1，然后将发酵液1通过超滤膜PES-20，截流粒径在10nm以上，分子量在500～500000范围内的物质，收集滤液2，再采用纳滤NF-270对滤液2进行浓缩过滤，截流分子量在200～1000左右的低分子物质，收集滤液3。

将滤液3通过大孔吸附树脂H103进行分离和纯化得到粗提物，量取粗提物200ml浓缩到一定体积放入瓷碗中，加入80～100目的硅胶5g，快速搅拌均匀，置60℃水浴锅上加热并不停搅拌，待溶剂挥发净尽后即制得样品胶，在硅胶柱中加入300～400目的硅胶100g(分离胶)，保持上表面水平，再装入干燥好的样品胶，然后先用纯石油醚通柱，再用石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1(体积比)的流动相每次20目洗脱甘草次酸，收集滤液并进行喷雾干燥、分步收集，最后得到甘草次酸纯品。

最后获得甘草次酸产品纯度≥98％，转化率≥90％。

实施例6

将黄曲霉(Aspergillus flavus)CGMCC No 5144接种至含种子培养基的锥形瓶中，种子培养基质量百分组成为：玉米糖化液1.0％，麸皮汁5.0％，酵母膏0.6％，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，甘草酸粗品0.1％，其余为水pH自然，接种量为1％，转速为180rpm，通气量为0.15m³/h，培养时间为20小时。

将以上培养菌株按照30％的接种量转接入100L的发酵罐内，内含60L发酵培养基，发酵培养基的质量百分组成：为甘草酸1.0％，硫酸铵0.9％，硫酸镁0.04％，磷酸氢二钾0.7％，磷酸二氢钾0.8％，其余为水，初始pH4.5，调整发酵温度为32℃，通气量0.4m³/h，搅拌速度150rmp，发酵3d，得到含甘草次酸的发酵液。

甘草次酸的分离和提纯步骤同实施例5，最后获得甘草次酸产品纯度≥98％，转化率≥90％。

实施例7

将黄曲霉(Aspergillus flavus)CGMCC No 5144接种至含种子培养基的锥形瓶中，种子培养基质量百分组成为：玉米糖化液1.5％，麸皮汁5.5％，酵母膏0.7％，硫酸铵0.15％，硫酸镁0.06％，磷酸二氢钾0.11％，甘草酸粗品0.11％，其余为水pH自然，接种量为1％，转速为180rpm，通气量为0.15m³/h，培养时间为20小时。

将以上培养菌株按照30％的接种量转接入100L的发酵罐内，内含70L发酵培养基，发酵培养基的质量百分组成为：甘草酸1.2％，硫酸铵1.0％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.8％，磷酸二氢钾0.9％，其余为水，初始pH5，调整发酵温度为30℃，通气量0.5m³/h，搅拌速度170rmp，发酵4d，得到含甘草次酸的发酵液。

实施例8

将从甘草种植地的土壤中采集目标样本经过初筛、紫外诱变和Licl复合多重诱变得到高产葡萄糖醛酸的曲霉属黄曲霉Aspergillus flavus，CGMCCNo.5144。

初筛为取甘草地土样加入无菌蒸馏水，摇匀、静置后，取上清液1ml梯度稀释，然后各吸取0.1ml于在初筛培养基上按常规涂布方法30℃培养3d，初筛平板的质量百分组成：90％甘草酸粗品1.0g，硫酸镁0.05g，硝酸钠0.5g，硫酸亚铁0.001g，磷酸二氢钾0.1g，琼脂1.8g，其余为水，pH5，挑选出长势良好的单菌落，保藏为初筛菌种待用。将初筛菌种接入复筛培养基中，复筛培养基的质量百分组成：10％甘草煮提液(w/v)，pH自然，30℃，150rpm的摇床中发酵培养3d。发酵液作产物TLC检测，在薄层层析板上有甘草次酸斑点出现的菌株即为目标菌株。取目标菌株的菌落于试管斜面培养基上进行培养，培养1～2d即可获得斜面菌种。

紫外诱变是将斜面菌种用接种环轻轻刮孢子于50ml的无菌水三角瓶中，用力摇动5min均匀分散，取5ml置于Ф10cm的平皿中，30W紫外灯，距离30cm，照射20s。

Licl诱变是将经紫外诱变的菌液稀释涂布诱变培养基平板，避光25℃培养5～7d，诱变培养基：葡萄糖4％，硫酸铵0.4％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.05％，酵母膏0.01％，醋酸钠0.2％，醋酸锌6μg/ml，硫酸铜0.5μg/ml，氯化锂0.5％，琼脂2.0％。

最后需要强调的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其特征是，所述的微生物为黄曲霉Aspergillus flavus，CGMCC No.5144。

2.如权利要求1所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其特征是，包括以下步骤：

步骤一、将黄曲霉Aspergillus flavus，CGMCC No.5144接入固体PDA斜面培养基中培养，然后从斜面上按1％的接种量接种至新鲜种子培养基中进行培养；

步骤二、将处于生长期中的经种子培养基培养的菌种按照30％的接种量接种至含新鲜发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵产生含甘草次酸的发酵液。

3.如权利要求1所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其特征是，在步骤二之后还包括步骤三：然后从发酵液中分离出甘草次酸粗品，并进行纯化。

4.如权利要求2所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，步骤一中种子培养基的质量百分组成为：玉米糖化液0.5～1.5％，麸皮汁4.5～5.5％，酵母膏0.5～0.7％，硫酸铵0.05～0.15％，硫酸镁0.04～0.06％，磷酸二氢钾0.09～0.11％，甘草酸粗品0.09～0.11％，其余为水。

5.如权利要求4所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，步骤一中种子培养基培养条件为：菌株放置到锥形瓶中于转速200rpm的摇床上振摇培养，通气量0.2m³/h，培养时间24小时。

6.如权利要求2所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，步骤二中发酵培养基的质量百分组成：为甘草酸0.8～1.2％，硫酸铵0.8～1.0％，硫酸镁0.03～0.05％，磷酸氢二钾0.6～0.8％，磷酸二氢钾0.7～0.9％，其余为水，初始pH4～5。

7.如权利要求6所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，步骤二中发酵罐中发酵培养条件为：发酵培养基50～70L，发酵温度20～40℃，通气量0.3～0.5m³/h，搅拌速度为130～170rmp，发酵2～4d。

8.如权利要求3所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，甘草次酸的分离包含以下步骤：

9.如权利要求3所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，甘草次酸的纯化包含以下步骤：

10.如权利要求1所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，黄曲霉Aspergillus flavus，CGMCC No.5144为通过紫外线和Licl复合诱变处理葡萄糖醛酸的曲霉属黄曲霉获得。