CN102337211B - 细胞培养装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞培养装置包括：固定底板及设在固定底板上的细胞培养***、光调控***和电极***。该细胞培养装置通过微流控技术的特定结构来实现神经细胞的培养，如神经细胞可以生长在细胞培养室中，而轴突却只能生长在神经导管中，培养室中的神经细胞通过神经导管中的轴突构成神经环路，细胞生长区域的重现性和控制力相对较强；再通过激光对神经细胞进行高时空分辨率的调控，选择性和特异性强，可以实现对神经细胞的兴奋和抑制；通过电极***刺激对神经环路进行辅助调控，并对神经环路的行为和功能进行实时检测，时空分辨率高，调控及检测结果可靠。
Description
【技术领域】
本发明涉及神经工程领域，尤其涉及一种基于微流控技术的细胞培养装置。
【背景技术】
随着神经***疾病发病率的不断上升，对它的研究正逐渐成为热点。然而，由于神经***的复杂性，使得在活体(in vivo)研究神经***的某些问题，尤其是对于神经环路以及神经可塑性的探索非常困难。在这种条件下，神经细胞的体外(in vitro)培养就成为了一种较为理想的方法。可以通过体外培养使神经细胞之间建立规则的联系，将神经元之间复杂的三维联系降低到二维，使得其观察和研究更加容易。
传统的神经细胞体外培养的方法是在培养基体上通过表面化学处理(Chemically pattemed surface)、物理微观结构构建(Physical structure)或者溶液浓度梯度(Solution gradients)来调控神经细胞的生长，使之形成神经环路，然后通过功能性电刺激(Functional electrical stimulation)或者局部灌注(Localperfusion)来调控神经细胞。
其中，表面化学处理是通过化学方法将细胞培养基体表面处理成具有一定形状的生物相容性界面，从而吸引神经细胞在这些区域生长；物理微观结构构建是通过微加工技术，将细胞培养基体表面处理成具有一定微观结构的界面，引导神经细胞在指定区域生长；溶液浓度梯度是通过控制生物活性物质(如多肽、蛋白)的浓度来影响神经细胞在一定区域内的生长。功能性电刺激是目前已经用于临床的一种调控方式，在对于原发性震颤、帕金森症和肌张力障碍等疾病的治疗中起到了较好的作用。
然而，通过表面化学处理、物理微观结构构建或者化学浓度梯度来调控神经细胞的生长以形成神经环路，细胞生长区域的重现性和控制力相对较差，从而实验的重现性较差。功能性电刺激虽然有优异的时间分辨率，但是它的空间分辨率较差，并且不具备选择性和特异性，较难实现对神经细胞的抑制。局部灌注虽然具有较高的空间分辨率，但是灌注的位置随意性较大，很难精确控制，重现性较差；此外，局部灌注的时间分辨率较差，无法满足电生理要求。因此，传统的缺少一种可同时用于神经细胞培养，神经环路构建，以及在较高时空分辨率(Spatiotemporal resolution)下进行调控、检测的细胞培养装置。
【发明内容】
基于此，有必要提供一种可同时用于神经细胞培养，神经环路构建，以及在较高时空分辨率下进行调控、检测的细胞培养装置。
一种细胞培养装置包括：固定底板及设在固定底板上的细胞培养***、光调控***和电极***；细胞培养***包括细胞培养室及连通细胞培养室的供神经轴突生长的神经导管；光调控***置于神经导管上方用于对神经导管内的培养物进行光刺激调控；电极***与神经导管相通用于对神经导管内培养物进行辅助调控，并对神经环路的行为和功能进行实时检测。
应用于上述方案，优选的，该细胞培养装置还包括固定在固定底板上的药物灌注***，药物灌注***包括药物灌注池、药物导管及废液池，药物灌注池通过药物导管与废液池相连，药物导管与神经导管相连通。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中电极***包括外接触点、导线及电极点，外接触点通过导线与电极点相连，神经导管与电极点相通。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中电极点通过电化学方法沉积有导电材料用于降低电极点的阻抗，且电极点通过酶固定技术修饰有酶化合物用于采集生化信号。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中电极***通过溅射或光刻的方式形成在固定底板上。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中光调控***的光刺激位置与电极点的位置对应。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中光调控***包括激光光源、光纤接口、光纤及用于控制激光光柱导向和直径的波导，波导通过光纤、光纤接口与激光光源相连。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中电极***包括多个一一对应的外接触点、导线及电极点，多个外接触点围绕固定底板四周均匀分布，多个导线及电极点形成电极阵列，相应的，光调控***包括多个不同直径的波导，多个波导形成波导阵列，波导阵列中波导的位置与电极阵列中电极点位置一一对应；电极阵列、波导阵列及药物导管中设有微流控开关。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中神经导管的宽度为1～10μm，长度为100～1000μm；波导的直经为1～10μm。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中细胞培养***包括两组细胞培养室，每组包括两个连通的细胞培养室，两组细胞培养室之间通过4个神经导管连通，神经导管的直径为5μm，长度为900μm；电极***沿每个神经导管的轴向依次设有16个方形电极点，电极点的长宽均为5μm，每个神经导管轴向的电极点之间相距50μm；光调控***包括16个波导，波导的直径为2μm；药物灌注***包括多个与神经导管正交连通的药物导管。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中光调控***包括激光光源、光纤接口、分接口和光纤，光纤通过分接口、光纤接口与激光光源相连。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中电极***包括多个一一对应的外接触点、导线及电极点，多个外接触点围绕固定底板四周均匀分布，多个导线及电极点形成电极阵列，相应的，光调控***包括多个不同直径的光纤，多个光纤形成光纤阵列，光纤阵列中光纤的位置与电极阵列中电极点位置一一对应；电极阵列、波导阵列及药物导管中设有微流控开关。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中神经导管的宽度为1～10μm，长度为100～1000μm；光纤的直经为1～10μm。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中细胞培养***包括两组细胞培养室，每组包括两个连通的细胞培养室，两组细胞培养室之间通过4个神经导管连通，神经导管的直径为5μm，长度为900μm；电极***沿每个神经导管的轴向依次设有16个方形电极点，电极点的长宽均为5μm，每个神经导管轴向的电极点之间相距50μm；光调控***包括16个光纤，光纤的直径为2μm；药物灌注***包括多个与神经导管正交连通的药物导管。
应用于上述方案及其组合，优选的，其中固定底板的材质为玻璃、硅或二氧化硅；细胞培养室及神经导管的材质为透明的聚二甲氧基硅氧烷。
该细胞培养装置通过微流控技术的特定结构来实现神经细胞的培养，如神经细胞可以生长在细胞培养室中，而轴突却只能生长在神经导管中，培养室中的神经细胞通过神经导管中的轴突构成神经环路，细胞生长区域的重现性和控制力相对较强；再通过激光对神经细胞进行高时空分辨率的调控，选择性和特异性强，可以实现对神经细胞的兴奋和抑制；通过电极***刺激对神经环路进行辅助调控，并对神经环路的行为和功能进行实时检测，时空分辨率高，调控及检测结果可靠。
【附图说明】
图1为一实施方式的细胞培养装置结构示意图；
图2为图1实施方式中细胞培养***结构示意图；
图3为图1实施方式中电极阵列与神经导管分布示意图；
图4为图1实施方式中细胞培养***与药物灌注***分布示意图；
图5为图1实施方式中神经导管与药物导管分布示意图；
图6为图1实施方式中光调控***与细胞培养***分布示意图；
图7为另一实施方式的光调控***与细胞培养***分布示意图。
【具体实施方式】
下面主要结合附图及具体实施例对细胞培养装置作进一步详细的说明。
如图1所示，一优选实施方式的细胞培养装置100包括：固定底板110、细胞培养***120、电极***130、药物灌注***140及光调控***(图未示)。其中，细胞培养***120、电极***130、药物灌注***140及光调控***固定在固定底板110上。
固定底板110可以由硬质材料构成，主要起支撑固定的作用。可以选用的材料有玻璃、硅及二氧化硅等。本实施方式的固定底板110为方形玻璃底板。在其他实施方式中，固定底板110还可以采用其他材料如硅或二氧化硅制作，形状也不限于方形，还可以为圆形等。
请参图2，本实施方式的细胞培养***120包括两组共4个细胞培养室122。每组细胞培养室之间通过主导管124连通。两组之间的主导管124通过设在主导管124上的4个神经导管126连通。神经导管126连通两主导管124，从而两组细胞培养室122可以通过神经导管126连通。细胞培养室122和神经导管126主要用于控制和引导神经细胞的生长和神经细胞之间的连接以及神经环路的形成。可以根据需要的研究模型进行设计不同规格的神经导管126，神经导管126的宽度为1～10μm，长度为100～1000μm。优选的，本实施方式的神经导管的宽度为5μm，长度为900μm，这种设计的神经导管126可以保证神经细胞不会进入到神经导管126中，而只有轴突在神经导管126中生长，从而可以得到有序的神经网络。
细胞培养***120优选柔性透明的透气性较好的材料制作，如硅橡胶等。本实施方式的细胞培养***采用具有高度疏水性的聚二甲氧基硅氧烷(PDMS)制作。为使神经细胞在细胞培养室122中更好的生长，本实施方式的细胞培养室122、主导管124及神经导管126的内表面可以通过表面嫁接、表面涂膜、层层自组装等技术进行生物相容性处理。此外，在细胞培养前，细胞培养室122、主导管124及神经导管126的内表面进一步还可以进行包被处理，如多聚赖氨酸包被、层粘连蛋白包被等。
请结合图1和图3，电极***130包括外接触头132、导线134及电极点136。外接触头132通过导线134与电极点136连接，每个外接触头132对应一个电极点136。多个外接触头132围绕固定底板110的四周均匀设置，多个导线134及电极点136形成电极阵列。本实施方式的固定底板110的每条边设有16个外接触点132。为进一步方便使用，外接触点132的设计使之可以直接连接到通用的电生理测量仪器上进行电生理测量，如美国Plexon公司和德国MEA公司的电生理测量仪。神经导管126的轴向依次排列有由16个导线134及方形电极点136形成的电极阵列，每个电极点136的长宽均为5μm，每两个电极点136之间间隔50μm。神经导管126与电极点136相通，从而电极阵列可以对神经导管126内的培养物进行高时空分辨率的电生理测量和电脉冲刺激。
优选的，本实施方式的电极***130是通过溅射或光刻的方式形成在固定底板110的表面。导线134及电极点136的材料可以为金、铂、氧化铱、氮化钛、导电聚合物、碳基材料中的一种或者两种以上。在实际使用过程中，电极***130可以作为一种辅助的调控方式，电极阵列可以对神经细胞进行功能性电脉冲刺激，通过改变在微环境中的电场强度来对神经细胞的生长进行诱导，并能对神经环路和神经可塑性进行研究。为降低电极点136的接触阻抗，增强电生理信号的信噪比，可以通过电化学方法在电极点136的表面沉积修饰材料，如氧化铱、导电聚合物或碳基材料等。如对氧化铱材质的电极点136进行碳基材料的修饰后，可以在1KHz的测量频率下将电极点136的阻抗降低50％～90％，得到的电生理信号的背景噪音小，信噪比高。进一步，可以使用酶固定技术对电极点136进行酶化合物的固定修饰，以构成生物传感器对轴突周围的微环境进行检测，检测的信号包括神经递质的浓度、氨基酸浓度、离子浓度、氧浓度、温度、pH值等，从而得到轴突在调控过程中的神经递质、谷氨酸和重要离子浓度的变化，以及环境中氧气、温度和pH等重要指标的变化情况。例如可以对电极点136进行酪氨酸酶修饰后，可以得到神经传递质多巴胺传感器，采用该多巴胺传感器可以实现在一定空间范围内实施检测轴突位置释放的多巴胺浓度，从而可以研究神经环路的功能。
更进一步，可以通过在各电极阵列中设置微流控开关，可以针对性的打开或关闭相应的电极点136，选择性的对神经导管126进行局部的电脉冲刺激。
请结合图1、图4和图5，药物灌注***140包括药物灌注池142、药物导管144及废液池146。药物灌注池142通过药物导管144与废液池146相连。药物导管144与神经导管126相连通，可以对神经导管126内的微环境中轴突进行药物刺激。所用的药物可以为神经营养因子、神经递质、氨基酸或基因(如光敏感型蛋白基因等)等。本实施方式的药物灌注***140包括9个药物导管144。9个药物导管144与神经导管126正交连通。采用多个药物导管144可以对轴突进行多点药物刺激或者进行高通量的药物筛选，药物释放均匀，实验结果可靠。进一步，各药物导管144中可设置微流控开关，通过微流控开关打开或关闭相应的药物导管，可以针对性的对神经导管126内的轴突进行药物刺激。
如图6所示，光调控***150设于细胞培养***120的上方。光调控***150包括激光光源(图未示)、光纤接口152、光纤154及用于控制激光光柱的导向和直径的波导156。波导156通过光纤154、光纤接口152与激光光源相连。波导156将激光光源发出的激光导入到神经导管126中，对轴突等进行光刺激调控。在实施过程中，激光光源主要发出蓝色(波长＝472nm)或黄色(波长＝593nm)激光，蓝色或黄色激光通过光纤154和波导156导入到神经导管126中进行照射。由于蓝色或黄色激光只对导入了光敏感基因的细胞起作用，因此该光调控***150具有细胞特异性，并且能有效兴奋或抑制神经元。在使用光调控***150之前，需要将光敏感基因通过特异的启动子转入到与相关回路的神经元内并表达。其中，兴奋型通道蛋白基因为Channelrhodopsin-2(ChR2)，抑制型通道蛋白基因为Helorhodopsin(NpHR)。光调控***150通过光纤154和波导156向神经导管内转有光敏感基因的神经元提供光刺激，由此引起神经元的兴奋或抑制。用蓝光刺激表达有兴奋型通道蛋白基因的神经元，将兴奋该类神经元；而用黄光刺激表达有抑制型通道蛋白基因的神经元，将抑制该类神经元。通过兴奋或抑制就能调控神经回路，从而进行相关的研究。由于光调控***150具有细胞特异性，这种光敏感基因神经调控技术具有较高的时空分辨率。
光调控***150可以包括多个波导156，波导的直接可以为1～10μm。多个波导156通过微加工技术形成波导阵列。通过波导阵列可以将入射的激光分成具有固定大小的激光阵列，同时可以在波导阵列中加入微流控开关，可以选择性的进行局部的光刺激，目的性强，时空分辨率高。波导156引导激光的光刺激位点与电极点136的位置对应，从而电极点136可以较为准确针对性的采集光刺激位点的电生理信号。本实施方式的光调控***150在每条神经导管126的轴向分布有16个波导156。波导156的直径为2μm。16个波导156与16个电极点136相对应。
在其他实施方式中，光调控***还可以通过设置不同直径的光纤替代波导。如图7所示，本实施方式中的光调控***250包括激光光源(图未示)、光纤接口252、分接口254和光纤256。光纤256通过分接口254、光纤接口252与激光光源相连。光纤256的直径可以为1～10μm。优选的，光纤的直径为2μm。光纤256直接将激光光源发出的激光导入到神经导管126中。多个光纤256可以形成光纤阵列，光纤阵列中可以加入微流控开关，选择性的对神经导管126进行局部的光刺激。
该细胞培养装置100通过微流控技术的特定结构来实现神经细胞的培养，如神经细胞可以生长在细胞培养室122中，而轴突却只能生长在神经导管126中，细胞培养室122中的神经细胞通过神经导管126中的轴突构成神经环路，细胞生长区域的重现性和控制力相对较强；再通过激光对神经细胞进行高时空分辨率的调控，选择性和特异性强，可以实现对神经细胞的兴奋和抑制；通过电极***130刺激对神经环路进行辅助调控，并对神经环路的行为和功能进行实时检测，时空分辨率高，调控及检测结果可靠。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.一种细胞培养装置，其特征在于，包括：固定底板及设在所述固定底板上的细胞培养***、光调控***和电极***；所述细胞培养***包括细胞培养室及连通所述细胞培养室的供神经轴突生长的神经导管；所述光调控***置于所述神经导管上方用于对神经导管内的培养物进行光刺激调控；所述电极***与所述神经导管相通用于对神经导管内培养物进行辅助调控，并对神经环路的行为和功能进行实时检测；所述电极***包括外接触点、导线及电极点，所述外接触点通过所述导线与所述电极点相连，所述神经导管与所述电极点相通；所述电极点通过电化学方法沉积有导电材料用于降低电极点的阻抗，且所述电极点通过酶固定技术修饰有酶化合物用于采集生化信号；所述光调控***的光刺激位置与所述电极点的位置对应；所述光调控***包括激光光源、光纤接口、光纤及用于控制激光光柱导向和直径的波导，所述波导通过光纤、光纤接口与所述激光光源相连。
2.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，还包括固定在所述固定底板上的药物灌注***，所述药物灌注***包括药物灌注池、药物导管及废液池，所述药物灌注池通过所述药物导管与所述废液池相连，所述药物导管与所述神经导管相连通。
3.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，所述电极***通过溅射或光刻的方式形成在所述固定底板上。
4.如权利要求2所述的细胞培养装置，其特征在于，所述电极***包括多个一一对应的外接触点、导线及电极点，多个外接触点围绕所述固定底板四周均匀分布，多个导线及电极点形成电极阵列，相应的，所述光调控***包括多个不同直径的波导，多个所述波导形成波导阵列，所述波导阵列中波导的位置与所述电极阵列中电极点位置一一对应；所述电极阵列、波导阵列及所述药物导管中设有微流控开关。
5.如权利要求4所述的细胞培养装置，其特征在于，所述神经导管的宽度为1~10μm，长度为100~1000μm；所述波导的直径为1~10μm。
6.如权利要求5所述的细胞培养装置，其特征在于，所述细胞培养***包 括两组细胞培养室，每组包括两个连通的细胞培养室，两组细胞培养室之间通过4个神经导管连通，所述神经导管的直径为5μm，长度为900μm；
所述电极***沿每个神经导管的轴向依次设有16个方形电极点，所述电极点的长宽均为5μm，每个神经导管轴向的电极点之间相距50μm；
所述光调控***包括16个波导，所述波导的直径为2μm；
所述药物灌注***包括多个与神经导管正交连通的药物导管。
7.权利要求2所述的细胞培养装置，其特征在于，所述光调控***包括激光光源、光纤接口、分接口和光纤，所述光纤通过分接口、光纤接口与所述激光光源相连。
8.如权利要求7所述的细胞培养装置，其特征在于，所述电极***包括多个一一对应的外接触点、导线及电极点，多个外接触点围绕所述固定底板四周均匀分布，多个导线及电极点形成电极阵列，相应的，所述光调控***包括多个不同直径的光纤，多个所述光纤形成光纤阵列，所述光纤阵列中光纤的位置与所述电极阵列中电极点位置一一对应；所述电极阵列、波导阵列及所述药物导管中设有微流控开关。
9.如权利要求8所述的细胞培养装置，其特征在于，所述神经导管的宽度为1~10μm，长度为100~1000μm；所述光纤的直径为1~10μm。
10.如权利要求9所述的细胞培养装置，其特征在于，所述细胞培养***包括两组细胞培养室，每组包括两个连通的细胞培养室，两组细胞培养室之间通过4个神经导管连通，所述神经导管的直径为5μm，长度为900μm；
所述电极***沿每个神经导管的轴向依次设有16个方形电极点，所述电极点的长宽均为5μm，每个神经导管轴向的电极点之间相距50μm；
所述光调控***包括16个光纤，所述光纤的直径为2μm；
所述药物灌注***包括多个与神经导管正交连通的药物导管。
11.如权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，所述固定底板的材质为玻璃、硅或二氧化硅；所述细胞培养室及所述神经导管的材质为透明的聚二甲氧基硅氧烷。
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| CN102337211A (zh) | 2012-02-01 |
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Legal Events
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