CN102329754B - 一种弗氏链霉菌新菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)新菌株CLIMAX-VSF，其保藏号为CGMCC No.5133，保藏日期为2011年8月12日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明还公开了含有其的菌剂。本发明提供的弗氏链霉菌新菌株CLIMAX-VSF，具有十分显著的抗病、固氮解磷和分泌生长素性能。该菌能够在土壤没有外加养分的情况下显著提高发芽率、苗期生长速度，并且显著抑制苗期及生长期病害。在用于肥料的混配增效方面，显示出该菌具备良好的活化土壤养分作用以及抗多种耕作障碍性能。

Description

一种弗氏链霉菌新菌株及其应用

技术领域

本发明属用于土壤肥料领域，具体涉及一种农用微生物制剂及其应用。

背景技术

白色农业是指微生物资源产业化的工业型新农业，通常指微生物发酵工程在农业上的应用。农业生产需要土壤提供作物生长的营养物质和生存环境。多年来，化学肥料的施用对农业增收起到了关键作用。然而，由于长期施用化学肥料，土壤有益微生物菌群受到破坏、有机肥供应不足，各类养分比例失调，致使农田生态环境、土壤理化性状和土壤微生物区系受到了不同程度的破坏，在一定程度上影响了农产品的品质，我国目前土壤资源现状迫切需要通过人为措施解决土壤被逐渐破坏的问题，确保农业种植水平和农作物产品品质。一些有益微生物可固定空气中的氮素、活化土壤中难以利用的磷、钾及其他营养元素，提高土壤养分供应能力和保水、保肥能力，提高土地资源的持续生产能力，还能增强农作物抗病性，减少农药用量。

在我国生态环境保护的十大对策中明确提倡要推广“生态农业”，保护生态环境和农田土壤，推动无公害健康食品的生产，促进生态***中生物循环，达到保持和增强土壤肥力及生物活性目的。以有益微生物为核心的微生物制剂或肥料产品能起到改良土壤、提高地力、促进生长等作用，是优质无公害农产品生产的优选生产资料。随着我国现代农业的快速发展，特别是绿色有机农业种植面积不断扩大，将特定微生物菌融入到农业生产中来，已成为当今政府及企业所关注的热点问题。

发明内容

本发明首先提供一种弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)新菌株CLIMAX-VSF。

本发明还提供含有弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的菌剂。

本发明还提供含有弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的种子处理剂。

本发明还提供含有弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的菌肥。

本发明还提供含有弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的喷灌剂。

本发明提供的弗氏链霉菌CLIMAX-VSF是从高产田土壤中分离而得，该菌株十分显著的抗病、固氮解磷解钾和分泌生长素性能。已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏登记编号为CGMCC No.5133，保藏日期为2011年8月12日。

研究人员在土壤相对贫瘠但产量较高的棉花土壤中取得根际土壤，在土壤悬液中加入苯酚数滴并通过选择培养基培养，取复合特征的菌种并在显微镜下检查，证明为单一CLIMAX-VSF菌体后通过反复分离和大量菌株重复性培养筛选，获得CLIMAX-VSF菌株。CLIMAX-VSF菌株通过培养特征、显微形态特征、生理生化特征和遗传特征，确定该菌株符合弗氏链霉菌的特征。

本发明的弗氏链霉菌CLIMAX-VSF可制备成菌剂，其中，弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的活菌数可为50亿/克以上，优选为100亿/克。

本发明的含有弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的菌剂，可按如下方式进行制备：

1)制备弗氏链霉菌CLIMAX-VSF种子液；

2)弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的固体增殖培养：步骤1)的种子液接入到固体增殖培养基中30±2℃的无菌有氧条件下培养7～10天；所述的固体增殖培养基优选为含有麦麸50～70份、红糖3～6份、棉籽饼或豆饼20～40份、硫酸镁1～3份、氯化钠1～3份、碳酸钙1～4份，pH7.0～7.5；

3)将步骤3)增殖培养后的培养基进行常温干燥，即得弗氏链霉菌CLIMAX-VSF原菌菌剂。

本发明还提供含弗氏链霉菌CLIMAX-VSF菌剂的制备方法，其包括：

1)制备弗氏链霉菌CLIMAX-VSF种子液；

2)弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的固体增殖培养：步骤1)的种子液接入到固体增殖培养基中30±2℃的无菌有氧条件下培养7～10天；所述的固体增殖培养基含有麦麸50～70份、红糖3～6份、棉籽饼或豆饼20～40份、硫酸镁1～3份、氯化钠1～3份、碳酸钙1～4份，pH7.0～7.5；

3)将步骤3)增殖培养后的培养基进行常温干燥，即得弗氏链霉菌CLIMAX-VSF原菌菌剂。

本发明提供的种子处理剂，优选含有如下重量份的组分：

弗氏链霉菌CLIMAX-VSF菌剂30-90份；

载体5-30份；

麦饭石5-20份；

农用稀土0-40份；

硫酸锌0-10份。

其中，所述的载体优选为沸石粉、膨润土、凹凸棒中的一种或几种任意比例的混合物。

本发明提供的菌肥，优选含有如下重量份的组分：

弗氏链霉菌CLIMAX-VSF菌剂0.2-30份

有机肥30-100份

腐植酸粉10-50份

氮磷钾元素0-50份。

氮磷钾元素是指用于可用于农业的常用氮磷钾肥原料，氮元素可选自尿素、硫酸铵、氯化铵或其组合；磷可选自磷酸一铵、磷酸二铵、过磷酸钙、磷酸二氢钾、磷矿粉或其组合；钾可选自硫酸钾、氯化钾、碳酸钾、硝酸钾或其组合。

本发明提供的喷灌剂，优选含有如下重量份地组分：

弗氏链霉菌CLIMAX-VSF过滤液50～400份

氨基酸液300～600份

磷酸二氢钾10～200份

硼酸10～50份

一水硫酸锰10～60份

七水硫酸锌10～50份

尿素20～150份

农用稀土0～50份，其中，弗氏链霉菌CLIMAX-VSF过滤液是将弗氏链霉菌CLIMAX-VSF菌剂与水按照1∶50～200的比例混合后搅拌1～8小时，过滤所得的滤液。

其中，氨基酸液可以用可溶性氨基酸粉加去离子水制成，也可以直接购买氨基酸液。目前以上两种原料均可买到，如保定味香源食品有限公司。

本发明提供的弗氏链霉菌新菌株CLIMAX-VSF，具有十分显著的抗病、固氮解磷和分泌生长素性能。该菌能够在土壤没有外加养分的情况下显著提高发芽率、苗期生长速度，并且显著抑制苗期及生长期病害。在用于肥料的混配增效方面，显示出该菌具备良好的活化土壤养分作用以及抗多种耕作障碍性能。除此之外，该菌可以通过一定的工艺制作成液体产品进行喷灌使用，更进一步将弗氏链霉菌的使用立体化，使得根际和根外都可以应用该种生态环保型的微生态制剂。

本发明通过采用液体+固体联合发酵方法进行制造增殖，与传统的液体发酵吸附成固体制剂的方式相比，该方法进行菌种增殖的产孢量更高、代谢产物量大，其产品的生物活性更好，保存期更长。

CLIAMX-VSF弗氏链霉菌为天然菌体培养，其应用具有广阔前景，为本发明开发了其用于制作种子处理剂、肥料增效剂、喷灌剂三种应用提供了可行的方案，并且获得良好的实际应用效果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若无特别说明，本发明中所述的“份”是指“重量份”。

实施例1弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的鉴定

本发明的弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的形态特征，见下表。

生理生化特征如下：

试验项目	结果	试验项目	结果	试验项目	结果
						葡萄糖	+	甘油	+	苹果酸钠	+
甘露醇	+	乳糖	+	葡萄糖酸钠	+
						水杨苷	-	半乳糖	+	柠檬酸钠	-
棉子糖	-	松三糖	+	琥珀酸钠	-
						淀粉	+	L-***糖	+	丙二酸钠	-
山梨醇	-	木糖	+	马尿酸钠	-
						山梨糖	-	纤维二糖	+	丙酸钠	-
蔗糖	-	赤藓醇	+	乙酸钠	+
						蜜二糖	+	苦杏仁苷	+	酒石酸钠	-
甘露糖	+	海藻糖	+	酪氨基酸酶	+
						麦芽糖	-	核糖	+	淀粉酶	+
菊糖	-	糖元	-	明胶液化	-

鼠李糖	-	肌醇	-	硝酸盐还原	+
						果糖	+	卫矛醇	+

测定了弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的16sRNA的序列，序列如SEQID No.1所示。经比对，与其它公布的弗氏链霉菌的16sRNA的序列同源性较高。

通过上述形态特征、生理生态特征和16sRNA序列分析，可以确定分离到的确为弗氏链霉菌的新菌株。

实施例2弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的生物学特性

1.分泌生长素性能

1)先将保存有弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的冻干管进行活化。具体方法是先接入到高氏一号培养基的斜面中在30±2℃进行培养15天；在获得健康菌落后，将其接入PDA培养基中30℃培养5天，然后挑选发育健康菌种接入到经过灭菌的由蔗糖20份、氯化钠5份、蛋白胨20份、硫酸镁5份、磷酸二氢钾3份、水1000份组成的液体培养基中，然后再150r/min、30±2℃培养3天，获得弗氏链霉菌种子液。

2)固体增殖培养：将弗氏链霉菌种子液接入到由麦麸60份、红糖5份、棉籽饼30份、硫酸镁1.5份、氯化钠1.5份、碳酸钙2份组成的经过120℃以上高温灭菌的固体培养料(pH7.5)中，在30±2℃的无菌有氧条件下培养，在固体增殖到活菌数为10亿/克时进行生长素水平测试)，发现其所分泌的植物生长素水平较高，结果见下表。

表1弗氏链霉菌分泌的生长素种类及水平

	10亿/克
		赤霉素GA3	103.37mg/kg
吲哚乙酸IAA	4.82mg/kg
		细胞***素CTK	2.61mg/kg

2.抗菌性能

经过抑菌圈试验：通过在培养皿中接入CLIMAX-VSF菌种及病原菌，测试其空白区域直径，直径范围越大说明该菌对病原菌的抑制能力越强：

表2弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的抗菌活性

病原菌	抑菌直径(mm)
		小麦根腐病菌	29
棉花黄萎病菌	20.5
		棉花枯萎病菌	20
棉花炭疽病菌	27
		黄瓜疫霉菌病	28
苹果叶轮斑病菌	19
		杨树炭疽病菌	35.5
花生青枯病菌	27
		甘薯瘟病菌	33.5
西瓜炭疽病菌	39.5

3.解氮解磷活性

经过长期田间试验跟踪经过弗氏链霉菌CLIMAX-VSF种子处理和土壤接种的植株，在贫瘠土壤、不施肥状态进行对比，发现其有明显的将土壤中难溶性磷溶解的作用和空气固氮的作用，其与对照空白相比分别要增产16.7％和37.2％，显示出氮元素和磷元素的供给均明显强于对照空白。

实施例3弗氏链霉菌CLIMAX-VSF原菌菌剂的制备

本发明采用液体-固体联合发酵培养工艺进行弗氏链霉菌菌剂的培养，通过先液体增殖培养再接入到固体培养物增殖培养，所形成的菌剂具有很强的生物酶活性，具体步骤包括：

1)种子制备及液体增殖培养：先将保存有弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的冻干管进行活化。具体方法是先接入到高氏一号培养基的斜面中在30±2℃进行培养15天；在获得健康菌落后，将其接入PDA培养基中30℃培养5天，然后挑选发育健康菌种接入到经过灭菌的由蔗糖20份、氯化钠5份、蛋白胨20份、硫酸镁5份、磷酸二氢钾3份、水1000份组成的液体培养基中，然后再150r/min、30±2℃培养3天，获得弗氏链霉菌种子液。

2)固体增殖培养：将弗氏链霉菌种子液接入到由麦麸60份、红糖5份、棉籽饼30份、硫酸镁1.5份、氯化钠1.5份、碳酸钙2份组成的经过120℃以上高温灭菌的固体培养料(pH7.5)中，在30±2℃的无菌有氧条件下培养7天。

3)干燥处理：固体增殖培养完毕后将其放于干燥室进行常温干燥。干燥后的弗氏链霉菌经过平板计数法检测有效活菌数为80亿/g，将其作为弗氏链霉菌原菌制剂包装入库保存。

实施例4含有弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的种子处理剂

实施例3制备的弗氏链霉菌原菌制剂30份、载体(沸石粉)5份、麦饭石20份、硫酸锌10份，以上原料充分混合均匀即得。

实施例5含有弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的种子处理剂

实施例3制备的弗氏链霉菌原菌制剂90份、载体(膨润土∶凹凸棒1∶1)30份、麦饭石5份、农用稀土40份，以上原料充分混合均匀即得。

实施例6含有弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的种子处理剂

实施例3制备的弗氏链霉菌原菌制剂60份、载体(膨润土)10份、麦饭石10份、农用稀土20份，硫酸锌5份，以上原料充分混合均匀即得。

实施例7含有弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的菌肥

实施例3制备的弗氏链霉菌原菌制剂2份、有机肥100份、腐植酸粉10份、尿素按氮计10份、磷酸二铵按磷计20份、氯化钾按钾计20份，将上述原料充分混合均匀后即得含弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的菌肥。

实施例8含弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的菌肥

实施例3制备的弗氏链霉菌原菌制剂30份、有机肥30份、腐植酸粉50份，将上述原料充分混合均匀后即得含弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的菌肥。

实施例9含弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的菌肥

实施例3制备的弗氏链霉菌原菌制剂15份、有机肥50份、腐植酸粉30份、氯化铵按氮计10份、过磷酸钙按磷计10份、硫酸钾按钾计10份，将上述原料充分混合均匀后即得含弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的菌肥。

实施例10含弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的喷灌剂

1)将实施例3的弗氏链霉菌CLIMAX-VSF原菌制剂按照1∶50加水进行间歇式搅拌，搅拌5小时，搅拌速度为60rpm，然后将其过滤后获得富含菌体和多种酶及生长素等成分的弗氏链霉菌过滤液，再配制如下配方：

2)先将氨基酸液(购自保定味香源食品有限公司)300份、磷酸二氢钾200份、硼酸10份、一水硫酸锰60份、七水硫酸锌10份、尿素20份、表面活性剂0.001份。以上成分在60℃在反应罐中进行搅拌混合30分钟，待温度降至25℃以下加入弗氏链霉菌过滤液50份，再常温搅拌20分钟制成喷灌剂。

实施例11含弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的喷灌剂

1)将实施例3的弗氏链霉菌CLIMAX-VSF原菌制剂按照1∶200加水进行间歇式搅拌，搅拌8小时，搅拌速度为70rpm，然后将其过滤后获得富含菌体和多种酶及生长素等成分的弗氏链霉菌过滤液，再配制如下配方：

2)先将氨基酸液(购自保定味香源食品有限公司)600份、磷酸二氢钾10份、硼酸50份、一水硫酸锰10份、七水硫酸锌50份、尿素150份、农用稀土50份，表面活性剂0.002份。以上成分在60℃在反应罐中进行搅拌混合60分钟，待温度降至25℃以下加入弗氏链霉菌过滤液400份，再常温搅拌5分钟制成喷灌剂。

实施例12含弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的喷灌剂

1)将实施例3的弗氏链霉菌CLIMAX-VSF原菌制剂按照1∶100加水进行间歇式搅拌，搅拌6小时，搅拌速度为60rpm，然后将其过滤后获得富含菌体和多种酶及生长素等成分的弗氏链霉菌过滤液，再配制如下配方：

2)先将氨基酸液(购自保定味香源食品有限公司400份、磷酸二氢钾100份、硼酸30份、一水硫酸锰30份、七水硫酸锌25份、尿素80份、农用稀土20份，表面活性剂0.2份。以上成分在80℃在反应罐中进行搅拌混合40分钟，待温度降至25℃以下加入弗氏链霉菌过滤液200份，再常温搅拌10分钟制成喷灌剂。

试验例1种子处理剂

在水稻播种前，用实施例4～6的种子处理剂对水稻种子进行浸种处理。每亩用量的稻种使用20克加5公斤水搅匀后进行浸种，在播种后2周左右进行调查发现，与清水浸种相比，秧苗健壮，株高、根长增加，大田生长旺盛，结实率和千粒重提高。产量平均增加10.5％，与此同时，经过田间观察还具有防治恶苗病效果。

试验例2菌肥

在底肥期，每亩葡萄均匀沟施80公斤实施例7的菌肥。与实施例7配方相同，但不含弗氏链霉菌原菌制剂的对照相比，施用后能提前采摘5天，同时采摘时增产幅度达18.1％，且显著提高商品性能，果色鲜艳光泽，甜度增加2度以上。实施例7和8的菌肥也具有类似的效果。

试验例3喷灌剂

在西红柿定植缓苗后和快速生长期各喷施并结合根灌实施例10的喷灌剂，其中，每次200毫升按照1∶75配水进行喷施，结合每亩用5公斤按照比水1∶200进行灌根。经过跟踪调查发现，与清水对照相比，使用后，叶毒病和病毒病病情指数下降40-70％，平均增产15-20％，最高可达33％，且西红柿的个头均匀，果色健康，单个果重显著增加，具有良好的经济效益。实施例10和11的喷灌剂也具有类似的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）新菌株CLIMAX-VSF，其保藏号为CGMCC No.5133。

2.含有权利要求1所述菌株的菌剂。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其中弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的活菌数为50亿/克以上。

4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，按如下方式进行制备：

1）制备弗氏链霉菌CLIMAX-VSF种子液；

2）弗氏链霉菌CLIMAX-VSF的固体增殖培养：步骤1）的种子液接入到固体增殖培养基中30±2℃的无菌有氧条件下培养7～10天至活菌数为50亿/克以上；所述的固体增殖培养基含有麦麸50～70份、红糖3～6份、棉籽饼20～40份、硫酸镁1～3份、氯化钠1～3份、碳酸钙1～4份，pH7.0～7.5；或所述的固体增殖培养基含有麦麸50～70份、红糖3～6份、豆饼20～40份、硫酸镁1～3份、氯化钠1～3份、碳酸钙1～4份，pH7.0～7.5；

3）将步骤3）增殖培养后的培养基进行干燥，即得弗氏链霉菌CLIMAX-VSF原菌菌剂。

5.含有权利要求1所述菌株的种子处理剂，其特征在于，含有如下重量份的组分：

权利要求4所述的菌剂30-90份；

载体5-30份；

麦饭石5-20份；

农用稀土0-40份；

硫酸锌0-10份；

所述载体为沸石粉、膨润土、凹凸棒中的一种或几种任意比例的组合物。

6.含有权利要求1所述菌株的菌肥，其特征在于，含有如下重量份的组分：

权利要求4所述的菌剂0.2-30份；

有机肥30-100份；

腐植酸粉10-50份；

氮磷钾元素0-50份。

7.含有权利要求1所述菌株的喷灌剂，其特征在于，含有如下重量份的组分：

弗氏链霉菌CLIMAX-VSF过滤液50～400份；

氨基酸液300～600份；

磷酸二氢钾10～200份；

硼酸10～50份；

一水硫酸锰10～60份；

七水硫酸锌10～50份；

尿素20～150份；

农用稀土0～50份

表面活性剂0.001～0.2份，

其中，弗氏链霉菌CLIMAX-VSF过滤液是将权利要求4所述的菌剂与水按照1:50～200的比例混合搅拌均匀后过滤所得的滤液。