CN102329373A - 地加瑞克的固相合成工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及地加瑞克的一种固相合成方法,包括以下步骤:1)树脂与Fmoc-D-Ala-OH得到Fmoc-D-Ala-树脂;树脂是氨基树脂;2)采用Fmoc固相合成策略依次将按地加瑞克的氨基酸排列顺序进行连接;3)去除N端Fmoc,用乙酸酐和吡啶进行乙酰化;4)去除C端第6个氨基酸残基-4Aph(X)上的保护基X;5)将L-4,5-dihydrooroticacid连接到C端第6个氨基酸残基-4Aph的侧链氨基上;6)用裂解试剂切割肽树脂,无水***沉淀,离心后得粗肽;7)经纯化分离得地加瑞克。本发明操作简单,对人体和环境危害小,且该工艺有效的降低了杂质的含量,能够进行规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种地加瑞克的制备方法,尤其涉及地加瑞克的固相合成方法。
背景技术
地加瑞克(英文名:DegareIix)是丹麦辉凌制药有限公司研发的***癌治疗药,2008年12月24日获美国食品和药物管理局(FDA)批准上市。它属于“***释放激素(GnRH)”受体抑制剂类药物,主要针对晚期***癌患者,通过抑制***来延缓***癌的病程发展。
作为一个人工合成的十肽,Degarelix存在以下化学结构:
该化学结构中C端第五个氨基酸Aph(L-Hor)上的六元环L-Hor在碱性条件下容易发生异构化反应,生成乙内酰脲-5-乙酸(详见:Koedjikov,A.H.et.al.,J.Chem.Soc.Perkin,Trans.2,1984,1077-1081;Kaneti,J.et.al.,Org.Biomol.Chem.,2004,1098-1103),反应机理如下式所示:
该机制导致Aph(L-Hor)发生如下转变(详见WO2010121835):
上述反应会导致产品中存在一个和目标产物性质相近的杂质Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Aph(Z)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2,其中Z代表乙内酰脲-5-乙酰基,增大了纯化难度并降低了产品收率。
WO2011066386和US5925730采用Boc固相合成策略,临时保护基的脱除都是在酸性条件下(TFA)进行。虽然有效的避免了Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Aph(Z)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2的产生,但Boc策略最终要用到HF进行裂解,对人和环境有较大的危害。
WO2010121835采用Fmoc固相合成策略,以Rink amide AM或Rink amide MBHA为固相载体,5位和6位分别以Fmoc-Aph(L-hor)-OH和Fmoc-Aph(tBuCbm)-OH进行偶联。该方法操作复杂,且L-Hor在之后的反复脱保护过程中容易发生异构化,同时Aph(tBuCbm)侧链上保护基的脱除是在水溶液中进行,进一步加大了发生异构化的可能性,最终导致产生0.1~0.3%的Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Aph(Z)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2杂质。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术存在的上述问题,提供一种反应条件温和、操作简单、生产安全、环境污染小、高收率、高质量、适合规模化生产的地加瑞克固相合成方法。
本发明的技术解决方案是:一种地加瑞克的固相合成方法,包括以下步骤:
1)树脂与Fmoc-D-Ala-OH得到Fmoc-D-Ala-树脂;
2)采用Fmoc固相合成策略依次将Fmoc-Pro-OH、Fmoc-ILys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-4Aph(X)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH按地加瑞克的氨基酸排列顺序进行连接;
3)去除N端Fmoc,用乙酸酐和吡啶进行乙酰化;
4)去除C端第6个氨基酸残基-4Aph(X)上的保护基X;
5) 将L-4,5-dihydroorotic acid连接到C端第6个氨基酸残基-4Aph的侧链氨基上;
6)用裂解试剂切割肽树脂,无水***沉淀,离心后得到粗肽;
7)经纯化分离得地加瑞克。
上述地加瑞克固相合成方法中,步骤1)所用树脂优选Sieber树脂或Rink amide BHA以及9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-acetamidomethyl树脂,树脂替代度为0.3~0.8mmol/g。
上述地加瑞克固相合成方法中, C端第5个氨基酸Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH由Fmoc-D-4Aph-OH和三甲基硅基异氰酸酯合成获得,反应溶剂为DMF,反应温度为0~15℃。
上述地加瑞克固相合成方法中,Fmoc-4Aph(X)-OH由Fmoc-D-4Aph-OH和X-Cl合成获得,反应溶剂为DCM,反应温度为0~15℃。Fmoc-4Aph(X)-OH中保护基团X为Trt或Alloc。
上述地加瑞克固相合成方法中,乙酸酐和吡啶的摩尔用量分别为N端自由氨基的10~40倍。
上述地加瑞克固相合成方法中,脱除Trt的试剂为TFA和DCM;脱除Alloc的试剂为Pd(Ph3P)4和苯硅烷和DCM。上述地加瑞克固相合成方法中, TFA和DCM中TFA的体积比为5~10%,常温搅拌反应1.5~2h。
上述地加瑞克固相合成方法中,Pd(Ph3P)4和苯硅烷和DCM中Pd(Ph3P)4的摩尔用量为侧链保护基的0.25~1倍;苯硅烷的摩尔用量为侧链保护基的10~20倍,常温搅拌反应0.5~1h。
上述地加瑞克固相合成方法中,裂解试剂为三氟乙酸和苯甲硫醚和苯甲醚和1,2-乙二硫醇,其体积比为90:5:3:2,裂解条件为室温搅拌2~3h,沉淀粗肽时无水***体积为8~12倍。
上述地加瑞克固相合成方法中,使用偶联剂,偶联剂为DIC+Y,其中Y为HOBt或HOAt,反应溶剂为DMF或DMF和DCM混合溶剂,室温搅拌反应2~3h。
与已有的地加瑞克合成方法相比,本发明地加瑞克的固相合成工艺具有以下优点:
1)本发明采用了Fmoc策略,与WO2011066386采用的Boc策略相比,避免了剧毒、强腐蚀性的氟化氢的使用,反应条件更温和,使生产人员更安全,并大大减轻了环保压力。
2)本发明创造性的采用Fmoc-Aph(Cbm)-OH和Fmoc-Aph(X)-OH为地加瑞克序列C端第5和6个氨基酸的合成原料,其中X为Trt或Alloc。与WO2010121835相比,本发明在N端乙酰化化以后,才进行L-Hor基团的导入,避免了L-Hor与碱的接触,降低了其发生异构化的可能性。同时,本发明最终的裂解切割在无水条件下进行,进一步减少了L-Hor异构化的可能性。WO2010121835中,Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Aph(Z)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2的含量为0.1~0.3%,采用本发明的合成方法,该杂质的含量能稳定有效的控制在0.1%以下。
3) 本发明通过合适的反应条件选择,保证了每步反应完全,不需要进行WO2010121835中繁琐的封闭操作,使得本发明操作简单,易于规模化生产。
具体实施方式
本发明公开了一种地加瑞克的固相合成工艺,主要用于降低相关杂质含量,提高地加瑞克的纯度和收率,利于规模化生产,其主要步骤包括:
1)树脂与Fmoc-D-Ala-OH得到Fmoc-D-Ala-树脂;
2)采用Fmoc固相合成策略依次将Fmoc-Pro-OH、Fmoc-ILys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-4Aph(X)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH按地加瑞克的氨基酸排列顺序进行连接;
3)去除N端Fmoc,用乙酸酐和吡啶进行乙酰化;
4)去除C端第6个氨基酸残基-4Aph(X)上的保护基X;
5) 将L-4,5-dihydroorotic acid连接到C端第6个氨基酸残基-4Aph的侧链氨基上;
6)用裂解试剂切割肽树脂,无水***沉淀,离心后得到粗肽;
7)经纯化分离得地加瑞克。
以下是对本发明技术方案的进行进一步详细描述。
实施例1:Fmoc-D-Ala-Sieber树脂的合成
将Sieber树脂(10mmol,替代度0.3mmol/g)装入固相反应柱,DMF洗两遍,加入500ml DMF溶胀30min。加入500ml 20% DBLK脱保护10min,再次加入500ml 20% DBLK脱保护15min,DMF洗涤6次。用60mlDMF溶解 9.34g Fmoc-D-Ala-OH和4.26gHOBt,冰浴10分钟,加入4.9ml DIC,预活化2~5min,将活化好的溶液加入固相反应柱,搅拌反应2h,茚三酮检测呈阴性。抽干,DMF洗6次,DCM洗3次,MeOH收缩三次(时间分别为5min,5min和10min)、干燥后得到Fmoc-D-Ala-Sieber树脂,经检测替代度为0.298mmol/g。
实施例2:Fmoc-D-Ala-Sieber树脂的合成
将Sieber树脂(10mmol,替代度0.5mmol/g)装入固相反应柱,DMF洗两遍,加入500ml DMF溶胀30min。加入500ml 20% DBLK脱保护10min,再次加入500ml 20% DBLK脱保护15min,DMF洗涤6次。用60mlDMF溶解 9.34g Fmoc-D-Ala-OH和4.26gHOBt,冰浴10分钟,加入4.9ml DIC,预活化2~5min,将活化好的溶液加入固相反应柱,搅拌反应2h,茚三酮检测呈阴性。抽干,DMF洗6次,DCM洗3次,MeOH收缩三次(时间分别为5min,5min和10min),干燥后得到Fmoc-D-Ala-Sieber树脂,经检测替代度为0.495mmol/g.
实施例3:Fmoc-D-Ala-Sieber树脂的合成
将Sieber树脂(10mmol,替代度0.8mmol/g)装入固相反应柱,DMF洗两遍,加入500ml DMF溶胀30min。加入500ml 20% DBLK脱保护10min,再次加入500ml 20% DBLK脱保护15min,DMF洗涤6次。用60mlDMF溶解 9.34g Fmoc-D-Ala-OH和4.26gHOBt,冰浴10分钟,加入4.9ml DIC,预活化2~5min,将活化好的溶液加入固相反应柱,搅拌反应2h,茚三酮检测呈阴性。抽干,DMF洗6次,DCM洗3次,MeOH收缩三次(时间分别为5min,5min和10min),干燥后得到Fmoc-D-Ala-Sieber树脂,经检测替代度为0.799mmol/g。
实施例4:Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-Pal-Ser-Aph(Alloc)-Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Sieber树脂的合成
将Fmoc-D-Ala-Sieber树脂(10mmol)装入固相反应柱,DMF洗2次,再次加入100mlDMF溶胀30min,20% DBLK脱保护两次(时间分别为5min和7min),DMF洗涤6次。
用60mlDMF溶解 10.122g Fmoc-D-Pro-OH和4.26gHOBt,冰浴10分钟,加入4.9ml DIC,预活化2~5min,将活化好的溶液加入固相反应柱,搅拌反应2h,茚三酮检测呈阴性。抽干,DMF洗3次,20% DBLK脱保护两次(时间分别为5min和7min),DMF洗涤6次。
重复以上步骤,依次完成Fmoc-ILys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-4Aph(Alloc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH的连接。
将40g乙酸酐和32g吡啶混合均匀后加入到固相反应柱,搅拌反应2h,茚三酮检测呈阴性。抽干,DCM洗涤3次,DMF洗涤6次。
实施例5:Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-Pal-Ser-Aph(Trt)-Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Sieber树脂的合成
将Fmoc-D-Ala-Sieber树脂(10mmol)装入固相反应柱,DMF洗2次,再次加入100mlDMF溶胀30min,20% DBLK脱保护两次(时间分别为5min和7min),DMF洗涤6次。
用60mlDMF溶解 10.122g Fmoc-D-Pro-OH和4.26gHOBt,冰浴10分钟,加入4.9ml DIC,预活化2~5min,将活化好的溶液加入固相反应柱,搅拌反应2h,茚三酮检测呈阴性。抽干,DMF洗3次,20% DBLK脱保护两次(时间分别为5min和7min),DMF洗涤6次。
重复以上步骤,依次完成氨基酸Fmoc-ILys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-4Aph(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH的连接。
将40g乙酸酐和32g吡啶混合均匀后加入到固相反应柱,搅拌反应2h,茚三酮检测呈阴性。抽干,DCM洗涤3次,DMF洗涤6次。
实施例6:Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-Pal-Ser-Aph-Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Sieber树脂的合成
在装有Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-Pal-Ser-Aph(Alloc)-Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Sieber树脂的固相反应柱中加入2.89g四(三苯基膦)钯、12.99g苯硅烷和100ml DCM,搅拌反应0.5h,抽干,DCM洗涤3次,DMF洗涤6次,DCM再洗涤3次。
实施例7:Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-Pal-Ser-Aph-Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Sieber树脂的合成
在装有Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-Pal-Ser-Aph(Trt)-Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Sieber树脂的固相反应柱中加入100ml 10% TFA/DCM溶液,室温搅拌反应2h,抽干,DCM洗涤3次,DMF洗涤6次。
实施例8:Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-Pal-Ser-Aph(L-Hor)-Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Sieber树脂的合成
用60ml DMF溶解4.93g L-hydroorotic acid和4.26g HOBt,冰浴10分钟,加入4.9ml DIC,预活化2~5min,将活化好的溶液加入到装有Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-Pal-Ser-Aph-Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Sieber树脂(10mmol)的固相反应柱,搅拌反应2h,茚三酮检测呈阴性。抽干,DMF洗涤6次,DCM洗涤3次,收缩三次(时间分别为5min,5min和10min),真空干燥后得到36.81g肽树脂。
实施例9:肽树脂的裂解
将360ml冰冻(-5℃)好的裂解液(三氟乙酸:苯甲硫醚:苯甲醚:1,2-乙二硫醇=90:5:3:2)加入到装有肽树脂的圆底烧瓶中,室温搅拌反应2h,过滤,滤液加入到3.6L冰冻无水***中,离心,干燥后得到16.8g粗肽(收率:99.4%,纯度:92%)。
实施例10:粗肽的纯化
(1)溶解
将粗肽称重,碾碎放至烧杯中,以约30g/L量加入40%(v/v)乙腈+60%(v/v)水溶液,超声波超声至完全溶解。使用0.45μm尼龙66微孔滤膜过滤。
(2)纯化
a)第一次纯化:
将色谱柱用50%乙腈冲洗干净后用5%乙腈平衡***5分钟后,以16-23克/次的上样量进行HPLC纯化,于280nm波长处监测,根据色谱峰分段收集馏分,并将收集的馏分用分析液相色谱仪进行检测,纯度≥99.0%且单杂≤0.2%馏分即为第一步合格馏分。其余为不合格馏分,不合格馏分中纯度大于80%部分再进行回收纯化,纯度小于80%作废液处理。
b)第二次纯化:
将色谱柱用50%乙腈冲洗干净后用5%乙腈平衡***5分钟后,以14-20克/次的上样量进行HPLC纯化,于280nm波长处监测,根据色谱峰分段收集馏分,并将收集的馏分用分析液相色谱仪进行检测,纯度≥99.8%且单杂≤0.1%馏分即为第二步合格馏分。其余为不合格馏分,不合格馏分中纯度大于80%部分再进行回收纯化,纯度小于80%作废液处理。
c)脱盐、浓缩及冻干:
将色谱柱用50%乙腈冲洗干净后用流动相A2相和5%乙腈平衡柱子5min上样,上样17-23克。样品若已析出聚集,加入30%醋酸超声溶解后加水稀释,按照上述梯度要求进行转盐,于280nm波长处监测色谱峰,收集出峰馏分,浓缩至20mg/ml左右,冻干后得到6.8g精肽(收率40%,纯度:99.8%)。
实施例11:Fmoc-Aph(Alloc)-OH的合成
向500ml的两口圆底烧瓶中加入Fmoc-4-Amino-L-Phe–OH 16g(40mmol),加入二氯甲烷100ml,搅拌下溶解。冰水浴保持二氯甲烷溶液的温度处于0~15℃之间,向二氯甲烷溶液中加入三乙胺 11.1ml(80mmol),继续搅拌。烯丙氧羰基氯(Alloc-Cl)8.5ml(80mmol)溶于 100ml二氯甲烷中,缓慢滴加至圆底烧瓶中,期间控制圆底烧瓶内的二氯甲烷溶液温度低于15℃。滴加完毕之后保持0~15℃两个小时,之后恢复至室温反应两个小时。
反应液过滤,滤液用碳酸氢钠水溶液(5%)洗涤(100ml*3),柠檬酸水溶液(5%)洗涤(100ml*3),无水硫酸钠干燥有机相。过滤,旋干,残余物柱层析纯化,洗脱剂乙酸乙酯:石油醚=1:3,得到最终产物Fmoc-4-Amino-L-Phe(Alloc)-OH 15.2g,收率78%。
实施例12:FmocAph(Trt)-OH的合成
向500ml的两口圆底烧瓶中加入Fmoc-4-Amino-L-Phe–OH 16g(40mmol),加入二氯甲烷100ml,搅拌下溶解。冰水浴保持二氯甲烷溶液的温度处于0~15℃之间,向二氯甲烷溶液中加入三乙胺 11.1ml(80mmol),继续搅拌。三苯甲基氯(Trt-Cl)22.3g(80mmol)溶于 100ml二氯甲烷中,缓慢滴加至圆底烧瓶中,期间控制圆底烧瓶内的二氯甲烷溶液温度低于15℃。滴加完毕之后保持0~15℃两个小时,之后恢复至室温反应两个小时。
反应液过滤,滤液用碳酸氢钠水溶液(5%)洗涤(100ml*3),柠檬酸水溶液(5%)洗涤(100ml*3),无水硫酸钠干燥有机相。过滤,旋干,残余物柱层析纯化,洗脱剂乙酸乙酯:石油醚=1:3,得到最终产物Fmoc-4-Amino-L-Phe(Trt)-OH 20.8g,收率80.1%。
实施例13:Fmoc-D-Aph(Cbm)-OH的合成
在一个100ml单口烧瓶中,30ml DMF溶解Fmoc-4-Amino-D-Phe–OH(40g,0.1mol),冰水浴下保持反应体系内部温度处于0~15℃之间。三甲基硅基异氰酸酯(trimethylsilyl isocyanate)27ml(0.2mol)溶于20ml DMF中,剧烈搅拌下缓慢滴加至反应瓶中,滴加过程中保持反应温度处于0~15℃之间,之后保持0~15℃两个小时,之后保持室温搅拌24h。
反应液倒入3L水中,析出白色固体,抽滤,得到粗产品约40g。五氧化二磷真空干燥5小时。硅胶柱层析进行纯化,展开剂乙酸乙酯:石油醚=1:2,得最终产物Fmoc-4-ureido-D-Phe-OH 20g,收率45%。
以上描述中,缩写及其代表如下:
DIC | N,N'-二异丙基碳二亚胺 |
HOBt | 1-羟基苯并*** |
DCM | 二氯甲烷 |
DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
20%DBLK | 20%六氢吡啶(v)/N,N-二甲基甲酰胺 (v) |
Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH | Fmoc-4-ureido-D-Phe-OH |
Fmoc-4Aph(Alloc)-OH | Fmoc-4-Amino-L-Phe(Alloc)-OH |
Fmoc-4Aph(L-Hor)-OH | Fmoc-4-Amino-L-Phe(hydroorotyl)-OH |
Fmoc-4Aph(Trt)-OH | Fmoc-4-Amino-L-Phe(Trt)-OH |
Fmoc-D-3Pal-OH | Fmoc-3-(3-Pyridyl)-D-Alanine |
Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH | Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH |
Fmoc-D-2Nal-OH | Fmoc-3-(2-Naphthyl)-D-alanine |
Fmoc-ILys(Boc)-OH | Fmoc-N(ε)-isopropyl-N(ε)-Boc-lysine |
Claims (10)
1.一种地加瑞克的制备方法,包括以下步骤:
1)树脂与Fmoc-D-Ala-OH得到Fmoc-D-Ala-树脂;
2)采用Fmoc固相合成策略依次将Fmoc-Pro-OH、Fmoc-ILys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH、Fmoc-4Aph(X)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH以及Fmoc-D-2Nal-OH按地加瑞克的氨基酸排列顺序进行连接;
3)去除N端Fmoc,用乙酸酐和吡啶进行乙酰化;
4)去除C端第6个氨基酸残基-4Aph(X)上的保护基X;
5) 将L-4,5-dihydroorotic acid连接到C端第6个氨基酸残基-4Aph的侧链氨基上;
6)用裂解试剂切割肽树脂,无水***沉淀,离心后得到粗肽;
7)经纯化分离得地加瑞克。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:树脂为Rink Amide-BHA树脂、Sieber树脂和9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-polystyrene树脂,替代度为0.3~0.8mmol/g。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH由Fmoc-D-4Aph-OH和三甲基硅基异氰酸酯合成获得,反应溶剂为DMF,反应温度为0~15℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述Fmoc-4Aph(X)-OH由Fmoc-D-4Aph-OH和X-Cl合成获得,反应溶剂为DCM,反应温度为0~15℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述Fmoc-4Aph(X)-OH的保护基团X为Trt或Alloc。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述脱除Trt的试剂为TFA和DCM;脱除Alloc的试剂为Pd(Ph3P)4和苯硅烷和DCM。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于:所述TFA和DCM中TFA的体积比为5~10%,常温搅拌反应1.5~2h。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于:所述Pd(Ph3P)4和苯硅烷和DCM中Pd(Ph3P)4的摩尔用量为侧链保护基的0.25~1倍;苯硅烷的摩尔用量为侧链保护基的10~20倍,常温搅拌反应0.5~1h。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述裂解试剂为三氟乙酸和苯甲硫醚和苯甲醚和1,2-乙二硫醇,其体积比为90:5:3:2,裂解条件为室温搅拌2~3h,沉淀粗肽时无水***体积为8~12倍。
10.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述固相合成过程中使用偶联剂,偶联剂为DIC+Y,其中Y为HOBt或HOAt,反应溶剂为DMF或DMF和DCM混合溶剂,室温搅拌反应2~3h。
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