CN102304514B

CN102304514B - 一种引物及利用该引物检测gⅰ型gⅱ型诺如病毒的方法

Info

Publication number: CN102304514B
Application number: CN2011102975515A
Authority: CN
Inventors: 韩建康; 张红河; 吴晓芳; 纪蕾; 徐德顺; 汤仁树
Original assignee: Huzhou Center For Disease Control & Prevention
Current assignee: Huzhou Center For Disease Control & Prevention
Priority date: 2011-01-27
Filing date: 2011-10-08
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2031-10-08
Also published as: CN102304514A

Abstract

本发明涉及一种引物及利用该引物检测GⅠ型GⅡ型诺如病毒的方法，属于生物检测技术领域。一种引物，它的序列如下：Nov-F：5-GTGAATGAWGATGGCGTCKA-3，Nov-R：5-GTHAGWATCCAGGGGTCAAT-3 。本发明关键在于引物序列的设计，RT-PCR反应体系组成、反应条件选择和反应结果判断均可按本领域常规方法进行。本发明可实现一对引物在同一反应管同时检测并区分GⅠ型和GⅡ型诺如病毒，既简化了操作步骤、又可缩短检测时间。

Description

一种引物及利用该引物检测GⅠ型GⅡ型诺如病毒的方法

技术领域

本发明涉及一种引物及利用该引物检测GⅠ型GⅡ型诺如病毒的方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

诺如病毒(Noroviruses，NVs)属于杯状病毒科诺如病毒属，是全世界引发非细菌性胃肠炎暴发和散发的重要病原。目前根据病毒基因RNA聚合酶 (RNA dependent RNA polymerase，RdRp)和主要衣壳蛋白VP1的核苷酸序列差异，诺如病毒可分为5个遗传组(GenogroupⅠ～Ⅴ，GⅠ～Ⅴ)，其中引起人类感染的主要是GⅠ型和GⅡ型诺如病毒，每个遗传组又可进一步分为若干个基因型。由于该病毒抵抗力强、致病剂量低、各年龄阶段人群对其普遍易感，常可通过污染食物或水源等传播途径在一些公共场所如学校、幼儿园、医院等引发大范围的暴发流行。因此建立简单、快速、特异灵敏的检测方法,以及区分诺如病毒GⅠ型和GⅡ型对该病的防控具有重要意义。

由于诺如病毒不能进行细胞和组织培养，也没有合适的动物模型，其检测方法受到很大限制。目前用于该病毒的检测方法主要有电镜法、免疫学法及分子生物学法。电镜法具有直接、可靠的优点，但检测灵敏度较低，通常粪便标本病毒滴度达到10⁶/g才能达到检测要求。

发明内容

本发明的目的是为解决上述技术问题，提供一种引物。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的。

一种引物，它的序列如下：

Nov-F：5-GTGAATGAWGATGGCGTCKA-3 (nt5353-nt5372)

Nov-R：5-GTHAGWATCCAGGGGTCAAT-3 (nt5528-nt5510)。

括号中所述为该引物对应目的片段的核苷酸位置。

本发明的另一个目的是提供一种利用上述引物检测GⅠ型GⅡ型诺如病毒的方法。

利用上述引物检测GⅠ型GⅡ型诺如病毒的方法，包括以下步骤：

①提取待测样品RNA，以待测样品RNA为模板，在具有序列为Nov-F：5-GTGAATGAWGATGGCGTCKA-3 Nov-R：5-GTHAGWATCCAGGGGTCAAT-3的引物的RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应；

②取5 ml RT-PCR产物在含溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，电泳后根据有无特异性条带和长度判断待检标本中是否含有GⅠ型和GⅡ型诺如病毒核酸。

本发明采用RT-PCR检测方法，利用一对诺如病毒检测分型通用引物可实现一次性处理样本即可同时检测并区分诺如病毒GⅠ型和GⅡ型，并成功的应用于临床粪便标本的实验室检测。

本发明关键在于引物序列的设计， RT-PCR反应体系组成、反应条件选择和反应结果判断均可按本领域常规方法进行。

所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。

所述RT-PCR反应体系每25μl组成如下：

Figure 2011102975515100002DEST_PATH_IMAGE001

所述RT-PCR反应条件为：50℃ 30min，94℃ 3min进行逆转录，然后94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min 共进行35个循环，72℃ 10min，4℃保存。

作为单正链RNA病毒，诺如病毒极易发生变异，存在众多型别。其中引起人类感染的GI型和GII型诺如病毒至少可分为14和17个基因型。想应用基于核酸扩增的PCR技术对诺如病毒进行敏感地检测并同时区分GⅠ型和GⅡ型，设计一套特异、广谱的引物非常关键。早期应用于诺如病毒检测的RT-PCT方法，引物的设计大都针对位于ORF1的RdRp区或是ORF2的衣壳蛋白区。欧盟曾联合5个国家的5个不同的实验室对5种常规RT-PCR方法进行了方法学评估。结果表明,没有一对单一的引物能达到同时检测并区分诺如病毒GⅠ型和GⅡ型。随后又有一些针对上述区域的实时荧光PCR方法相继建立，也均是分别针对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒设计特异性引物和探针对其进行分型检测。

本发明的有益效果主要体现在：设计的一对诺如病毒特异性引物同时针对诺如病毒GⅠ型和GⅡ型衣壳蛋白的高度保守区，适合用于GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的同时检测；利用该对引物针对GI型诺如病毒和GII型诺如病毒扩增的目的片段大小不同（GI型：175bp；GII型：160bp）, 可实现一对引物在同一反应管同时检测并区分GⅠ型和GⅡ型诺如病毒，既简化了操作步骤、又可缩短检测时间。实验结果表明本发明方法对诺如病毒GⅠ和GⅡ型的检测有高度的特异性，与其他常见的致腹泻病毒轮状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒均无交叉反应；本发明方法可成功用于检测并区分实际粪便样本中的GⅠ型和GⅡ型诺如病毒，非常适用于诺如病毒引起的突发疫情的实验室早期诊断。

附图说明

图1为已知诺如病毒GⅠ型和GⅡ型阳性毒株、阴性及特异性的检测；

图2为本发明的检测方法对实际样本中诺如病毒核酸的检测。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

实施例

1 材料和方法

1.1 病毒

轮状病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒核酸受赠于浙江省疾控中心病毒所。已知诺如病毒GⅠ型和GⅡ型阳性毒株为本实验室保存。临床标本为湖州地区2008-2010年非细菌性急性胃肠炎暴发疫情中采集的患者粪便标本。

1.2 引物设计

从GenBank基因库上检索出60株不同年份和地区的GⅠ型和GⅡ型诺如病毒毒株全基因序列，用生物学软件进行同源性比较，在衣壳蛋白保守区设计特异性引物，序列为：

Nov-F：5-GTGAATGAWGATGGCGTCKA-3 (nt5353- nt5372)

Nov-R：5-GTHAGWATCCAGGGGTCAAT-3 (nt5528- nt5510)

引物委托上海英骏生物技术有限公司合成。GⅠ型和GⅡ型诺如病毒扩增片断大小分别为175bp和160bp。

1.3 RT-PCR反应：

诺如病毒 RT-PCR引物序列，

Nov-F：5-GTGAATGAWGATGGCGTCKA-3 (nt5353- nt5372)

Nov-R：5-GTHAGWATCCAGGGGTCAAT-3 (nt5528- nt5510)

采用TAKARA公司one step RNA PCR kit（code：DRR024A），按试剂盒说明书操作，反应体系为25 ml，其中10×RT-PCR 缓冲液 2.5 ml , MgCl₂ 5 ml（25mM），dNTP混合物（各10 mM）2.5ml，RNase抑制剂（40U/ml）0.5 ml，AMV酶（5U/ml）0.5 ml，Taq酶（5U/ml）0.5 ml，上游与下游引物（20μM）各0.5 ml，模板RNA 5ml，DEPC水7.5 ml。反应条件为50℃ 30min，94℃ 3min进行逆转录，然后94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min进行扩增，35个循环后转入72℃ 10min，4℃保存。取5 ml产物在含溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，电泳后根据有无特异性条带（ GI:175bp，GII:160bp）。判断待检标本中是否含有GⅠ型和GⅡ型诺如病毒核酸。

1.4 RT-PCR特异性试验

利用建立起的RT-PCR反应体系分别对GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒核酸进行检测，验证其特异性。

1.5 实际样本的检测

选取非细菌性急性胃肠炎暴发疫情中采集的101份患者粪便标本，用本发明的诺如病毒RT-PCR方法和荧光RT-PCR方法同时进行检测。

2 结果

2.1 RT-PCR反应体系及条件

采用TAKARA公司的one step RNA PCR kit （code：DRR024A）RT-PCR试剂盒，总反应体系为25 ml。用Eppendorf PCR仪进行检测，反应参数为：50℃ 30min，94℃ 3min进行逆转录，然后94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min进行扩增，35个循环后转入72℃ 10min，4℃保存。取5 ml产物在含溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，电泳后判断有无特异性条带（GⅠ:175bp，GⅡ:160bp）。

2.2 特异性试验

本发明建立的RT-PCR方法对诺如病毒具有较好的特异性，对其他肠道病毒如轮状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒等无交叉反应。

2.3 实际样本的检测

选取非细菌性急性胃肠炎暴发疫情中采集的101份患者粪便标本，分别选用本发明的诺如病毒检测分型通用引物和2套用于诺如病毒分型检测的引物探针对标本同时进行RT-PCR和荧光RT-PCR检测。结果显示：本发明的诺如病毒RT-PCR方法共检出GⅠ阳性6份，GⅡ阳性32份，阴性63份。采用荧光RT-PCR方法检测结果与本发明的方法完全相符。但本发明可实现一对引物在同一反应管同时检测并区分GⅠ和GⅡ型诺如病毒，既简化了操作步骤、又可缩短检测时间。图2显示的是实际样本的检测图谱。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖州市疾病预防控制中心

<120> 一种引物及利用该引物检测GⅠ型GⅡ型诺如病毒的方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgaatgawg atggcgtcka 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gthagwatcc aggggtcaat 20

Claims

1.一种引物，其特征在于，所述引物序列如下：

Nov-F：5-GTGAATGAWGATGGCGTCKA-3

Nov-R：5-GTHAGWATCCAGGGGTCAAT-3 。