CN102301957A - 一种以重楼根茎为外植体的愈伤组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以重楼根茎为外植体的愈伤组织培养方法，该方法以经特定预处理后的重楼根茎为外植体，通过消毒后将其接入愈伤组织诱导培养基和增殖培养中进行培养，最终实现了对重楼植物愈伤组织地有效诱导和快速增殖。本发明较好地解决了当前重楼植物在组织培养方面存在的瓶颈问题，为今后深入开展重楼植物的各种生物技术研究奠定了坚实的理论基础。

Description

一种以重楼根茎为外植体的愈伤组织培养方法

技术领域

本发明涉及一种重楼组织培养方法，特别是涉及一种以重楼根茎为外植体的愈伤组织培养方法。

背景技术

重楼是名贵中药材之一，全世界共有24种，我国拥有19种，其中又以西南地区各省的种类和资源尤为丰富，如云南、四川、贵州等地。重楼主要有效成分是甾体皂苷，其苷元主要为异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元，并含有氨基酸、甾酮、蜕皮激素、黄酮苷等化合物。现代药理研究表明，重楼具有抗肿瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒等作用，其良好的疗效已被众多的制药工业用于药剂的使用，是云南白药、宫血宁、热毒清等重要中成药的主要成分。

随着中医药产业的快速发展，重楼药材的需求正以每年20％的幅度递增，而其野生资源却逐年减少，导致重楼价格迅速上涨，严重制约了制药企业的产量和质量。当前，重楼主要靠采挖野生资源，由于长期过度采挖，并缺乏对其生态环境的保护，致使野生重楼资源遭到了毁灭性的破坏，现已濒临灭绝。

当前重楼主要是靠种子和根茎进行繁殖，由于重楼种子存在种胚发育不完全，胚乳坚硬，胚轴后熟等明显“双重休眠”特性，因此重楼种子在播种后通常需要经历两个冬天才能萌发成苗，是典型的“二年生种子”，而且在自然状态下重楼种子出苗率很低、生长周期长，从出苗到成材需要8～10年的时间；而使用重楼根茎进行营养繁殖，由于重楼根茎本身就是其药用有效部位，因此利用根茎切块生产重楼种苗存在用种量大、生产成本高等问题。

利用组织培养技术生产药用植物具有生长周期短，繁殖率高、能有效降低灾害性气候对植物生长的不利影响等优点，可进行周年培养生产，且培养条件优越，对植物生长极为有利；因此应用组织培养方法进行重楼植物的快速繁殖是解决当前重楼药材短缺和更好地保护其野生植物资源的有效方法。

到目前为止，重楼植物的组织培养研究还未取得令人满意的结果，仅有少数成果报道。四川师范大学学报(自然科学版)第29卷第1期(2006年1月)刊登了李群等人撰写的《重楼属植物愈伤组织的诱导和培养》，文中作者以重楼植物的不同部位作为外植体进行了愈伤组织诱导培养，发现重楼根和叶片不能诱导出愈伤组织，而根茎、子房和幼芽可不同程度地诱导出愈伤组织，但实验结果显示根茎形成的愈伤组织易纤维化，不具备增殖能力，另外，他们发现倒苗期的根茎很难诱导产生愈伤组织。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以重楼根茎为外植体的愈伤组织培养方法，该方法可实现以倒苗期重楼根茎为外植体对愈伤组织的有效诱导和快速增殖。

为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤：

(1)外植体的选取：选取倒苗期重楼的根茎，用刀将根茎带芽的前两个节段切下，用草木灰处理切下段的切口后将切下段移栽于腐质土中，待其有新根长出时，挖出移栽体，作为外植体备用；

(2)外植体的消毒：用流水洗净外植体表面的泥土及污物，再将洗净后的外植体放入消洗灵溶液中浸泡10～30min，然后将浸泡后的外植体用流水冲洗2～4h后取出晾干，将晾干后的外植体转入超净工作台，先用浓度为0.1％～0.2％的升汞消毒6～20min，然后用无菌水冲洗3～6次，再用已灭菌的滤纸吸干其上的水分；

(3)愈伤组织的诱导培养：切去外植体前端的芽体，将修剪后的外植体接入愈伤组织诱导培养基1/2MS+6-BA0.5～2mg·L^-1+NAA 0～1.0mg·L^-1+IAA 0～3mg·L^-1+蔗糖30～50g·L^-1+琼脂6.0～7.0g·L^-1中进行培养；

(4)愈伤组织的增殖培养：将步骤(4)培养后的愈伤组织转接入增殖培养基MS+6-BA 0.5～2mg·L^-1+NAA 0.1～1mg·L^-1+2.4-D 0～2mg·L^-1+蔗糖30～50g·L^-1+琼脂6.0～7.0g·L^-1中进行培养；

上述所有培养基的pH值为5.6～6.5、培养温度18～28℃、每天光照8～16小时、光照强度为1000～1800lx。

目前重楼植物的组织培养仍未取得满意效果，其主要原因是在外植体的选择和进行有效诱导培养上仍未有明显突破。

本发明针对重楼药材一般在倒苗期采收的特点，专门采用倒苗期的重楼根茎，将其经过前期预处理后作为组织培养的外植体，通过消毒后将其接入愈伤组织诱导培养基中，可获得质地优良、生长速度快和能大量增殖的愈伤组织，较好地解决了当前重楼植物在组织培养方面存在的瓶颈问题，可实现重楼短时间、低成本、大批量生产。

具体实施方式

实施例1

(1)外植体的选取：选取倒苗期重楼的根茎，用锋利的刀将根茎带芽的前两个节段切下，伤口力求小而平滑，用草木灰处理切下段的切口后将切下段移栽于腐质土中，待其有新根长出时，挖出移栽体，作为外植体备用；

(2)外植体的消毒：用流水洗净外植体表面的泥土及污物，再将洗净后的外植体放入消洗灵溶液中浸泡15min，然后将浸泡后的外植体用流水冲洗2h后取出晾干，将晾干后的外植体转入超净工作台，先用浓度为0.1％的升汞消毒2次，每次消毒6min，然后用无菌水冲洗5次，再用已灭菌的滤纸吸干其上的水分；

(3)愈伤组织的诱导培养：切去外植体前部的芽体，将修剪后的外植体接入愈伤组织诱导培养基1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+IAA 2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1中进行培养，培养60天后，统计其愈伤组织的诱导率为31.3％；

(4)愈伤组织的增殖培养：选取步骤(4)中生长较快的愈伤组织，将其在超净台上切割为0.5cm左右的大小后转接入增殖培养基MS+6-BA2.0mg·L^-1+NAA 1.0mg·L^-1+2.4-D 0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1中进行培养，培养60天后，其愈伤组织增殖倍数为2.15倍；

上述所有培养基的pH值为6.5、培养温度25℃、每天光照12小时、光照强度为1500lx。

实施例2

将实施例1步骤(3)中的愈伤组织诱导培养基改为1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+IAA2.0mg·L^-1+NAA 0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1，其它步骤同实施例1，诱导培养60天后，其愈伤组织的诱导率为33.4％。

实施例3

将实施例1步骤(4)中的愈伤组织增殖培养基改为MS+6-BA2.0mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+蔗糖30～50g·L^-1+琼脂6.0～7.0g·L^-1，其它步骤同实施例1，增殖培养60天后，愈伤组织增殖倍数为1.75倍。

Claims (1)

1.一种以重楼根茎为外植体的愈伤组织培养方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)外植体的选取：选取倒苗期重楼的根茎，用刀将根茎带芽的前两个节段切下，用草木灰处理切下段的切口后，将切下段移栽于腐质土中，待其有新根长出时，挖出移栽体，作为外植体备用；

(2)外植体的消毒：用流水洗净外植体表面的泥土及污物，再将洗净后的外植体放入消洗灵溶液中浸泡10～30min，然后将浸泡后的外植体用流水冲洗2～4h后取出晾干，将晾干后的外植体转入超净工作台，先用浓度为0.1％～0.2％的升汞消毒6～20min，然后用无菌水冲洗3～6次，再用已灭菌的滤纸吸干其上的水分；

(3)愈伤组织的诱导培养：切去外植体前端的芽体，将修剪后的外植体接入愈伤组织诱导培养基1/2MS+6-BA0.5～2mg·L^-1+NAA 0～1.0mg·L^-1+IAA 0～3mg·L^-1+蔗糖30～50g·L^-1+琼脂6.0～7.0g·L^-1中进行培养；

(4)愈伤组织的增殖培养：将步骤(4)培养后的愈伤组织转接入增殖培养基MS+6-BA 0.5～2mg·L^-1+NAA 0.1～1mg·L^-1+2.4-D 0～2mg·L^-1+蔗糖30～50g·L^-1+琼脂6.0～7.0g·L^-1中进行培养；

上述所有培养基的pH值为5.6～6.5、培养温度18～28℃、每天光照8～16小时、光照强度为1000～1800lx。