CN102297875B - 一种植物体内羟基自由基的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种电子自旋共振结合二级自由基自旋捕获技术测定植物体内羟基自由基的方法。该方法选取二甲基亚砜(DMSO)作自由基一级捕获剂，用N-叔丁基-α-苯硝酮(PBN)作自由基二级捕获剂，经过一系列的捕获、提取后，用电子自旋顺磁共振(ESR)测定植物样品中的羟基自由基。

Description

一种植物体内羟基自由基的测定方法

技术领域

本发明涉及自由基的测定方法，具体地说是用电子自旋共振结合二级自由基自旋捕获技术，通过捕获、提取，用电子自旋顺磁共振测定植物样品中的羟基自由基浓度的方法。

背景技术

土壤污染是世界性环境问题之一。我国重金属污染土壤约2000万公顷，农药、抗生素、病原体污染土壤1300-1600万公顷，污染比较严重的耕地约2000万公顷，占耕地面积的1/5。土壤污染对作物产量、品质产生不利影响。我国每年因土壤污染而减产粮食1000多万吨，造成经济损失约200亿元。因此，污染土壤的清洁与安全利用是一项重要的任务，土壤污染诊断是其中的一个重要环节。单纯依靠化学方法进行土壤污染诊断，不能全面、科学地表征土壤的整体质量特征，需要其他方法对此做出补充，土壤污染生态毒理诊断研究顺应这一客观要求，得到了国际性的广泛重视和迅速发展。

高等植物是土壤生态***中的基本组成部分。利用其生长状况，从组织水平、分子水平判断污染土壤对植物生长的影响从而可以达到诊断土壤污染的目的。生物在其有氧代谢过程中会出现各种自由基，同时生物体细胞中又有各种自由基清除体系，因而细胞内自由基维持在合理的水平，但在如环境污染、除草剂使用等逆境条件下，生物体内往往出现超量的自由基并对生物代谢产生影响。研究资料表明，生物体内产生的自由基主要包括超氧化物自由基、羟自由基(·OH)、脂质过氧化产物，过氧化氢(H₂O₂)、单线态氧(¹O₂)等氧自由基以及一氧化氮(NO₂·)等氮自由基等。生物体内形成的这部分自由基将会引起细胞内膜的脂质过氧化、蛋白质变性、核酸分子与基因突变、碳水化合物碳链断裂等。因此根据植物体内自由基种类和强度的变化，可以判断植物是否处于氧化应激状态，为污染物对植物的毒害机制研究以及污染土壤的早期诊断提供最直接的证据。

羟基自由基(·OH)被公认是生物***中最具活性的活性氧物种，它具有极强的氧化能力，并能引发诱导产生链反应。由此，发展准确的、灵敏的·OH检测技术是十分重要的。传统的·OH化学检测，如分光光度法、荧光光度法、化学发光法等灵敏度高，操作方便，但测定过程中的干扰因素较多。电子自旋共振法是最常用、最有效的检测方法，它具有快速、简便、经济、用量少等优点，现已广泛应用于生物学、医学研究领域。·OH的寿命极短，只有10^-6秒，因此电子自旋共振需配合捕获剂，以延长自由基的寿命。其原理是利用适当的自旋捕获剂与活泼的短寿命自由基结合，生成相对稳定的自旋加合物，然后用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量，利用自旋加合物的数量来计算原来自由基的多少。这种方法不仅有助于探明生物大分子的结构和功能，并能对各种生物体的内部环境、空间构象和运动状态提供各种有用的信息。植物细胞具有不同于动物细胞的结构，通过捕获剂的选择，捕获条件以及提取方法的优化，可望实现高灵敏度、抗干扰能力强的植物体内羟基自由基测定。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物体内羟基自由基的测定方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案是采用电子自旋共振结合二级自由基自旋捕获技术，通过一系列的捕获、提取方法，测定植物体内的羟基自由基浓度。本方法具有操作简单、灵敏度高、抗干扰能力强的优点。

本发明提供一种植物体内羟基自由基的测定方法，所述测定法包括如下步骤：

1)自由基捕获剂的配制：称取N-叔丁基-α-苯硝酮(购自：AMRESCO公司)，在室温下溶解在二甲基亚砜(购自：Sigma-Aldrich公司)中，配制成10-100mM的N-叔丁基-α-苯硝酮(PBN)的二甲基亚砜(DMSO)溶液；

2)称取新鲜植物组织(例如，根、茎或叶或其组合)0.2-1.5g，剪碎放于玻璃组织研磨器中，加入步骤1)中配制的0.5-1.5ml 10-100mM N-叔丁基-α-苯硝酮的二甲基亚砜溶液，于冰浴中研磨1-5分钟至均匀；

3)将步骤2)所得研磨液转移至容积为1.5ml的离心管(购自：河北省沧县杜生强发医疗器械厂)中，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，于0-4℃下2000-6000g离心3-10分钟；和

4)将步骤3)所得的样品，取上清液装入石英玻璃样品管(型号：1mm，购自：Bruker公司)，用电子自旋顺磁共振仪(型号：ESP 300，购自：Bruker公司)检测。

按照本发明的优选实施方案，所述植物体内羟基自由基的测定方法包括如下步骤：

1)自由基捕获剂的配制：称取N-叔丁基-α-苯硝酮(购自：AMRESCO公司)，在室温下溶解在二甲基亚砜(购自：Sigma-Aldrich公司)中，配制成10-100mM的N-叔丁基-α-苯硝酮(PBN)的二甲基亚砜(DMSO)溶液；

2)称取新鲜植物组织(例如，根、茎或叶或其组合)0.2-1.5g，剪碎放于玻璃组织研磨器中，加入步骤1)中配制的0.5-1.5ml 10-100mM N-叔丁基-α-苯硝酮的二甲基亚砜溶液，于冰浴中研磨1-5分钟至均匀；

3)将步骤2)所得研磨液转移至容积为1.5ml的离心管(购自：河北省沧县杜生强发医疗器械厂)中，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，于0-4℃下2000-6000g离心3-10分钟后，弃去上清液；

4)将步骤3)所得的沉淀样品，再次加入0.5-1.5ml N-叔丁基-α-苯硝酮的二甲基亚砜溶液，振荡1-5分钟后，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟，然后将离心管置于冷冻离心机中，于0-4℃下2000-6000g离心3-10分钟；和

5)将步骤4)所得的样品，取上清液装入石英玻璃样品管(型号：1mm，购自：Bruker公司)，用电子自旋顺磁共振仪(型号：Bruker ESP 300，购自：Bruker公司)检测。

其中，在本发明的一个实施方案中，上述步骤4)或5)中提及的电子自旋顺磁共振仪(型号：ESP 300，购自：Bruker公司)检测的检测条件可以为：微波功率20mW，微波频率9.7GHz，中心磁场3470G，场宽100G，调频100kHz，调幅2.5G。但是本领域技术人员应该理解，实际实验中所选用的电子自旋顺磁共振仪检测的检测条件可以因为所用的电子自旋顺磁共振仪的型号、样品类型等而有所不同，本领域技术人员可以根据实际条件或经过简单的预实验进行选择。

本发明所述的方法，所述步骤1)中所使用的N-叔丁基-α-苯硝酮的二甲基亚砜溶液需在测定当日配制，最好即用即配。

本发明所述的方法，所述的植物体组织为植物根、茎、叶或其组合。

另外，我们对上述步骤2)-4)中的离心转速、离心时间进行优化，发现转速为2000g时，样品分离效果差，其结果是谱图基线较差，相对自由基信号弱，影响测定灵敏度。同样，离心时间为1分钟时，样品分离效果差，测定灵敏度不高。但是如果离心时间过长，样品中的自由基容易淬灭，影响测定。因此，在优选实施方案中，我们优选使用的离心转速为4500g，离心时间为3-10分钟，更优选地，离心时间为4分钟。

温浴是为了N-叔丁基-α-苯硝酮的自由基加合反应更快。温度为20℃时，加合反应慢，导致测定信号弱；但是如果温度太高，自由基寿命短，容易淬灭，也会导致灵敏度的降低。同样，温浴时间过短，加合反应不完全，测定信号低；但时间过长，自由基容易淬灭，也会导致测定信号变弱。因此，在优选实施方案中，我们优选使用的温浴温度是37℃，温浴时间为15分钟。

因此，在本发明的一个更优选的实施方案中，所述植物体内羟基自由基的测定方法包括如下步骤：

1)自由基捕获剂的配制：称取N-叔丁基-α-苯硝酮(购自：AMRESCO公司)，在室温下溶解在二甲基亚砜(购自：Sigma-Aldrich公司)中，配制成10-100mM的N-叔丁基-α-苯硝酮(PBN)的二甲基亚砜(DMSO)溶液；

2)称取新鲜植物组织(例如，根、茎或叶或其组合)0.2-1.5g，剪碎放于玻璃组织研磨器中，加入步骤1)中配制的0.5-1.5ml 10-100mM N-叔丁基-α-苯硝酮的二甲基亚砜溶液，于冰浴中研磨1-5分钟至均匀；

3)将步骤2)所得研磨液转移至容积为1.5ml的离心管(购自：河北省沧县杜生强发医疗器械厂)中，于37℃水浴中温浴15分钟，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，于0-4℃下4500g离心4分钟后，弃去上清液；

4)将步骤3)所得的沉淀样品，再次加入0.5-1.5ml N-叔丁基-α-苯硝酮的二甲基亚砜溶液，振荡1-5分钟后，于37℃水浴中温浴15分钟，然后将离心管置于冷冻离心机中，于0-4℃下4500g离心4分钟；和

5)将步骤4)所得的样品，取上清液装入石英玻璃样品管(型号：1mm，购自：Bruker公司)，用电子自旋顺磁共振仪(型号：Bruker ESP 300，购自：Bruker公司)检测。

本发明采用电子自旋共振结合二级自由基自旋捕获技术，通过一系列的捕获、提取方法，测定植物体内的羟基自由基。所选用的羟基自由基捕获剂为二甲基亚砜及N-叔丁基-α-苯硝酮，其原理在于可以用以下反应式描述：

DMSO+OH·→DMSO·OH+·CH₃

2·CH₃+O₂→2·OCH₃

·OCH₃+PBN→PBN/·OCH₃

·CH₃+PBN→PBN/·CH₃

式中PBN/·OCH₃和PBN/·CH₃是较稳定的自由基，经检测，它们的寿命长达40分钟。将它们作为报告基团，进行电子自旋共振检测，借助于此报告基团的ESR信号，从而达到对OH·进行定量检测。

将文献上报道的用电子自旋共振结合二级自由基自旋捕获技术测定动物体内OH·方法直接用于测定植物体内的OH·，所得谱图基线较差，自由基信号弱，灵敏度不够理想。本发明人经过选择适当的捕获、提取方法，电子自旋共振谱图明显改善，大大提高了方法的灵敏度，可用于植物体内羟基自由基的定量检测。这是本发明的优点所在。

本发明的测定法灵敏度高，抗植物基体干扰能力强，可实现植物体内自由基的准确、快速、高效检测，为污染物引起植物毒害的机理研究以及土壤污染的生态毒理早期诊断奠定基础。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1.显示实施例1中镉(Cd)胁迫下的玉米根中羟基自由基的自旋共振谱图。

图2.显示实施例2中阿特拉津胁迫下小麦根、叶中羟基自由基的自旋共振谱图。

图3.显示实施例3中不同浓度金霉素(CTC)胁迫下玉米根中羟基自由基的自旋共振谱图。

图4.显示实施例4中不同捕获、提取条件下，玉米根中羟基自由基的自旋共振谱图，a：未温浴；b：经过一次温浴和离心；c：经过二次温浴和离心。

图5.显示实施例5中不同温浴温度条件下，玉米根中羟基自由基的自旋共振谱图，a：20℃；b：37℃；c：45℃。

图6.显示实施例6中不同温浴时间条件下，玉米根中羟基自由基的自旋共振谱图，a：4分钟；b：15分钟；c：30分钟。

图7.显示实施例7中不同离心机转速条件下，玉米根中羟基自由基的自旋共振谱图，a：2000g；b：4500g；c：6000g。

图8.显示实施例8不同离心时间条件下，玉米根中羟基自由基的自旋共振谱图，a：1分钟；b：4分钟；c：10分钟。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

实施例1：用电子自旋共振结合二级自由基自旋捕获技术测定镉胁迫的玉米根中的羟基自由基

将发芽5天后的玉米幼苗根部浸泡在5mg/L Cd(NO₃)₂(购自：北京化学试剂公司)的水溶液中24小时后，分离幼苗的根、叶，分别用自来水和蒸馏水将根、叶洗净。称取新鲜植物根0.2-1.5g，剪碎放于玻璃组织研磨器中，加入0.5-1.5ml 10-100mM PBN的DMSO溶液，于冰浴中研磨均匀。将研磨液转移至容积为1.5ml的离心管(购自：河北省沧县杜生强发医疗器械厂)中，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟后，将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，于0-4℃下2000-6000g冷冻离心3-10分钟后，弃去上清液。再加入0.5-1.5ml PBN的DMSO溶液，振荡1-5分钟，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟，0-4℃，2000-6000g冷冻离心3-10分钟。取上清液装入石英玻璃样品管(型号：1mm，购自：Bruker公司)，用电子自旋顺磁共振仪(型号：ESP 300，购自：Bruker公司)检测，检测条件如下：微波功率20mW，微波频率9.7GHz，中心磁场3470G，场宽100G，调频100kHz，调幅2.5G。检测谱图见图1。

从图1中可见，谱图出现明显的尖峰，此峰为甲氧自由基的峰(·OCH₃)。说明重金属镉能诱导植物体内羟基自由基的产生。此方法的灵敏度高，抗干扰能力强，能够满足植物根中自由基的定性测定。

实施例2：用电子自旋共振结合二级自由基自旋捕获技术测定阿特拉津胁迫下小麦根、叶中的羟基自由基

将发芽5天后的小麦幼苗根部浸泡在10mg/L阿特拉津(购自：Sigma-Aldrich公司)中。24小时后，分离幼苗的根、叶，分别用自来水和蒸馏水将根、叶洗净。称取新鲜植物根或叶0.2-1.5g，分别剪碎放于玻璃组织研磨器中，加入0.5-1.5ml10-100mM PBN的DMSO溶液，于冰浴中研磨均匀。将研磨液转移至离心管中，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟后，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，于0-4℃下2000-6000g冷冻离心3-10分钟后，弃去上清液。再加入0.5-1.5ml PBN的DMSO溶液，振荡1-5分钟，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟后，于0-4℃，2000-6000g冷冻离心3-10分钟。取上清液装入石英玻璃样品管，用电子自旋顺磁共振仪检测，检测条件如下：微波功率20mW，微波频率9.7GHz，中心磁场3470G，场宽100G，调频100kHz，调幅2.5G。检测谱图见图2。

从图2中可见，谱图出现明显的尖峰，此峰为甲氧自由基峰(·OCH₃)及甲基自由基峰(·CH₃)。说明阿特拉津能诱导植物体内羟基自由基的产生。此方法的灵敏度高，抗干扰能力强，能够满足植物根、叶中自由基的定性测定。

实施例3：用电子自旋共振结合二级自由基自旋捕获技术测定不同浓度金霉素胁迫下的玉米根中的羟基自由基

将发芽5天后的玉米幼苗根部分别浸泡在0，0.5，5，50mg/L金霉素(CTC，购自：中国药品与生物制品检定所)水溶液中。24小时后，分离幼苗的根、叶，用自来水和蒸馏水将根洗净。称取新鲜植物根0.2-1.5g，剪碎放于玻璃组织研磨器中，加入0.5-1.5ml 10-100mM PBN的DMSO溶液，于冰浴中研磨均匀。将研磨液转移至离心管中，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟后，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，于0-4℃下2000-6000g冷冻离心3-10分钟后，弃去上清液。再加入0.5-1.5ml PBN的DMSO溶液，振荡1-5分钟，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟，0-4℃，2000-6000g冷冻离心3-10分钟。取上清液装入石英玻璃样品管，用电子自旋顺磁共振仪检测，检测条件如下：微波功率20mW，微波频率9.7GHz，中心磁场3470G，场宽100G，调频100kHz，调幅2.5G。检测谱图见图3。

从图3中可见，正常生长的植物体内也能检测到羟基自由基，说明此方法的灵敏度高。随着金霉素浓度的提高，植物根中自由基信号明显提高，且存在剂量效应关系，说明这种测定方法可以满足植物体内羟基自由基的定量分析。

实施例4.不同捕获、提取条件下，玉米根中羟基自由基的自旋共振谱图

将发芽5天后的玉米幼苗根部浸泡在50mg/L金霉素(购自：中国药品与生物制品检定所)水溶液中。24小时后，分离幼苗的根、叶，用自米水和蒸馏水将根洗净。分别称取三份新鲜植物根0.2-1.5g，剪碎放于玻璃组织研磨器中，加入0.5-1.5ml 10-100mM PBN的DMSO溶液，于冰浴中研磨均匀。

将第一份样品研磨转移至离心管中离心，取上清夜直接用电子自旋顺磁共振仪检测(谱图见图4a)。

将第二份样品研磨后，转移至离心管中，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟后，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，于0-4℃下2000-6000g冷冻离心3-10分钟后，取上清夜直接用电子自旋顺磁共振仪检测(谱图见图4b)。

将第三份样品研磨后，转移至离心管中，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，于0-4℃下2000-6000g冷冻离心3-10分钟后，弃去上清液。再加入1-5ml PBN的DMSO溶液，振荡1-5分钟，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟，0-4℃，2000-6000g冷冻离心3-10分钟。取上清液装入石英玻璃样品管，用电子自旋顺磁共振仪检测(谱图见图4c)。

从图4中可见，将自由基捕获剂加入样品后直接测定，所得谱图基线很差，自由基信号弱，灵敏度不够理想。经过一次温浴和离心后，谱图基线、信号有所改善。经过二次温浴和离心后，谱图质量明显提高。

实施例5：不同温浴温度条件下，玉米根中羟基自由基的自旋共振谱图。

将发芽5天后的玉米幼苗根部浸泡在5mg/L Cd(NO₃)₂(购自：北京化学试剂公司)的水溶液中24小时后，分离幼苗的根、叶，分别用自来水和蒸馏水将根、叶洗净。称取3份新鲜植物根0.2-1.5g，剪碎放于玻璃组织研磨器中，分别加入0.5-1.5ml 10-100mM PBN的DMSO溶液，于冰浴中研磨均匀。

将第一份样品研磨液转移至容积为1.5ml的离心管(购自：河北省沧县杜生强发医疗器械厂)中，于20℃水浴中温浴5-20分钟，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，于0-4℃下2000-6000g冷冻离心3-10分钟，弃去上清液。再加入0.5-1.5ml PBN的DMSO溶液，振荡1-5分钟，于20℃水浴中温浴5-20分钟后，于0-4℃，2000-6000g冷冻离心3-10分钟。取上清液装入石英玻璃样品管(型号：1mm，购自：Bruker公司)，用电子自旋顺磁共振仪(型号：ESP 300，购自：Bruker公司)检测。检测谱图见图5a。

将第二份样品研磨液转移至容积为1.5ml的离心管(购自：河北省沧县杜生强发医疗器械厂)中，于37℃水浴中温浴5-20分钟，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，于0-4℃下2000-6000g冷冻离心3-10分钟，弃去上清液。再分别加入0.5-1.5ml PBN的DMSO溶液，振荡1-5分钟，于37℃水浴中温浴5-20分钟，0-4℃，2000-6000g冷冻离心3-10分钟。取上清液装入石英玻璃样品管(型号：1mm，购自：Bruker公司)，用电子自旋顺磁共振仪(型号：ESP 300，购自：Bruker公司)检测。检测谱图见图5b。

将第三份样品研磨液转移至容积为1.5ml的离心管(购自：河北省沧县杜生强发医疗器械厂)中，于45℃水浴中温浴5-20分钟，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，于0-4℃下2000-6000g冷冻离心3-10分钟，弃去上清液。再分别加入0.5-1.5ml PBN的DMSO溶液，振荡1-5分钟，于45℃水浴中温浴5-20分钟，0-4℃，2000-6000g冷冻离心3-10分钟。取上清液装入石英玻璃样品管(型号：1mm，购自：Bruker公司)，用电子自旋顺磁共振仪(型号：ESP 300，购自：Bruker公司)检测。检测谱图见图5c。

从图5中可见，各个不同温浴温度下，谱图都出现比较明显的自由基峰，但20℃、45℃温浴样品峰高明显小于37℃温浴的峰，说明过高和过低的温浴温度都会影响测定的灵敏度。因此，优选的温育温度为37℃。实施例6：不同温浴时间条件下，玉米根中羟基自由基的自旋共振谱图。

将发芽5天后的玉米幼苗根部浸泡在5mg/L Cd(NO₃)₂(购自：北京化学试剂公司)的水溶液中24小时后，分离幼苗的根、叶，分别用自来水和蒸馏水将根、叶洗净。称取3份新鲜植物根0.2-1.5g，剪碎放于玻璃组织研磨器中，分别加入0.5-1.5ml 10-100mM PBN的DMSO溶液，于冰浴中研磨均匀。

用上述三份样品研磨液分别按实施例5的步骤进行实验，不同的是本实施例所用的水浴温度控制为37℃，温育时间分别为4分钟(第一份样品)、15分钟(第二份样品)和20分钟(第三份样品)。三份样品研磨液的检测谱图见图6。

从图6中可见，温浴4分钟的样品谱图(图6a)中自由基峰较不明显，温浴15分钟(图6b)和20分钟(图6c)的样品谱图中出现比较明显的自由基峰，20分钟的峰高小于15分钟，说明过短和过长的温浴时间都会影响测定的灵敏度。因此，优选的温育时间为15分钟。

实施例7：不同离心转速条件下，玉米根中羟基自由基的自旋共振谱图。

将发芽5天后的玉米幼苗根部浸泡在5mg/L Cd(NO₃)₂(购自：北京化学试剂公司)的水溶液中24小时后，分离幼苗的根、叶，分别用自来水和蒸馏水将根、叶洗净。称取3份新鲜植物根0.2-1.5g，剪碎放于玻璃组织研磨器中，分别加入0.5-1.5ml 10-100mM PBN的DMSO溶液，于冰浴中研磨均匀。

将第一份样品研磨液转移至容积为1.5ml的离心管(购自：河北省沧县杜生强发医疗器械厂)中，于37℃水浴中温浴15分钟后，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，分别于0-4℃下2000g冷冻离心3-10分钟后，弃去上清液。再加入0.5-1.5ml PBN的DMSO溶液，振荡1-5分钟，于37℃水浴中温浴15分钟后，于0-4℃2000g冷冻离心3-10分钟。取上清液装入石英玻璃样品管(型号：1mm，购自：Bruker公司)，用电子自旋顺磁共振仪(型号：ESP 300，购自：Bruker公司)检测。检测谱图见图7a。

将第二份样品研磨液转移至容积为1.5ml的离心管(购自：河北省沧县杜生强发医疗器械厂)中，于37℃水浴中温浴15分钟后，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，于0-4℃下4500g冷冻离心3-10分钟后，弃去上清液。再加入0.5-1.5ml PBN的DMSO溶液，振荡1-5分钟，于37℃水浴中温浴15分钟后，于0-4℃，4500g冷冻离心3-10分钟。取上清液装入石英玻璃样品管(型号：1mm，购自：Bruker公司)，用电子自旋顺磁共振仪(型号：ESP 300，购自：Bruker公司)检测。检测谱图见图7b。

将第三份样品研磨液转移至容积为1.5ml的离心管(购自：河北省沧县杜生强发医疗器械厂)中，于37℃水浴中温浴15分钟后，然后将离心管置于冷冻离心机(型号：GL-8MS，购自：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)中，分别于0-4℃下6000g冷冻离心3-10分钟后，弃去上清液。再加入0.5-1.5ml PBN的DMSO溶液，振荡1-5分钟，于37℃水浴中温浴15分钟后，于0-4℃，6000g冷冻离心3-10分钟。取上清液装入石英玻璃样品管(型号：1mm，购自：Bruker公司)，用电子自旋顺磁共振仪(型号：ESP 300，购自：Bruker公司)检测。检测谱图见图7c。

从图7中可见，当离心转速为2000g时，谱图基线较差，自由基信号弱，影响测定灵敏度。增加离心转速，样品分离效果好，样品谱图中出现比较明显的自由基峰，说明过慢的离心转速会影响测定的灵敏度。因此，优选的离心转速为4500g。

实施例8：不同离心时间条件下，玉米根中羟基自由基的自旋共振谱图。

将发芽5天后的玉米幼苗根部浸泡在5mg/L Cd(NO₃)₂(购自：北京化学试剂公司)的水溶液中24小时后，分离幼苗的根、叶，分别用自来水和蒸馏水将根、叶洗净。称取3份新鲜植物根0.2-1.5g，剪碎放于玻璃组织研磨器中，加入0.5-1.5ml 10-100mM PBN的DMSO溶液，于冰浴中研磨均匀。

用上述三份样品研磨液分别按实施例7的步骤进行实验，不同的是本实施例所用的离心速度为4500g，离心时间分别为1分钟(第一份样品)、4分钟(第二份样品)和10分钟(第三份样品)。三份样品研磨液的检测谱图见图8。

从图8中可见，当离心时间1分钟时，谱图基线较差，自由基信号弱，影响测定灵敏度。增加离心转速，样品分离效果好，但离心10分钟时样品谱图中自由基峰较离心4分钟时低，说明过短或过长离心时间会影响测定的灵敏度。因此，优选的离心时间为3-10分钟，更优选的离心时间为4分钟。

应该理解，尽管示例性的实施方案已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (10)

1.一种植物体内羟基自由基的测定方法，选取二甲基亚砜及N-叔丁基-α-苯硝酮作羟基自由基捕获剂，经过一系列的捕获、提取后，用电子自旋顺磁共振测定植物体内自由基加合物浓度，所述测定方法包括如下步骤：

1)自由基捕获剂的配制：称取N-叔丁基-α-苯硝酮，在室温下溶解在二甲基亚砜中，配制成10-100mM的N-叔丁基-α-苯硝酮的二甲基亚砜溶液；

2)称取新鲜植物体组织0.2-1.5g，剪碎放于玻璃组织研磨器中，加入步骤1)中配制的0.5-1.5ml10-100mM N-叔丁基-α-苯硝酮的二甲基亚砜溶液，于冰浴中研磨1-5分钟至均匀；

3)将步骤2)所得研磨液转移至离心管中，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟，将离心管置于冷冻离心机中，于0-4℃下2000-6000g离心3-10分钟；和

4)将步骤3)所得的样品，取上清液装入石英玻璃样品管，用电子自旋顺磁共振仪检测。

2.一种植物体内羟基自由基的测定方法，选取二甲基亚砜及N-叔丁基-α-苯硝酮作羟基自由基捕获剂，经过一系列的捕获、提取后，用电子自旋顺磁共振测定植物体内自由基加合物浓度，所述测定方法包括如下步骤：

1)自由基捕获剂的配制：称取N-叔丁基-α-苯硝酮，在室温下溶解在二甲基亚砜中，配制成10-100mN4的N-叔丁基-α-苯硝酮的二甲基亚砜溶液；

2)称取新鲜植物体组织0.2-1.5g，剪碎放于玻璃组织研磨器中，加入步骤1)中配制的0.5-1.5ml10-100mM N-叔丁基-α-苯硝酮的二甲基亚砜溶液，于冰浴中研磨1-5分钟至均匀；

3)将步骤2)所得研磨液转移至离心管中，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟，将离心管置于冷冻离心机中，于0-4℃下2000-6000g离心3-10分钟后，弃去上清液；

4)将步骤3)所得的样品，再次加入0.5-1.5ml10-100mM N-叔丁基-α-苯硝酮的二甲基亚砜溶液，振荡1-5分钟后，于20-45℃水浴中温浴5-20分钟，将离心管置于冷冻离心仪中，于0-4℃下2000-6000g离心3-10分钟；和

5)将步骤4)所得的样品，取上清液装入石英玻璃样品管，用电子自旋顺磁共振仪检测。

3.根据权利要求1或2所述的植物体内羟基自由基的测定方法，其特征在于，所述的植物体组织为植物的根、茎、叶或其组合。

4.根据权利要求1或2所述的植物体内羟基自由基的测定方法，其特征在于，所述水浴的温浴温度为37℃。

5.根据权利要求4所述的植物体内羟基自由基的测定方法，其特征在于，在所述水浴中温浴15分钟。

6.根据权利要求1或2所述的植物体内羟基自由基的测定方法，其特征在于，在所述水浴中温浴15分钟。

7.根据权利要求1、2或5中任一项所述的植物体内羟基自由基的测定方法，其特征在于，所述离心的转速为4500g。

8.根据权利要求1、2或5中任一项所述的植物体内羟基自由基的测定方法，其特征在于，所述离心的时间为4分钟。

9.根据权利要求7所述的植物体内羟基自由基的测定方法，其特征在于，所述离心的时间为4分钟。

10.根据权利要求4所述的植物体内羟基自由基的测定方法，其特征在于，所述离心的时间为4分钟。

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