CN102292384A - 3d细胞培养制品及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种光学透明的多孔聚合物组合物，包含该组合物的制品，以及制备该组合物和将该组合物用于细胞培养的方法，所述使用方法包括例如调节或提高如本发明中所限定的细胞功能或基因表达。

Description

3D细胞培养制品及方法
要求在先提交的美国申请的权利的声明
本申请要求2008年11月24日提交的美国临时申请第61/117366号和2009年11月12日提交的美国临时申请第61/260456号的权利。所述在先文件的内容以及本文提及的任何出版物、专利或专利文件的完整内容均通过参考并入本文。
背景技术
本发明涉及细胞培养制品以及制备所述制品和在细胞培养中使用所述制品的方法。
发明内容
本发明提供了具有相互连接成网络的孔和间隙的高孔性三维(3D)组合物，以及包含所述组合物的制品，如具有高光学透明度的细胞培养制品，例如当存在或不存在培养基或细胞时涂布在基材上的细胞培养制品。本发明还提供了制备所述高孔性3D组合物及其制品的方法，以及细胞培养方法，包括例如调节细胞功能或基因表达，以及用所述制品监控细胞的培养。
附图说明
在本发明的实施方式中：
图1显示了具有互连孔和间隙结构的示例性多孔聚二甲氧基硅烷(PDMS)制品，所述结构用共焦显微镜在反射模式下拍到；
图2A显示了聚焦于表平面的多孔PDMS显微图；
图2B显示了在图2A所示多孔PDMS细胞培养制品中培养期间形成的HepG2球状体；
图3A显示了具有互连孔结构的多孔PDMS制品的示例性样品，所述结构用共焦显微镜在反射模式下拍到；
图3B显示了图3A所示样品在530微米深度掺杂Qdot后的双光子荧光图像；
图4显示了密堆积单模大孔成孔剂系综的示例性简图；
图5显示了密堆积双模大孔成孔剂和小孔成孔剂系综的示例性简图；
图6显示了培养肝细胞系HepG2 C3A 24小时后，细胞附着LDH检验评价的结果；
图7显示了在对比制品和本发明多孔制品(PDMS)中培养HepG2 7天后，细胞附着LDH检验的结果；
图8显示了在存在和不存在诱导剂的情况下，在对比胶原蛋白制品和本发明多孔制品(PDMS)中原代培养CYP3A4和CYP1A2人肝细胞后进行的LDH检验结果；
图9显示了用胶原蛋白作归一化标准，分析本发明组合物的人原代肝细胞基因表达结果；
图10比较了用各种培养表面培养之后，人肝细胞的存活数量；
图11A和11B显示了在具有多种孔径的多孔PDMS基板中用利福平诱导的人肝细胞的基因表达水平。
图12显示了在具有多种孔径和多种硬度(混合比)的多孔PDMS基板中培养的人肝细胞的选择性基因表达质量。
图13显示了所公开的多种多孔PDMS基板的测量模量(应力对应变)的关系。
图14显示了图13所示多孔PDMS基板的测量模量与基板硬度之间的曲线关系，其中基板硬度通过单体或低聚物材料与固化剂的混合比确定。
具体实施方式
下面详细描述本发明的各种实施方式，若有附图则结合附图描述。所提到的各种实施方式并未限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的范围限制。此外，本说明书中的例子不是限制性的，仅仅是从众多可能的实施方式中为要求专利权的本发明提供一些实施方式。
定义
“孔”是指，例如，在聚合物制品表面具有至少一个外部开口的固体聚合物的表面、本体或同时在其表面和本体中的空穴或空隙。
“间隙”是指，例如，固体聚合物本体内的空穴或空隙，但这种固体聚合物在聚合物制品表面上没有直接的外部开口，即不是孔，但可能有间接的外部开口或通道通向聚合物体的外表面，其方式是与相近或相邻的“孔”、“间隙”或其组合建立一种或多种联系或连接。
“孔网络”是指，例如，在根据本发明制造的过程中，从组合物中除去微粒材料之后，剩余制品的合并或总空隙空间，由孔和间隙构成。
“孔隙率”是指，例如，材料中孔和间隙的总间隙容积与该材料体的体积之比。
“连续空隙相”是指具有互连孔网络的制品，所述互连孔网络基本上没有“死端”，也不存在例如与其他间隙仅有单一连接的“此路不通”的情况，也没有“孤立空隙”，即无任何相互联系的间隙。半连续空隙相也是指具有互连孔网络的制品，但它可能有一些上述“死端”或“孤立空隙”，例如约1体积％-20体积％。若遇到或需要具有上述网络性质的半连续空隙相，则在选择成孔剂时，可考虑例如挥发性成孔剂，如扩散性气体或升华性固体，或者与聚合物相在光学上匹配或相似的透明空心颗粒。
本文所述“可重构粉末”是指这样一种粉末，当用液体处理时，它会产生具有所述多孔互连网络性质的团聚聚合物。
“光学密度”、“OD”或类似术语是指，例如，在存在或不存在培养基的情况下，本发明制品的多孔聚合物材料在给定波长下，在给定长度上的透光性的量度。
“保持率”是指置于培养表面上的细胞在一段时间后仍附着或保留在表面上的活细胞数目所占百分率。
“诱导剂”是指能引起细胞或有机体响应发育信号，加速酶或酶序列的生物合成的分子或类似试剂。
“检验”、“化验”或类似术语是指一种分析，其目的是确定例如细胞生长特性的存在、不存在、数量、程度、动力学、动态学或类型，或者对外源刺激的响应，如候选配体化合物、培养基、基板涂层或类似因素。
“附着”、“附连”、“粘合”、“粘附”、“粘连”、“固定”或类似术语一般是指通过例如物理吸附、化学键合和类似方法或其组合，将例如本发明的表面改性物质、增容剂、诱导剂、细胞、候选配体化合物和类似实体固定或安装在表面上。具体地，“细胞附着”、“细胞粘附”或类似术语是指使细胞与表面相互作用或者将细胞结合到表面上，例如通过用表面，如生物传感器表面[如康宁公司(Corning，Inc.)的Epic
Figure BPA00001407682500041
仪器或类似设备]或培养表面，培养细胞或与细胞相互作用。
“附着细胞”是指与基板外表面相连、固定在基板外表面上或者与基板外表面在一定程度上接触的细胞或细胞系或细胞体系，如原核或真核细胞。这类细胞经培养之后，能抵抗或经受住洗涤和交换基质的过程，这样的过程是许多基于细胞的分析的前提。“弱附着细胞”是指在细胞培养期间，与基板表面之间存在弱相互作用或弱连接或弱接触的细胞或细胞系或细胞体系，如原核或真核细胞。然而，这些类型的细胞，例如人胚肾(HEK)细胞，很容易在物理干扰如洗涤或基质交换作用下脱离基板表面。“悬浮细胞”是指在基质中培养时，优选不附着或粘附到基板表面上的细胞或细胞系。“细胞培养”或“对细胞的培养”是指使原核或真核细胞在受控条件下生长的过程。“细胞培养”可包括对源自多细胞真核生物的细胞，特别是动物细胞的培养，但也包括对复杂组织、器官、病原体或类似体系的培养。
“细胞”或类似术语是指被半透膜从外部包围的一小团原生质，通常是微量的原生质，它任选包括一个或多个核以及多个其他细胞器，能够独立地或者通过与其他类似物质相互作用来执行生命的所有基本功能，构成包括合成细胞构造、细胞模型体系和类似的人工细胞体系在内的能够独立发挥功能的生命物质的最小结构单位。
“细胞体系”或类似术语是指一种细胞集合，它可包括一种以上类型的细胞(或者单类细胞的分化形式)，这些细胞相互作用，从而执行生物、生理或病理生理功能。这样的细胞体系可包括例如器官、组织、干细胞、分化肝细胞以及类似的细胞体系。
本文可能会采用本领域的普通技术人员熟知的简写(例如用“h”或“hr”表示小时，用“g”或“gm”表示克，用“mL”表示毫升，用“rt”表示室温，用“nm”表示纳米，以及其他类似的简写)。
当用“重量百分数”、“重量％”、“基于重量的百分数”或类似术语描述例如一种组分时，除非另有明确说明，它们是指该组分的重量与包含该组分的组合物的总重之比，用百分数表示。
“包括”、“包含”或类似术语是指含有或者具有但不限于，它是开放的而不是封闭的。
在描述本发明的实施方式时，用来修饰例如组合物中某成分的数量、浓度、体积、处理温度、处理时间、产率、流速、压力和类似数值及其范围的“约”字，是指例如数值可能出现变化，这种变化源自例如制备化合物、组合物、浓缩物或应用制剂所采用的一般测量和处理程序，这些程序中不可避免的误差，实施相关方法时所用原料或成分的制备、来源或纯度上的差异，以及类似因素。术语“约”还包括例如组合物、制剂或细胞培养基因老化而与特定的初始浓度或混合物在量上不同，以及因混合或处理组合物或制剂而与特定的初始浓度或混合物在量上不同。无论是否受“约”字修饰，本文所附权利要求包括这些量的等效量。
实施方式中的“基本上由……组成”是指例如组合物、制备或使用组合物的方法、制剂，或者基板、细胞培养制品以及本发明中的类似制品、设备或装置的表面上的组合物，可包括权利要求中列出的组分或步骤，再加上对所述组合物、制品、装置以及制备和利用本发明的方法的基本新颖性质无实质影响的其他组分或步骤，如特定的反应物、特定的组分、特定的添加剂或成分、特定的试剂、特定的细胞或细胞系、特定的表面改性剂或条件、特定的候选配体或药物，或者选定的类似结构、材料或工艺变量。可能对本发明的组分或步骤的基本性质造成实质性影响，或者可能给本发明带来不利特性的项目包括例如细胞培养组合物或制品与液体培养基之间的光学不匹配，光学失配或不透明而又无法从组合物中基本上除去的夹带成孔剂颗粒，会对细胞培养组合物或制品造成生物、化学或光学污染的成孔剂颗粒，以及类似的因素和特性。
本文所用的不定冠词“一个”或“一种”以及对应的定冠词“该”是指至少一个或一种，或者一个或多个或者一种或多种，除非另有说明。
“任选的”、“任选地”或类似词语是指后面描述的事项或情况可能发生，有可能不发生，该描述包括所述事项或情况发生的情形和它们不发生的情形。例如，词汇“任选组分”是指该组分可能存在，也可能不存在，该描述包括含有该组分和不含该组分这样两个实施方式。
为组分、成分、添加剂、细胞类型、病原体和类似方面披露的具体的和优选的数值及其范围仅用于说明的目的；它们不排除其他限定值或者处于所限定的范围内的其他数值。本发明的组合物、装置和方法包括具有本文所述任何数值或任何数值组合、具体数值、更具体的数值以及优选数值的组合物、装置和方法。
本发明提供了非基于动物的细胞培养组合物、制品，如用于哺乳动物细胞及类似细胞，具有更近似于体内行为的细胞功能。例如，肝细胞体外培养在药物发现过程中可能是有用的(例如预测ADME Tox)，因为作为解毒过程的一部分，在细胞色素(CY)酶P450作用下，药物在肝脏里发生代谢后能转化为毒性更强的中间体并与其他化合物(例如药物)相互作用。然而，体内原代肝细胞会迅速失去功能，包括白蛋白的产生和CY P450的活性，这在很大程度上控制着细胞代谢药物分子的能力。因此，用这些细胞研究毒性和药物相互作用通常受到限制，所得信息较少。
在一些实施方式中，本发明提供了用于3D细胞培养、细胞检测或在3D培养中监控细胞的合成组合物。这种组合物为细胞提供了细胞培养环境，供其在活体外生长并发育自然功能；并且，这些细胞培养组合物经选择或设计后，可具有合适的光学性能，例如具有改进的细胞成像穿透深度，因而能帮助检测基板中细胞的活性。
在一些实施方式中，本发明的多孔聚合物制品适用于3D细胞培养，提供了下面的一种或多种特征，这些特征可单独或组合出现。培养的细胞可通过所述制品的互连孔结构自由迁移、交流或彼此接触。培养的细胞可在所述多孔制品的间隙或孔内长成具有特定精确尺寸的球状体。球状体的尺寸可通过限定基板中间隙或孔的分布来控制，而所述间隙或孔的分布通过审慎选择成孔剂材料来限定。在一些实施方式中，可制备具有两个(即双模)或多个(例如多模)粒径分布、包含孔网络间隙的多孔制品，以促进细胞间的交流，并促进营养物渗入和废物排出多孔制品内部网络的互连通道。可设计具有更大间隙和孔径的多孔制品，以容纳细胞或适应细胞生长；也可设计更小的间隙和孔径，以促进例如细胞交流、营养交换和废物交换。多孔制品是例如多孔固体或多孔凝胶，它们既容易与培养基结合，也容易从培养基分离，包括方便连续或半连续地交换培养基。若需要，可使制品的折射率与培养基的折射率相匹配或相接近，从而在将多孔制品浸入培养基时，使其近似透明。近似透明的制品能够例如增大穿透深度，便于对居于制品内部的细胞进行光学成像。在用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制备的本发明制品中，双光子荧光显微镜的成像穿透深度可达例如约100-1000微米，比起在基于聚乙烯醇(PVA)的多孔制品中的仅约90微米，要深约500微米。在一些实施方式中，即使对于诸如PVA这样光学性质不利的聚合物，本发明也提供了解决光学透明性问题的方案。
PDMS是具有高稳定性和生物相容性、适合细胞生长的材料。最近，康宁公司介绍了用于3D细胞培养的UltraWebTM表面(参见www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/UltraWeb_Ref erences.pdf)。UltraWebTM是由纳米纤维结构构成的合成膜。细胞在膜表面顶部分布和增殖。本发明提供了改进的3D细胞培养制品和方法，与基于具有UltraWebTM表面的细胞培养体系的体内3D细胞培养体系相比，其具有优越的性质。
本发明还涉及多孔细胞培养制品以及制备和使用所述制品的方法。所述细胞培养制品提供了三维环境(3D细胞培养)，具有有用的培养性质和对培养的细胞进行光学检测的性质。
在活体中，细胞通常在细胞外基质(ECM)支撑结构的帮助下沿三维生长。ECM包含例如蛋白质，如胶原蛋白、弹性蛋白和层粘连蛋白，它们不仅为细胞的3D生长提供机械支撑，而且使细胞在生长和发育功能的同时能够相互交流。细胞生物学家，特别是癌症研究人员，一直怀疑在陪替氏培养皿的平整表面上对细胞进行传统的单层或二维(2D)培养还不够精细，不能重现细胞充分发育其自然生物活性和功能所需的生长环境。对这种能近似地模拟体内细胞生长结构的3D细胞培养体系，人们数十年前就开始产生研究兴趣；然而，直到Bissell研究小组阐明[参见V.W.Weaver等，Journal of Cell Biology，V137(1)，p231-245，1997]***癌细胞在3D培养体系中发生的逆转，3D细胞培养体系才出现转机，因为这种逆转在2D培养体系中培养的细胞身上从未观察到。此后，3D细胞培养体系迅速成为传统单层细胞培养体系的重要替代体系。
研究人员常常用来自动物组织的生物材料，如胶原蛋白凝胶(参见H.K.Kleinman等，Biochemistry 27，p6188-6193，1982)和Matrigel
Figure BPA00001407682500081
(参见Bell，E.，Ivarsson等，Proc.Natl.Acad.Sci.，76，p.1274-1278，1979)，作为3D细胞培养的ECM。虽然实践证明这些材料可有效用于3D细胞培养，且适合在基质内数百微米的深度下给细胞成像，但提取动物组织存在以下缺点，包括例如：
不同批次的底物的组成不可控、不确定，因而难以比较不同来源的底物的培养结果；
基质中形成的细胞球状体的尺寸是随机的，给结果的定量带来困难；以及
基质的凝胶形式给对培养物的物理操作造成困难，例如，在培养过程中，要改变培养基而不干扰细胞培养物是具有挑战性的。因此，人们开发出多种基于合成材料的细胞培养底物，用来替代用于3D细胞培养的天然底物，但成功者有限。一些示例性例子包括：由合成聚合物构成的微米级或纳米级微纤维经证实可成功用于细胞培养[参见E.Entcheva等，Biomaterials，25(26)，P5753-5762，2004；C.E.Semino等，Difierentiation，71，p262-270，2003]，但细胞生长的深度有限，类似于二维细胞培养；孔径小于细胞直径的多孔聚合物材料支持表面上细胞球状体的形成，但它们同样提供有限的生长深度，类似于纳米级或微米级纤维基质；用合成材料如聚(乳酸)(PLA)和聚(乙醇酸)(PGA)制备的大孔基质[参见D.Barrera等，Copolymerization and degradationof poly(lactic-co-lysine)(聚(乳酸-赖氨酸)的共聚和降解)，Macromolecules，28，p425-432，1995；G.Vunjak-Novakovic等，Dynamic cell seeding ofpolymer scaffolds for cartilage tissue engineering(用于软骨组织设计的聚合物支架的动力学细胞接种)，Biotechnol.Prog.，14，p.193-202，1998]为细胞生长提供了一种结构，使其比在纤维基底物上长得更深。然而，这些材料是不透明的，即使是最先进的成像技术，如共焦荧光显微法和双光子荧光法，在底物中的成像深度也不超过数百微米。因此，理想的3D细胞培养体系应当提供合适的三维细胞外基质(ECM)或支架，支持细胞的三维生长，但同时应使后续检测培养基质中的细胞成为可能。现有的3D细胞培养体系大多注重为细胞的3D生长提供支持，而很少考虑后续在培养过程中对细胞的检测。本发明提供了一种3D细胞培养体系，不仅可用于细胞的生长或维持，而且方便在培养过程中检测、研究或监控细胞。
通过提供本发明的具有三维(3D)互连孔网络和高光学透明性的高孔性细胞培养组合物和制品，细胞培养能力受限的问题和监控细胞培养过程的能力受限的问题得到解决。
在一些实施方式中，本发明提供了制备三维多孔细胞培养制品的方法，所述方法包括：
使包含至少一种单体或低聚物(如二甲基硅氧烷预聚物或前体和硅氧烷预聚物)、固化剂、交联剂或类似催化剂以及至少一种微粒成孔剂的混合物发生聚合，形成具有微粒相的连续聚合物基质；以及
处理所得的固体基质，从基质中除去微粒相。
聚合物基质中的微粒相可以是，例如连续相、半连续相、不连续相或其组合。
在一些实施方式中，所述至少一种微粒成孔剂可以是，例如以下情形中的至少一种：
粒径约为75-1000微米的第一颗粒混合物；
粒径约为0.1-75微米的第二颗粒混合物；或者
它们的组合。
在一些实施方式中，成孔剂可包含例如具有单模粒径分布的相似或不同颗粒的混合物。根据尺寸分布性质，单模分布可提供具有大间隙、中等间隙或小间隙的颗粒相，或者它们的混合相，并在除去微粒相后提供相应的大表面孔、中等表面孔、小表面孔或其混合孔。图4显示了密堆积单模大孔成孔剂系综的示意图。
在一些实施方式中，成孔剂可包含例如具有例如双模粒径分布的颗粒混合物。每种模都以合适量存在的双模粒径分布可提供大间隙和小间隙相混合、大表面孔和小表面孔相混合或者它们相互组合的颗粒相。图5显示了具有大孔成孔剂和小孔成孔剂的密堆积双模系综的示意图。
在具有第一颗粒混合物和第二颗粒混合物的一些实施方式中，各混合物可独立选自例如单模颗粒、双模颗粒、单分散颗粒、双分散颗粒、多分散颗粒及其组合。在一些实施方式中，第一颗粒混合物和第二颗粒混合物可由相同物质或不同物质组成，但它们具有不同的粒径性质、粒径分布性质或其组合。一般地，随着成孔剂含量增加，孔隙率和孔径例如线性增加。
混合物的聚合可在合适的基板上完成。作为另外的或替代的情形，混合物的聚合可以例如预成形体的形式完成，它是具有多种有用形状的模塑形式，并任选附着或连接到例如基板、容器或类似支撑体上，也就是说，使包含至少一种单体或低聚物和至少一种成孔剂微粒材料的混合物在基板上发生聚合，以在基板上形成连续的聚合物基质和不连续的微粒相。
所述至少一种单体或低聚物的聚合包括例如形成至少一种单体或低聚物的连续聚合物相，所述至少一种单体或低聚物选自例如，硅氧烷、乙烯基取代的三烷氧基硅烷、α-烯烃、乙烯基酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、不饱和酮、单亚乙烯基芳烃以及类似的可聚合单体或低聚物，或者它们的组合。可聚合或共聚成本文所述制品的合适单体或低聚物的例子包括：单亚乙烯基芳烃(例如苯乙烯、芳烷基苯乙烯，如邻-、间-和对-甲基苯乙烯，2，4-二甲基苯乙烯，芳乙基苯乙烯，对-丁基苯乙烯，以及类似的单体或低聚物；还有α-烷基苯乙烯，如α-甲基苯乙烯、α-乙基苯乙烯、α-甲基-对甲基苯乙烯以及类似的单体或低聚物；乙烯基萘，以及类似的单体或低聚物)；芳基-卤代-单亚乙烯基芳烃(例如邻-、间-和对-氯苯乙烯，2，4-二溴苯乙烯，2-甲基-4-氯苯乙烯，以及类似的单体或低聚物)；丙烯腈、甲基丙烯腈、丙烯酸烷基酯(例如丙烯酸甲酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸乙基己酯，以及类似的单体或低聚物)，相应的甲基丙烯酸酯烷基酯、丙烯酰胺类(例如丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N-丁基丙烯酰胺，以及类似的单体或低聚物)；不饱和酮(例如乙烯基甲基酮、甲基异丙烯基酮，以及类似的单体或低聚物)；α-烯烃(例如乙烯、丙烯，以及类似的单体或低聚物)；乙烯基酯(例如乙酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯，以及类似的单体或低聚物)；乙烯基和亚乙烯基卤化物(例如乙烯基和亚乙烯基氯化物和溴化物，以及类似的单体或低聚物)；乙烯基取代的硅烷，如乙烯基取代的三烷氧基硅烷，以及类似的单体或低聚物，或者它们的组合。Hosoya等在“High-PerformancePolymer-Based Monolithic Capillary Column(基于高性能聚合物的整体毛细管柱)”，Anal.Chem.，2006，78(16)，5729-5735中提到用环氧化物单体三(2，3-环氧丙基)异氰脲酸酯(TEPIC)与二胺4-[(4-氨基环己基)甲基]环己胺(BACM)和手性反式-1，2-环己二胺(CHD)制备毛细管柱；Tsujioka等在“A New Preparation Method for Well-Controlled 3D Skeletal EpoxyResin-Based Polymer Monoliths(一种新的制备良好控制的3D骨架环氧树脂基聚合物整体件的方法)”，Macromolecules，2005，38(24)，9901-9903中提到用双酚A二环氧甘油醚(BADE)、(BACM)和致孔溶剂如聚乙二醇(PEG)制备3D整体件。
所述至少一种成孔剂可以是例如以下物质的颗粒：单糖、多糖、聚(亚烷基)二醇、聚乙烯醇、冰、蜡，升华性物质(如固体CO2)，熔点低于所形成的聚合物的物质，水溶性聚合物、非水溶性聚合物或其共聚物，具有壳芯的微囊(其中例如，壳包含单体或低聚物不溶材料，而芯包含可与水混溶的材料或水溶性材料)，具有可溶性壳和空心或充气芯的微球囊，或者它们的组合。
为从所得的聚合固体基质中除去微粒相而对基质进行的处理包括例如：
与一种物质接触，以溶解微粒相，其中所述物质包含以下物质中的至少一种：水性液体；有机液体；超临界流体，例如CO2；低熔点固体，例如蜡、水及类似低熔点固体；气体，例如空气、N2、氩气以及类似气体；或者它们的组合；
加热所述基质，使所述微粒相液化或溶解；
或者上述接触与加热组合起来。
除去微粒相后所得聚合物相的折射率可以例如等于或小于约1.49，如约1.2-1.49，包括所有中间值和中间范围，如1.2-1.4，1.2-1.35，1.25-1.4，1.3-1.49，1.3-1.4，1.35-1.49，1.35-1.4，以及类似的数值和范围。
在一些实施方式中，所述制备方法还可包括例如基于粒径系综(particle sizeensemble)选择成孔剂堆积密度，所述粒径系综包括将成为所得细胞培养制品中的连续聚合物基质的空隙容积和将成为所得细胞培养制品中的空隙容积的微粒成孔剂所占体积部分，所述空隙容积就是间隙容积与孔容积之和。
所述包含至少一种供聚合用的单体或低聚物和至少一种微粒成孔剂可通过例如以下至少一种方法制备：高速液-固混合、液-固掺混、液-固离心或其组合。
在一些实施方式中，本发明提供了三维细胞培养制品，其包括例如：
具有互连孔网络的聚合物体，所述互连孔网络包含由具有单孔径分布的孔或者具有双模分布的大孔和小孔及对应的间隙组成的孔。在一些实施方式中，所述制品的聚合物体可以是例如以下至少一种：珠子；可重构粉末；涂布制剂，例如多孔聚合物体的液体悬浮颗粒；厚20-500微米的薄膜、厚10000-100000微米的厚膜或者具有500-10000微米中间厚度的膜；或者它们的组合。
在一些实施方式中，本发明提供了通过上述方法制备的三维细胞培养制品，所述方法包括：
使包含至少一种单体或低聚物和至少一种微粒成孔剂的混合物发生聚合反应，形成具有独立微粒相的连续聚合物基质；以及
处理所得的固体基质，除去基质中的微粒相。
所述三维细胞培养制品可包含例如基板；以及支撑在基板上的具有互连孔网络的聚合物层，所述多孔聚合物层包含具有连续或半连续空隙相的连续聚合物基质。在一些实施方式中，所述细胞培养制品可以双连续材料为特征，即聚合物形成连续基质，而微空隙形成第二个连续相，虽然它是空的或开放的相。
在一些实施方式中，所述多孔聚合物制品的表面积可以是例如约0.1-20米2/克。
在一些实施方式中，所述多孔聚合物制品经汞或氮孔隙率测定法测得的孔隙率可以是，例如约50％-95％，包括中间值和中间范围；所述多孔聚合物制品在空气中的折射率可以是例如约1.28-1.49，包括中间值和中间范围；所述多孔聚合物制品的密度可以是例如约1-1000千克/米3，包括中间值和中间范围。
在一些实施方式中，聚二甲基硅氧烷多孔聚合物的折射率可以是例如约1.28-1.49，一般的水性细胞培养基的折射率可以是例如约1.33-1.36。在一些实施方式中，多孔聚合物的折射率和一般的水性细胞培养基的折射率可经适当选择，使它们的折射率相匹配或近似匹配，例如，其折射率之差小于约±0.2个单位，优选小于约±0.15，更优选小于约±0.12，甚至更优选小于约±0.10。所述多孔聚合物制品的光学密度可以是例如约0-1，光学穿透深度可以是例如约100-1000微米或更深。所述多孔聚合物制品可包含聚合物、共聚物或类似材料，其分子量约为500-500000道尔顿。
在一些实施方式中，所述制品还可包含至少一种选自下组的添加剂：营养剂、抗生素、生长刺激剂、生长抑制剂、表面改性剂、表面增容剂，以及类似的细胞培养组分，如一种或多种促进剂、抑制剂、调节剂、缓和剂、诱导剂，或者它们的组合。
在一些实施方式中，本发明提供了一种细胞培养方法，其包括例如：使上述细胞培养物接触一种制品以及合适的培养基和培养条件，所述制品包含基板和支撑在基板上、具有互连孔网络的聚合物层，所述多孔聚合物层包含具有连续或半连续空隙相的连续聚合物基质，所述培养条件是例如温度控制、培养基交换和活细胞。
与工业标准胶原蛋白表面提供的保留率相比，所述细胞培养提供的保留率约为70％-100％。
在一些实施方式中，合适的细胞系的一个例子是人原代细胞。在一些实施方式中，所述培养制品提供了优异的细胞系性能、细胞功能、细胞活力、细胞基因表达和类似性质，或者它们的组合。
为开发有助于细胞培养和细胞检测的3D细胞培养基板，基础材料的光学性质宜与后续用来监控培养物中的细胞所需的检测或成像技术相匹配。在本发明的一些实施方式中，可用荧光显微镜监控培养物中的细胞。为配制所述细胞培养物，应当考虑基础材料的以下光学性质：在工作波长范围内具有良好的光学透明性，以避免光学检测过程中来自培养物的光学干扰；其折射率与细胞培养基的折射率高度匹配，以减少检测过程中来自材料的光学散射。除制品所用多孔材料的光学性质外，所选多孔材料的化学性质在培养条件下应非常稳定，使得细胞在培养过程中的生长不会受到制品变化的影响。在一些实施方式中，多孔材料优选具有良好的透气性和渗水性，以利于细胞的生长。
在一些实施方式中，可通过例如强制填充和浸提法将基础聚合物材料形成为具有互连孔或间隙的高孔性结构。在强制填充法中，将具有所需尺寸的填充剂或成孔剂与基础聚合物材料均匀混合，然后利用重力或压力强制填充剂彼此紧密接触，并与单体或低聚物、预聚物或类似前体紧密堆积在一起，得到聚合或固化的基础聚合物材料。可通过例如在超声浴中用合适的选择性溶剂浸出或溶解，对所得到的与填充剂堆积在一起的基础聚合物材料进行处理，以除去填充剂。多孔基板的孔径分布可通过填充剂的尺寸来控制，该孔径分布可以是单尺寸分布或一种以上的尺寸分布，具体取决于所需的培养应用。除考虑尺寸外，所用填充剂还应具有最小的毒性或者对细胞培养的生理条件干扰最少，使得未浸出而残留在多孔基板中的任何残余填充剂不会对细胞生长带来负面影响。
具有所需粒径和尺寸分布的成孔剂颗粒可通过任何合适的方法获得，包括例如粒径缩减法、粒径增大法或其组合。粒径缩减装置可用于干固体颗粒或者悬浮于载液中的颗粒。一种基于液体、使用高压液流的粒径缩减装置是例如Microfluidizer
Figure BPA00001407682500141
，或者如题为“粒径缩减装置及其使用”的专利申请WO/2006/064203所述的改进过增强器的类似装置，或者可以使用类似的分级装置通过尺寸缩减制得所需的颗粒。
粒径增大方法可包括例如乳化或悬浮聚合法，或者类似的粒径增大方法。可利用例如分级器、过滤器、网筛或类似装置，根据颗粒的尺寸或直径范围分离尺寸减小的颗粒或尺寸增加的颗粒。
所需粒径和尺寸分布可通过任何合适的颗粒分析装置和方法进行测量和表征，如霍力巴公司(Horiba)(www.horiba.com)提供的装置和方法，包括例如激光衍射法、动态光散射法、图像分析法，或者类似的分级装置和方法。霍力巴LB-550可测量约1纳米至约6微米的粒径，可测浓度范围为ppm级至约40％的固体。霍力巴LA-300激光衍射粒径分布分析仪可用来测量悬浮体或干粉的粒径。
培养制品的制造以及附属组分如基板和包装材料的获取优选在无菌条件下完成。
在一些实施方式中，本发明提供了非动物来源的细胞培养涂料及相应的涂布基板，所述涂布基板提供了类似于体内的细胞培养环境。
在一些实施方式中，所述多孔涂料和制品很容易制备，且较为廉价。所述涂料提供了非动物来源的基板涂层，所得涂布产品例如很少有或者没有不同批次之间的差异，并具有优异的可贮存性以及贮存稳定性或生物稳定性。在一些实施方式中，所述多孔聚合物涂料可提供基板表面涂层，其具有很容易通过例如选择聚合物涂料中所用单体或低聚物来调节的折射率。所述涂料组合物可提供无毒且生物相容的基板表面涂层。所述涂料组合物可提供很好处理的基板表面涂料，如容易沉积到各种表面上，并且提高了涂料和细胞附着到各种基板上的能力，所述基板有例如塑料、玻璃和类似的细胞培养基板或载体。若需要，可选用粘结层或转化涂层，如氨基硅烷，以促进多孔聚合物附着到基板如玻璃上。
在一些实施方式中，本发明提供了一种培养细胞的方法，其包括：
提供涂布了上述多孔组合物或类似组合物的基板；
使所述涂布基板与细胞培养物接触足够长的时间，建立功能细胞；
通过光学方法监控细胞；以及
任选从基板回收细胞。
在一些实施方式中，所述基板可以是例如选自金属氧化物、混合金属氧化物、合成聚合物、天然聚合物、类似材料或其组合。在一些实施方式中，本发明的多孔细胞培养制品可进一步通过例如表面处理或调理进行加工，获得具有更好的生物相容性的制品，参见例如共同拥有的美国专利第6617152号和同时待决的美国专利申请第11/973832号。
细胞培养物中的细胞可以是例如任何类型细胞如肝细胞的任何合适的原代细胞或者相关永生细胞系。所述细胞培养物可包括例如可活跃地产生白蛋白、抗体或类似实体及其组合的细胞。从基板中回收细胞可通过任何合适的方法完成，例如离心、搅拌、洗涤和类似方法，或者它们的组合。
在一些实施方式中，可选用各种生物相容性聚合物材料制备多孔组合物。作为另外的或替代的情形，生物相容性聚合物材料可单独使用、组合使用，或者与其他细胞培养材料或载体材料混合使用。聚合物材料可包括，例如聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃、聚(亚烷基)二醇、聚(亚烷基)氧化物、聚对苯二甲酸亚烷基酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯基卤化物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物，硝基纤维素，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、纤维素醋酸酯、纤维素丙酸酯、纤维素醋酸酯丁酸酯、纤维素醋酸酯邻苯二甲酸酯、羧乙基纤维素、纤维素三醋酸酯、纤维素硫酸钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯基酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(异丙基丙烯酸酯)[poly(isopropacrylate)]、聚(异丁基丙烯酸酯)[poly(isobutacrylate)]、聚(十八烷基丙烯酸酯)[poly(octadecacrylate)]、聚乙烯、聚丙烯聚(乙二醇)、聚(氧化乙烯)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚(乙烯基醇)、聚(醋酸乙烯酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚透明质酸、酪蛋白、明胶、谷蛋白、聚酸酐、聚丙烯酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖，以及它们的任何共聚物或其任何组合。
细胞的生理功能会受细胞培养环境的极大影响。在能最好地维持细胞的具体功能的环境里培养细胞是有益的。相比于平整表面上的传统二维(2D)细胞培养，在各种基质如Matrigel
Figure BPA00001407682500161
中进行的三维(3D)细胞培养，在维持细胞功能方面明确显示出其实用性，因为它与体内细胞环境非常相似。人们已经认识到，孔径和基质硬度是3D细胞培养体系中调节细胞形貌和功能的两个关键因素[参见例如，C.S.Ranucci等，Biomaterials 21(2000)783-793；M.H.Zaman等，Proc Nati Acad Sci USA 103(29)2006，10889-94；T.Sun等，“Investigation of fibroblast and keratinocyte cell-scaffold interactions using anovel 3D cell culture system(使用新的3D细胞培养体系研究纤维原细胞和角化细胞-支架相互作用)”，Journal of Materials Science：Materials inMedicine，18(2)，2007，pp.321-328]。然而，在这些培养体系中精确控制和调整孔径并非易事。
在一些实施方式中，本发明提供了控制和调整3D细胞培养基板的孔径和硬度，以调节特定细胞的细胞功能的组合物和方法。
在一些实施方式中，本发明提供了制备多孔合成材料基板的设计和方法，所述多孔合成材料基板能调节3D细胞培养物中的细胞功能。除了为细胞在活体外形成和发育其生物功能提供类似于体内的环境外，对这些多孔基板的孔径和硬度的控制和调整也可用于调节细胞功能，这可满足基于细胞的丰富应用的各种需要。例如，对某些药物试剂的诱导测试要求目标基因的基础表达水平较低，而对药物试剂的抑制测试要求目标基因的基础表达水平较高。通过调节基板的孔径和硬度性质来调整基因表达水平的能力提供了有用的平台，可用于比较这些结果，同时对其他培养条件干扰最少。
在一些实施方式中，本发明提供了具有诸如多孔支架的孔径和硬度这样的性质的材料，所述性质可调节，以便为不同细胞系提供优化的培养性能；本发明还提供了控制所述多孔支架的孔径和硬度的方法，可用以调节细胞生长和形貌；所述支架可在基因表达水平上选择性调节细胞功能。
所述多孔聚合物基板可为3D细胞培养提供以下特征：
孔径控制  孔径很容易控制和调整，这为细胞-细胞相互作用和组织提供了受到良好控制的物理调节。
细胞有序化  在细胞培养期间，细胞的组织和相互作用影响着细胞生长和细胞功能发育，因此，细胞功能可通过调整孔径来调节。
细胞调节  通过控制孔径来调节细胞功能对细胞生理环境带来的干扰最少。具有相同来源的细胞可通过不同基板孔径性质调节功能，可提供用于比较的样板。例如，在孔较小的所述多孔PDMS基板中培养人肝细胞时，人肝细胞表现出中等水平的CYP(细胞色素P450)基因，如CYP 1A2、CYP 2B6和CYP 3A4，但对利福平(USAN)或利福霉素(INN)诱导的药物响应较强，这非常适合通过候选药物对细胞功能进行诱导研究。在孔较大的多孔PDMS中培养人肝细胞时，人肝细胞表现出较高水平的CYP基因，这种情况对于通过候选药物对细胞功能进行抑制研究是很理想的。
基板调整和基因调节  硬度可用例如杨氏模量度量，对于本文所述多孔基板来说可精确控制和调整。通过调整基板硬度，可在基因表达水平上选择性调节细胞功能。细胞功能的调节可以是细胞特异性的。由于孔径和硬度易于调整，所述基板提供了具有高度适应性的多功能3D细胞培养平台。杨氏模量是度量聚合物材料硬度的一种物理量。模量越高，材料越硬。这可通过实验确定，即对材料样品进行拉伸测试，产生应力-应变曲线，从曲线斜率即可得到。应力-应变曲线描述了材料伸长率(应变)与施加在材料上的力(应力)之间的变化关系，直至材料失效(例如断裂)；参见图13。若斜率大，则表明样品具有高拉伸模量，也就是说材料抗变形，具有高硬度。若斜率不大，则表明材料具有低拉伸模量，也就是说材料容易变形，具有低硬度。模量可用强度单位表达，如帕或牛/厘米2。研究表明，活细胞的基因表达水平随多孔聚合物层的杨氏模量硬度升高。在一些实施方式中，多孔聚合物层的杨氏模量可用是例如约0.1-15兆帕，包括中间值和中间范围。
细胞功能可受细胞培养环境的极大影响。在设计良好的细胞培养体系中，细胞可保持其特异性细胞功能。此外，通过调整细胞与培养环境的物理相互作用，可调节细胞功能。
在一些实施方式中，本发明提供了通过调整多孔培养基板的孔径和模量(硬度)来调节3D细胞培养物中的细胞功能的方法。
在一些实施方式中，大部分孔的孔径可比单个细胞大。因此，细胞主要在孔内接种(seed)、迁移、增殖和组织化。基板孔径分布对细胞-细胞和细胞-基质相互作用构成物理约束，可显著影响细胞功能。所述多孔PDMS具有微孔结构，使细胞可进入孔内生长，并加强细胞-细胞相互作用。得到了原代人肝细胞在不同孔径的基板上形成球状体的光学图像(未示出彩色图像)。该图像显示，当多孔PDMS的孔径范围从180-212微米增大到300-355微米时，通常在单个孔内形成单个球状体，且球状体尺寸随孔径增大而增大；而从500-600微米、850-1000微米和1000-1400微米时，不是在单个孔内形成更大的球状体，而是形成多个更小的球状体。在孔径超过1000微米的基板中，观察到的球状体更少，细胞倾向于形成细胞-细胞附着较松的团聚体。
在具有多种孔径(柱形图未示出)的所述多孔PDMS中培养人肝细胞，并以胶原蛋白和Matrigel
Figure BPA00001407682500181
作为对照，对基因ABCB1[ATP-结合盒(bindingcassette)，亚家族B(MDR/TAP)，成员1]、ABCC2[ATP-结合盒(bindingcassette)，亚家族C(CFTR/MRP)，成员2]、ALB(白蛋白)、CEBPA[CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)，α]、GJB1(间隙连接蛋白，β1)、HNF4A(肝细胞核因子4，α)和UGT1(UDP葡萄糖醛酸转移酶1)做基础基因表达实验，结果总是表明，所有10种基因标记都通过实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)得到阳性表达。这些基因是一组标记基因，用来测量与作为工业标准的胶原蛋白表面和Matrigel相比，肝细胞的功能在上述基板中保持得如何。所有10种标记基因的表达水平比在胶原蛋白表面上高，说明多孔PDMS比胶原蛋白能更好地保持肝细胞的功能。更重要的是，这些基因的表达水平与在Matrigel
Figure BPA00001407682500191
上相当，Matrigel
Figure BPA00001407682500192
是一种用于保持肝细胞功能的领先的商业基板。在附图中，y轴上的“RQ”表示“相对定量结果”，用具体基因标记的基因表达水平除以管家基因次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)的表达水平。
实施例
以下实施例用于更充分地描述利用本发明的方式，并进一步阐述为实施本发明的各个方面所设想的最佳实施方式的具体例子。这些例子不限制本发明的范围，是为说明的目的而提供的。
制备多井板形式的细胞培养基板的方法。
在标准孔板式多井玻璃***组件上，可如下所述直接形成具有本发明的多孔PDMS的多个单元。
a.在支撑基板如多井孔板上直接形成多孔聚合物单元。
将选定的单体或低聚物、任选的交联剂以及具有例如单粒径分布、双粒径分布或多粒径分布的成孔剂颗粒混合成均匀混合物。
通过离心、摇晃、加压或类似方法恰当堆积成孔剂。
在支撑基板，如厚度小于约500微米的玻璃板顶部放置所需多单元形式的模具，如多井孔板。
将与成孔剂堆积在一起的单体或低聚物的均匀混合物倒入空模具里。
在规定的固化条件下固化模具里的均匀混合物。
用物理方法从模具中移出固化的混合物。
从固化的混合物中除去成孔剂。
将支撑基板附着到多孔板上，例如用合适的粘合剂或者物理固持件。
b.在多井板底部直接形成多孔聚合物。
将选定单体或低聚物和交联剂的混合物分配到多井板的每个井中。
将成孔剂分配到每个井中，将多井板摇晃约30分钟。
继续将成孔剂分配到每个井中并摇晃，直到单体或低聚物混合物中的成孔剂达到饱和，如再摇晃30分钟后，单体或低聚物与成孔剂混合物的表面上留有一层成孔剂。
在规定的固化条件下使聚合物和成孔剂的混合物固化。
固化之后，利用恰当的浸提条件除去成孔剂。
c.预形成多孔聚合物，然后将其分布到多井板的每个井中。
在容器中混合选定的单体或低聚物、交联剂和具有一个或两个粒径分布(即单模或双模)的成孔剂。
堆积成孔剂和聚合物前体。
固化混合物，使聚合物交联。
从固化的聚合物中浸出成孔剂。
将所得多孔聚合物切成所需形状和尺寸，将该片聚合物放到井板底部。
施加紧固剂，如一种***粘合剂，将多孔聚合物样品固定在板的底部。
对多孔聚合物(PDMS)中肝细胞培养的评价
肝细胞系C3A在多孔聚合物中的附着或活力研究。通过细胞溶解释放乳酸脱氢酶(LDH)，它是一种稳定的胞质酶。LDH的释放量与溶解的细胞数量成正比。利用CytoTox 96细胞毒性分析盒[普洛麦格公司(Promega)]对活细胞数量进行定量测定，由此评价C3A细胞在多孔聚合物基板中的附着情况。用胶原蛋白细胞培养板和MatriGel3D培养材料作为对照标准。
图6显示了肝细胞系C3A在多孔PDMS聚合物基板上培养24小时后，用LDH分析法评价细胞附着情况的结果。培养7天后进行LDH分析，观察到类似的结果，如图7所示。根据LDH分析结果不难得出，肝细胞3A4细胞系可在所述多孔聚合物基板中培养，这些细胞的附着情况与胶原蛋白标准相当。
人原代肝细胞的附着或活力研究
图8显示了在作比较的胶原蛋白和本发明的多孔聚合物(PDMS)中，在含诱导剂和不含诱导剂的情况下，对人原代肝细胞培养物进行LDH分析的结果。所述诱导剂是最终浓度为10微摩尔的利福平。
用胶原蛋白作归一化标准，在多孔PDMS中培养的人原代肝细胞的基因表达分析
维持对功能稳定的原代人肝细胞的长期培养，是开发新药的药物代谢研究中的主要目标。各种基因标记的基因表达是评价相应细胞功能的可靠途径。在所述分析中，用定量实时PCR识别mRNA水平的基因表达。表1列出的10种基因标记是根据它们在肝细胞特异性功能中的作用选择的。
表1
Figure BPA00001407682500211
图9显示了以胶原蛋白作为归一化标准，人原代肝细胞在所述组合物中的基因表达分析结果。图9所示结果表明，在本发明的多孔PDMS中培养的人原代肝细胞表达了用来表达肝细胞的全部10种基因标记，测量结果用表达数据的log10(相对量)表示：ABCB1(900)，ABCB2(905)，ALB(910)，CEBPA(915)，1A2(920)，2B6(925)，34A(930)，GJB1(935)，HNF4a(940)，以及UGT1(945)。
实施例1
培养基的制备  用聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为基础材料，说明制备和使用所述培养基的各个方面。用购自道康宁公司的Sylgard-182 PDMS弹性体套装材料制备PDMS相关材料。将Sylgard-182A/Sylgard-182B混合物(重量比9∶1)以1∶3或稍高于所需尺寸分布的体积比与糖晶体混合。具有所需尺寸分布的糖晶体是通过用不同尺寸的筛子筛分市售粒状糖(蔗糖)得到的，然后放入离心机，以2400rpm的速度离心1小时，将糖晶体紧密堆积在PDMS预聚物中，然后真空脱气，再在75℃固化约3小时。在热超声浴中，在约40-70℃的温度下，用去离子水处理约8小时，将糖晶体从固化的PDMS聚合物基质中浸出。用去离子水洗涤浸出的基质，然后在无菌环境中，在真空下干燥约24小时。用显微镜检测所得多孔PDMS材料，发现它具有互连孔结构和高光学透明性。多孔PDMS材料容易用例如剪刀、激光、冲床等设备和方法切割成适合细胞培养目的的所需尺寸和厚度。
光学图像分析  参见附图，图1显示了用共焦显微镜在反射模式下成像的具有互连孔结构的示例性多孔PDMS制品。
图2A突出了肝细胞球状体在本发明的多孔PDMS基板中的形成。放大(20倍)的表面图像显示，在多孔PDMS外表面上有一个直径约为150-180微米的开口(位于左上部，很清晰)，还有一些散开的单个肝细胞。培养的HepG2球状体在表面下和制品间隙内形成(比较模糊)。
图2B显示了在图2A所示多孔PDMS细胞培养制品内培养时形成的HepG2球状体，此时放大(20倍)焦距已从制品表面转移到制品内部，以突出清晰的HepG2球状体。
比较例1
聚乙烯醇(PVA)基板  重复实施例1，区别在于使用购买的多孔PVA基板。多孔PVA基板，如高孔隙率PVA海绵，可购自例如凯巴技术公司(Ceibatech)(www.ceibatech.com)，并且在美国专利第5554659号中有介绍。多孔PVA基板的双光子荧光显微镜图像仅获得了约90微米的穿透深度。
实施例2
Hep G2细胞培养  将C3A细胞系(具有少于或等于10x通道)中的活肝细胞置于多孔PDMS表面以及作为对照的市售胶原蛋白和Matrigel
Figure BPA00001407682500231
预涂表面上含10％FBS和1％青霉素的DMEM基质里。接种密度约为100k个细胞/井。培养物在37℃培育24小时，以实现附着。24小时、3天和7天后更换培养基。实验表明，实施例1中的多孔PDMS涂布基板适用于肝细胞球状体的3D培养。
图3A显示了具有互连孔结构的多孔PDMS制品的示例性样品，它用共焦显微镜以反射模式成像，按照实施例1制备。
图3B显示了图3A所示样品在530微米深度掺杂了Qdot后的双光子荧光图像。此样品和图像表明，本发明的多孔PDMS基板提供了更深的成像穿透深度。利用双光子荧光显微镜对多孔PDMS样品成像，该样品掺杂了5微克/毫升Qdot荧光纳米晶体[可购自因维特罗津公司(Invitrogen)，参见www.invitrogen.com]，该晶体在460纳米处发射荧光。如图3B所示，在基板内530纳米深度检测到良好的光学信号。
图3A显示，在多孔PDMS基板表面上具有孔口(很清晰)，在表面下方，即基板内形成肝细胞球状体(比较模糊)。在图3B中，焦点从基板表面向下移至基板内部，以聚焦在球状体上。图3A和3B所示图像表明，HepG2细胞能够在PDMS基板的互连孔结构内接种和迁移，形成细胞球状体，再现HepG2的体内行为。
实施例3
原代肝细胞培养  将购自科西诺技术有限公司(XenoTech，LLC)的低温保存原代肝细胞解冻，并用Percoll分离工具箱(科西诺技术有限公司)提纯。将活细胞置于多孔PDMS表面以及作为对照的胶原蛋白和Matrigel预涂表面上含MFE培养基(康宁公司)的10％FBS中。接种密度约为400k个细胞/井。培养物在37℃培育18小时，以实现附着。在余下的培养时间里，将培养基换成不含血清的MFE培养基。连续3天用利福平诱导CYP3A4代谢活动，每天更换培养基。用睾酮(200微摩尔)培育3小时后，每份表面培养物中的CYP3A4代谢活性用HPLC法测评，或者用普洛麦格公司的P450TM工具箱测量。用普洛麦格公司的CytoTox 96非放射性细胞毒性LDH分析工具箱估测培养物中的细胞数量。
图10比较了培养7天后，通过光学密度测定的多种培养表面上活人肝细胞的数量：胶原蛋白(2D)(1010)、Matrigel
Figure BPA00001407682500242
(3D)(1020)、单层PDMS(2D)(1030)和本发明的多孔PDMS(3D)(1040)。本发明的多孔PDMS(3D)(1040)可与胶原蛋白(2D)(1010)和Matrigel
Figure BPA00001407682500243
(3D)(1020)相比，特别可与单层PDMS(2D)(1030)相比。
实施例4
根据本发明制备了孔径在180-1400微米范围内的多孔PDMS基板，用以证实孔径可调节肝细胞在细胞组织和RNA表达中的功能。PDMS预聚物和固化剂按10∶1的混合比形成混合物，然后与具有精确尺寸分布范围如约75-1400微米的糖晶体紧密堆积，再在100℃固化约1小时。若延长固化时间，可采用较低固化温度。用水溶解固化后的聚合物中的糖，并在超声浴中将其洗出，形成用于3D细胞培养的多孔PDMS基板。
对原代人肝细胞进行接种，并在这些孔径受控的多孔PDMS基板中培养。对肝细胞形貌的时程研究表明，多孔基板的孔径调节培养物中肝细胞球状体的形成。在孔径较小的多孔基板中，肝细胞倾向于在每个单孔中形成一个球状体，且球状体尺寸随孔径增大。在大于约355微米的孔中，每个孔中倾向于形成多个较小的球状体，而不是形成一个大球状体。除调节球状体在多孔基板中的形成外，实时聚合酶链反应(PCR)结果(图11)表明，CYP2B6基因和CYP3A4基因的表达水平与球状体的形成趋势相呼应，具体说来，当基板孔径从180微米增加到355微米时，这两种基因的表达水平下降。当孔径大于355微米时，基因表达水平随孔径增加。此外，在180-1400微米的孔径范围内，利福平对基因表达的诱导倍数(图12)随孔径减弱。图11A和11B显示了在具有多种孔径的多孔PDMS基板中，受利福平诱导的人肝细胞的基因表达水平。图11A显示了CYP2B6基因的表达，图11B显示了CYP3A4基因的表达，其中曲线(1110)、(1120)和(1130)分别代表基础、诱导和倍数诱导的情况。
至少从前述结果可以总结出：1)多孔3D细胞培养基板的孔径可有选择地调节一些基因的表达水平，同时维持其他基因的表达水平；2)基板孔径还可调节细胞对药物的响应，反映在诱导倍数[即存在诱导剂(药物)时的基因表达水平除以基础表达水平(无诱导剂)]的差异上；3)孔径小于约355微米的多孔基板促进了对药物的高诱导响应，这可用于多种化学试剂对细胞的诱导上；以及4)孔径大于约355微米的多孔基板有选择地提高了一些基因的表达，这可有效用于对细胞-药物相互作用的抑制检验。
实施例5
通过调整多孔基板的硬度(模量)来调节细胞功能  PDMS的剪切模量随制备条件变化，但通常在100千帕至3兆帕的范围内。PDMS的硬度(模量)随预聚物与固化剂的混合比减小。按照实施例4中的程序，用混合比为5重量％、10重量％、20重量％和30重量％的预聚物/固化剂混合物制备多孔PDMS基板。对人原代肝细胞进行接种并培养7天。图12显示了在多孔PDMS里培养的人肝细胞中以下基因的表达：CYP1A2(1220)、CYP2B6(1210)和CYP3A4(1230)，其中所述多孔PDMS的孔径约为180-212微米，并基于预聚物与固化剂的混合比而具有不同的硬度。PDMS的硬度随PDMS预聚物基料与固化剂的混合比的增加而增大。对基板硬度进行评价并示于图12，用混合比表征为例如5∶1，10∶1，20∶1和30∶1。图12中细胞的实时PCR结果表明，CYP2B和CYP34A的基因表达水平随PDMS预聚物与固化剂的混合比的增加而下降，即基因表达水平随多孔基板的硬度增大。
图13显示了测得的多孔PDMS基板的模量(应力-应变)关系，所述基板在预聚物(单体或低聚物)与固化剂的多种混合比下制备：5∶1(1310)；10∶1(1320)；20∶1(1330)和30∶1(1340)。图14显示了如图13所示测得的多孔PDMS基板的模量与混合比的关系曲线。
上面已经结合多种具体的实施方式和技术描述了本发明。不过应当理解，在本发明的精神和范围内，可作出许多变化和改进。

Claims (20)

1.一种制备三维多孔细胞培养制品的方法，所述方法包括：
使包含至少一种单体、低聚物或其混合物以及至少一种微粒成孔剂的混合物发生聚合，形成具有密堆积微粒相的连续聚合物基质；以及
处理所得的固体基质，从基质中除去密堆积微粒相。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种微粒成孔剂包括以下物质中的至少一种：
粒径约为75-1000微米的第一颗粒混合物；
粒径约为0.1-75微米的第二颗粒混合物；
或者它们的组合。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一微粒混合物和所述第二微粒混合物各自独立地选自单模颗粒、双模颗粒、单分散颗粒、双分散颗粒、多分散颗粒或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物的聚合在基板上完成，所得的三维多孔细胞培养制品基本上是光学透明的。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种单体或低聚物的聚合包括由选自下组的至少一种单体或低聚物形成连续聚合物相：硅氧烷、乙烯基取代的三烷氧基硅烷、α-烯烃、乙烯基酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、不饱和酮、单亚乙烯基芳烃或其组合。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种成孔剂选自以下物质的颗粒：糖、多糖、聚亚烷基二醇、聚乙烯醇、冰、蜡，熔点低于所形成的聚合物的物质、水溶性聚合物、非水溶性聚合物、非水溶性单体或低聚物与水溶性单体或低聚物的共聚物、具有壳和芯的微囊、具有壳和空芯的微球囊或者它们的组合。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，为从所得的聚合固体基质中除去微粒相而对基质进行的处理包括以下至少一种操作：
与一种物质接触，以溶解微粒相，其中所述物质包含以下物质中的至少一种：水性液体、有机液体、超临界流体、低熔点固体、气体或者它们的组合；
加热所述基质，使所述微粒相液化；
声波处理；
或者它们的组合。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，除去微粒相后所得的聚合物相的折射率约为1.2-1.45。
9.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括基于粒径系综选择成孔剂堆积密度，所述粒径系综包括被可聚合单体、低聚物或其混合物填充，将成为所得的细胞培养制品中的连续聚合物基质的空隙容积，还包括被微粒成孔剂占据、将成为空隙容积的体积部分。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包含用于聚合的至少一种单体或低聚物和至少一种微粒成孔剂的混合物通过以下至少一种方法制备：高速液体混合、掺混、离心或其组合。
11.一种三维细胞培养制品，其包含：
具有互连孔网络的聚合物体，所述互连孔网络包含由下述孔或间隙组成的孔：具有单模孔径分布的孔及其对应间隙、具有双模孔径分布的大孔和小孔及对应的间隙、或者它们的组合；所述制品基本上是光学透明的。
12.如权利要求11所述的制品，其特征在于，所述聚合物体包含以下至少一种：珠子；可重构的粉末；涂布制剂；厚约20-500微米的薄膜；多孔整体件；或者它们的组合。
13.一种用权利要求1所述方法制备的三维细胞培养制品，其包含：
基板；以及
支撑在基板上的具有互连孔网络的聚合物层，
所述多孔聚合物层包含具有连续或半连续空隙相的连续聚合物基质。
14.如权利要求13所述的制品，其特征在于，所述多孔聚合物的表面积约为1-20米2/克。
15.如权利要求13所述的制品，其特征在于，所述多孔聚合物经汞孔隙率测定法测得的孔隙率约为50％-95％，在空气中的折射率约为1.28-1.45，密度约为0.5-1.5千克/米3，分子量约为500-500000道尔顿。
16.如权利要求13所述的制品，其特征在于，所述多孔聚合物的光学密度约为0-1，光学穿透深度约为10-1000微米。
17.如权利要求13所述的制品，它还包含选自下组的至少一种添加剂：营养剂、抗生素、生长刺激剂、生长抑制剂、表面改性剂、表面增容剂或其组合。
18.一种细胞培养方法，其包括：使权利要求13所述的细胞培养制品接触培养基，然后接触活细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所得的细胞培养物提供了约90％-100％的保持率。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，活细胞的基因表达水平随多孔聚合物层的杨氏模量硬度提高，所述多孔聚合物层的杨氏模量约为0.1-15兆帕。
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