CN102286395A - 一株兼防烟草野火病和角斑病的枯草芽孢杆菌 - Google Patents
一株兼防烟草野火病和角斑病的枯草芽孢杆菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株兼防烟草野火病和角斑病的枯草芽孢杆菌。该枯草芽孢杆NYJ-02的保藏编号为CGMCCNo.4555。本发明还提供了由该枯草芽孢杆菌NYJ-02制备的菌剂及其制备方法。本发明所述的枯草芽孢杆NYJ-02为一种生防细菌，该菌株及其菌剂对烟草野火病和角斑病的病菌均具有较强的抑制作用，具有良好的生物农药开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株兼防烟草野火病和角斑病的枯草芽孢杆菌，属于微生物领域。
背景技术
烟草是我国重要的经济作物之一。烟草野火病和角斑病是烟草主要的细菌性病害，在世界各烟区均有发生，目前的植烟品种中对两病害均无抗性，因此病害的流行在逐年加重，每年均造成比较严重的损失。
该病害的防治方法主要以化学农药为主, 但长期使用化学农药，造成烟叶农药残留的增加和污染环境等问题，导致烟田生态***的不稳定和严重恶化，病虫的抗性增加，危害更加猖獗。因此发展绿色生物农药是农业可持续发展的需要，也是全球农业发展的趋势和走向。
烟草行业“无公害烟叶”、“减害降焦”工程要求重视化学农药的潜在危险和危害，研究符合环保、健康，可持续发展理念的高效、低毒、低残留、与环境相容的生物农药，来缓解和改变化学农药所导致“三R”(Residue, Resistance, Resurgence)问题，促进烟草行业可持续健康发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株无公害且对烟草两大细菌性病害野火病和角斑病均具有显著防效的枯草芽孢杆菌。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），命名为NYJ-02，经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的一个株系，是从烟草叶际分离得到，已于2011年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），其保藏编号为 CGMCC No.4555。
本发明还提供一种由保藏编号为CGMCC No.4555的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NYJ-02制备的菌剂。该菌剂的优选使用浓度为18.0×108cfu/mL。该菌剂可以通过现有技术中的制备方法来制备，还可以根据需要，添加可接受的辅料。
为了更加详细地说明本发明所述菌剂的制备，本发明提供了一种所述枯草芽孢杆菌菌剂的优选的制备方法，该方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保藏号为CGMCC No.4555的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NYJ-02接种于斜面培养基上，于26℃~28℃条件下培养2~3天；
（2）种子培养：从斜面培养基上挑取单菌落接入种子培养基中，于26℃~28℃条件下培养16~18小时，制得种子液；
（3）发酵培养：按4~5%的接菌量，将所述种子液接入发酵培养基中，于26℃~28℃条件下培养3天，即得所述的枯草芽孢杆菌的菌剂。
上述方法中涉及的各种培养基均可以是现有技术中适于枯草芽孢杆菌生长的培养基。本发明也提供一种优选的培养基配方，即：
所述斜面培养基组分及配比为：酵母膏6.25 g，蛋白胨3.75 g，葡萄糖1.0 g，NaCl 3.0 g，KNO3 5.0 g，琼脂粉15.0 g，加蒸馏水定容至1000 mL，pH为7.0~7.5，121 ℃下高温蒸汽灭菌30 min。
所述种子培养基和发酵培养基组分及配比：为酵母膏6.25 g，蛋白胨3.75 g，葡萄糖1.0 g，NaCl 3.0 g，KNO3 5.0 g，加蒸馏水定容至1000 mL，pH为7.0~7.5，121 ℃下高温蒸汽灭菌30 min。
本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌NYJ-02或所述菌剂在制备防治烟草角斑病药物中的应用。
本发明的优点是：
本发明所述的枯草芽孢杆菌NYJ-02发酵液可兼防烟草野火病和烟草角斑病两种病害，具有良好的生物农药开发前景。
附图说明
图1为本发明菌株NYJ-02的电镜照片，杆状，周生鞭毛；
图2为本发明菌株NYJ-02对烟草角斑病菌的室内抑菌照片，图中抑菌带宽度为15.7mm；
图3为本发明菌株NYJ-02对烟草野火病菌的室内抑菌照片，图中抑菌带宽度为10.2mm。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不是限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1 枯草芽孢杆菌NYJ-02获得与鉴定
一、枯草芽孢杆菌NYJ-02获得与鉴定
本发明所述的枯草芽孢杆菌NYJ-02，是从烟草叶际分离得到。本菌为革兰氏阳性菌，周生鞭毛，可游动，单个细胞大小0.7～0.8 um × 2～3 um，芽孢0.6～0.9 um×1.0～1.5 um，椭圆到柱状，菌落表面粗糙不透明，污白色，种子培养基培养表面形成污白色皱醭。在pH值低于4及大于10的条件下细菌几乎不能生长，最适pH值为7。最佳培养基成份：氮源（酵:蛋=5:3）1%，葡萄糖0.1%，NaCl 0.3%，KNO3 0.5%，最适生长温度26-28℃。
本发明所述的枯草芽孢杆菌NYJ-02其16S rDNA序列如序列表SEQ ID No：1所示。
二、枯草芽孢杆菌NYJ-02的保藏
通过上述鉴定结果，确认菌株NYJ-02为为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的一个株系，是从烟草叶际分离得到，已于2011年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），其保藏编号为 CGMCC No.4555。
实施例2枯草芽孢杆菌NYJ-02的培养
（1）斜面培养：培养时间3天，培养基成分（1000 mL）：酵母膏6.25 g，蛋白胨3.75 g，葡萄糖1.0 g，NaCl 3.0 g，KNO3 5.0 g，琼脂粉15.0 g， pH为7.0~7.5。培养温度26， pH为7.0~7.5。培养温度26℃~28℃。
（2）种子培养：超净工作台中从斜面挑取经活化的单菌落接入种子培养基中，26℃~28℃摇菌16~18个小时，转速200rpm，得到种子液。种子培养基成分（1000 mL）：酵母膏6.25 g，蛋白胨3.75 g，葡萄糖1.0 g，NaCl 3.0 g，KNO3 5.0 g，pH为7.0~7.5。
（3）发酵：按5%的接种量，将上述获得的种子液接入发酵培养基中，振荡培养3天（72小时），转速200rpm，得到枯草芽孢杆菌发酵液，即本发明所述的菌剂。发酵培养基配方同种子培养基。
实施例3枯草芽孢杆菌NYJ-02对烟草角斑病和野火病的室内抑菌试验
分别挑取纯培养的病原菌（角斑病菌和野火病菌）和枯草芽孢杆菌NYJ-02分别放入装有50 mL上述种子培养基的三角瓶中，将三角瓶放置到恒温振荡培养箱中28 ℃震荡培养48 h，配制成浓度为3×108 cfu/mL的菌悬液备用。
分别取5 mL角斑病菌和野火病菌发酵液，分别加入到融化并冷却至55℃的100 mL上述灭菌斜面培养基中，轻摇使其与培养基混合均匀，倒入灭菌的培养皿中，冷却成平板。用移液枪吸取70 μL枯草芽孢杆菌NYJ-02发酵液在冷却好的平板上划线，28℃培养48~72 h后观察抑菌效果，测量抑菌带宽度。以未接菌的等量种子培养液代替枯草芽孢杆菌NYJ-02菌悬液为空白对照，试验设3次重复。结果见表１及图2、3。
表1枯草芽孢杆菌NYJ-02对烟草角斑病菌和野火病菌室内抑菌效果
实施例4枯草芽孢杆菌NYJ-02（CGMCC No. 4555）对烟草野火病拮抗试验
本试验在牡丹江烟草科学研究所试验场育苗大棚中进行。
接种野火病菌液的制配：挑取野火病病原菌（牡丹江烟草科学研究所保存）放入装有500 mL种子培养基的三角瓶中，将三角瓶放置到恒温振荡培养箱中28 ℃震荡培养48 h，配制成浓度为3×108 cfu/mL的菌悬液备用。
试验设计：试验于烟株成苗期进行，设三个处理，一个空白对照，三次重复，12个小区，每小区100株烟苗。
处理A：生物农药农用链霉素，加水稀释5000倍喷雾；
处理B：化学农药DT杀菌剂，加水稀释400倍喷雾；
处理C：枯草芽孢杆菌NYJ-02菌剂，由实施例2制得发酵液加水配制成浓度约18.0×108 cfu/mL喷雾；
处理D：空白对照，按处理C配比将枯草芽孢杆菌NYJ-02发酵液换成发酵培养液喷雾。
接种方法：先采用喷雾法实施A、B、C、D四个处理，间隔24 h，连续实施二次后，再间隔24 h喷雾法接种野火病菌悬液。
调查方法：接种7d后调查各小区的病叶率。
试验结果见表2
表2.枯草芽孢杆菌NYJ-02对野火病防治效果
| 病叶率 | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | 平均病叶率 | 防治效果(%) | 差异显著 |
| A | 12.00 | 7.50 | 10.50 | 10.00 | 24.40 | ab A |
| B | 8.23 | 7.28 | 7.02 | 7.54 | 40.72 | b A |
| C | 1.43 | 0.99 | 1.98 | 1.47 | 88.44 | c B |
| D | 16.17 | 9.17 | 12.83 | 12.72 | a A |
调查结果显示枯草芽孢杆菌NYJ-02对烟草野火病的防治效果高达88.44%，生物农药农用链霉素对烟草野火病的防治效果只有24.40%，极显著低于NYJ-02，化学农药DT杀菌剂对烟草野火病的防治效果只达40.72%，也极显著低于NYJ-02，说明枯草芽孢杆菌NYJ-02对烟草野火病的防治效果显著高于目前防治烟草野火病的当家生物农药农用链霉素和化学农药DT杀菌剂的防治效果。
实施例5枯草芽孢杆菌NYJ-02（CGMCC No. 4555）对烟草角斑病拮抗试验
本试验在牡丹江烟草科学研究所试验场烟田进行。
接种角斑病菌液的制配：挑取角斑病病原菌（牡丹江烟草科学研究所保存）分别放入装有500 mL种子培养基的三角瓶中，将三角瓶放置到恒温振荡培养箱中28 ℃震荡培养48 h，配制成浓度为3×108 cfu/mL的菌悬液备用。
试验设计：试验田为河淤土，前茬为烤烟，田间施氮量为3.5KG/亩，Ｎ：Ｐ：Ｋ为1：2：3，四次重复，采用随机区组排列，四行区，每行12株，株距0.9m×0.5m，共设4个处理：
A：枯草芽孢杆菌NYJ-02菌剂，由实施例2制得发酵液加水配制成浓度约18.0×108 cfu/mL喷雾；
B：化学农药DT杀菌剂, 加水稀释400倍喷雾；
C：生物农药农用链霉素，加水稀释5000倍喷雾；
D：空白对照，按处理A配比将枯草芽孢杆菌NYJ-02发酵液换成发酵培养液喷雾。
各处理在旺长期采用高压喷雾法喷雾，隔天重新喷施一次，两天后各处理喷施烟草角斑病病原菌悬液。喷施病原菌后5d、10d分别调查防治效果，每小区调查全部烟株，每株调查中下部叶片10片，以每片叶病斑面积占整个叶片面积的百分比分级，记录总叶片数、各级病叶数，计算病情指数及防治效果。
病害分级标准：
0级：全叶无病；
1级：病斑面积占叶片面积的1%以下；
3级：病斑面积占叶片面积的1%~5%；
5级：病斑面积占叶片面积的5%~10%；
7级：病斑面积占叶片面积的10%~20%；
9级：病斑面积占叶片面积的20%以上。
NYJ-02对烟草角斑病的田间药效试验结果见表3。其中，NYJ-02发酵液防效达到76.18%，显著高于目前防治烟草角斑病的当家化学农药DT杀菌剂和生物农药农用链霉素的防治效果，进一步证明了NYJ-02菌株对烟草角斑病也具有较好的防效，有进一步开发的价值。
表3.枯草芽孢杆菌NYJ-02对野火病防治效果
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所
<120> 一株兼防烟草野火病和角斑病的枯草芽孢杆菌
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1414
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 1
tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60
cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120
tggttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180
gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc 240
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag 420
ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540
ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600
acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660
ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720
cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780
gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840
agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 960
cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080
cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140
gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200
aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260
cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380
ccgaagtcgg tgaggtaacc tttaggagcc agcc 1414
Claims (7)
1.一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NYJ-02，其保藏编号为 CGMCC No.4555。
2.一种由保藏编号为CGMCC No.4555的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NYJ-02制备的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的使用浓度为18.0×108cfu/mL。
4.一种枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：将保藏编号为CGMCC No.4555的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NYJ-02接种于斜面培养基上，于26℃~28℃条件下培养2~3天；
（2）种子培养：从斜面培养基上挑取单菌落接入种子培养基中，于26℃~28℃条件下培养16~18小时，制得种子液；
（3）发酵培养：按4~5%的接菌量，将所述种子液接入发酵培养基中，于26℃~28℃条件下培养3天，即得所述的枯草芽孢杆菌菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述斜面培养基组分及配比为：酵母膏6.25 g，蛋白胨3.75 g，葡萄糖1.0 g，NaCl 3.0 g，KNO3 5.0 g，琼脂粉15.0 g，加蒸馏水定容至1000 mL，pH为7.0~7.5；所述种子培养基和发酵培养基组分及配比为：酵母膏6.25 g，蛋白胨3.75 g，葡萄糖1.0 g，NaCl 3.0 g，KNO3 5.0 g，加蒸馏水定容至1000 mL，pH为7.0~7.5。
6.权利要求1所述枯草芽孢杆菌NYJ-02或权利要求2所述菌剂在制备防治烟草野火病药物中的应用。
7.权利要求1所述枯草芽孢杆菌NYJ-02或权利要求2所述菌剂在制备防治烟草角斑病药物中的应用。
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