CN102281756A - 植物生长调节剂在增强藻类生长中的应用 - Google Patents

植物生长调节剂在增强藻类生长中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了通过使用植物生长调节剂(如生长激素、吲哚乙酸等等)和激素模拟物(苯氧乙酸化合物等等)提高自养、异养或光异养地生长的藻类产生生物质的方法。植物调节剂或其模拟物可进一步提高藻类培养物或收获的生物质中所期望的增值产品(诸如，生物柴油或淀粉)的比例。

Description

植物生长调节剂在增强藻类生长中的应用
相关申请的引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2009年1月13日提交的美国临时专利申请系列号61/204,920(其完整内容在此引作参考)的优先权。
发明背景
藻类是地球上最丰富的、分布最广的物种之一。目前已知的藻类超过150,000种，可能更多的种类还有待发现。对于大多数藻类的种，尽管已知其基本区别特征和品性，但关于如何在总体生命分类中分类所有不同的藻类种仍然存在一定的不确定性。
藻类(包括许多不同大小和颜色的植物样形式，硅藻类和蓝藻菌)构成地球上生命的最重要的类群之一，负责我们大部分的大气，并构成许多其他生物形式的食物链的基础。围绕藻类或与藻类共生地进化的整个生态***和藻类环境包括食物源、掠食者、病毒和许多其它我们一般与高等生命形式相关联的环境因素。
尽管藻类有着这样的重要性和范围外，但是人类的直接利用有限。特别在亚洲，作为食物栽培或收获藻类，经常为“海草”的形式。藻类也广泛地用于生产诸如色素和食物添加剂的多种成分。藻类也被用于工业化处理，以浓缩和去除重金属污染，被称之为硅藻土的硅藻残余物被用作过滤介质以及用于其它用途。
藻类也可以生产油料、淀粉和气体，它们可以用于生产柴油燃料、醇(例如乙醇)和氢气或沼气。
虽然其它生物材料也可以生成这些燃料，但藻类的特点是高产率和理论上的低成本。藻类的生长速度可比其它形式的植物快10到100倍。藻类也能在生产所期望的油和淀粉方面有高产率，在某些情况下，这些形式的产量可达它们本身重量的60％之多。除了高产量的好处以外，利用藻类生产生物产品不会和农业竞争耕地，它既不需要农田也不需要淡水。而且因为藻类是光自养生物，所以它们使用最基本的输入就能够达到所有这些，在大部分情况下只需要阳光、水、空气、二氧化碳和简单营养物。
尽管藻类作为燃料来源的潜在好处是不言而喻的，但实际上由于多种原因过去的尝试遇到了挫折和困难。例如，藻类细胞的最佳增殖条件就没有明确定义，通常不同于增值生物产品(例如，油/脂质或者多糖)的最佳生产所需要的。
发明概述
本发明提供了使用某些植物生长调节剂(例如，生长激素)调节藻类生长的***和方法，例如，为了生产增值生物产品(例如，油或淀粉)的目的。
因此本发明的一方面提供了增强藻类细胞增殖的方法，包括在植物生长调节剂或其模拟物的存在下培养该藻类，以增加藻类细胞数。
在特定的实施方式中，藻类的细胞数至少增加了大约5％、10％、20％、50％、75％、2-倍、5-倍、10-倍、20-倍、50-倍、100-倍、500-倍、1000-倍、104-倍(4logs)、105-倍(5logs)、106-倍(6logs)、107-倍(7logs)、108-倍(8logs)、109-倍(9logs)或者更多。
在特定的实施方式中，藻类细胞的***速率至少增加了大约5％、10％、20％、50％、75％、100％、200％、500％、1,000％等等或者更多。
在特定的实施方式中，在该培养条件下，藻类培养的群体倍增时间是大约0.05-2天。
在特定的实施方式中，植物生长调节剂包括选自植物生长素(Auxin)、细胞***素(Cytokinin)、赤霉素(Gibberellin)和/或其混合物的至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种生长激素。优选地，生长激素包括选自植物生长素、细胞***素或赤霉素的每种激素种类/类别的至少一种或两种。
例如，植物生长素包括吲哚乙酸(IAA)和/或1-萘乙酸(NAA)。其它植物生长素模拟物可以是2，4-D；2，4，5-T；吲哚-3-丁酸(IBA)；2-甲基-4-氯苯氧基乙酸(MCPA)；2-(2-甲基-4-氯苯氧基)丙酸(mecoprop，MCPP)；(2，4-二氯苯氧基)丙酸(dichloroprop，2，4-DP)；或者(2，4-二氯苯氧基)丁酸(2，4-DB)。
在特定的实施方式中，赤霉素包括GA3。
在特定的实施方式中，细胞***素是腺嘌呤型细胞***素或苯脲型细胞***素。例如，腺嘌呤型细胞***素或模拟物可以包括激动素(kinetin)、玉米素(zeatin)和/或6-苄氨基嘌呤，苯脲型细胞***素可以包括二苯脲和/或噻苯隆(TDZ)。
在特定的实施方式中，植物生长调节剂进一步包括维生素B1或其类似物/模拟物。
在特定的实施方式中，仅有一种所述生长调节剂(例如植物生长素家族的生长调节剂或细胞***素家族的生长调节剂)用于藻类生长。
在特定的实施方式中，使用一种以上的所述生长调节剂。在特定的实施方式中，至少使用一种植物生长素家族的生长调节剂和至少一种细胞***素家族的生长调节剂，该至少一种植物生长素和该至少一种细胞***素的重量比大约为1∶2到2∶1(w/w)，优选为约1∶1(w/w)。在特定的实施方式中，植物生长素和赤霉素的比例(w/w)大约为1∶2到2∶1，优选为约1∶1。在特定的实施方式中，植物生长素和维生素B1的比例(w/w)大约为1∶4到1∶1，优选为约1∶2。
在特定的实施方式中，所述模拟物是苯氧乙酸化合物。
在特定的实施方式中，所述方法进一步包括在含有最佳细胞增殖所需的无限制水平的营养物和微量元素的培养基中培养藻类。
在特定的实施方式中，营养物包括一种或者多种炭、氮、磷、硫和/或氧源。优选地，营养物的浓度对细胞的***和/或生长是无毒的。
在特定的实施方式中，培养基可以包括厌氧生物消化物(biodigestate)的液态分离物(separation)，需要时任选地补充额外的营养物。厌氧生物消化物可以由动物内脏、家畜粪便、食品加工废物、市政废水、酒糟水、酒糟(distiller’s grains)、或者其它有机物的厌氧消化产生。
在特定的实施方式中，营养物的浓度对细胞的***和/或生长是无毒的。
在特定的实施方式中，藻类在细胞***的最适温度下培养，对非嗜热藻类来说最适温度在大约0-40℃之间，而对嗜热藻类来说则在大约40-95℃，或者大约60-80℃之间。
在特定的实施方式中，藻类在生物反应器中培养。优选地，生物反应器适应于最佳的细胞增殖。优选地，生物反应器可以灭菌。
在特定的实施方式中，藻类利用异养、光异养或者自养的生理机制代谢。
在特定的实施方式中，藻类是杂色藻类(Chromophytes)、优选绿藻类(Chlorophytes)或者硅藻类(Bacillariophytes)。在特定的实施方式中，藻类是小球藻(Chlorella sp.)(例如普通小球藻(Chlorellavulgaris))、Auxenochlorella sp.(Auxenochlorella protothecoides)、栅藻(Scenedesmus sp.)和Ankistrodesmus sp，等等。在特定的实施方式中，藻类具有无藻壳(frustule)的形式。在特定的实施方式中，藻类不是褐藻(Phaeophyceae)或者红藻。在特定的实施方式中，藻类不是破囊壶菌(Thraustochytriales)。
本发明的另一方面提供用于生产藻类产品的方法，包括在植物生长调节剂或其模拟物的存在下培养藻类，以积累藻类产品。
在特定的实施方式中，藻类细胞数增加不超过大约1,000％、300％、200％、100％或者50％。
在特定的实施方式中，藻类的生物质显著增加。例如，在特定的实施方式中，藻类的生物质至少增加大约5％、10％、20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％。在特定的实施方式中，由于所述的藻类产品积累，藻类的生物质大量增加。
在特定的实施方式中，藻类在氮限制的培养基或含有为藻类产品合成优化的氮水平的培养基中培养。
在特定的实施方式中，植物生长调节剂包括一种油刺激因子。例如，油刺激因子可以包括腐殖酸盐，例如黄腐酸(fuvic acid)或者腐殖酸。
在特定的实施方式中，藻类在生物反应器中培养。优选地，生物反应器适应于藻类产品的最佳生产。
在特定的实施方式中，藻类产品是油或者脂质，如包含Omega-3、Omega-6和/或Omega-9的藻类产品。
在特定的实施方式中，藻类产品是淀粉(或者多糖)。当期望的藻类产品是淀粉或者多糖时，藻类优选地不经受氮限制的生长条件。
本发明的另一方面提供适合本发明的藻类生长过程的***。优选地，生物反应器可以灭菌，以在异养和光异养的条件下促进未污染的藻类生长。
可预期的是这里所描述的所有实施方式可以和其它实施方式的特征相组合，无论是否适合。
附图简述
图1显示在用0.1％酵母提取物和0.5％葡萄糖改良的布氏(Bristol’s)培养基中生长7天的对照普通小球藻(Chlorellavulgaris)。
图2显示在用0.1％酵母提取物、0.5％葡萄糖和黄腐酸改良的布氏培养基中生长7天的普通小球藻。
图3显示原壳小球藻(Chlorella protothecoide)在存在或不存在植物生长调节剂组合的条件下的示例生长曲线。
图4显示原壳小球藻在存在或不存在植物生长调节剂组合的条件下的示例生长曲线。
图5显示原壳小球藻在存在或不存在植物生长调节剂组合的条件下的示例生长曲线。
图6显示原壳小球藻在存在或不存在植物生长调节剂组合的条件下的示例生长曲线。
发明详述
本发明的一个方面部分地基于发现藻类生长(例如，在指数生长期或指数生长后期的细胞增殖)可以被特定的植物生长调节剂或其模拟物所刺激。
所以本发明的一个方面提供一种增强藻类细胞增殖的方法，包括在植物生长调节剂或其模拟物的存在下培养藻类，以增加藻类细胞数。
植物激素或调节剂影响植物中的基因表达和转录水平、细胞***和生长。人类合成了大量的相关化合物，并用于调节栽培的植物、杂草、体外生长的植物和植物细胞的生长。这些人造化合物有时叫作植物生长调节剂，或简称为PRG。这些合成的调节剂可以和自然存在的调节剂相同，或者可以包含在自然界中未曾发现的化学修饰。这里所使用的“生长激素(或其模拟物)”包括天然的植物激素和人造/合成的调节剂、其模拟物或者衍生物。优选地，生长激素/调节剂、或其模拟物至少在一种浓度下刺激藻类生长，优选地在与下列实施例(例如，实施例3到7)所使用的类似或者相同的条件下。术语“生长激素”和“生长调节剂”在这里可以交换使用。
大体上，植物激素和调节剂分为5大类，其中一些由许多不同的化学物质构成，这些化学物质在植物与植物之间在结构上可能不同。基于它们的结构相似性和它们对植物生理学的效应，这些化学物质各自被一起归入这些类别之一。另外的植物激素和生长调节剂不容易归入这些类别。恰恰相反，它们天然存在或由人类或其它生物体所合成，包括抑制植物生长或者中断植物体内的生理过程的化学物质。
这五种主要的类别是：脱落酸(也被称为ABA)；植物生长素；细胞***素；乙烯；和赤霉素。其它已鉴定的植物生长调节剂包括：油菜素内酯类(Brassinolides)(与动物甾醇激素在化学结构上类似的植物甾醇。它们促进细胞伸长和细胞***、木质部组织分化和抑制叶片脱落)；水杨酸(在某些植物中激活基因，产生帮助抵御病原性侵入物的化合物)；茉莉酸类(Jasmonates)(由脂肪酸生成并似乎促进生成用于抵御入侵生物体的防御蛋白质。据信它们也在种子萌发中有作用，并且影响种子中蛋白质的储存，还似乎影响根的生长)；植物肽激素类(包括所有的参与细胞与细胞之间信号传导的分泌小肽。这些小肽激素在植物生长和发育中起重要作用，包括防御机制、控制细胞***和膨胀以及花粉自交不亲合性)；聚胺类(迄今在所有已研究的生物中均发现的低分子量强碱性分子。它们在植物生长和发育方面有重要作用，并影响有丝***和减数***的过程)；一氧化氮(NO)(在激素和防御应答中作为信号)；独脚金萌发素内酯(Strigolactones)(与抑制芽分枝有关)。
PRG的脱落酸类别包括通常在植物叶子中生成的一种化合物，该化合物来源于叶绿体，特别是在植物处于应激时。一般而言，他作为一种抑制性的化合物影响芽生长、种子和芽休眠。
植物生长素是能正面影响细胞扩大、芽形成和发根的化合物。它们也促进其它激素的生成，并且与细胞***素联合，它们控制茎、根和果实的生长，并把茎转化为花。植物生长素通过改变细胞壁的塑性来影响细胞的伸长。植物生长素水平在光照下下降，在黑暗中上升。在高浓度下，植物生长素对植物具有毒性；它们对双子叶植物毒性最大，但对单子叶植物毒性小些。由于此特性，已经开发了包括2，4-D和2，4，5-T在内的合成植物生长素除草剂并用于杂草控制。植物生长素，特别是1-萘乙酸(NAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)，通常也应用于在植物扦插时刺激根的生长。在植物中最常见的植物生长素是吲哚乙酸或IAA。
植物生长素家族中最重要的一个成员是吲哚-3-乙酸(IAA)。在整株植物中，它产生植物生长素效应的主要部分，并是一种最有效的天然植物生长素。然而，IAA分子在水溶液中化学不稳定。其它自然存在的植物生长素包括4-氯吲哚乙酸、苯乙酸(PAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)。常见的合成植物生长素类似物包括1-萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)等等。下面示出了几种可在本发明中应用的示例性的(非限制性的)自然和合成的植物生长素。
Figure BPA00001405748600081
Figure BPA00001405748600091
细胞***素或CK是一组影响细胞***和芽形成的化合物。它们也有助于延缓组织衰老或老化，负责介导植物生长素在整个植物中的运输，并影响节间长度和叶生长。它们与植物生长素合作具有高度的协同作用，而且这两组植物激素的比例影响植物一生中大部分生长期。细胞***素对抗植物生长素所诱导的顶端优势；它们与乙烯一起促进叶、花部分和果实的脱落。
有两种类型的细胞***素：由激动素(Kinetin)、玉米素(Zeatin)和6-苄氨基嘌呤代表的腺嘌呤型细胞***素，和诸如二苯脲或者噻苯隆(thidiazuron，TDZ)的苯脲型细胞***素。
Figure BPA00001405748600092
乙烯是一种通过Yang循环由甲硫氨酸分解生成的气体，它存在于所有细胞中。乙烯作为植物激素的有效性依赖于它的生成速率和逃逸到空气中的速率的比值。特别是在黑暗中，乙烯在快速生长和***的细胞中以较高的速率生成。新生长的和新发芽的幼苗生成的乙烯超过可能逃逸出植物的乙烯，这会提高乙烯的量，抑制叶扩大。当新芽暴露在光中时，植物细胞中的植物色素引起的反应生成减少乙烯产生的信号，允许叶扩大。乙烯影响细胞生长和细胞形状；当生长的芽在地下碰到障碍物时，乙烯的生成就大为升高，防止细胞伸长并引起茎膨胀。结果增厚的茎可以施加更大的压力对抗阻挡它通往地表的障碍物。如果芽不能到达地面并且乙烯刺激作用延长，这就会影响茎的自然向地性响应----直立生长，允许茎围绕物体生长。研究似乎表明乙烯影响茎的直径和高度：当树木的茎受到风的影响，导致横向应力时，就会生成更多乙烯，导致树干和树枝更厚、更强壮。乙烯影响果实成熟：正常情况下，当种子成熟时，乙烯生成增加，并在果实中积累，导致恰在种子散布前发生呼吸跃变事件(climacteric event)。乙烯的生成调节核蛋白----乙烯不敏感2(EIN2)，并且随之调节其它激素，包括ABA和应激激素。
Figure BPA00001405748600101
赤霉素或者GA包括一大类在植物体内和由真菌天然产生的化学物质。赤霉素在种子萌发方面具有重要意义，影响动员用于新细胞生长的食物生成的酶的产生。这是通过调节染色体转录完成的。在谷类(水稻、小麦、玉米等等)种子中，称之为糊粉层的细胞层包裹着胚乳组织。种子吸收水分导致GA生成。GA被转运到糊粉层，糊粉层的响应是生成分解储存在胚乳中的食物备份的酶，然后被生长的幼苗所利用。GA诱导玫瑰花结形成植物的抽苔，增加节间长度。他们促进开花、细胞***和萌发后的种子生长。赤霉素也可以逆转ABA所诱导的芽生长和休眠的抑制。
所有已知的赤霉素都是二萜酸(diterpenoid acid)，它们在质体中通过类萜途径合成，然后在内质网和胞质溶胶中修饰，直至它们达到生物活性的形式。所有赤霉素都是从对映赤霉素烷骨架衍生来的，但是经由对映贝壳杉烯合成。赤霉素根据发现的先后顺序命名为GA1.....GAn。赤霉酸，第一种鉴定结构特征的赤霉素是赤霉酸，为GA3。到2003年，共有126种GA从植物、真菌和细菌中鉴定。赤霉素是四环二萜酸。根据含有19个碳还是20个碳，赤霉素分为两类。19碳赤霉素，诸如赤霉酸，已经失去碳20，并且在该位置具有连接碳4和碳10的五元内脂桥。一般来说，19碳形式是赤霉素的生物活性形式。羟基化也对赤霉素的生物活性具有重要影响。一般来说，生物活性最强的化合物是二羟基化的赤霉素，它们在碳3和碳5位上具有羟基。赤霉酸是双羟基化的赤霉素。以下示出了代表性的(非限制性的)赤霉素。
Figure BPA00001405748600111
可用于本发明(例如，加入藻类培养物中促进细胞***或增殖)的示例性生长激素/调节剂或其模拟物包括植物生长素家族、细胞***素家族和/或赤霉素家族的成员。
例如，可用于本发明的植物生长素和模拟物包括(不限于)：吲哚乙酸(IAA)；2，4-D；2，4，5-T；1-萘乙酸(NAA)；吲哚-3-丁酸(IBA)；2-甲基-4-氯苯氧乙酸(MCPA)；2-(2-甲基-4-氯苯氧基)丙酸(mecoprop，MCPP)；2-(2，4-二氯苯氧基)丙酸(dichloroprop，2，4-DP)；(2，4-二氯苯氧基)丁酸(2，4-DB)；4-氯吲哚乙酸(4-Cl-IAA)；苯乙酸(PAA)；2-甲氧基-3，6-二氯苯甲酸(麦草畏)；4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸(毒莠定或落叶素))；α-(对氯苯氧基)异丁酸(PCIB，一种抗植物生长素)；或其混合物。当使用混合物时，混合物优选具有与有效量的IAA(单独使用时)或者有效量的IAA+NAA等效的生物活性(例如，在基本相同的生长条件下，刺激藻类细胞生长到基本相同的程度，优选在基本相同的时间内)。对于实施例，看下列实施例中所应用的条件。
可用于本发明的细胞***素和模拟物可以是腺嘌呤型或者苯脲型，并且可以包括(不限于)激动素、玉米素、6-苄氨基嘌呤(6-BA或6-BAP)、二苯脲、噻苯隆(TDZ)或其混合物。优选地使用腺嘌呤型细胞***素，诸如激动素、玉米素、6-苄氨基嘌呤(6-BA或6-BAP)或其混合物。当使用混合物时，混合物优选地具有与有效量的激动素+6-BA等效的生物活性(例如，在基本相同的生长条件下，刺激藻类细胞生长到基本相同的程度，优选地在基本相同的时间内)。参见，例如，下列实施例中所使用的条件。
可用于本发明的赤霉素和模拟物可以是本文所述的或本领域已知的任何赤霉素，如GA3。优选地，赤霉素、其模拟物或衍生物或混合物具有与有效量的GA3等效的生物活性(例如，在基本相同的生长条件下，刺激藻类细胞生长到基本相同的程度，优选地在基本相同的时间内)。参见，例如，下列实施例中所使用的条件。
模拟物也可以是苯氧乙酸(phenoxyacetic)化合物。
为获得最佳生长刺激效果，在特定的实施方式中，仅有一种所述生长调节剂(例如，植物生长素家族生长调节剂，细胞***素家族生长调节剂，或者赤霉素家族生长因子)用于藻类生长。在特定的实施方式中，使用超过一种所述生长调节剂。例如，可以使用至少一种植物生长素家族生长调节剂和至少一种细胞***素家族生长调节剂，并且培养基中的总植物生长素与总细胞***素的(重量)比可以调节到大约1∶2到2∶1，优选大约1∶1。
优选地，当存在赤霉素时，培养基中的总植物生长素与总赤霉素的(重量)比可以调节到大约1∶2到2∶1，优选大约1∶1。
在特定的实施方式中，可以使用维生素B1或其模拟物、衍生物或功能等同物。优选地，培养基中的总植物生长素与总维生素B1的(重量)比可以调节到大约1∶4到1∶1，优选大约1∶2。
在特定的实施方式中，生长培养基中植物生长素的总浓度为大约0.01-0.04μg/L、大约0.003-0.12μg/L、大约0.002-0.2μg/L或者大约0.001-0.4μg/L。
在特定的实施方式中，生长培养基中细胞***素的总浓度为大约0.01-0.04μg/L、大约0.003-0.12μg/L、大约0.002-0.2μg/L或者大约0.001-0.4μg/L。
在特定的实施方式中，生长培养基中赤霉素的总浓度为大约0.01-0.04μg/L、大约0.003-0.12μg/L、大约0.002-0.2μg/L或者大约0.001-0.4μg/L。
在特定的实施方式中，生长培养基中维生素B1的总浓度为大约0.02-0.08μg/L、大约0.006-0.24μg/L、大约0.004-0.4μg/L或者大约0.002-0.8μg/L。
在特定的实施方式中，可以使用乙烯、油菜素内酯类、水杨酸、茉莉酸类、植物肽激素类、聚胺类、一氧化氮和/或独脚金萌发素内酯。
在特定的实施方式中，可以使用乙烯、油菜素内酯类、茉莉酸类、植物肽激素类和/或聚胺类。
在特定的实施方式中，一种或多种激素或调节剂的存在使细胞增殖增加了大约15％(例如，1.4到1.6)、20％、25％、30％、35％或者更多，优选地在实施例中的一种生长条件下，例如实施例3-7。
根据本发明的此方面，藻类细胞数可以增加至少大约5％、10％、15％、20％、50％、75％、2-倍、5-倍、10-倍、20-倍、50-倍、100-倍、500-倍、1000-倍、104-倍(4logs)、105-倍(5logs)、106-倍(6logs)、107-倍(7logs)、108-倍(8logs)、109-倍(9logs)或者更多。
不管培养基使用的具体植物生长调节剂如何，多种不同的培养基可以被用于支持藻类生长。一般来说，合适的培养基可含有氮、微量金属(例如，磷、钾、镁和铁等等)的无机盐、维生素(例如，硫胺素)等等，这些可能是生长必需的。例如，可以使用诸如VT培养基、C培养基、MC培养基、MBM培养基和MDM培养基(参见SoruiKenkyuho，ed.by Mitsuo Chihara and Kazutoshi Nishizawa，KyoritsuShuppan(1979))、OHM培养基(参见Fabregas等人，J.Biotech.，Vol.89，pp.65-71(2001))、BG-11培养基、布氏培养基和它们的改良培养基等培养基。其它合适的培养基的例子包括，但不限于，Luria肉汤、半咸水、添加有营养物的水、乳品厂排出物(dairy runoff)、盐度小于或等于1％的培养基、盐度大于1％的培养基、盐度大于2％的培养基、盐度大于3％的培养基，盐度大于4％的培养基和它们的组合。最优选的培养基包括厌氧生物消化物的液体分离物，可选地补充有额外的营养物。液体可以通过机械方式，诸如使用螺旋压力机或通过离心，从厌氧生物消化物分离出来。液体理想地含有不超过5-10％的固形物，优选不超过8％的固形物。
可以根据用途，诸如生长或增殖、或诱导期望的藻类产物，来选择这些培养基。例如，对于最佳的细胞***/增殖，使用含有大量用作氮源的成分的培养基(例如，丰富培养基：以氮表示，含有至少大约0.15g/L)。对于藻类产物生产(例如，油)，优选含有少量用作氮源的成分的培养基(例如，以氮表示，含有少于大约0.02g/L)。或者，可以使用含有浓度介于这些培养基中间的氮源的培养基(低营养培养基：以氮表示，含有至少0.02g/L和少于0.15g/L)。
换句话说，在指数生长期，培养基优选具有非限制水平的营养物(包括一种或多种碳、氮、磷、硫和/或氧源)和微量元素，这是最佳细胞数增加所需要的。优选地，营养物的浓度对细胞***和生长是无毒性的。
培养基的氮浓度、磷浓度和其它性质的确定依赖于将要接种的藻类的量和所期望的它们的生长速率。例如，当每毫升105细胞数量级的藻类接种于低营养(例如，氮)培养基时，藻类将会生长到一定的程度，但由于氮源的量太少，生长将会停止。这种低营养培养基适用于在一步中(例如，以分批方式)连续进行生长和藻类产物生产。此外，通过调节N/P摩尔比至大约10-30、优选15-25的值，或者调节C/N摩尔比至大约12-80的值(例如，更低的N含量)，可诱导藻类产生期望的生物产品(例如，油)。在藻类接种量较高的情况下、丰富培养基可以用于进行上述的培养。用这种方式，可以考虑各种条件来决定培养基的组成。
藻类生长培养基中的氮源或者氮添加物可以包括硝酸盐、氨、尿素、亚硝酸盐、铵盐、氢氧化铵、硝酸铵、谷氨酸一钠、可溶性蛋白质、不可溶性蛋白质、水解蛋白质、动物副产物、乳品厂废物、酪蛋白、乳清、水解酪蛋白、水解乳清、大豆制品、水解大豆制品、酵母、水解酵母、玉米浆、玉米浸液、谷类浸液固形物、酒糟、酵母提取物、氮的氧化物、N2O，或其它合适来源(例如，其它肽类、寡肽和氨基酸，等等)。碳源或碳添加物可以包括糖、单糖、二糖、糖醇、脂肪、脂肪酸、磷脂、脂肪醇、酯类、寡糖、多糖、混合糖类、甘油、二氧化碳、一氧化碳、淀粉、水解淀粉或者其它合适来源(例如其它五碳糖，等等)。
额外的培养基成分或添加物可以包括缓冲液、矿物质、生长因子、消泡剂、酸、碱、抗生素、表面活性剂或者抑制不希望的细胞生长的物质。
营养物可以在开始时一次性加入，或者开始时仅加部分且在生长过程中加入部分，作为单次后继添加，作为藻类生长过程中的连续进料，作为生长过程中相同或不同营养物的多次添加，或者作为这些方法的组合。
如果希望，可以通过使用缓冲液或在生长开始时或过程中添加酸或碱来控制或调节培养物的pH值。在某些情况中，为了获得所期望的pH控制程度，可以在反应器的不同区域或相同区域在相同或不同的时间使用酸和碱两者。缓冲液***的非限制性例子包括单、二或者三价磷酸盐、TRIS、TAPS、双(羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲基胂酸盐、MES和乙酸盐。酸的非限制性例子包括硫酸、盐酸、乳酸和乙酸。碱的非限制性例子包括氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、氨、碳酸氢钠、氢氧化钙和碳酸钠。这些酸和碱中的一部分除了调节pH值以外也可以作为细胞的营养物。在整个生长过程中，培养物的pH值可以控制在一个大约的恒定值，或者在生长过程中可以改变pH值。此变化可以用于启动或终止不同的分子途径，加强一种特定产物的产生，加强产物(例如，脂肪、染料或生物活性化合物)积累，抑制其它微生物生长，抑制或促进泡沫生成，使细胞休眠，使细胞从休眠中恢复，或者用于其它目的。
在特定的实施方式中，在整个培养期间，优选的是使pH值维持在大约4-10，或者大约6-8。
同样，在某些实施方式中控制或者调节培养温度到大约一个特定值，或者可以象对于pH值变化所列的那样，为了相同或者不同的目的在生长过程中可以改变温度。例如，细胞***的最适温度对非嗜热藻类来说大约在0-40℃、20-40℃、15-35℃或者约20-25℃；对于嗜热藻类来说，大约在40-95℃，优选地大约在60-80℃。
在特定的此类实施方式中，提供温度控制元件，包括测量***内温度(例如培养基温度)的测量元件，和可以响应测量控制温度的控制元件。控制元件可以包括浸入式线圈或培养容器的侧壁或底壁上的夹套。
藻类可以在自然环境中培养，例如在开放的池塘、沟槽或沟渠等等，或者在封闭的生物反应器(容器或管道等等)内生长。如果生长条件需要改变或调节，藻类培养物可以在第一生长条件下在第一生物反应器中生长，在第二生长条件下在第二生物反应器中生长，等等。在分批方式中，不同的步骤可以使用单独的培养罐/容器独立运行。在每一步结束时也可以洗涤和收集生长的藻类，再把藻类返回同一培养罐中，然后运行下一步骤。在特定的实施方式中，洗涤步骤是可选的，可能是需要的也可能不是需要的，这取决于第一反应器中的培养基。
开放的池塘(或沟槽等等)或封闭的(优选可灭菌的)生物反应器可以用分批模式、连续模式或者半连续模式运行。例如，在分批模式下，池塘/生物反应器会加入合适水平的新鲜和/或回收的培养基和接种物。然后使培养物一直生长到所期望的生长水平。此时收获产物。在一个实施方式中，整个池塘/生物反应器的内含物都被收获，然后在需要时可以清洁并消毒(例如生物反应器灭菌)池塘/生物反应器，再填充培养基和接种物。在另一实施方式中，仅有部分内含物被收获，例如大约50％，然后补加培养基以重新填充池塘/生物反应器，继续生长。
或者，在连续培养模式，新鲜的和/或回收的培养基和新鲜的接种物连续进料到池塘/生物反应器中，同时连续收获细胞物质。在连续操作中，可以有初始启动阶段，在该阶段延迟收获，以允许建立足够的细胞浓度。在该启动阶段，可以中断培养基进料和/或接种物进料。或者，可以将培养基和接种物加入池塘/生物反应器中，并且当池塘/生物反应器开始达到期望的液体体积时，开始收获。为了适应操作要求和适合于特定的产物生物和生长培养基，可以使用其它启动技术。在第一池塘/生物反应器中培养物已经生长时，可以将大约10-90％、或20-80％、或30-70％的培养物转移到第二池塘/生物反应器，剩余的内含物作为第一池塘/生物反应器中后继生长的启动培养物。或者，转移约100％的培养物到第二池塘/生物反应器中，同时用新源接种第一池塘/生物反应器。
可以以“搅拌模式”或“柱塞流模式(plug flow mode)”或“组合模式”运行连续池塘/生物反应器。在搅拌模式下，加入并混合培养基和接种物到池塘/生物反应器的通常体积。混合设备包括但不限于浆轮、螺旋桨、涡轮、浆叶或者气升(airlift)，以垂直的、水平的或者组合方向操作。在某些实时方式中，添加培养基或者接种物所引起的湍流可以辅助或完成混合。在池塘/生物反应器的水平面积上，细胞和培养基成分的浓度不会发生大的变化。在柱塞流模式中，培养基和接种物从池塘/生物反应器的一端加入，在另一端收获。在柱塞流模式中，培养物通常从培养基入口移动到收获点。在培养物从入口移动到收获点的过程中发生细胞生长。利用某些手段可以实现培养物移动，这些手段包括但不限于，倾斜池塘/生物反应器、混合设备、泵、通过池塘/生物反应器表面吹气以及在池塘/生物反应器一端添加物料和在另一端移除物料导致的移动。可以在池塘/生物反应器的不同位点补加培养基成分，以为不同的细胞生长阶段提供不同的生长条件。同样，培养的温度和pH值可以在池塘/生物反应器的不同的位点有所变化。可选地，可在多个位点提供逆向混合。使用混合器、桨叶、折流挡板或者其它适合的技术可以实现主动混合。
在组合模式下，一部分池塘/生物反应器运用柱塞流模式来运行，另一部分运用搅拌模式来运行。例如，培养基可以在搅拌区加入从而生成“自我播种”或“自我接种”***。带有正在生长的细胞的培养基从搅拌区移动到柱塞流区，在柱塞流区细胞继续生长到收获点。根据所希望的效果，搅拌区可以位于池塘/生物反应器的开始处、中间部分、或结束处。除了产生自我播种培养物外，使用这些搅拌区的目的包括，但不限于，提供使细胞暴露于特定试剂或培养基成分的特定条件或浓度的特定停留时间。这些搅拌区可以使用折流挡板、障碍物、分流器和/或者混合装置获得。
半连续培养可以通过向池塘/生物反应器中加入起始量的培养基和接种物来进行。随着生长的继续，连续或间断地添加额外的培养基。
在特定优选的实施方式中，藻类培养物可以在一个或多个封闭的(优选灭菌的)生物反应器中生长。这些封闭的培养和收获***可以是灭菌的，因此可以大幅度减少由污染的藻类、细菌、病毒和消耗藻类的微生物和/或其它外来物种所引发的问题。
这里所使用的“灭菌”包括可以从表面、设备、食物或者药物或者生物培养基有效杀死或消除可传播物(例如，真菌、细菌、病毒、孢子形式等等)的任何过程。通过应用热、化学物质、放射、高压、过滤或它们的联合方法可以实现灭菌。至少有两大类灭菌：物理法和化学法。物理灭菌法包括：加热灭菌、放射灭菌、高压气体灭菌(超临界CO2)。化学灭菌法包括：环氧乙烷、臭氧、氯漂白剂、戊二醛甲醛、过氧化氢、过乙酸或醇(例如，70％乙醇、70％丙醇)，等等。放射灭菌包括使用紫外(UV)光。这里所描述和在本领域已知的所有手段可以适合本发明中所使用的培养罐、管路和容器。
在特定的实施方式中，此类生物反应器可以设计为在户外的环境中安装并运行，在该环境中它暴露在环境光和/或温度。这些装置、***和方法可以设计为提供改进的热调节，该热调节可用于维持温度在适合最适生长和产油的温度范围内。在特定的实施方式中，这些***可以在地面上建造和运行，该地面对于标准的农作物，例如，玉米、小麦、大豆、芸苔(canola)或水稻的栽培不重要或无用。
在特定的实施方式中，至少在一定阶段，藻类可以生长在灭菌或没有灭菌的开放池塘中。例如，在特定的实施方式中，异养嗜盐藻可以在盐水基培养基中露天生长，此条件基本上限制了所有其它细胞的生长。与此类似，在特定的实施方式中，嗜热异养藻可以在限制基本上所有其它生物体生长的温度下生长。
用于培养藻类的最简单装置没有特殊限制。然而，优选地该装置能提供养分(包括二氧化碳)和光供自养生长，和可选地提供养分(包括有机碳)供异养生长，和可选地，在光异养生长条件下，能够用光照射培养悬液液。例如，在小规模培养的情况下，可以优选使用扁平的培养瓶。在大规模培养(例如在跑道形(race track)或通道构建的***中培养)的情况下，可以使用由透明板(例如，由玻璃、塑料等制成)组成并且在必要时装备有照射装置和搅拌器的培养罐或容器。这类培养罐的例子包括板式培养罐、管型培养罐、气室型培养罐和中空圆柱型培养罐。在任何情况下，优选使用密封容器。
尽管自然光可以用于自养和光异养生长，但是人造光源也可以用于本发明。在特定实施方式中，导向性光源(源于自然或人造的)可以用于本发明。例如，阳光收集器可以用于收集自然光，通过波导管(例如纤维光缆)可以将收集到的自然光传送到指定位置(生物反应器)。一种优选的人造光源是LED，它能提供最有效率的光能源之一，因为LED能提供非常特定的波长的光，可以为最大化的细胞利用定制。在特定实施方式中，可以使用发出波长为大约400-500nm、400-460nm、620-680nm或600-700nm的光的LED。
多种碳源可应用于藻类生长的不同阶段。例如，单糖可以作为碳源。或者，CO2可以作为碳源。
如果CO2作为碳源，例如，可以通过在含水培养基中鼓泡，将CO2引入封闭的***生物反应器中。在优选的实施方式中，可以通过有孔的氯丁橡胶膜进行气体鼓泡引入CO2，这可产生具有高表面积∶体积比的小气泡，以用于最大交换。在更优选的实施方式中，可以在水柱的底部引入气泡，其中水流的方向和气体运动的方向相反。这种逆流设置也通过增加气泡暴露于含水培养基的时间，使气体交换最大化。为进一步增加CO2的溶解，可以增加水柱的高度以延长气泡暴露于培养基的时间。CO2溶于水生成H2CO3，H2CO3然后可被光合藻类所“固定”产生有机化合物。例如，可以以大约1-3％(v/v)的浓度、大约0.2-2vvm的流速供应CO2。在其他实施方式中，也可以使用更高的CO2浓度(例如，最高至100％)和/或更低的速率(例如，低于0.2vvm)。当使用板式培养罐时，也可以通过供应CO2搅拌培养悬浮液，使得藻类(例如，绿藻)可以接受均一的光照。
为了使藻类培养在不同的生长条件之间转换，例如，通过以顺序方式使它们暴露于不同类型的植物生长调节剂，藻类可以从培养基中物理收获和分离。可以直接从池塘中或在培养物转移到储藏罐后进行收获。收获步骤可以包括从大量培养基中分离细胞，和/或将该培养基重新用于其它批藻类培养物的步骤。
或者，培养基的转换可以如下实现：连续稀释在第一生物反应器中在第一生长条件下(例如，第一植物生长调节剂)下生长的藻类培养物，并且收集移出的(displaced)藻类培养物用于在第二生物反应器中在第二生长条件(例如，第二植物生长调节剂)下生长。
本发明的另一方面部分地基于发现了某些植物生长调节剂可以用于刺激某些藻类产物的产生。因此本发明的另一方面提供一种用于生产藻类产物的方法，包括在植物生长调节剂或其模拟物的存在下培养藻类以积累藻类产物。在一个优选的实施方式中，藻类产物是油/脂类。
优选地，对于油类生产，植物生长调节剂是一种油刺激因子，诸如腐殖酸盐(例如，黄腐酸、腐殖酸或腐黑物)。可以从多种来源获得腐殖酸盐，包括商业供货商。在特定优选实施方式中，下列程序被用于生产腐殖酸盐：将约25g粉末化的风化褐煤(leonardite)物质(加拿大Alberta开采，由Black Earth Humates Ltd，Edmonton，Alta.，T5L 3C1提供)用大约500ml 1％的NaOH溶液水合。相信这会释放出腐殖酸和黄腐酸混合物到溶液中。将该混合物静置使有机灰分物质沉淀到底部后，小心吸去液体上部。然后加入大约2ml 98％的硫酸以酸化该吸去部分。相信这会使腐殖酸沉淀到容器底部。然后将该部分分配到两个150ml离心容器中，然后在大约10,000rpm离心这两个容器大约10分钟。腐殖酸被离心到底部，小心地从上部倾倒出黄腐酸部分。黄腐酸的产率根据所用的风化褐煤的质量而可能不同。本技术技术人员可以容易地对这里所描述的方法做微小变动而没有偏离发明的精神。
在特定的实施方式中，使用的黄腐酸约为生长培养基的5-12.5％(v/v)。
根据发明的此方面，藻类生长的主要目的是产生所期望的藻类产物。因此，藻类细胞数的进一步增加可能浪费了有价值的资源或能源，这不是所希望的。优选地，在此生长条件下，藻类细胞数增加不超过一个log(10-倍)、300％、200％、100％或者50％。
在积累生物产物的生长条件下，藻类生物质优选地显著增加。例如，因为藻类产物的积累，藻类的生物质可以大大增加。在特定的实施方式中，藻类的生物质在此生长条件下至少增加了大约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍。例如，若细胞的藻类产物(例如，油、脂类等等)比例从1％增加到99％，则藻类生物质大约增加了19-20倍。
在特定的实施方式中，在此生长条件下，积累的藻类产物至少增加了10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍或者更多。例如，若细胞的藻类产物(例如，油、脂类等等)比例从1％增加到99％，则藻类产物大约增加了1900倍。
优选地，也在氮限制培养基或者具有为藻类产物合成优化的氮水平的培养基中培养藻类。
如上所述，藻类可以在开放池塘或生物反应器中培养，该开放池塘或生物反应器可以适应藻类产物的最佳生产。
在生长期末期，藻类可以从生长容器(池塘和生物反应器)中回收。可以使用几种方法从大量水/培养基中分离细胞团。非限制性的实例包括筛选、离心、旋转真空过滤、加压过滤、水力旋流(hydrocycloning)、浮选(flotating)、分液(skimming)、筛分和重力沉降。其它技术，诸如添加沉淀剂、絮凝剂或者促凝剂等等，也可以和这些技术联合应用。也可以使用两个或更多的分离阶段。当使用多个分离阶段时，这些分离阶段基于相同或不同的技术。非限制性的实例包括筛选大量的藻类培养内容物，接着过滤或离心流出液。
例如，藻类可以如下所述利用立式漩涡循环、收获蜗旋器和/或吸管从培养基中部分分离出来。或者，可以使用大容量工业规模商业离心机补充或代替其它的分离方法。这类离心机可以从已知的商业来源(例如，Cimbria Sket or IBG Monforts，Germany；Alfa Laval A/S，Denmark)获得。离心、过滤和/或沉淀也可以用于从其它藻类成分中纯化油。通过添加絮凝剂，诸如粘土(例如，颗粒尺寸小于2微米)、硫酸铝或者聚丙烯酰胺，可以帮助从含水培养基中分离藻类。在絮凝剂存在的条件下，藻类可以通过简单的重力沉淀分离，或者可以更容易地离心分离。基于絮凝剂的藻类分离公开在例如美国专利申请公布No.20020079270中，在此引入作为参考。
熟练技术人员会认识到可以使用本领域已知的任何可用于从液体培养基中分离细胞诸如藻类的技术。例如，美国专利申请公布20040121447和美国专利6,524,486(均在此引入作为参考)公开了一种用于从含水培养基中部分分离藻类的切向流过滤装置和设备。其它从培养基中分离藻类的方法已经公开在美国专利5,910,254和6,524,486中，每个专利在此引入作为参考。也可以使用其它已发表的藻类分离和/或提取方法。参考，例如，Rose等人，Water Science and Technology25：319-327，1992；Smith等人，Northwest Science 42：165-171，1968；Moulton等人，Hydrobiologia 204/205：401-408，1990；Borowitzka等人，Bulletin of Marine Science 47：244-252，1990；Honeycutt，Biotechnologyand Bioengineering Symp.13：567-575，1983。
一旦细胞团被收集，就可以通过机械手段、化学(例如酶)手段和/或溶剂萃取法破碎(例如，裂解)藻类细胞，从而释放出藻类产物(例如，油)。
用于破碎细胞的机械手段的非限制性实例包括各种类型的压榨，诸如：螺杆压榨机、间歇压榨机、压滤机、冷榨机、弗氏压碎器；压力下降设备；压力下降匀浆器、胶体磨、珠磨或球磨机、机械剪切装置(例如高剪切混合器)、热休克法、热处理法、渗透冲击法、声波或超声波处理、压出、压榨、研磨、蒸气***、转子-定子破碎器、阀型处理器、固定几何处理器、氮气减压和其它已知方法。大容量商业细胞破碎器也可以从已知的来源(例如，GEA Niro Inc.，Columbia，MD；Constant Systems Ltd.，Daventry，England；Microfluidics，Newton，MA)购买。例如，在含水悬浮液中破碎微藻的方法在美国专利No.6,000,551中已经公开，该专利在此引入作为参考。
化学手段的非限制性的实例包括使用酶、氧化剂、溶剂、表面活性剂和螯合剂。基于所使用的技术的确切性质，细胞破碎可以干燥进行，或者可以存在溶剂、水或者蒸汽。
可以用于破碎或协助破碎细胞的溶剂包括但不限于，己烷、庚烷、醇类、超临界流体、氯化溶剂、丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、醛类、酮类、氯化溶剂、氟化-氯化溶剂及其组合。典型的表面活性剂包括但不限于，去污剂、脂肪酸类、部分甘油脂类、磷酯类、溶血磷酯类、醇类、醛类、聚山梨酯混合物及其组合。典型的超临界流体包括二氧化碳、乙烷、乙烯、丙烷、丙烯、三氟甲烷、氯三氟甲烷、氨、水、环己烷、正戊烷和甲苯。超临界流体溶剂也可以通过包含水或者其它化合物来修饰，以改变该流体的溶剂性质。用于化学破碎的合适的酶包括蛋白酶、纤维素酶、脂酶、磷脂酶、溶菌酶、多糖酶及其组合。合适的螯合剂包括但不限于，EDTA、卟吩(porphine)、DTPA、NTA、HEDTA、PDTA、EDDHA、葡庚糖酸盐、磷酸根离子(各种质子化及非质子化的)及其组合。在某些情况下，溶剂萃取可以与这里所描述的机械或化学细胞破碎法组合使用。也可以使用机械和化学方法的组合。
从含有产物的部分或相中分离破碎的细胞可以通过多种技术实现。非限制性的实例包括离心、水力旋转器、过滤、浮选和重力沉降。在某些情况下，期望包括溶剂或超临界流体，例如，以溶解期望的产物、减少产物和破碎的细胞间的相互作用、减少分离后保留在破碎细胞中的产物、或者提供洗涤步骤以进一步减少损失。适用于这些目的溶剂包括但不限于，己烷、庚烷、超临界流体、氯化溶剂、醇类、丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、醛类、酮类、氟化-氯化溶剂。超临临界流体的例子包括二氧化碳、乙烷、乙烯、丙烷、丙烯、三氟甲烷、氯三氟甲烷、氨、水、环己烷、正戊烷、甲苯及其组合。超临界流体溶剂也可以通过包含水或者其它化合物来修饰，以改变该流体的溶剂性质。
如此分离的产物然后可以根据其希望的用途适当地进一步加工，如通过溶剂去除、干燥、过滤、离心、化学修饰、酯交换反应、进一步纯化、或通过某些步骤的组合。
例如，脂质/油可从生物质中分离，然后用于使用已知形成生物柴油的方法产生生物柴油。例如，可以使用这里所描述的任何方法压榨生物质，并分离所产生的富含脂质的液体。然后可以使用标准的酯交换技术，如已知的Connemann方法(参考，例如美国专利5,354,878，整个内容在此引入作为参考)，将分离出的油加工成生物柴油。
例如，藻类可以被收集，从液体培养基中分离，破碎并分离油内容物(同上)。藻类生成的油会富含甘油三酯。这种油可使用公知的方法转化为生物柴油，诸如Connemann方法(参考，例如，美国专利5354878，在此引入作为参考)，这是已经建立的从植物来源如菜籽油生产生物柴油的方法。标准的酯交换过程包括碱催化的甘油三酯和醇(通常是甲醇)之间的酯交换反应。甘油三酯的脂肪酸被转移到甲醇，生成烷基酯(生物柴油)，并释放出甘油。甘油被移除并可以被用于其他目的。
与分批反应方法(例如，J.Am.Oil Soc.61：343，1984)相比，Connemann方法采用通过反应器柱的反应混合物连续流，其中流速低于甘油的下沉率。这导致甘油从生物柴油中连续分离。反应混合物可以通过更多的反应器柱被处理，以完成酯交换过程。通过水提取可以除去残留的甲醇、甘油、游离脂肪酸和催化剂。
然而，熟练技术人员可以认识到，可以利用任何本领域已知的从含有甘油三酯的油生产生物柴油的方法，例如，美国专利4,695,411、5,338,471、5,730,029、6,538,146、6,960,672公开的方法，每个专利在此引入作为参考。也可以使用不涉及酯交换的替代方法。例如，通过高温分解、气化或热化学液化(参考，例如，Dote，Fuel 73：12，1994；Ginzburg，Renewable Energy 3：249-252，1993；Benemann和Oswald，DOE/PC/93204-T5，1996)。
尽管有上千个已知的种，自然存在的藻类许多(如果不是大多数的话)可用于油/脂类/生物柴油的生产和其他产品的生成。这些藻类可能在异养、光异养或自养条件下代谢。可用于本发明的特别优选的藻类包括绿藻(Chlorophytes)或Bacilliarophytes(硅藻)。
在某些实施方式中，藻类可以经过遗传修饰/遗传工程化，以进一步提高每单位英亩的生物柴油原料产量。用于特定产品输出的藻类的遗传修饰是应用本领域已知的技术相对直接进行的。但是，这里公开的低成本培养、收获和产品提取方法可用于遗传修饰(例如，转基因，非转基因)的藻类。熟练技术人员将认识到不同的藻株会表现出不同的生长和油类生产能力，并且在不同条件下，该***可能包含一个藻株或具有不同特性的株的混合物，或藻株加共生细菌。所用的藻种可以针对地理位置、温度敏感性、光照强度、pH敏感性、盐度、水质、养分利用率、温度或光照的季节性差异、将从藻类获得的期望的终产品和其他多种因素而优化。
在特定的实施方式中，用于生产生物产品(如，油/生物柴油)的藻类可以是遗传工程的(例如，转基因的或通过定向诱变产生的，等等)，以包含一个或多个分离的核酸序列，该核酸序列可以提高生物产品的产量或提供其它用于藻类培养、生长、收获或应用的特点。稳定转化藻类种的方法和包含所用分离核酸的组合物都是本领域中已知的，任何此类方法和组合物都可以在本发明实践中使用。所使用的转化方法的例子可包括微粒轰击、电穿孔、原生质体融合、PEG介导的转化、DNA包被的碳化硅晶须或使用病毒介导的转化(参考，例如，Sanford等人，1993，Meth.Enzymol.217：483-509；Dunahay等人，1997，Meth.Molec.Biol.62：503-9；美国专利Nos.5,270,175；5,661,017，在此引入作为参考)。
例如，美国专利5,661,017公开了含有叶绿素C的藻类的藻类转化方法，这些藻类例如是硅藻纲(Bacillariophyceae)、金藻纲(Chrysophyceae)、褐藻纲(Phaeophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)、针胞藻纲(Raphidophyceae)、普林藻纲(Prymnesiophyceae)、隐藻纲(Cryptophyceae)、小环藻属(Cyclotella)、舟形藻属(Navicula)、细柱藻属(Cylindrotheca)、褐指藻属(Phaeodactylum)、双眉藻属(Amphora)、角毛藻属(Chaetoceros)、菱形藻属(Nitzschia)或者海链藻属(Thalassiosira)。包含所使用的核酸的组合物，如乙酰辅酶A羧化酶，也已经公开。
在各种实施方式中，选择性标记可以被引入分离的核酸或载体，用以选择转化的藻类。可使用的选择性标记可能包括新霉素磷酸转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、氨基糖苷乙酰转移酶、氯霉素乙酰转移酶、潮霉素B磷酸转移酶、博莱霉素结合蛋白、膦丝菌素乙酰转移酶、溴苯腈腈水解酶、草甘膦抗性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶、厚壳桂因碱抗性核糖体蛋白S14、吐根碱抗性核糖体蛋白S14、磺酰脲抗性乙酰乳酸合酶、咪唑啉酮抗性乙酰乳酸合酶、链霉素抗性16S核糖体RNA、壮观霉素抗性16S核糖体RNA、红霉素抗性23S核糖体RNA或甲基苯并咪唑抗性微管蛋白。提高转基因表达的调控核酸序列是已知的，诸如隐秘小环藻(C.cryptica)乙酰辅酶A羧化酶5′-非翻译调控序列、隐秘小环藻乙酰辅酶A羧化酶3′-非翻译调控序列及其组合。
实施例1
在布氏培养基中培养普通小球藻(参考Nichols，Growth Media-freshwater.In：Phycological Methods.Ed.J.R.Stern.CambridgeUniversity Press，Pp 7-24，1973，引入作为参考；还可以参见下表1)，该培养基用0.1％的酵母提取物(DIFCO，MI-Bacto YeastExtract，产品号212750)和0.5％葡萄糖(对照细胞)改良。第二组在添加了10％黄腐酸的同样的培养基中培养，该黄腐酸从风化褐煤(20-25％黄腐酸)中提取。
表1.自养和异养布氏培养基(mg/L)
  化学物质   自养   异养
  NaNO3   250   250
  CaCl2.2H2O   25   25
  MgSO4.7H2O   75   75
  K2HPO4   75   75
  KH2PO4   175   175
  NaCl   25   25
  EDTA   50   50
  KOH   31   31
  Fe2SO4.7H2O   4.98   4.98
  H2SO4   0.001mL/L   0.001mL/L
  H3BO3   11.42   11.42
  ZnSO4.7H2O   8.82   8.82
  MnCl2.4H2O   1.44   1.44
  MoO3   0.71   0.71
  CuSO4.5H2O   1.57   1.57
  Co(NO3)2.6H2O   0.49   0.49
  酵母提取物   -   1000
  C6H12O6   -   5000
可以制备母液以便向培养基中添加化学品。
为了制备黄腐酸，约25g粉末化的风化褐煤物质(加拿大Alberta开采，由Black Earth Humates Ltd，Edmonton，Alta.，T5L 3C1提供)用大约500ml 1％的NaOH溶液水合。据信会释放出腐殖酸和黄腐酸混合物到溶液中。将该混合物静置使得有机灰分物质沉淀到底部后，小心吸去液体上部。然后加入大约2ml 98％的硫酸以酸化吸去部分。相信会使腐殖酸沉淀到容器底部。然后将该部分分配到两个150ml离心容器中。然后以大约10,000rpm离心这两个容器大约10分钟。腐殖酸被离心到底部，将黄腐酸部分小心地从上层倾倒出。黄腐酸的产率可能不同，这取决于所用的风化褐煤的质量。通常情况下，使用目前的材料产生约250-280毫升的黄腐酸部分。然后以生长培养基的5-12.5％(v/v)使用此黄腐酸。
对照细胞的平均半径约为3.4m，液泡发育极小。在黄腐酸改良培养基中培养的细胞表现出广泛多样化的细胞大小。最大的细胞平均半径达到约5.6m，并表现出非常大的液泡。这些液泡是含脂的，用尼罗红染色得到证实。黄腐酸刺激细胞产生远远超过对照细胞的存储产物。
值得注意的是，在这里所示的实施例中，在黄腐酸存在的情况下，大量的藻类细胞被诱导成存储模式，尽管事实上培养基中的氮是不受限制的。预计当藻类细胞在氮限制条件下培养时，出现大型含脂液泡的细胞的频率将大大增加。此外，预计培养物中的油含量将达到80+％(或许90％以上)的范围。
实施例2
Auxenochlorella protothecoides在用0.1％酵母提取物(见上文)和0.5％葡萄糖(对照组)改良的布氏培养基(见上文)中生长。其他两组在相同的培养基中培养，一组添加吲哚乙酸(2mg/L，Cat.No.12886，Sigma-Aldrich Canada Ltd.)，另一组添加赤霉酸(2mg/L，Cat.No.G7645，Sigma-Aldrich Canada Ltd.)。七天后测量干重并比较两组培养物。
相对于对照组，吲哚乙酸处理组的干细胞质量增加了50％。赤霉酸处理组的干细胞质量增加了20％。此外，吲哚乙酸处理的细胞的油产量增加了15％。
实施例3
原壳小球藻在含有或没有某种生长因子组合的条件下生长的比较
使用的母液配方(formula)是0.25g激动素，0.25g 6-BA，0.5gNAA，0.5g GA3，1.0g维生素B1，1.0L dH2O。将19.5nL加入250mLHGM(见下表)生成配方2。向摇瓶接种原壳小球藻，使起始光密度为0.04吸光度单位。将摇瓶放置在摇床上，于125rpm及异养(暗)条件下。温度保持在约23℃。每天测量光密度。结果列于图3中。
表2.异养生长培养基(HGM)
Figure BPA00001405748600291
备注1：NaEDTA.2H2O，075g/L；FeCl3.6H2O，0.097g/L；MgCl2.4H2O，0.041g/L；boricacid，0.011g/L；ZnCl2，0.005g/L；CoCl2.6H2O，0.002g/L；CuSO4，0.002g/L；Na2MoO4.H2O，0.002g/L.
备注2：HGM是改良的布氏培养基，具有提高的NaNO3浓度(从2.94mM终浓度到8.82mM终浓度)，和额外的成分，包括0.4％酵母提取物(Bacto)，2.0％葡萄糖和微量金属的混合物(见备注1)。传统的布氏培养基不含葡萄糖，因为在光养条件下生长的藻类利用光合作用产生有机化合物，如碳水合物。
备注3：培养基置于Nephelo烧瓶(250ml)中，并于121℃灭菌20分钟。
结果表明配方1生成生物质的速率比对照异养生长培养基要快。对照和配方1的比生长速率，μ，分别为1.4和1.8。
实施例4
原壳小球藻在含有或没有某种生长因子组合的条件下生长的比较
所使用的母液配方是0.25g激动素，0.25g 6BA，0.5g NAA，0.5gGA3，1.0g维生素B1，1.0L dH2O。将4.7nL添加到250mL HGM(参考上表)中，生产配方2。向摇瓶中接种原壳小球藻，使得起始光密度为0.04吸光度单位。将摇瓶放置在摇床上，于125rpm及异养(暗)条件下。温度保持在约23℃。每天测量光密度。结果列于图4中。
结果表明配方2生成生物质的速率比对照异养生长培养基要快。对照和配方2的比生长速率，μ，分别为1.4和1.6。
实施例5
原壳小球藻在含有或没有某种生长因子组合的条件下生长的比较
所使用的母液配方是0.25g激动素，0.25g 6BA，0.25g NAA，0.25gIAA，0.5g GA3，1.0g维生素B1，1.0L dH2O。将19.5nil添加到250mLHGM(参考上表)中，生成配方3。向摇瓶中接种原壳小球藻，使起始光密度为0.04吸光度单位。将摇瓶放置在摇床上，于125rpm和异养(暗)条件下。温度保持在约23℃。每天测量光密度。结果列于图5中。
结果表明配方3生成生物质的速率比对照异养生长培养基要快。对照和配方3的比生长速率，μ，分别为1.4和1.8。
实施例6
原壳小球藻在含有或没有某种生长因子组合的条件下生长的比较
所使用的母液配方是0.25g激动素，0.25g 6BA，0.25g NAA，0.25gIAA，0.5g GA3，1.0g维生素B1，1.0L dH2O。将4.7nL添加到250mLHGM(参考上表)中，生成配方4。向摇瓶中接种原壳小球藻，使起始光密度为0.04吸光度单位。将摇瓶放置在摇床上，于125rpm以及异养(暗)条件下。温度保持在约23℃。每天测量光密度。结果列于图6中。
结果表明配方4生成生物质的速率比对照异养生长培养基要快。对照和配方4的比生长速率，μ，分别为1.4和1.8。
上述所使用的调节剂浓度列于下表3中。
表3.植物生长调节剂刺激的藻类生长的概括
Figure BPA00001405748600311
实施例7光异养和异养生长
评估了斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)和原壳小球藻生长过程中光暴露的影响。两种藻类的生长速率在光异养生长条件下都较高。斜生栅藻在光异养生长下的生长速率提高约86.7％。同时，当原壳小球藻在光异养生长条件下生长时，其生长速率提高了39.07％。这些实验的结果总结在下面的表4-7中。
表4.不同的激素浓度对在光异养条件下培养48小时的斜生栅藻的生长速率的影响
表5.不同的激素浓度对在异养条件下培养48小时的斜生栅藻的生长速率的影响
Figure BPA00001405748600322
表6.不同的激素浓度对在光异养条件下培养48小时的原壳小球藻的生长速率的影响
Figure BPA00001405748600323
表7.不同的激素浓度对在异养条件下培养48小时的原壳小球藻的生长速率的影响
Figure BPA00001405748600331

Claims (39)

1.一种增强藻类细胞增殖的方法，包括在一种或多种植物生长调节剂、其模拟物、或其混合物的存在下培养所述藻类，以增加藻类细胞数。
2.权利要求1的方法，其中藻类细胞数至少增加约5％、10％、20％、50％、75％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍或以上。
3.权利要求1的方法，其中藻类细胞***的速度至少增加约5％、10％、20％、50％、75％、100％、200％、500％、1000％或更多。
4.权利要求1的方法，其中藻类培养的群体倍增时间是大约0.05-2天。
5.权利要求1的方法，其中所述植物生长调节剂包括至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种选自植物生长素、细胞***素、赤霉素和/或其混合物的生长激素。
6.权利要求5的方法，其中所述植物生长素包括吲哚乙酸(IAA)和/或1-萘乙酸(NAA)。
7.权利要求5的方法，其中所述赤霉素包括GA3。
8.权利要求5的方法，其中所述细胞***素是腺嘌呤型细胞***素或苯脲型细胞***素。
9.权利要求8的方法，其中所述腺嘌呤型细胞***素包括激动素、玉米素和/或6-苄氨基嘌呤，所述苯脲型细胞***素包括二苯脲和/或噻苯隆(TDZ)。
10.权利要求1的方法，其中所述植物生长调节剂还包括维生素B1或其类似物/模拟物。
11.权利要求5的方法，其中所述植物生长素与细胞***素的比例(w/w)约为1∶2至2∶1(w/w)，或约1∶1(w/w)。
12.权利要求5的方法，其中所述植物生长素与赤霉素的比例(w/w)约为1∶2至2∶1(w/w)，或约1∶1(w/w)。
13.权利要求1的方法，其中所述模拟物是苯氧乙酸化合物。
14.权利要求1的方法，还包括在含有非限制水平的营养物和最佳细胞增殖所需的微量元素的培养基中培养所述藻类。
15.权利要求14的方法，其中所述营养物包括一种或多种C、N、P、S和/或O源。
16.权利要求14的方法，其中所述营养物的浓度对于细胞***和/或生长是无毒的。
17.权利要求1的方法，其中所述藻类在细胞***的最适温度下培养，所述最适温度的范围对于非嗜热藻类为约0-40℃，对于嗜热藻类为约40-95℃，或约60-80℃。
18.权利要求1的方法，其中所述藻类在生物反应器中培养。
19.权利要求18的方法，其中所述生物反应器适合灭菌。
20.权利要求18的方法，其中所述生物反应器适应于最佳的细胞增殖。
21.权利要求1的方法，其中所述藻类利用异养、光异养或自养的生理机制代谢。
22.权利要求1的方法，其中所述藻类是杂色藻类。
23.权利要求1的方法，其中所述藻类是绿藻类或硅藻类。
24.权利要求1的方法，其中所述藻类具有无藻壳的形式。
25.权利要求1的方法，其中所述藻类不是褐藻(褐藻科)或红藻。
26.权利要求1的方法，其中所述藻类不是破囊壶菌。
27.一种生产藻类产物的方法，包括在植物生长调节剂或其模拟物的存在下培养藻类，以积累藻类产物。
28.权利要求27的方法，其中藻类细胞数增加不超过一个log(1000％)、300％、200％、100％或50％。
29.权利要求27的方法，其中藻类生物质显著增加。
30.权利要求29的方法，其中藻类生物质增加至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％。
31.权利要求29的方法，其中由于所述藻类产物的积累，藻类生物质大大增加。
32.权利要求27的方法，其中所述藻类在氮限制培养基(例如，约1.5-15mgN/L)或含有为藻类产物合成优化的氮水平的培养基中培养。
33.权利要求27的方法，其中所述植物生长调节剂包括油刺激因子。
34.权利要求33的方法，其中所述油刺激因子包括腐殖酸盐，如黄腐酸或腐殖酸。
35.权利要求27的方法，其中所述藻类在生物反应器中培养。
36.权利要求35的方法，其中所述生物反应器适合灭菌。
37.权利要求35的方法，其中所述生物反应器适应于藻类产品的最佳生产。
38.权利要求27的方法，其中所述藻类产品是油或脂质。
39.权利要求38的方法，其中所述藻类产品包括Omega-3、Omega-6和/或Omega-9。
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