CN102279270A - 利用聚集诱导发光监测β淀粉样蛋白聚集过程的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用聚集诱导发光监测β淀粉样蛋白聚集过程的方法，属于生物医学研究和临床检测技术领域。该方法利用马来酰亚胺与半胱氨酸上巯基的高亲和性，将β淀粉样蛋白特异性地结合在聚集诱导荧光探针上。基于聚集诱导发光增强现象监测β淀粉样蛋白的聚集过程。该方法具有高灵敏、高选择性、稳定性好，易控制，制作成本低廉等优点。可以监测微摩尔甚至纳摩尔的Aβ42和Aβ40含量，且检测速度比利用ANS（8-苯胺-1-萘磺酸）等探针的监测方法提高15倍。可以定性或定量地监测β淀粉样蛋白聚集过程，将用其于潜伏期老年性痴呆患者的病理诊断，具有很好的应用前景。

Description

利用聚集诱导发光监测β淀粉样蛋白聚集过程的方法

技术领域

本发明涉及β淀粉样蛋白聚集过程的监测方法，尤其涉及利用聚集诱导发光法监测β淀粉样蛋白聚集过程的方法，属于生物医学研究和临床检测技术领域。 

背景技术

阿尔兹海默氏病（Alzheimer’s Disease，AD）是引起老年性痴呆最常见的一种疾病。目前，AD是老年人群中继心脑血管病、癌症、中风之后的第四大杀手。AD的病理学特征是在患者的大脑中可以观察到细胞外衰老斑块和细胞内的神经元纤维缠结，这是因为β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）在细胞内外异常聚结可以形成对神经元细胞具有毒害作用的短肽聚集体。在血浆、脑脊髓液和短肽聚集体中最常见的Aβ是Aβ 40和Aβ 42（Aβ 42 更容易聚集，毒性更强），它们是由淀粉样蛋白前体依次经过β和γ-分泌酶定点酶切而产生的。对AD患者的诊断当前主要是依据其记忆和行为的部分丧失，对于潜伏期患者的病理诊断是一个具有挑战意义的世界前沿课题。 

据医学相关资料显示，在全球已有的2400万老年性痴呆患者中，我国约占1/4，并以每年100万的速度递增。当前，对无症状的AD患者的检测最常用的技术有磁共振成像（magnetic resonance Imaging，MRI）、 正电子发射成像（positron emission tomography ，PET）和光学成像（optical imaging）、表面增强拉曼（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）光谱、扫描电化学显微镜（scanning electrical microscopy，SEM）技术和电化学方法等。MRI的灵敏度较低，在临床医学难以有效利用；PET价格太高，而且目前可供选择的同位素标记的PET探针较小，这些大大限制了其广泛应用。电化学方法需要复杂的电极制备过程。内源荧光法检测β淀粉样蛋白聚集体的文献也有报道，但是，发内源荧光的色氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸的激发波长和发射波长都处于紫外区，难以直接成像观察，且量子产率较低，检测灵敏度较低。荧光探针可以吸附或者共价结合到蛋白质上，导致其荧光特性（发射波长、荧光强度、荧光偏振度等）发生变化，进而可以对蛋白质进行定性和定量研究。目前，在A β的荧光检测中最常用的荧光探针有硫磺素（Thioflavin，ThT）、刚果红（Congo Red， CR）和8-苯氨基-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）等。这些探针都是通过疏水作用和蛋白质相结合，引起荧光探针荧光特性的变化，所以，特异性很差；另外，这些探针的检测重复性都很差；这些探针也无法检测淀粉体形成过程中出现的一些中间体。再加上，β淀粉样蛋白在体液中含量低，聚集速度较慢，所以，设计合成能监测β淀粉样蛋白聚集过程的超灵敏促动器和传感器，开发出对老年性痴呆患者早期诊断的医用试剂盒，可以使很多早期患者早发现、早治疗，大大减少患者的身体痛苦和经济负担。Roberti 等发现将Aβ的姊妹蛋白α-同核蛋白（α-synuclein）修饰在量子点（Qdot 605）上之后，形成一个可以促进α-synuclein聚集的成核中心，该方法可以快速、灵敏地研究α-synuclein在活细胞内的聚集过程。Jovin等在荧光物质芘上通过共价键偶联马来酰亚胺（maleimide），在α-synuclein上将惰性的丙氨酸突变为含有羟基的半胱氨酸（（Cysteine， Cys）），利用马来酰亚胺与巯基的高亲和性，在α-synuclein的三种突变体上标记了芘分子。利用芘聚集后形成激基缔合物（excimer）后产生的发射峰来检测α-synuclein的聚集。尽管芘分子可以形成激基缔合物，但是，由于激基缔合物在470 nm处的荧光峰较小，所以，只能定性地说明形成了聚集体，无法准确地定量说明聚集程度。 

聚集诱导荧光增强（aggregation induced emission enhancement，AIEE）型化合物是近年来荧光探针方面的一个研究热点。由于其特殊的分子结构，其在有机溶剂中荧光很弱甚至不发光，如果其存在的溶剂环境极性增加，或者化合物以聚集体或者固体形式存在时，分子内本来可以自由旋转的一些取代基旋转受阻，这样强烈地抑制了荧光分子的非辐射失活过程，导致AIEE型化合物的荧光大大增强。 如果在Aβ 42或者Aβ 40上特异性地标记上一种AIEE型化合物分子，Aβ 42或者Aβ 40分子的聚集必然导致AIEE型化合物的聚集，荧光增强。可以定性或定量地监测β淀粉样蛋白聚集过程，将用其于潜伏期老年性痴呆患者的病理诊断，具有很好的应用前景，目前还未见相关文献报导。 

发明内容

本发明目的是提供一种可以高灵敏、高选择性地监测β淀粉样蛋白聚集过程的聚集诱导发光新方法，为老年痴呆症等疾病的早期诊断提供有益信息。 

为实现本发明目的，本发明利用马来酰亚胺与半胱氨酸上巯基的高亲和性，将β淀粉样蛋白特异性地结合在聚集诱导荧光探针上，基于聚集诱导发光增强现象，高灵敏、高选择性地监测β淀粉样蛋白聚集过程，从而定性或定量地监测人体内β淀粉样蛋白变化。 

具体技术方案：首先合成具有聚集诱导发光增强效应的荧光探针，利用共价键在聚集诱导荧光探针分子上偶联马来酰亚胺，将β淀粉样蛋白42分子上的第2位的甘氨酸突变成半胱氨酸，利用马来酰亚胺与半胱氨酸上巯基的高亲和性，将β淀粉样蛋白特异性地结合在聚集诱导荧光探针上，用聚集诱导发光增强法监测β淀粉样蛋白的聚集过程。 

具体通过以下步骤实现： 

1) 将Aβ42 分子上的第2位的甘氨酸突变成半胱氨酸的β-淀粉样蛋白溶解在磷酸盐缓冲溶液中；

2) 然后加入如下结构的具有聚集诱导发光增强效应的荧光探针：

荧光探针 1

或

荧光探针2

或

荧光探针3        ；

3）在步骤（2）制得的溶液中加入β淀粉样蛋白待测样品，监测其荧光强度，利用聚集诱导发光增强监测β淀粉样蛋白的聚集过程。

所述的磷酸盐缓冲溶液为磷酸盐0.2 M，pH 7.4缓冲溶液。 

本发明建立了一种监测β淀粉样蛋白聚集过程的聚集诱导发光新方法，选取偶联有马来酰亚胺基团的具有聚集诱导发光效应的三种荧光探针分子，将Aβ42分子上第2位的甘氨酸突变成半胱氨酸，利用马来酰亚胺与半胱氨酸上巯基的高亲和性，将β淀粉样蛋白特异性地结合在聚集诱导荧光探针上。β淀粉样蛋白的聚集可以引起标记在其上的聚集诱导荧光探针分子存在的环境疏水性增加，荧光增强，可以高灵敏、高选择性地监测β淀粉样蛋白的聚集过程。具有以下优点： 

1) 监测β淀粉样蛋白的聚集诱导发光法具有很低的荧光背景，灵敏度大大地提高；

2) 将Aβ42 （β淀粉样蛋白42）分子上的第2位的甘氨酸突变成半胱氨酸的β淀粉样蛋白42，所述的变异位置既能有效地将荧光探针标记在β淀粉样蛋白42分子上又不至于改变Aβ42分子的聚集行为。利用马来酰亚胺与半胱氨酸上巯基的高亲和性，提高了监测方法的选择性；

3)制备方法简单，容易控制，制作成本低廉，简单高效；监测方法稳定性好，重现性好；

4) 应用范围广，可以在聚集诱导荧光探针上连接其它蛋白质或者利用聚集诱导发光增强现象研究蛋白质分子或者DNA分子的结构变化。

5）通过聚集诱导发光增强现象，可以监测微摩尔甚至纳摩尔的Aβ 42和Aβ 40含量，且检测速度比利用ANS（8-苯胺-1-萘磺酸）等探针的监测方法提高15倍。 

具体实施方式

为对本发明进行更好的说明，举实施例如下： 

实施例一 用偶联有马来酰亚胺的荧光探针1监测β淀粉样蛋白42的聚集过程，通过以下步骤实现：

1、合成偶联有马来酰亚胺荧光探针1,，该探针是水溶性的。合成路线如下所示。

2、 购买第2位的甘氨酸突变成半胱氨酸的Aβ42，将其溶解在磷酸盐缓冲溶液中（0.2 M，pH 7.4）。 

3 、在上述步骤2中加入偶联有马来酰亚胺荧光探针1，利用马来酰亚胺和半胱氨酸上巯基之间形成的特异性共价键将β淀粉样蛋白特异性地结合在聚集诱导荧光探针上。 

4 、利用聚集诱导发光增强监测β淀粉样蛋白的聚集过程：将上述制备好的探针放入含有50 nM Aβ42及400倍补体C3、补体C4、IGA、IGM、IGG、IGD、IGE、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子，200倍血清白蛋白、β-脂蛋白、α-1酸性糖蛋白、α-1抗胰蛋白、甲胎蛋白、触珠蛋白、铜蓝蛋白、α-2巨球蛋白、α-2脂蛋白、转铁蛋白，100倍的α-1球蛋白、α-2球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白样品中，发现β淀粉样蛋白发生聚集，β淀粉样蛋白的聚集引起标记在其上的聚集诱导荧光探针分子1存在的环境疏水性增加，荧光增强。用聚集诱导发光增强监测β淀粉样蛋白的聚集过程，线性范围为4-100 nM (R=0.9958)，检测限为0.5 nM（3σ），有较好的灵敏度。且上述干扰物均不干扰β淀粉样蛋白的测定（相对标准偏差控制在5%以内），具有较好的选择性。30 分钟检测完毕。 

偶联有马来酰亚胺的荧光探针1 合成路线 

化合物1和2在NaH和Ph₃P的条件下反应生成中间产物3，中间产物3在CHCl₃和NaOAc的条件下和顺丁烯二酸酐反应生成化合物4，化合物4和BBr₃反应生成化合物5，化合物5在氢氧化钠环境中和二溴乙烷反应生成中间体6，中间体6在四氢呋喃和水的混合溶剂中和三乙基胺作用，生成目标产物7。

实施例二 用偶联有来酰亚胺的荧光探针2监测β淀粉样蛋白42的聚集过程，通过以下步骤实现： 

1 、合成偶联有马来酰亚胺荧光探针2，该探针是水溶性的。合成路线如下所示。

2、购买第2位的甘氨酸突变成半胱氨酸的Aβ42，将其溶解在磷酸盐缓冲溶液中（0.2 M，pH 7.4）。 

3 、在上述步骤2中加入偶联有马来酰亚胺荧光探针2，利用马来酰亚胺和半胱氨酸上巯基之间形成的特异性共价键将β淀粉样蛋白特异性地结合在聚集诱导荧光探针上。 

4、利用聚集诱导发光增强法监测β淀粉样蛋白的聚集过程：将上述制备好的探针放入含有30 nM的Aβ42及300倍补体C3、补体C4、IGA、IGM、IGG、IGD、IGE、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子，150倍血清白蛋白、β-脂蛋白、α-1酸性糖蛋白、α-1抗胰蛋白、甲胎蛋白、触珠蛋白、铜蓝蛋白、α-2巨球蛋白、α-2脂蛋白、转铁蛋白，50倍的α-1球蛋白、α-2球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白样品中，发现β淀粉样蛋白发生聚集，β淀粉样蛋白的聚集引起标记在其上的聚集诱导荧光探针分子2存在的环境疏水性增加，荧光增强。用聚集诱导发光增强法监测β淀粉样蛋白的聚集过程，线性范围为5-90 nM (R=0.9975)，检测限为1 nM（3σ），有较好的灵敏度。且上述干扰物均不干扰β淀粉样蛋白的测定（相对标准偏差控制在5%以内），具有较好的选择性。30 分钟检测完毕。 

 

偶联有马来酰亚胺的荧光探针2合成路线

化合物1在NaH条件下和Ph₃P反应生成中间体2，中间体2和化合物3反应生成产物4，产物4和AgNO₃反应生成产物5，产物5在CHCl₃以及HAc/NaOAc环境中和顺丁烯二酸酐反应生成目标产物6。

实施例三 用偶联有马来酰亚胺的荧光探针3监测β淀粉样蛋白42的聚集过程，通过以下步骤实现： 

1、 合成偶联有马来酰亚胺荧光探针3，该探针是水溶性的。合成路线如下所示。

2、 购买第2位的甘氨酸突变成半胱氨酸的Aβ42，将其溶解在磷酸盐缓冲溶液中（0.2 M，pH 7.4）。 

3 、在上述步骤2中加入偶联有马来酰亚胺荧光探针3，利用马来酰亚胺和半胱氨酸上巯基之间形成的特异性共价键将β淀粉样蛋白特异性地结合在聚集诱导荧光探针上。 

4 、利用聚集诱导发光增强法监测β淀粉样蛋白的聚集过程：将上述制备好的探针放入含有50 nMAβ42及500倍补体C3、补体C4、IGA、IGM、IGG、IGD、IGE、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子，200倍血清白蛋白、β-脂蛋白、α-1酸性糖蛋白、α-1抗胰蛋白、甲胎蛋白、触珠蛋白、铜蓝蛋白、α-2巨球蛋白、α-2脂蛋白、转铁蛋白，150倍的α-1球蛋白、α-2球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白样品中，发现β淀粉样蛋白发生聚集，β淀粉样蛋白的聚集引起标记在其上的聚集诱导荧光探针分子3存在的环境疏水性增加，荧光增强。用聚集诱导发光增强法监测β淀粉样蛋白的聚集过程，性范围为10-150 nM (R=0.9982)，检测限为2 nM（3σ）。有较好的灵敏度。且上述干扰物均不干扰β淀粉样蛋白的测定（相对标准偏差控制在5%以内），具有较好的选择性。30 分钟检测完毕。 

偶联有马来酰亚胺的荧光探针3合成路线 

化合物1在对甲基苯磺酸环境中和乙二醇反应生成化合物2，化合物2在Zn/TiCl₄催化下和化合物3反应生成产物4，产物4在三氯甲烷和NaOAC条件下和顺丁烯二酸酐反应生成化合物5，化合物5在对甲基苯磺酸的环境中转化成化合物6，化合物6和反应物7反应生成目标产物8。

本发明基于荧光探针聚集诱导发光增强现象，高灵敏、高选择性地监测β淀粉样蛋白的聚集过程，取得了较好的效果。 

Claims (2)

1.一种利用聚集诱导发光监测β淀粉样蛋白聚集过程的方法，其特征

在于，通过以下步骤实现：

1) 将Aβ42 分子上的第2位的甘氨酸突变成半胱氨酸的β-淀粉样蛋白溶解在磷酸盐缓冲溶液中；

2) 然后加入如下结构的具有聚集诱导发光增强效应的荧光探针：

或

或

；

3）在步骤（2）制得的溶液中加入β淀粉样蛋白待测样品，监测其荧光强度，利用聚集诱导发光增强监测β淀粉样蛋白的聚集过程。

2.如权利要求1所述的一种利用聚集诱导发光监测β淀粉样蛋白聚集过程的方法，其特征在于，磷酸盐缓冲溶液为0.2 M，pH 7.4缓冲溶液。