CN102260683A - 一种编码水稻转录因子wrky蛋白的基因及其表达载体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因及其表达载体与应用。本发明基因在水稻根、茎、叶、花、穗等组织中有表达，根、花中表达丰度最高，其次为茎、叶，穗中的丰度低。本发明基因受茉莉酸、乙烯和水稻纹枯病菌诱导，而水杨酸则抑制其表达。本发明基因编码的蛋白具有转录激活活性，超表达转基因株系的T2代水稻植株对纹枯病的抗性增强，表明该基因是植物抗病防卫反应的正调节因子，可以应用于水稻等作物的抗病分子育种工程。

Description

一种编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因及其表达载体与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因及其表达载体与应用。

背景技术

植物在长期的进化过程中，形成了复杂而精巧的抗病防卫机制。植物防卫过程的激活大多涉及宿主基因表达的时序调控，且调控多数发生在转录水平。转录因子与基因启动子区域中的顺式作用元件特异结合，从而调节特定基因的时空表达。表达谱分析、突变体和转基因实验都证明了转录因子在植物防卫反应的调控中起关键作用。因此，分离和鉴定抗病信号途径中的转录调节组分对阐明植物防卫反应的分子机理至关重要。

WRKY蛋白是主要存在于植物中的一类转录因子(

and Somssich，2004)。高等植物的WRKY构成转录因子超家族，水稻中有100个以上成员(Wuet al，2005)。它们共同的结构特征是含有1-2个WRKY结构域。该结构域包含大约60个氨基酸残基，N端的七肽WRKYGQK十分保守，其后紧接一个C2H2或C2HC的锌指纹。根据WRKY保守域的数目和锌指纹的类型，将WRKY蛋白分成3个组(Eulgem et al，2000)。

WRKY蛋白的主要功能是参与植物抗病防卫反应的调节(Pandey andSomssich，2009)。证据表明，一些水稻WRKY基因参与抗病信号的传递与调节。OsWRKY03、71作用于SA依赖的抗病信号途径，调节下游基因OsNPR1和PR1b的表达(Liu et al.，2005，2007)。OsWRKY13作为SA信号途径的激活蛋白和JA信号途径的抑制蛋白，介导水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性(Qiu et al.，2007)；进一步的分析表明，OsWRKY13通过激活谷胱甘肽氧化/还原***和类黄酮生物合成途径，以监测细胞的氧化还原状态和刺激植保素合成，从而在抗病反应中发挥作用(Qiu et al.，2008)。同样，OsWRKY45的功能研究也较深入，超表达植株对稻瘟病的抗性增强，RNA干涉抑制表达植株则对这种病害的抗性减弱，该转录因子作用于SA介导的抗病信号途径，但不依赖于NH1(Shimono etal.，2007)。另外一个研究小组发现，超表达OsWRKY45的拟南芥植株对丁香假单胞菌和干旱、高盐的抗性均增强(Qiu and Yu，2009)，提示它在生物和非生物胁迫信号途径的整合中发挥作用。有趣的是，来源于籼稻的OsWRKY45-2与粳稻的等位基因OsWRKY45-1仅有10个氨基酸的差异，然而它们在水稻与白叶枯菌、细菌性条纹病菌的互作中表现出相反的调节效应：前者是抗病反应的正调节子，后者是负调节子，这可能是由于它们介导不同的信号途径的缘故(Tao et al.，2009)。Wang et al.(2007)的实验表明，超表达OsWRKY89的水稻植株对稻瘟菌的抗性增强，抑制表达的植株则表现出相反的表型，这种调节作用是通过改变叶片表面蜡质代谢和排列分布实现的。Peng et al.(2008)报道，OsWRKY62在植物先天性免疫中扮演一个负调控因子的角色，超表达株系中防卫基因的活化受到抑制，对白叶枯病的基础抗性和Xa21介导的抗性均有所减弱。另外，OsWRKY53、31和23在植物抗病反应中的调节功能也得到了不同程度的解析(Chujo et al.，2007；Zhang et al.，2008；Jing et al.，2009)。

WRKY还参与植物对非生物胁迫的应答和某些发育、代谢过程。如参与对低温、高盐、干旱、氧化胁迫等非生物胁迫的应答；参与衰老、表皮毛的形态构建和种子大小的控制；参与糖代谢、倍半萜烯合成和脱落酸(ABA)等植物激素介导的信号途径。WRKY还与植物对UV-B的抗性有关。

水稻是单子叶植物研究的模式植物，是基因组最小、进化程度最低的禾本科植物，与其它禾本科植物如小麦、玉米、高梁、甘蔗基因组间存在共线性(colineariy)。因此，水稻基因组结构与功能的研究对其它禾本科植物的相关研究具有很大的借鉴意义。水稻又是重要的经济作物，是世界半数以上人口的主要食物来源，其基因组全序列测定的完成(International Rice GenomeSequencing Project，2005)为水稻功能基因组学的研究奠定了基础，从水稻基因组中挖掘有用的基因，用于提高产量、改善品种、提高抗逆性，是目前植物功能基因组学和农业高技术领域的研究热点。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因。

该基因为如下(a)或(b)或(c)或(d)所述的核苷酸序列：

(a)序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列；

(b)编码序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的核苷酸序列；

(c)与序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

(d)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

所述高严谨条件为在0.1×SSPE或0.1×SSC、0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

所述SEQ ID No：1核苷酸序列，具体如下：

AATACTGAAT AGGCAGCAGC AACAGCAGCA GCAGCTAATT AAGCATCAGA CAGAAACTAG  60

AAAGAGCGAG CACGCCACTA TGGATATGAT GGAGGAGGAG GCTGCCAACG CCGCCACTGC  120

TCAAGCTGCT GCTGCTGGCG ACCTCGCCGA CGTCGTGGCC CGTGCCAATG CACGCGCATT  180

CCTCGTCTCC ACCCCTCACC ATCACCCCTC ACCTCTGCAT CCTCTTCCTC CTCCTCCCAT  240

GCCTCAGGCG CCTCACCAAT ACTATCCCGC CCCCCAGATC ACCATCCCTT ACCACCACCA  300

CCACCACGGA GAGCTTCGGC GCCCTACCAC CATCGCTTAC ACCGACGCAC CTGTGCCGTT  360

CGAGACGGCG GGGCCGCCAT CCACGGTCGT CGACTCATAC CACCACCTCA CACCCGGCGA  420

CGCCGGCTAC GGGATGCCGC GGCCGCTTGC TCTCCAGATC TCCCAGCACG CCCTCTGTGG  480

CGGCGGCGAC GTGGTGATGG GCGGCGGAGG CGCAGGCGCT GCCGATGATG GAGAAGAAGC  540

CATCAGGATC TCGCCACTGA CGCCGTCTGC TCATCATCAA ATGATGAAAA GGAAGAATGA  600

GGTGAAGAAA GTGGTGTGCA TCCCGGCGCC GCCAGCGACG AGTAGCCGTG GAGGTGGAGG  660

AGAGGTGATC CCGTCTGATC TATGGGCATG GAGGAAGTAC GGCCAGAAAC CCATCAAAGG  720

CTCTCCTTAT CCACGGGGTT ACTACAGATG CAGCAGCTCA AAGGGATGTA TGGCGAGGAA  780

GCAGGTGGAG CGCAGCCGCA GCGACCCCAA CATGCTGGTG ATCACCTACG CGGCGGAGCA  840

CAACCACCCA TGGCCGATGC AACGTAATGT GCTCGCCGGA TATGCCCGTT CTCATCACAG  900

TACTCATGCT ACTGCCTCCA GCAGCCGCCA CAAGCAACAG CAGCAGCAGC AGACCAACCA  960

GCTGCAGCCT GCACTGATCA CAAGCTCATC GTCTTCTTCC TCCTCCCCAT TCAATCTCTA  1020

CGCCGACGTC GTGCTCGGTG GCCAACAGGC CAACATGATG ATGACGACGG AGGGCGCCGG  1080

CGCTGGACTT GGCATCCAAC CTTCAGCAGC TGATGAGGTC TTTGCAGAGC TGGAGGAGTT  1140

GGAGCCTGAT AATCCTACTA TGATCAATGC AAACATGCAG GTGTACTCCA CCACCAGCAG  1200

GCCAGGGGTA AGCAGCTATG ATCATCAGTG GCACAAGTTC TAATAATTAA ACCATGCAGT  1260

ACCTATATAT ATATATATCA GAACTTCAAT ATTCGAGAGA GGAGATCAGA GGAAATTGAA  1320

TTCTAGCACG TACAATTAAT ACATCATGAC TATGCAAAAT TTACATATAT ATGATATGAT  1380

GGTCGCCTGT GCGATTATTA GTGACCAAAT TAAAGATTGT CAGAGATATA GGCGTGTACT  1440

TACGCTTATA TGTATCACGC TGAGGTATAC TGTATTTACA AGAAGATAAA TAAAATATCC  1500

ATATC                                                              1505

其中，序列表SEQ ID No：1从茉莉酸甲酯处理的水稻幼苗叶RNA中通过RT-PCR的方法克隆，由1505个脱氧核苷酸组成，包含长1164bp的开放读码框，推测编码有387个氨基酸组成的蛋白质。自5′端第1位至第79位为5′未翻译区序列，第80位至1240位脱氧核苷酸为编码序列，第1241位至1243位为终止密码子，第1244位到1505位为3′未翻译区序列。

本发明的第二个目的在于提供一种上述基因编码的水稻转录因子WRKY蛋白，该蛋白为以下(a)或(b)所述的氨基酸残基序列：

(a)序列表中SEQ ID No：2所述的氨基酸残基序列；

(b)将(a)中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有水稻转录因子WRKY蛋白功能的由(a)衍生的氨基酸残基序列；

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

所述SEQ ID No：2氨基酸残基序列，具体如下：

Met Asp Met Met Glu    Glu Glu Ala Ala Asn    Ala Ala Thr Ala Gln    Ala Ala Ala Ala Gly

                 5                      10                     15                     20

Asp Leu Ala Asp Val    Val Ala Arg Ala Asn    Ala Arg Ala Phe Leu    Val Ser Thr Pro His

                 25                     30                     35                     40

His His Pro Ser Pro    Leu His Pro Leu Pro    Pro Pro Pro Met Pro    Gln Ala Pro His Gln

                45                     50                      55                    60

Tyr Tyr Pro Ala Pro    Gln Ile Thr Ile Pro    Tyr His His His His    His Gly Glu Leu Arg

                65                      70                     75                    80

Arg Pro Thr Thr Ile    Ala Tyr Thr Asp Ala    Pro Val Pro Phe Glu    Thr Ala Gly Pro Pro

                85                     90                     95                     100

Ser Thr Val Val Asp    Ser Tyr His His Leu    Thr Pro Gly Asp Ala    Gly Tyr Gly Met Pro

               105                    110                    115                     120

Arg Pro Leu Ala Leu    Gln Ile Ser Gln His    Ala Leu Cys Gly Gly    Gly Asp Val Val Met

               125                    130                    135                     140

Gly Gly Gly Gly Ala    Gly Ala Ala Asp Asp    Gly Glu Glu Ala Ile    Arg Ile Ser Pro Leu

               145                   150                   155                       160

Thr Pro Ser Ala His    His Gln Met Met Lys    Arg Lys Asn Glu Val    Lys Lys Val Val Cys

               165                    170                    175                     180

Ile Pro Ala Pro Pro    Ala Thr Ser Ser Arg    Gly Gly Gly Gly Glu    Val Ile Pro Ser Asp

               185                     190                  195                      200

Leu Trp Ala Trp Arg    Lys Tyr Gly Gln Lys    Pro Ile Lys Gly Ser    Pro Tyr Pro Arg Gly

               205                   210                    215                    220

Tyr Tyr Arg Cys Ser    Ser Ser Lys Gly Cys    Met Ala Arg Lys Gln    Val Glu Arg Ser Arg

               225                    230                   235                    240

Ser Asp Pro Asn Met    Leu Val Ile Thr Tyr    Ala Ala Glu His Asn    His Pro Trp Pro Met

               245                    250                   255                    260

Gln Arg Asn Val Leu    Ala Gly Tyr Ala Arg    Ser His His Ser Thr    His Ala Thr Ala Ser

               265                   270                    275                    280

Ser Ser Arg His Lys    Gln Gln Gln Gln Gln    Gln Thr Asn Gln Leu    Gln Pro Ala Leu Ile

               285                   290                    295                   300

Thr Ser Ser Ser Ser    Ser Ser Ser Ser Pro    Phe Asn Leu Tyr Ala    Asp Val Val Leu Gly

               305                   310                    315                    320

Gly Gln Gln Ala Asn    Met Met Met Thr Thr    Glu Gly Ala Gly Ala    Gly Leu Gly Ile Gln

               325                  330                     335                    340

Pro Ser Ala Ala Asp    Glu Val Phe Ala Glu    Leu Glu Glu Leu Glu    Pro Asp Asn Pro Thr

               345                   350                    355                    360

Met Ile Asn Ala Asn    Met Gln Val Tyr Ser    Thr Thr Ser Arg Pro    Gly Val Ser Ser Tyr

               365                  370                     375                    380

Asp His Gln Trp His    Lys Phe

                385        387

其中，序列表SEQ ID No：2由387个氨基酸残基组成，含一个WRKY结构域(自氨基端的第200至256位氨基酸残基)和一个C2H2锌指纹，归类为WRKY第三组。

本发明的第三个目的在于提供上述编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因的重组表达载体。

本发明基因在水稻根、茎、叶、花、穗等组织中有表达。根、花中表达丰度最高，其次为茎、叶，穗中的丰度低。本发明基因受茉莉酸、乙烯和水稻纹枯病菌诱导，而水杨酸则抑制其表达。

本发明的第四个目的在于提供上述编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因的转基因细胞系。

本发明的第五个目的在于提供上述编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因的工程菌。

本发明的第六个目的在于提供上述编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因在培育抗逆性植物中的应用。更具体地说，所述抗逆性植物为水稻。

本发明的水稻转录因子WRKY蛋白具有转录激活活性。

本发明的超表达转基因株系的T2代水稻植株对纹枯病的抗性增强，表明该基因介导了水稻对病害的防卫反应。

附图说明

图1为本发明实施例基因编码的蛋白的转录激活活性分析图组。

图2为本发明实施例基因在激素处理和纹枯病菌接种后的表达图组。

图3为本发明实施例基因的超表达载体构建和T2代超表达水稻植株的Northern分析图组。

图4为本发明实施例基因的T2代超表达水稻植株抗纹枯病分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的描述。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实验过程中涉及到的限制性内切酶和T₄DNA连接酶由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。

一、本发明基因的cDNA序列的分离：

水稻栽培种秀水11三叶期幼苗用100μM茉莉酸甲酯喷雾，取处理后1、6和12小时的叶片提取RNA，等量混合RNA样品，反转录(RT)后，进行PCR扩增。扩增条件为：94℃的温度下预变性3分钟，再94℃下30秒，56℃下30秒，72℃下1分40秒，30个循环，最后在72℃下延伸10分钟。扩增得到1505bp的cDNA片段。PCR产物纯化后，连接到pUCmT载体上，测序验证，即得序列表中的SEQ ID №：1。引物为5’-AATACTGAATAGGCAGCAGCAACA-3’和5’-GCACAGGCGACCATCATATCATAT-3’。

二、本发明基因编码的蛋白的转录激活分析：

参见图1，图1的A部分为酵母转化子的生长情况的示意图组。A部分的中间图是分区接种示意图：1表示pCL1(正对照)载体，2表示pGBKT7(pBD，负对照)载体，3表示pBD-WRKY载体，4表示pBD-WRKYΔC载体。载体的构建及含义见下述“具体实验过程”。

A部分的左图表示上述四种载体的转化子在SD-Trp培养基上均生长。

A部分的右图表示的是pCL1、pBD-WRKY和pBD-WRKYΔC转化子在选择培养基SD-Trp-Ade-His上生长，而pBD转化子不生长。

图1的B部分为转化子的α-半乳糖苷酶的相对活性图表，含pCL1(正对照)的转化子的α-半乳糖苷酶活性定义为100％。α-半乳糖苷酶活性用试剂盒(购自Clotech公司)测定，按供应商说明书进行。

具体实验过程如下：

以引物5’-GGAATTCCATATGTATGGATATGATGGAGGAGGAGG-3’(下划线为NdeI位点)与5’-CGGGATCCGAACTTGTGCCACTGATGATCATAG-3’(下划线为BamHI位点)扩增本发明基因的整个编码区域(自SEQ ID №：1的79位至1216位)，以引物5’-GGAATTCCATATGGCAACAGCAGCAGCAGCAGA-3’(下划线为NdeI位点)和5’-CGGGATCCGAACTTGTGCCACTGATGATCATAG-3’(下划线为BamHI位点)扩增本发明基因的缺失C端102个氨基酸残基的编码区域(自SEQ ID No：1中的934至1216位)，PCR产物分别连接到pGBKT7载体的GAL4DNA结合域(BD)上，构建pBD-WRKY和pBD-WRKYΔC载体，分别以pCL1(编码全长GAL4)和空载体pGBKT7(pBD)作为正负对照，转化AH109酵母株。转化子在SD培养基和SD-Trp-Ade-His选择培养基上30℃培养3天，观察生长情况，发现pCL1、pBD-WRKY和pBD-WRKYΔC转化子能够在上述选择培养基上较好地生长，而携带空载体pBD的转化子不能生长，如图1的A部分所示，说明本发明基因编码的蛋白具有转录激活的活性。pBD-WRKYΔC的α-半乳糖苷酶活性为pBD-WRKY的28.9％(图1的B部分所示)，说明C-端102个氨基酸残基负责本发明基因编码的蛋白的大部分转录激活活性。

三、本发明基因的诱导表达分析：

(1)水稻培养与病原菌接种、激素处理：

水稻品种秀水11种子在37℃下浸泡1天，露白后催芽1天，然后播种在加有营养液的蛭石中，在温室中培养。28℃(昼)/25℃(夜)，光周期14/10h，光照强度100μmol m^-2s^-1，相对湿度为85％。三叶期苗用于各种处理，于不同时间取样，取叶片提取RNA。

纹枯病菌GD118从国家公益性行业(农业)科研专项(nyhyzx3-16)水稻纹枯病防治协作组获得。接种物制备：将浸泡2天的稻谷粒装入培养皿中，121℃灭菌30分钟，冷却后，将3天菌龄的纹枯菌菌丝块接种于已灭菌的稻谷粒，于28℃高湿度环境下暗培养3天。将两颗携带菌丝的接种物靠于稻株基部，左右各一颗。接种后的水稻于室温下培养，保持湿度在85％左右。以未携带菌丝的接种物模拟接种为对照。分别于0、1、6、12、24h后取叶片提取总RNA。

激素处理：用100μmol L^-1茉莉酸甲酯(MeJA)、2mmol L^-1水杨酸(SA)和1mmol L^-1乙烯利(ET)喷施三叶期水稻幼苗，分别于0、1、6、12、24h取叶片提取总RNA。其中茉莉酸甲酯先溶于少量甲醇，再用ddH₂O溶，甲醇终浓度为0.1％(体积百分含量)。

(2)RNA提取、Northern杂交和实时荧光RT-PCR分析

采用Promega公司的PureYield^TM RNA Midiprep System，从3叶期水稻(秀水11)的叶中提取总RNA提取，按使用说明书进行。本发明基因的特异性探针的扩增引物为：5’-CAATGCACGCGCATTCCTCG-3’和5’-CGTCAGTGGCGAGATCCTGA-3’。此探针用于Northern杂交分析。10μg总RNA在1.2％甲醛变性琼脂糖胶中电泳分级，然后转移至Hybond-N⁺尼龙膜上，与[α-³²P]-标记的基因特异性探针在65℃下杂交。65℃下，用2×SSC加0.1％SDS洗5分钟，在同样温度下用1×SSC加0.1％SDS再洗5分钟。膜压磷屏(Amersham Pharmacia，UK)。

以2μg总RNA为模板进行逆转录，采用Invitrogen公司的SuperScriptreverse transcriptase II，按使用说明书操作。实时荧光RT-PCR采用ARI PRISM7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems)，按以下条件进行：94℃预变性2分钟；94℃变性5秒，54℃退火10秒；72℃延伸20秒，40个循环。水稻Actin1(AK071586)用作内标。扩增本发明基因的特异性引物为：5’-AACAGCAGCAGCAGCAGA-3’和5’-GTCGGCGTAGAGATTGAATGG-3’。Actin1的扩增引物为：5’-GGCACCACACCTTCTACAATGAG-3’和5’-ACACCATCACCAGAGTC AAGCA-3’。

结果如图2所示，图2的A部分为本发明基因在纹枯病菌、茉莉酸甲酯和乙烯利处理下表达的Northern分析，图2的B部分为水杨酸处理下本发明基因表达的实时荧光定量RT-PCR分析。可见，本发明基因受纹枯病菌接种、茉莉酸和乙烯利诱导表达，而不受水杨酸诱导，说明该基因可能参与茉莉酸/乙烯介导的抗病防卫信号途径中。

四、本发明基因的超表达转基因植株的抗病分析：

参见图3，A部分为本发明基因的超表达载体示意图，WRKY指本发明基因的全长编码序列(自SEQ ID No：1中的第80至1240位)，LB和RB分别指pCambia1301载体的左、右边界，T7 terminator指T7终止子，Ubi指玉米ubiquitin基因的启动子。B部分为超表达水稻植株(T2代)中本发明基因的Northern分析图，其中WT指野生型对照，1-7、3-9、9-8、10-2、11-6、12-2和16-1表示7个代表性的T2代转基因水稻植株。

具体实验过程如下：

将本发明基因cDNA的全长编码序列***至一改建的pCambia1301载体中，置于玉米ubiquitin基因启动子的控制之下，构建超表达载体(ubiquitin::WRKY)，见图3，然后将超表达载体用农杆菌介导的转化法转入水稻(秀水11)的愈伤组织中。具体方法为：成熟水稻种子用70％的乙醇进行表面消毒1分钟后，用20％(v/v)的次氯酸钠消毒30分钟，在NBI培养基上培养(MS添加0.5g L^-1谷氨酰胺，0.5g L^-1脯氨酰胺，2.0mg L^-12，4-D；pH 5.8)，约14天后长出愈伤，将愈伤组织剥下，置新的NBI培养基上培养，4天后即可侵染；将含有ubiquitin::WRKY的农杆菌液均匀涂在固体YEP平板上培养2-3天，用无菌药匙从平板上刮菌于液体共培养基(MS+2g L^-1肌醇+0.3g L^-1酪蛋白水解物+100μM乙酰丁香酮)中至细胞浓度为3×10⁹cfu mL^-1，将愈伤放入菌中侵染20分钟，将愈伤倒在干净滤纸上吸干表面的菌液，移到Nbco培养基上培养(NBI培养基加100μM乙酰丁香酮)；培养2天后，将愈伤转移到筛选培养基NBs上培养(NBI培养基加500mg L^-1头孢霉素，30mg L^-1潮霉素)；等到愈伤出绿点后(约30天)移至分化培养基(MS培养基中添加2.0mg L^-1 6-BAP、0.5mg L^-1萘乙酸、30g L^-1山梨醇和30mg L^-1潮霉素)上培养。获得的小苗即T0代转基因植株种于温室，T0代转基因植株自交所得的种子长成的植株为T1代，T1代转基因植株自交所得的种子长成的植株为T2代。Northern分析表明，T2代植株中本发明基因的表达较野生型明显增强，如图3的B部分所示。

本发明基因的超表达转基因植株的抗病评价采用T2代转基因水稻植株。图4是本发明基因的超表达水稻植株(T2代)抗纹枯病分析图，图中WT指野生型对照，#3-9和#10-2表示2个代表性的T2代转基因水稻植株。由图4可见，超表达的转基因植株对纹枯病菌的抗性菌明显增强。

Claims (7)

1.一种编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因，其特征在于为如下（a）或（b）或（c）或（d）所述的核苷酸序列：

（a）序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列；

（b）编码序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的核苷酸序列；

（c）与序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

（d）在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

所述高严谨条件为在0.1×SSPE 或 0.1×SSC、0.1% SDS的溶液中，在65^oC下杂交并洗膜。

2.一种水稻转录因子WRKY蛋白，为以下（a）或（b）所述的氨基酸残基序列：

（a）序列表中SEQ ID No：2所述的氨基酸残基序列； 

（b）将（a）中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有水稻转录因子WRKY蛋白功能的由（a）衍生的氨基酸残基序列；

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

3.一种含有如权利要求1所述编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因的重组表达载体。

4.一种含有如权利要求1所述编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因的转基因细胞系。

5.一种含有如权利要求1所述编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因的工程菌。

6.一种如权利要求1所述编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因在培育抗逆性植物中的应用。

7.根据权利要求6所述编码水稻转录因子WRKY蛋白的基因在培育抗逆性植物中的应用，其特征在于：所述抗逆性植物为水稻。

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