CN102070709A - 一种植物转录因子wrky蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物转录因子WRKY蛋白及其编码基因与应用。该植物转录因子WRKY蛋白，为如下（a）或（b）所述的蛋白质：（a）具有序列表中的SEQIDNo：2所述的氨基酸残基序列；（b）将（a）中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有植物WRKY转录因子功能的由（a）衍生的蛋白质。本发明的植物转录因子WRKY蛋白转录受纹枯病菌、稻瘟病菌以及水杨酸和茉莉酸诱导；本发明的植物转录因子WRKY蛋白的超表达转基因株系的T2代植株对纹枯病、稻瘟病抗性增强，表明该基因介导了植物抗病防卫反应，可以应用于水稻等作物的抗病分子育种工程。

Description

一种植物转录因子WRKY蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种植物转录因子WRKY蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

植物在长期的进化过程中，形成了复杂而精巧的抗病防卫机制。植物防卫过程的激活大多涉及宿主基因表达的时序调控，且调控多数发生在转录水平。转录因子与基因启动子区域中的顺式作用元件特异结合，从而调节特定基因的时空表达。表达谱分析、突变体和转基因实验都证明了转录因子在植物防卫反应的调控中起关键作用。因此，分离和鉴定抗病信号途径中的转录调节组分对阐明植物防卫反应的分子机理至关重要。

WRKY蛋白是主要存在于植物中的一类转录因子（??lker and Somssich，2004）。高等植物的WRKY构成转录因子超家族，水稻中有100个以上成员（Wu et al，2005；Zhang and Wang，2005；Liu et al，2006；Ramamoorthy et al, 2008）。它们共同的结构特征是含有1－2个WRKY结构域。该结构域包含大约60个氨基酸残基，N端的七肽WRKYGQK十分保守，其后紧接一个C2H2或C2HC的锌指纹。根据WRKY保守域的数目和锌指纹的类型，将WRKY蛋白分成3个组（Eulgem et al，2000）。

WRKY蛋白的主要功能是参与植物防卫反应的调节（Pandey and Somssich, 2009）。一些研究表明，水稻WRKY在植物抗病防御中发挥重要作用（Liu et al，2006；Ryu et al，2007；Liu et al，2007；Qiu et al，2007；Shimono et al，2007; Wang et al, 2007；）。 OsWRKY45超表达株系对稻瘟病菌的抗性增强，而其敲除突变体则表现出相反的表型（Shimono et al，2007）；OsWRKY45作用于SA信号途径中，且不依赖于NH1。异位（ecotopic）超表达OsWRKY45的拟南芥植株PR1表达增强，表现出对丁香假单胞菌的抗性（Qiu and Yu, 2009）。最近Peng et al报道，OsWRKY62在植物先天性免疫（innate immunity），包括PTI [pathogen-associated molecular pattern (PAMP)-triggered immunity]和ETI(effector-triggered immunity)中扮演一个负调控因子的作用，超表达株系中防卫基因的活化受到抑制，其基础抗性和Xa21介导的对白叶枯病的抗性均有所减弱。

WRKY还参与植物对非生物胁迫的应答和某些发育、代谢过程。如参与对低温、高盐、干旱（Mare et al，2004；Seki，2002； Mare et al，2004）、伤（Hara，2000）、氧化胁迫（Rizhsky et al，2004）等非生物胁迫的应答；参与衰老（Hinderhofer and Zentgraf，2001）、表皮毛的形态构建（Johnson et al，2002）和种子大小的控制（Luo et al，2005）；参与糖代谢（Sun et al，2003）、倍半萜烯合成（Xu et al，2004）和脱落酸（ABA）等植物激素介导的信号途径（Xie et al，2005）。最近，Xie et al（2007）证明，HvWRKY38位于SA和ABA信号途径的交叉点，参与种子萌发的负调控过程。WRKY还与植物对UV-B的抗性有关（Wang et al，2007）。

水稻是单子叶植物研究的模式植物。与其它禾本科植物，如小麦、玉米、高梁、甘蔗基因组间存在共线性（colineariy）。水稻是基因组最小、进化程度最低的禾本科植物。因此，水稻基因组结构与功能的研究对其它禾本科植物的相关研究具有很大的借鉴意义。随着水稻基因组全序列测定的完成，发现新基因和鉴定基因的功能是功能基因组研究的迫切任务。水稻又是重要的经济作物，是世界半数以上人口的主要食物来源。从水稻基因组中挖掘有用的基因，用于提高产量、改善品种、提高抗逆性，是目前植物功能基因组学和农业高技术领域的研究热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物转录因子WRKY蛋白。

本发明的目的还在于提供本发明植物转录因子WRKY蛋白的编码基因及其重组表达载体、转基因细胞系、工程菌及其在培育抗逆性植物中的应用。

本发明所提供的植物转录因子WRKY蛋白，为如下（a）或（b）所述的蛋白质：

（a）具有序列表中的SEQ ID No：2所述的氨基酸残基序列； 

（b）将（a）中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有植物WRKY转录因子功能的由（a）衍生的蛋白质。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

所述SEQ ID No：2氨基酸残基序列，具体如下：

Met Asp Gly Thr Asn  Asn His Gly Ala Leu  Met Asp Asp Trp Met  Leu Pro Ser Pro Ser

1                    5                         10                          15                       20

Pro Arg Thr Leu Met  Ser Ser Phe Leu Asn  Glu Glu Phe Ser Ser  Gly Pro Phe Ser Asp

                    25                         30                        35                       40

Ile Phe Cys Asp Asn  Gly Ser Asn Lys His  Gln Asp Gly Leu Gly  Lys Ser Lys Ala Phe 

                    45                        50                         55                       60

Ile Asp Ser Ser Arg  Glu Glu Thr Ala Gln  Leu Ala Lys Lys Phe  Glu Ser Asn Leu Phe

                   65                        70                        75                        80 

Gly Ala Asn Gln Lys  Ser Ser Ser Asn Gly  Cys Leu Ser Glu Arg  Met Ala Ala Arg Thr

                    85                        90                        95                       100

Gly Phe Gly Val Leu  Lys Ile Asp Thr Ser  Arg Val Gly Tyr Ser  Thr Pro Ile Arg Ser

                    105                      110                     115                     120

Pro Val Thr Ile Pro  Pro Gly Val Ser Pro  Arg Glu Leu Leu Glu  Ser Pro Val Phe Leu

                  125                     130                        135                     140

Pro Asn Ala Ile Ala  Gln Pro Ser Pro Thr  Thr Gly Lys Leu Pro  Phe Leu Met His Ser

                  145                      150                      155                       160

Asn Val Lys Pro Ser  Ile Pro Lys Lys Thr  Glu Asp Glu Thr Arg  His Asp Arg Val Phe

                    165                    170                       175                      180

Phe Phe Gln Pro Ile  Leu Gly Ser Lys Pro  Pro Thr Cys Pro Val  Ala Glu Lys Gly Phe

                    185                     190                      195                      200

Ser Val Asn His Gln  Asn Gln Pro Ser Val  Thr Asp Asn His Gln  Glu Leu Ser Leu Gln

                   205                       210                       215                      220

Ser Ser Ser Thr Ala  Ala Lys Asp Phe Thr  Ser Ala Thr Ile Val  Lys Pro Lys Thr Ser

                   225                       230                    235                     240

Asp Ser Met Leu Asp  Asn Asp Asp His Pro  Ser Pro Ala Asn Asp  Gln Glu Glu Asn Ala

                     245                       250                      255                       260

Thr Asn Lys Asn Glu  Glu Tyr Ser Ser Asp  Leu Ile Ile Thr Pro  Ala Glu Asp Gly Tyr

                     265                     270                    275                       280

Asn Trp Arg Lys Tyr  Gly Gln Lys Gln Val  Lys Asn Ser Glu His  Pro Arg Ser Tyr Tyr

                    285                       290                      295                     300

Lys Cys Thr Phe Thr  Asn Cys Ala Val Lys  Lys Val Glu Arg Ser  Gln Asp Gly Gln Ile

                    305                       310                      315                      320

Thr Glu Ile Val Tyr  Lys Gly Ser His Asn  His Pro Leu Pro Pro  Ser Asn Arg Arg Pro

                   325                     330                       335                      340

Asn Val Pro Phe Ser  His Phe Asn Asp Leu  Arg Asp Asp His Ser  Glu Lys Phe Gly Ser

                    345                       350                       355                      360

Lys Ser Gly Gln Ala  Thr Ala Thr Ser Trp  Glu Asn Ala Ala Asn  Gly His Leu Gln Asp

                    365                      370                     375                        380

Val Gly Ser Glu Val  Leu Thr Lys Leu Ser  Ala Ser Leu Thr Thr  Thr Glu His Ala Glu

                   385                       390                      395                      400

Lys Ser Val Met Asp  Lys Gln Glu Ala Val  Asp Ile Ser Ser Thr  Leu Ser Asn Glu Glu

                   405                       410                     415                      420

Asp Asp Arg Val Thr  His Arg Ala Pro Leu  Ser Leu Gly Phe Asp  Ala Asn Asp Asp Tyr

                    425                      430                       435                       440

Val Glu His Lys Arg  Arg Lys Met Asp Val  Tyr Ala Ala Thr Ser  Thr Ser Thr Asn Ala

                   445                        450                     455                      460

Ile Asp Ile Gly Ala  Val Ala Ser Arg Ala  Ile Arg Glu Pro Arg  Val Val Val Gln Thr

                  465                     470                      475                     480  

Thr Ser Glu Val Asp  Ile Leu Asp Asp Gly  Tyr Arg Trp Arg Lys  Tyr Gly Gln Lys Val

                   485                       490                      495                       500  

Val Lys Gly Asn Pro  Asn Pro Arg Ser Tyr  Tyr Lys Cys Thr His  Pro Gly Cys Ser Val

                    505                      510                       515                      520

Arg Lys His Val Glu  Arg Ser Ser His Asp  Leu Lys Ser Val Ile  Thr Thr Tyr Glu Gly

                    525                     530                      535                      540

Lys His Asn His Glu  Val Pro Ala Ala Arg  Asn Ser Gly His Pro  Ser Ser Gly Ser Ala

                    545                     550                       555                     560

Ala Ala Pro Gln Ala  Thr Asn Gly Leu Leu  His Arg Arg Pro Glu  Pro Ala Gln Gly Gly

                   565                        570                      575                       580

Gly Gly Gly Ser Leu  Ala Gln Phe Gly Tyr  Gly Ser Ala Gly His  Arg Pro Ala Glu Gln

                    585                       590                      595                      600

Phe Gly Ala Ala Ala  Ala Gly Phe Ser Phe  Gly Met Leu Pro Arg  Ser Ile Ala Thr Pro

                   605                       610                       615                    620

Ala Pro Ser Pro Ala  Ile Ala Val Pro Ala  Met Gln Gly Tyr Pro  Gly Leu Val Leu Pro

                   625                    630                       635                       640

Arg Gly Glu Met Lys  Val Asn Leu Leu Pro  Gln Ser Gly Asn Ala  Gly Ala Ala Ala Ser

                     645                       650                      655                      660

Gln Gln Leu Met Gly  Arg Leu Pro Lys Gln  His Pro Gln Met

                     665                       670             

其中，序列表SEQ ID No：2由674个氨基酸残基组成，含两个WRKY结构域：一个自氨基端的第277至334位氨基酸残基，另一个自氨基端的第482至547位氨基酸残基。这两个WRKY结构域有一个典型的C2H2锌指结构域，属于第I组。 自氨基端第443至447位氨基酸残基是核定位信号区。

上述植物转录因子WRKY蛋白基因（OsWRKY30）也属于本发明的保护范围。

本发明的植物转录因子WRKY蛋白的cDNA基因，为如下（a）或（b）或（c）或（d）所述的核苷酸序列：

（a）具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列；

（b）具有编码序列表中SEQ ID No：2的蛋白质序列的DNA；

（c）具有与序列表中SEQ ID No：1的DNA序列90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

（d）具有在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE (或 0.1×SSC)、0.1% SDS的溶液中，在65^oC下杂交并洗膜。

所述SEQ ID No：1核苷酸序列，具体如下：

ttgggattgt caccttttca tggacgggac caacaaccat ggagcattga tggacgattg      60

gatgcttccc tcacccagtc caagaacact catgtcgagt ttcttgaacg aagaattcag      120

ctccggtccc ttttcagaca ttttctgtga taatggcagt aacaaacatc aggatggact       180

tgggaagagc aaagctttca tcgattcaag ccgggaagaa actgctcagc tagcaaaaaa    240

gtttgaatca aacctttttg gtgccaacca gaaatcaagc tcaaatggct gtctgtcaga       300

gaggatggct gcaaggacag gttttggtgt cctgaaaatt gatacatctc gtgtcggtta       360

ttctacaccg attcggtctc cggtgacgat cccgcccggt gtgagtccaa gggaacttct      420

tgagtcgccg gtttttcttc cgaacgcaat tgcacaacct tctcctacca ctggcaaact       480

gccatttttg atgcatagta atgttaaacc atcgatccct aaaaaaactg aagatgaaac       540

acgccatgat cgtgtattct tctttcaacc cattttggga tctaagccac caacttgtcc        600

agttgcagag aagggtttca gtgttaatca tcaaaaccag ccttcagtga cggataatca      660

ccaggagctc agtcttcagt ctagctcaac tgcagccaag gatttcactt cagcaactat      720

tgttaaaccta agacatctga ttccatgtta gacaatgatg atcacccttc ccctgcaaa       780

tgatcaagaa gagaatgcaa caaacaaaaa tgaagagtat tcttcagacc tgatcattac      840

ccctgctgag gatggatata actggaggaa atatggacag aagcaagtta agaacagtga    900

gcatcccagaag ctactacaaa tgcactttca cgaattgcgc tgtcaagaag gtggagcg     960

ttctcaagat ggccaaataa cagagatagt ctacaaaggt tctcacaatc accctttgcc      1020

gccttccaac cgccgaccaa atgttccttt ctcacacttc aatgatctga gagatgatca      1080

ctctgagaaa tttggttcca agtctggtca ggccacagca acttcatggg agaatgccgc     1140

aaatggacac ctccaagatg tcggtagtga agttctgaca aaactgtctg cttctcttac       1200

gacaacagaa catgctgaaa aatctgttat ggacaaacaa gaagctgtgg atatctcatc      1260

gacgctctcc aatgaagagg atgatagggt aacgcatcgt gccccgcttt ctctgggctt      1320

tgatgcgaac gatgactatg ttgaacacaa gagaagaaag atggatgttt atgccgctac      1380

tagcactagc accaacgcca tcgacatagg agctgtggcg tcaagagcta tccgggagcc    1440

tcgcgttgtt gttcagacca caagtgaggt tgacatcctt gatgatggtt accgttggcg       1500

caagtatggg cagaaagttg tcaaaggaaa cccaaatcca aggagctact acaagtgcac    1560

tcatccgggt tgctcggtgc gcaagcatgt ggagcgatca tcgcatgatc tgaaatccgt      1620

catcacgacg tatgaaggaa agcacaacca tgaagttcca gctgccagga acagtggcca    1680

cccaagctca ggctcagccg ctgcaccaca ggctaccaat ggtcttcttc accggagacc    1740

tgaaccggca caaggtggtg gtggtggtag ccttgctcag tttggctatg gctcagctgg     1800

tcacagacca gcagagcagt ttggtgcagc agcagctggt ttctcctttg gaatgctgcc      1860

tcgtagcatt gcaactccgg cgccgtctcc ggcgatcgcc gtgccggcga tgcaggggta    1920

cccagggctt gtgctgccga gaggtgagat gaaggtgaac ttgctgccac agtctgggaa     1980

tgctggtgca gcagctagcc agcagctgat gggcaggtt gccaaagcag catcctcagat     2040

gtaa                                                        2044

其中，序列表SEQ ID No：1由2044个脱氧核苷酸组成，自5′端第1位至第19位为5′未翻译区序列，第20位至2041位脱氧核苷酸为编码序列,2042位至2044位为终止密码子。

本发明的植物转录因子WRKY蛋白的基因组基因，为如下（a）或（b）或（c）或（d）所述的核苷酸序列：

（a）具有序列表中SEQ ID No：3的核苷酸序列；

（b）具有编码序列表中SEQ ID No：2的蛋白质序列的DNA；

（c）具有与序列表中SEQ ID No：3的DNA序列90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

（d）具有在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE (或 0.1×SSC)、0.1% SDS的溶液中，在65^oC下杂交并洗膜。

所述SEQ ID No：3核苷酸序列，具体如下：

ATGGACGGGACCAACAACCATGGAGCACTGATGGACGATTGGATGCTTCCCTCACCCAGT    60

CCAAGAACACTCATGTCGAGTTTCTTGAACGAAGAATTCAGCTCCGGTCCCTTTTCAGAC    120

ATTTTCTGTGATAATGGCAGTAACAAACATCAGGATGGACTTGGGAAGAGCAAAGCTTTC    180

ATCGATTCAAGCCGGGAAGAAACTGCTCAGCTAGCAAAAAAGTTTGAATCAAACCTTTTT    240

GGTGCCAACCAGAAATCAAGCTCAAATGGCTGTCTGTCAGAGAGGATGGCTGCAAGGACA   300

GGTTTTGGTGTCCTGAAAATTGATACATCTCGTGTCGGTTATTCTACACCGATTCGGTCT       360

CCGGTGACGATCCCGCCCGGTGTGAGTCCAAGGGAACTTCTTGAGTCGCCGGTTTTTCTT     420

CCGAACGCCATTGTAAGTGACTTCCTCACCTCAATCAGTATTTGCTCTGTGTAATGTTCA       480

GTTACTCTACTCATGTGGTTTATATGGAGGATATATTTGTCAGTAAATGGTGAAATCTAA        540

ACCAAGATACCTATTATAAAAAATATTCTAACGCAAGATACAGCATCTTTAATTTCTCTT        600

ATGTCTCTGCAGCTTCGTATAATTAGTGGAATTTTGGAGAAGAAAGTGACTATATATGTT       660

GATGACTGATTAATCTTAATGTCATGGTTTTGATTTATGCAGGCACAACCTTCTCCTACC       720

ACTGGCAAACTGCCATTTTTGATGCATAGTAATGTTAAACCATCGATCCCTAAAAAAACT      780

GAAGATGAAACACGCCATGATCGTGTATTCTTCTTTCAACCCATTTTGGGATCTAAGCCA      840

CCAACTTGTCCAGTTGCAGAGAAGGTAGTTTTCTCAAACAATGTTGTTCTATTCCCTATT      900

TACTGCAAATCTGTAATCACTGCTCGCCTGCTCGGCGCAGTTTGTTTTACTGTTCCAGCA      960

AATCTGACGAGCAAAATCAAATTATCAGTGTTTTTTATGCATTGGTCTGATGATATTTAT       1020

ACTTTTCAGGGTTTCAGTGTTAATCATCAAAACCAGCCTTCAGTGACGGATAATCACCAG     1080

GAGCTCAGTCTTCAGTCTAGCTCAACTGCAGCCAAGGATTTCACTTCAGCAACTATTGTT     1140

AAACCTAAGACATCTGATTCCATGTTAGACAATGATGATCACCCTTCCCCTGCAAATGAT      1200

CAAGAAGAGAATGCAACAAACAAAAATGAAGAGTATTCTTCAGACCTGATCATTACCCCT    1260

GCTGAGGATGGATATAACTGGAGGAAATATGGACAGAAGCAAGTTAAGAACAGTGAGCAT    1320

CCCAGAAGCTACTACAAATGCACTTTCACGAATTGCGCTGTCAAGAAGGTGGAGCGTTCT    1380

CAAGATGGCCAAATAACAGAGATAGTCTACAAAGGTTCTCACAATCACCCTTTGCCGCCT     1440

TCCAACCGCCGACCAAATGTTCCTTTCTCACACTTCAATGATCTGAGAGATGATCACTCT      1500

GAGAAATTTGGTTCCAAGTCTGGTCAGGCCACAGCAACTTCATGGGAGAATGCCGCAAAT    1560

GGACACCTCCAAGATGTCGGTAGTGAAGTTCTGACAAAACTGTCTGCTTCTCTTACGACA    1620

ACAGAACATGCTGAAAAATCTGTTATGGACAAACAAGAAGCTGTGGATATCTCATCGACG    1680

CTCTCCAATGAAGAGGATGATAGGGTAACGCATCGTGCCCCGCTTTCTCTGGGCTTTGAT     1740

GCGAACGATGACTATGTTGAACACAAGAGAAGGTTGGCTAGCCTTAGTCACTAATCACTC    1800

AATGAACCAATCTTCACTTTGAGTAGCTGATTGTTTTCCTTCAATTTTATTCATTTCAGA       1860

AAGATGGATGTTTATGCCGCTACTAGCACTAGCACCAACGCCATCGACATAGGAGCTGTG     1920

GCGTCAAGAGCTATCCGGGAGCCTCGCGTTGTTGTTCAGACCACAAGTGAGGTTGACATC    1980

CTTGATGATGGTTACCGTTGGCGCAAGTATGGGCAGAAAGTTGTCAAAGGAAACCCAAAT    2040

CCAAGGTCAATTCTAATGCCATTTTTCTCTTTTGGAACAAATTCTTTGCAGTTCCTCTAA       2100

TCCTTCACTACAAAAGTAAATGTTTAGCTTCACAATATGACACTGTCATCGAAGGAACAT      2160

TTCTCTGTCCATATGTGTGCATCCATAGTTGGTACAAAGACCGGAAATTACTCGCATTAT       2220

CTAAAAAACTCCATTTTGTATTTGCAGGAGCTACTACAAGTGCACTCATCCGGGTTGCTC      2280

GGTGCGCAAGCATGTGGAGCGATCATCGCATGATCTGAAATCCGTCATCACGACGTATGA      2340

AGGAAAGCACAACCATGAAGTTCCAGCTGCCAGGAACAGTGGCCACCCAAGCTCAGGCTC   2400

AGCCGCTGCACCACAGGCTACCAATGGTCTTCTTCACCGGAGACCTGAACCGGCACAAGG    2460

TGGTGGTGGTGGTAGCCTTGCTCAGTTTGGCTATGGCTCAGCTGGTCACAGACCAGCAGA     2520

GCAGTTTGGTGCAGCAGCAGCTGGTTTCTCCTTTGGAATGCTGCCTCGTAGCATTGCAAC      2580

TCCGGCGCCGTCTCCGGCGATCGCCGTGCCGGCGATGCAGGGGTACCCAGGGCTTGTGCT     2640

GCCGAGAGGTGAGATGAAGGTGAACTTGCTGCCACAGTCTGGGAATGCTGGTGCAGCAGC    2700

TAGCCAGCAGCTGATGGGCAGGTTGCCAAAGCAGCATCCTCAGATGTAAAAATGGCAGGA     2760

ACATGAGA                                                                            2768

其中，序列表SEQ ID No：3，由2768个脱氧核苷酸组成，含有四个内含子（自5??端第435位至704位，第867至1031位，第1774至1860位，第2048至2249位脱氧核苷酸）和五个外显子（自5??端第1位至434位，第704位至866位，第1032位至1773位，第1861至2047位脱氧核苷酸，第2250至2750位脱氧核苷酸）。

含有本发明所述基因的重组表达载体、转基因细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围。

本发明的植物WRKY转录因子具有转录激活活性。实验证明，本发明的植物WRKY转录因子基因的转录受水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、纹枯病菌、稻瘟病菌以及机械伤害诱导。

本发明的植物WRKY转录因子的超表达转基因株系的T2代植株在形态上与野生型无显著差别；超表达T2代植株对纹枯病和稻瘟病抗性增强，表明该基因介导了植物对病害的防卫反应。

本发明所述的基因可应用在培育抗逆性植物中。所述植物具体为水稻。

附图说明

图1为OsWRKY30的亚细胞定位图组。

图2为OsWRKY30的转录激活活性分析图组。

图3为OsWRKY30在激素处理和病原接种后的表达图组。

图4为OsWRKY30超表达载体示意图。

图5为OsWRKY30超表达对纹枯病菌和稻瘟病菌的抗性分析图组。

具体实施方式

    下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的描述。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实验过程中涉及到的限制性内切酶和T₄DNA连接酶由宝生物工程（大连）有限公司生产，参照使用说明书使用。

实施例1：OsWRKY30 cDNA的分离

水稻栽培种秀水11三叶期幼苗用100 μM茉莉酸甲酯（MeJA）喷雾处理6小时，取叶片提取RNA，反转录（RT）后，进行PCR扩增。扩增条件为：94℃的温度下预变性3分钟，再94℃下30秒，57℃下30秒，72℃下2分，30个循环，最后在72℃下延伸10分钟。扩增得到2044bp的cDNA片段。PCR产物纯化后，连接到pUCmT载体上，测序验证，即得序列表中的SEQ ID №：1。引物为5’- TTGGGATTGTCACCTTTTCATG- 3’和 5’- TTTTACATCTGAGGATGCTGC- 3’。OsWRKY30的cDNA序列在GenBank上的登录号为HM153428。

实施例2：OsWRKY30的亚细胞定位

构建了p35S-WRKY30-GFP载体，运用了粒子轰击法将它瞬时表达在洋葱表皮细胞中，同时用pCam35S-GFP载体作为对照。

具体步骤如下所述：

：用试剂盒提取纯化p35S-WRKY30-GFP或p35S-GFP（对照）质粒，定量后取2.5 μg备用。

：撕下白色洋葱内表皮（1cm × 1cm），内侧置上，置于含氨苄青霉素（Amp，100 μg mL^-1）改进的MS培养基（1× MS 盐，1× Gamborg's B5维生素，30 g L^-1 蔗糖，2% 琼脂，pH 5.7）备用。

：称取60 mg金粉（直径1.0 mm）于1.5 mL离心管；加1000 mL无水乙醇，振荡悬浮1-2分；10,000 rpm离心，10秒；弃上清，重复一次；用1000 mL无菌ddH₂O悬浮，振荡1-2分；10,000 rpm离心，10秒；弃上清，重复一次；用1000 mL无菌ddH₂O悬浮，振荡1-2分，现用或-20℃保存备用。

金粉与DNA的包埋：取均匀的金粉悬浮液50 mL，加入质粒2.5 mg，并混匀；加20 mL 0.1 mol L^-1 亚精胺，混匀；轻轻地一滴一滴地加入50 mL 2.5 mol L^-1 CaCl₂，并不时轻轻摇晃；震荡器上温和震荡3-5分后，室温放置10分；10,000 rpm离心，10秒，弃上清，无水乙醇漂洗2次；加60 mL无水乙醇悬浮，混匀。

：将压力膜和轰击膜在70%的酒精中浸泡1-2小时后取出，于超净工作台中晾干；金属挡板用70%酒精浸泡后，于酒精灯上灭菌；取10 mL制备好的金粉－DNA复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置，凉干，不要涂布于整个膜上，大小应与载体固定圈上的孔径范围一致；安装到发射装置上；将可裂膜安装到气体加速管的下端；靶材料集中到培养皿的中部，放入真空室内，取下培养皿盖；抽真空指针到26；放氦气于气体加速管，直到管中压力达到可裂圆片所能承受的压力时，可裂膜破开；气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属挡板挡住，而下面的金属颗粒却透过金属挡板的网孔，射向靶细胞；可裂膜压力为1,000 p.s.i.。平皿用Parafilm封好，22℃暗培养18小时后，用激光共聚焦扫描显微镜（Bio-Rad MRC 1024）40倍镜下观察、并采集图象。

图1所示照片为在激光共聚焦显微镜下，放大40×10倍拍照。图1中A、B、C为pCam35S-GFP载体瞬时表达照片，D、E、F为pCam35S-OsWRKY30-GFP载体瞬时表达照片。图中A和 D为蓝色光激发下的绿色荧光；图中C和 F为可见光下的洋葱细胞；图中B为A和C的叠加；图中E为D和F的叠加。结果表明OsWRKY30定位于细胞核内。

实施例3：OsWRKY30转录激活的分析

参见图2，A部分为酵母转化子的生长情况的示意图组，左边的图片表示的是在SD-Trp培养基上均生长的图片；中间的图表示的是分区接种示意图：1部分表示pCL1（正对照），2部分表示pBD（负对照），3表示pBD-WRKY30；右边的图片表示的是pCL1和pBD-WRKY30在选择培养基SD-Trp-Ade-His上生长，pBD不生长。图2中的B部分为转化子的a-半乳糖苷酶的相对活性图表，含pCL1的转化子的a-半乳糖苷酶活性定义为100%。

具体实验过程如下：

以引物5’-GGAATTCCATATGTTGGGATTGTCACCTTTTCATG-3’(含一个 SmaI 位点,下划线部分)和5’-GCGTCGACCATCTGAGGATGCTGCTTTG-3’(含一个SalI位点, 下划线部分)扩增OsWRKY30的编码区域，PCR产物连接到pGBKT7载体的GAL4 DNA结合域（BD）上，构建pBD-WRKY30载体，分别以pCL1（编码全长GAL4）和空载体pGBKT7作为正负对照，转化AH109酵母株。转化子在SD培养基和SD-Trp-Ade-His(购自Clotech公司) 选择培养基上30℃培养 3天，观察生长情况，同时测定转化子的α-半乳糖苷酶活性，发现pBD-WRKY30转化子和pCL1转化子（正对照）能够在上述选择培养基上较好地生长，而携带空载体pGBKT7的转化子不能生长，如图2的A部分所示，且具有α-半乳糖苷酶活性，如图2的B部分所示，说明OsWRKY30具有转录激活的活性。

α-半乳糖苷酶活性用试剂盒（购自Clotech公司）测定，按供应商说明书进行，底物为PNP-α-Gal（p-nitrophenyl α-D-galactopyranoside）。

实施例：OsWRKY30的诱导表达

（1）水稻培养与病原菌接种、激素处理

水稻品种秀水11种子在37℃下浸泡1天，露白后催芽1天，然后播种在加有营养液的蛭石中，在温室中培养。28℃（昼）/ 25℃（夜），光周期14/10 h，光照强度100 ??mol m^-2 s^-1，相对湿度为85%。三叶期苗用于各种处理，于不同时间取样，取叶片提取RNA。

稻瘟菌p131（从中国农业大学彭友良教授实验室获得）为水稻秀水11的非亲和株。稻瘟菌菌株p131培养、产孢，将产生的孢子配成以10⁵/mL的浓度，喷接到生长至三叶期的水稻幼苗上，在黑暗、保湿的条件下培养，分别于0、1、6、12、24 h后取叶片提取总RNA。

纹枯病菌GD118（从扬州大学潘学彪教授实验室获得）为水稻秀水11的非亲和株。接种物制备：将浸泡2天的稻谷粒装入培养皿中，121℃灭菌30min，冷却后，将3天菌龄的纹枯菌菌丝块接种于已灭菌的稻谷粒，于28℃高湿度环境下暗培养3天。将两颗携带菌丝的接种物靠于稻株基部，左右各一颗。接种后的水稻于室温下培养，保持湿度在85%左右。

激素处理：用100 ??mol L^-1 MeJA和2 mmol L^-1 SA喷施三叶期水稻幼苗，分别于0、1、6、12、24 h取叶片提取总RNA。其中MeJA先溶于少量甲醇，再用ddH₂O溶，甲醇终浓度为0.1%（体积百分含量）。

RNA提取按Chomczyski和Sacchi（1987）的方法。总RNA（10 ??g）在1.2%甲醛变性琼脂糖胶中电泳分级，然后转移至Hybond-N⁺尼龙膜上，与[a-³²P]-标记的OsWRKY30特异性探针在65℃下杂交。65℃下，用2×SSC加0.1% SDS洗5分，在同样温度下用1×SSC加0.1% SDS再洗5分。膜压磷屏 (Amersham Pharmacia, UK)。

结果如图3所示，OsWRKY30受到稻瘟病菌和纹枯病菌接种诱导表达，同时受SA和MeJA诱导，说明OsWRKY30可能参与SA和JA介导的抗病防卫信号途径中。

实施例5：OsWRKY30超表达转基因植株抗病分析

    参见图4，A部分为OsWRKY30超表达载体示意图，B部分为OsWRKY30超表达植株（T2代）中OsWRKY30的Northern分析图，其中WT指野生型对照。

具体实验过程如下：

将OsWRKY30的全长编码序列***至一改建的pCambia1301载体中，置于玉米ubiquitin基因启动子的控制之下，构建超表达载体（ubiquitin:: OsWRKY30），见图4，然后将超表达载体用农杆菌（Agrobacterium）介导的转化法转入水稻（秀水11）的愈伤组织中。具体方法为：成熟水稻种子用70%的乙醇进行表面消毒1分钟后，用20%（v/v）的次氯酸钠消毒30分钟，在NBI培养基上培养（MS添加0.5 g L^-1谷氨酰胺，0.5 g L^-1脯氨酰胺，2.0 mg L^-1 2,4-D；pH 5.8），约14天后长出愈伤，将愈伤组织剥下，置新的NBI培养基上培养，4天后即可侵染；将含有ubiquitin:: OsWRKY30的农杆菌液均匀涂在固体YEP平板上培养2-3天，用无菌药匙从平板上刮菌于液体共培养基（MS+ 2g L^-1肌醇+ 0.3 g L^-1 酪蛋白水解物 + 100μM 乙酰丁香酮）中至细胞浓度为3×10⁹ cfu mL^-1，将愈伤放入菌中侵染20分钟，将愈伤倒在干净滤纸上吸干表面的菌液，移到Nbco培养基上培养（NBI培养基加100μM乙酰丁香酮）；培养2天后，将愈伤转移到筛选培养基NBs上培养（NBI培养基加500 mg L^-1头孢霉素，30 mg L^-1潮霉素）；等到愈伤出绿点后（约30天）移至分化培养基（MS培养基中添加2.0 mg L^-1 6-BAP、0.5 mg L^-1 萘乙酸、30 g L^-1 山梨醇和30 mg L^-1 潮霉素）上培养。获得的小苗即T0代转基因植株种于温室，T0代转基因植株自交所得的种子长成的植株为T1代，T1代转基因植株自交所得的种子长成的植株为T2代。Northern blot分析表明，T2代植株中OsWRKY30基因的表达较野生型明显增强，如图4的B部分所示。

OsWRKY30超表达转基因植株的抗病评价采用T2代植株。代表性的T2代植株中OsWRKY30表达情况如图4的B部分所示。参见图5，是OsWRKY30超表达植株（T2代）抗病分析图片，左边照片表示接种纹枯病菌，右边照片表示接种稻瘟病菌，图中超表达株系是指OsWRKY300超表达株系。由图可见，抗病性超表达OsWRKY30的转基因植株对稻瘟病菌和纹枯病菌的抗性菌明显增强。

 

                                                      序列表

<110>  湖南科技大学

<120>  一种植物转录因子WRKY蛋白及其编码基因与应用

<160>  3     

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  2044

<212>  cDNA

<213>  稻属水稻（Oryza sativa var.Xiushui11）

<400>  1

ttgggattgt caccttttca tggacgggac caacaaccat ggagcattga tggacgattg      60

gatgcttccc tcacccagtc caagaacact catgtcgagt ttcttgaacg aagaattcag      120

ctccggtccc ttttcagaca ttttctgtga taatggcagt aacaaacatc aggatggact       180

tgggaagagc aaagctttca tcgattcaag ccgggaagaa actgctcagc tagcaaaaaa    240

gtttgaatca aacctttttg gtgccaacca gaaatcaagc tcaaatggct gtctgtcaga       300

gaggatggct gcaaggacag gttttggtgt cctgaaaatt gatacatctc gtgtcggtta       360

ttctacaccg attcggtctc cggtgacgat cccgcccggt gtgagtccaa gggaacttct      420

tgagtcgccg gtttttcttc cgaacgcaat tgcacaacct tctcctacca ctggcaaact       480

gccatttttg atgcatagta atgttaaacc atcgatccct aaaaaaactg aagatgaaac       540

acgccatgat cgtgtattct tctttcaacc cattttggga tctaagccac caacttgtcc        600

agttgcagag aagggtttca gtgttaatca tcaaaaccag ccttcagtga cggataatca      660

ccaggagctc agtcttcagt ctagctcaac tgcagccaag gatttcactt cagcaactat      720

tgttaaaccta agacatctga ttccatgtta gacaatgatg atcacccttc ccctgcaaa       780

tgatcaagaa gagaatgcaa caaacaaaaa tgaagagtat tcttcagacc tgatcattac      840

ccctgctgag gatggatata actggaggaa atatggacag aagcaagtta agaacagtga    900

gcatcccagaag ctactacaaa tgcactttca cgaattgcgc tgtcaagaag gtggagcg     960

ttctcaagat ggccaaataa cagagatagt ctacaaaggt tctcacaatc accctttgcc      1020

gccttccaac cgccgaccaa atgttccttt ctcacacttc aatgatctga gagatgatca      1080

ctctgagaaa tttggttcca agtctggtca ggccacagca acttcatggg agaatgccgc     1140

aaatggacac ctccaagatg tcggtagtga agttctgaca aaactgtctg cttctcttac       1200

gacaacagaa catgctgaaa aatctgttat ggacaaacaa gaagctgtgg atatctcatc      1260

gacgctctcc aatgaagagg atgatagggt aacgcatcgt gccccgcttt ctctgggctt      1320

tgatgcgaac gatgactatg ttgaacacaa gagaagaaag atggatgttt atgccgctac      1380

tagcactagc accaacgcca tcgacatagg agctgtggcg tcaagagcta tccgggagcc    1440

tcgcgttgtt gttcagacca caagtgaggt tgacatcctt gatgatggtt accgttggcg       1500

caagtatggg cagaaagttg tcaaaggaaa cccaaatcca aggagctact acaagtgcac    1560

tcatccgggt tgctcggtgc gcaagcatgt ggagcgatca tcgcatgatc tgaaatccgt      1620

catcacgacg tatgaaggaa agcacaacca tgaagttcca gctgccagga acagtggcca    1680

cccaagctca ggctcagccg ctgcaccaca ggctaccaat ggtcttcttc accggagacc    1740

tgaaccggca caaggtggtg gtggtggtag ccttgctcag tttggctatg gctcagctgg     1800

tcacagacca gcagagcagt ttggtgcagc agcagctggt ttctcctttg gaatgctgcc      1860

tcgtagcatt gcaactccgg cgccgtctcc ggcgatcgcc gtgccggcga tgcaggggta    1920

cccagggctt gtgctgccga gaggtgagat gaaggtgaac ttgctgccac agtctgggaa     1980

tgctggtgca gcagctagcc agcagctgat gggcaggtt gccaaagcag catcctcagat     2040

gtaa                                                                                 2044

<210>  2

<211>  674

<212>  PRT

<213>  稻属水稻（Oryza sativa var.Xiushui11）

<400>  2

Met Asp Gly Thr Asn  Asn His Gly Ala Leu  Met Asp Asp Trp Met  Leu Pro Ser Pro Ser

1                       5                             10                              15                           20

Pro Arg Thr Leu Met  Ser Ser Phe Leu Asn  Glu Glu Phe Ser Ser  Gly Pro Phe Ser Asp

                        25                            30                            35                          40

Ile Phe Cys Asp Asn  Gly Ser Asn Lys His  Gln Asp Gly Leu Gly  Lys Ser Lys Ala Phe 

                       45                            50                             55                          60

Ile Asp Ser Ser Arg  Glu Glu Thr Ala Gln  Leu Ala Lys Lys Phe  Glu Ser Asn Leu Phe

                      65                            70                           75                            80 

Gly Ala Asn Gln Lys  Ser Ser Ser Asn Gly  Cys Leu Ser Glu Arg  Met Ala Ala Arg Thr

                        85                          90                            95                            100

Gly Phe Gly Val Leu  Lys Ile Asp Thr Ser  Arg Val Gly Tyr Ser  Thr Pro Ile Arg Ser

                       105                         110                         115                        120

Pro Val Thr Ile Pro  Pro Gly Val Ser Pro  Arg Glu Leu Leu Glu  Ser Pro Val Phe Leu

                     125                        130                           135                         140

Pro Asn Ala Ile Ala  Gln Pro Ser Pro Thr  Thr Gly Lys Leu Pro  Phe Leu Met His Ser

                     145                         150                          155                          160

Asn Val Lys Pro Ser  Ile Pro Lys Lys Thr  Glu Asp Glu Thr Arg  His Asp Arg Val Phe

                       165                       170                           175                         180

Phe Phe Gln Pro Ile  Leu Gly Ser Lys Pro  Pro Thr Cys Pro Val  Ala Glu Lys Gly Phe

                       185                        190                         195                          200

Ser Val Asn His Gln  Asn Gln Pro Ser Val  Thr Asp Asn His Gln  Glu Leu Ser Leu Gln

                      205                          210                           215                          220

Ser Ser Ser Thr Ala  Ala Lys Asp Phe Thr  Ser Ala Thr Ile Val  Lys Pro Lys Thr Ser

                      225                          230                        235                         240

Asp Ser Met Leu Asp  Asn Asp Asp His Pro  Ser Pro Ala Asn Asp  Gln Glu Glu Asn Ala

                        245                           250                         255                          260

Thr Asn Lys Asn Glu  Glu Tyr Ser Ser Asp  Leu Ile Ile Thr Pro  Ala Glu Asp Gly Tyr

                        265                         270                       275                           280

Asn Trp Arg Lys Tyr  Gly Gln Lys Gln Val  Lys Asn Ser Glu His  Pro Arg Ser Tyr Tyr

                       285                          290                          295                        300

Lys Cys Thr Phe Thr  Asn Cys Ala Val Lys  Lys Val Glu Arg Ser  Gln Asp Gly Gln Ile

                    305                       310                      315                      320

Thr Glu Ile Val Tyr  Lys Gly Ser His Asn  His Pro Leu Pro Pro  Ser Asn Arg Arg Pro

                      325                        330                          335                          340

Asn Val Pro Phe Ser  His Phe Asn Asp Leu  Arg Asp Asp His Ser  Glu Lys Phe Gly Ser

                       345                          350                           355                         360

Lys Ser Gly Gln Ala  Thr Ala Thr Ser Trp  Glu Asn Ala Ala Asn  Gly His Leu Gln Asp

                       365                         370                          375                          380

Val Gly Ser Glu Val  Leu Thr Lys Leu Ser  Ala Ser Leu Thr Thr  Thr Glu His Ala Glu

                      385                          390                          395                         400

Lys Ser Val Met Asp  Lys Gln Glu Ala Val  Asp Ile Ser Ser Thr  Leu Ser Asn Glu Glu

                      405                           410                        415                          420

Asp Asp Arg Val Thr  His Arg Ala Pro Leu  Ser Leu Gly Phe Asp  Ala Asn Asp Asp Tyr

                       425                          430                          435                           440

Val Glu His Lys Arg  Arg Lys Met Asp Val  Tyr Ala Ala Thr Ser  Thr Ser Thr Asn Ala

                      445                            450                        455                         460

Ile Asp Ile Gly Ala  Val Ala Ser Arg Ala  Ile Arg Glu Pro Arg  Val Val Val Gln Thr

                     465                        470                        475                         480  

Thr Ser Glu Val Asp  Ile Leu Asp Asp Gly  Tyr Arg Trp Arg Lys  Tyr Gly Gln Lys Val

                      485                          490                          495                          500  

Val Lys Gly Asn Pro  Asn Pro Arg Ser Tyr  Tyr Lys Cys Thr His  Pro Gly Cys Ser Val

                       505                          510                          515                        520

Arg Lys His Val Glu  Arg Ser Ser His Asp  Leu Lys Ser Val Ile  Thr Thr Tyr Glu Gly

                      525                          530                         535                         540

Lys His Asn His Glu  Val Pro Ala Ala Arg  Asn Ser Gly His Pro  Ser Ser Gly Ser Ala

                       545                        550                          555                         560

Ala Ala Pro Gln Ala  Thr Asn Gly Leu Leu  His Arg Arg Pro Glu  Pro Ala Gln Gly Gly

                       565                           570                         575                          580

Gly Gly Gly Ser Leu  Ala Gln Phe Gly Tyr  Gly Ser Ala Gly His  Arg Pro Ala Glu Gln

                       585                           590                         595                          600

Phe Gly Ala Ala Ala  Ala Gly Phe Ser Phe  Gly Met Leu Pro Arg  Ser Ile Ala Thr Pro

                       605                         610                           615                       620

Ala Pro Ser Pro Ala  Ile Ala Val Pro Ala  Met Gln Gly Tyr Pro  Gly Leu Val Leu Pro

                      625                       630                          635                          640

Arg Gly Glu Met Lys  Val Asn Leu Leu Pro  Gln Ser Gly Asn Ala  Gly Ala Ala Ala Ser

                        645                          650                          655                         660

Gln Gln Leu Met Gly  Arg Leu Pro Lys Gln  His Pro Gln Met

                        665                           670             

<210>  3

<211>  2768

<212>  DNA

<213>  稻属水稻（Oryza sativa var.Xiushui11）

<400>  3

ATGGACGGGACCAACAACCATGGAGCACTGATGGACGATTGGATGCTTCCCTCACCCAGT    60

CCAAGAACACTCATGTCGAGTTTCTTGAACGAAGAATTCAGCTCCGGTCCCTTTTCAGAC    120

ATTTTCTGTGATAATGGCAGTAACAAACATCAGGATGGACTTGGGAAGAGCAAAGCTTTC    180

ATCGATTCAAGCCGGGAAGAAACTGCTCAGCTAGCAAAAAAGTTTGAATCAAACCTTTTT    240

GGTGCCAACCAGAAATCAAGCTCAAATGGCTGTCTGTCAGAGAGGATGGCTGCAAGGACA   300

GGTTTTGGTGTCCTGAAAATTGATACATCTCGTGTCGGTTATTCTACACCGATTCGGTCT       360

CCGGTGACGATCCCGCCCGGTGTGAGTCCAAGGGAACTTCTTGAGTCGCCGGTTTTTCTT     420

CCGAACGCCATTGTAAGTGACTTCCTCACCTCAATCAGTATTTGCTCTGTGTAATGTTCA       480

GTTACTCTACTCATGTGGTTTATATGGAGGATATATTTGTCAGTAAATGGTGAAATCTAA        540

ACCAAGATACCTATTATAAAAAATATTCTAACGCAAGATACAGCATCTTTAATTTCTCTT        600

ATGTCTCTGCAGCTTCGTATAATTAGTGGAATTTTGGAGAAGAAAGTGACTATATATGTT       660

GATGACTGATTAATCTTAATGTCATGGTTTTGATTTATGCAGGCACAACCTTCTCCTACC       720

ACTGGCAAACTGCCATTTTTGATGCATAGTAATGTTAAACCATCGATCCCTAAAAAAACT      780

GAAGATGAAACACGCCATGATCGTGTATTCTTCTTTCAACCCATTTTGGGATCTAAGCCA      840

CCAACTTGTCCAGTTGCAGAGAAGGTAGTTTTCTCAAACAATGTTGTTCTATTCCCTATT      900

TACTGCAAATCTGTAATCACTGCTCGCCTGCTCGGCGCAGTTTGTTTTACTGTTCCAGCA      960

AATCTGACGAGCAAAATCAAATTATCAGTGTTTTTTATGCATTGGTCTGATGATATTTAT       1020

ACTTTTCAGGGTTTCAGTGTTAATCATCAAAACCAGCCTTCAGTGACGGATAATCACCAG     1080

GAGCTCAGTCTTCAGTCTAGCTCAACTGCAGCCAAGGATTTCACTTCAGCAACTATTGTT     1140

AAACCTAAGACATCTGATTCCATGTTAGACAATGATGATCACCCTTCCCCTGCAAATGAT      1200

CAAGAAGAGAATGCAACAAACAAAAATGAAGAGTATTCTTCAGACCTGATCATTACCCCT    1260

GCTGAGGATGGATATAACTGGAGGAAATATGGACAGAAGCAAGTTAAGAACAGTGAGCAT    1320

CCCAGAAGCTACTACAAATGCACTTTCACGAATTGCGCTGTCAAGAAGGTGGAGCGTTCT    1380

CAAGATGGCCAAATAACAGAGATAGTCTACAAAGGTTCTCACAATCACCCTTTGCCGCCT     1440

TCCAACCGCCGACCAAATGTTCCTTTCTCACACTTCAATGATCTGAGAGATGATCACTCT      1500

GAGAAATTTGGTTCCAAGTCTGGTCAGGCCACAGCAACTTCATGGGAGAATGCCGCAAAT    1560

GGACACCTCCAAGATGTCGGTAGTGAAGTTCTGACAAAACTGTCTGCTTCTCTTACGACA    1620

ACAGAACATGCTGAAAAATCTGTTATGGACAAACAAGAAGCTGTGGATATCTCATCGACG    1680

CTCTCCAATGAAGAGGATGATAGGGTAACGCATCGTGCCCCGCTTTCTCTGGGCTTTGAT     1740

GCGAACGATGACTATGTTGAACACAAGAGAAGGTTGGCTAGCCTTAGTCACTAATCACTC    1800

AATGAACCAATCTTCACTTTGAGTAGCTGATTGTTTTCCTTCAATTTTATTCATTTCAGA       1860

AAGATGGATGTTTATGCCGCTACTAGCACTAGCACCAACGCCATCGACATAGGAGCTGTG     1920

GCGTCAAGAGCTATCCGGGAGCCTCGCGTTGTTGTTCAGACCACAAGTGAGGTTGACATC    1980

CTTGATGATGGTTACCGTTGGCGCAAGTATGGGCAGAAAGTTGTCAAAGGAAACCCAAAT    2040

CCAAGGTCAATTCTAATGCCATTTTTCTCTTTTGGAACAAATTCTTTGCAGTTCCTCTAA       2100

TCCTTCACTACAAAAGTAAATGTTTAGCTTCACAATATGACACTGTCATCGAAGGAACAT      2160

TTCTCTGTCCATATGTGTGCATCCATAGTTGGTACAAAGACCGGAAATTACTCGCATTAT       2220

CTAAAAAACTCCATTTTGTATTTGCAGGAGCTACTACAAGTGCACTCATCCGGGTTGCTC      2280

GGTGCGCAAGCATGTGGAGCGATCATCGCATGATCTGAAATCCGTCATCACGACGTATGA      2340

AGGAAAGCACAACCATGAAGTTCCAGCTGCCAGGAACAGTGGCCACCCAAGCTCAGGCTC   2400

AGCCGCTGCACCACAGGCTACCAATGGTCTTCTTCACCGGAGACCTGAACCGGCACAAGG    2460

TGGTGGTGGTGGTAGCCTTGCTCAGTTTGGCTATGGCTCAGCTGGTCACAGACCAGCAGA     2520

GCAGTTTGGTGCAGCAGCAGCTGGTTTCTCCTTTGGAATGCTGCCTCGTAGCATTGCAAC      2580

TCCGGCGCCGTCTCCGGCGATCGCCGTGCCGGCGATGCAGGGGTACCCAGGGCTTGTGCT     2640

GCCGAGAGGTGAGATGAAGGTGAACTTGCTGCCACAGTCTGGGAATGCTGGTGCAGCAGC    2700

TAGCCAGCAGCTGATGGGCAGGTTGCCAAAGCAGCATCCTCAGATGTAAAAATGGCAGGA     2760

ACATGAGA                                                                            2768

Claims (10)

1.一种植物转录因子WRKY蛋白，为如下（a）或（b）所述的蛋白质：

（a）具有序列表中的SEQ ID No：2所述的氨基酸残基序列； 

（b）将（a）中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有植物WRKY转录因子功能的由（a）衍生的蛋白质；

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

2.一种编码权利要求1所述任一种植物转录因子WRKY蛋白的编码基因。

3.一种如权利要求2所述植物转录因子WRKY蛋白的编码基因，具有自SEQ ID No：2的5′端第1位至674位脱氧核苷酸的编码序列。

4.根据权利要求2或3所述的植物转录因子WRKY蛋白的编码基因，其特征在于：所述植物转录因子WRKY蛋白的cDNA基因，为如下（a）或（b）或（c）或（d）所述的核苷酸序列：

（a）具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列；

（b）具有编码序列表中SEQ ID No：2的蛋白质序列的DNA；

（c）具有与序列表中SEQ ID No：1的DNA序列90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

（d）具有在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

所述高严谨条件为在0.1×SSPE或 0.1×SSC、0.1% SDS的溶液中，在65^oC下杂交并洗膜。

5.根据权利要求2或3所述的植物转录因子WRKY蛋白的编码基因，其特征在于：所述植物转录因子WRKY蛋白的基因组基因，为如下（a）或（b）或（c）或（d）所述的核苷酸序列：

（a）具有序列表中SEQ ID No：3的核苷酸序列；

（b）具有编码序列表中SEQ ID No：2的蛋白质序列的DNA；

（c）具有与序列表中SEQ ID No：3的DNA序列90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

（d）具有在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

所述高严谨条件为在0.1×SSPE或 0.1×SSC、0.1% SDS的溶液中，在65^oC下杂交并洗膜。

6.一种含有如权利要求2～5中任一所述的基因的重组表达载体。

7.一种含有如权利要求2～5中任一所述的基因的转基因细胞系。

8.一种含有如权利要求2～5中任一所述的基因的工程菌。

9.一种如权利要求2～5中任一所述的基因在培育抗逆性植物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物为水稻。

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