CN102250846A

CN102250846A - 重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法

Info

Publication number: CN102250846A
Application number: CN 201110202229
Authority: CN
Inventors: 冉晓园; 闫敏; 刘程; 王爽
Original assignee: SHANGHAI JINAN TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI JINAN TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2011-11-23

Abstract

本发明公开一种重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，将编码甲醛脱氢酶及甲醛氧化物歧化酶的重组质粒分别转化含分子伴侣共表达质粒的表达菌株，使蛋白酶与分子伴侣共表达，获得了蛋白酶的可溶重组表达(含组氨酸标签或不含组氨酸标签)。本发明将甲醛脱氢酶及甲醛氧化物歧化酶与组氨酸标签融合表达，可溶重组蛋白，经组氨酸标签亲和纯化可获得蛋白纯度大于90％，平均收获1克菌体能够纯化获得约1毫克的蛋白酶。本发明在组氨酸标签与蛋白酶之间引入肠激酶酶切序列，可有效酶切去除标签，无载体氨基酸残留。该方法可促进蛋白酶在大肠杆菌表达体系中的可溶表达，并能够高效纯化制备大量重组蛋白酶。

Description

重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法

技术领域

本发明涉及重组蛋白表达方法，具体涉及一种重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法。

背景技术

甲醛脱氢酶(Glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase)(基因：fdhA)来自Pseudomonas putida和Pseudomonas aeruginosa这两个种属的蛋白酶有86％的氨基酸序列相同。其性质与III型醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase，ADH)相似。文献中关于此类醛脱氢酶的重组表达资料非常有限，在(Biochemistry 39，10720-10729，2000)报道中，采用pKK223-3(Tacpromoter，即Tac启动子)表达载体及大肠杆菌TG1表达菌株获得了来自Pseudomonas putida的醛脱氢酶的可溶表达。经Mimetic Blue-2 affinitycolumn(利用此类醛脱氢酶与NAD+的结合性质)及Q-Sepharose column色谱纯化，重组蛋白达到90％纯度，收率为140mg/20L发酵液。来自Pseudomonasaeruginosa的醛脱氢酶的重组表达未见文献报道。

甲醛脱氢酶(Glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase，来自Pseudomonas putida)与甲醛氧化物歧化酶(Formaldehyde Dismutase来自Pseudomonas putida F 61)有约60％的氨基酸序列相同。文献中关于甲醛氧化物歧化酶的重组表达资料也非常有限，在(Biosci.Biotechnol.Biochem.，66(1)，85-91，2002)的报道中，编码甲醛氧化物歧化酶的重组质粒与分子伴侣GroESL重组质粒共表达，获得了甲醛氧化物歧化酶的可溶表达。在此项工作中，目的基因构建在pKK223-3(含Tac启动子)表达载体上，与分子伴侣共表达获得最佳蛋白酶可溶表达。当表达载体采用Lac启动子或T7启动子，蛋白酶可溶表达很少或检测不到可溶表达。该文献指出表达载体的启动子对甲醛氧化物歧化酶的表达有影响。该文献还指出甲醛氧化物歧化酶与组氨酸标签融合表达(采用pET表达载体，T7启动子)，检测不到甲醛氧化物歧化酶的可溶表达。

实验表明将编码甲醛脱氢酶和甲醛氧化物歧化酶的基因构建在pET表达载体中(含T7启动子)，使蛋白酶不含融合标签或含有融合标签进行重组表达以及将目的基因构建在其它表达载体中使蛋白酶与N端GST或SUMO标签融合表达，均难以获得此类蛋白酶的可溶表达。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，该方法可促进蛋白酶在大肠杆菌表达体系中的可溶表达，并能够高效纯化制备大量重组蛋白酶。

本发明采用大肠杆菌重组表达技术制备大量可溶的蛋白酶，包括甲醛脱氢酶及甲醛氧化物歧化酶。本发明使得甲醛脱氢酶，甲醛氧化物歧化酶与组氨酸标签融合重组蛋白获得可溶表达。本发明将编码蛋白酶(甲醛脱氢酶及甲醛氧化物歧化酶)的基因构建在pColdII大肠杆菌表达载体中(cspA冷激启动子)，重组质粒转化含分子伴侣共表达质粒的大肠杆菌pG-Tf2表达菌株进行表达(共表达的分子伴侣有groES，groEL及tig)，成功获得含有组氨酸标签的蛋白酶的可溶表达。可溶重组蛋白，可通过组氨酸标签亲和色谱纯化获得90％以上纯度的蛋白酶。N端组氨酸标签与蛋白酶之间可选择性的引入肠激酶酶切序列(DDDDK)，在需要切除标签的情况下，可有效酶切去除标签，使得蛋白酶不含有载体残留的氨基酸。

本发明使得甲醛脱氢酶，甲醛氧化物歧化酶不含融合标签获得可溶表达。将编码蛋白酶(甲醛脱氢酶及甲醛氧化物歧化酶)的目的基因构建在pColdV表达载体中(cspA冷激启动子)，重组表达质粒转化含分子伴侣共表达质粒的大肠杆菌pG-Tf2菌株进行表达(共表达的分子伴侣有groES，groEL及tig)，不含融合标签的蛋白酶获得可溶表达。

本发明采用如下技术方案：

一种重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，包括如下步骤：

(1)基因合成蛋白酶的核苷酸序列，获得目的基因；所述蛋白酶为甲醛脱氢酶和甲醛氧化物歧化酶；

(2)表达载体构建：将经基因合成获得的目的基因序列，以NdeI和HindIII酶切位点克隆到以相同的两个酶双酶切的pCold载体中；

(3)重组蛋白酶在含分子伴侣共表达质粒的大肠杆菌pG-Tf2表达菌株中的表达：转化表达载体到大肠杆菌pG-Tf2，并进行诱导表达重组蛋白酶；

(4)重组蛋白酶的纯化。

步骤(1)具体为：甲醛脱氢酶和甲醛氧化物歧化酶的氨基酸序列经由Uniprot蛋白质数据库获得，分别为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示氨基酸序列，对该氨基酸序列进行反向转录获得基因核苷酸序列，分别为：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示核苷酸序列，对核苷酸序列做大肠杆菌偏好的密码子优化，基因合成经密码子优化的基因序列，测序正确，获得目的基因。

步骤(2)中，所述pCold载体含有cspA冷激启动子；所述pCold载体为pColdII载体或pColdV载体。

步骤(3)具体为：重组表达质粒转化大肠杆菌pG-Tf2；阳性转化子的表达筛选；培养大肠杆菌及IPTG诱导重组蛋白的表达；SDS-PAGE检测蛋白酶的表达情况及其可溶性。

步骤(3)中，所述共表达的分子伴侣有groES，groEL及tig。

如步骤(2)中将目的基因构建在pColdII载体中，则在步骤(3)中含有组氨酸标签的蛋白酶获得可溶表达；如步骤(2)中将目的基因构建在pColdV载体中，则在步骤(3)中不含组氨酸标签的蛋白酶获得可溶表达。

步骤(4)中，通过组氨酸标签亲和色谱纯化获得90％以上纯度的蛋白酶。

如步骤(2)中将目的基因构建在pColdII载体中，该pColdII载体含有编码标签序列MNHKVHHHHHH的核苷酸序列，编码DDDK酶切序列的核苷酸通过设计引物做PCR反应引入目的基因；则在步骤(3)中含有组氨酸标签的蛋白酶获得可溶表达，所述含有组氨酸标签的蛋白酶，其N端组氨酸标签序列为MNHKVHHHHHH(无需去除标签)或者MNHKVHHHHHHDDDDK(需去除标签)。

如步骤(3)中含有组氨酸标签的蛋白酶，其N端组氨酸标签序列为MNHKVHHHHHHDDDDK，则在步骤(4)之后增加如下步骤(5)：切除重组蛋白酶N端组氨酸标签。

步骤(5)具体为：含N端组氨酸标签MNHKVHHHHHHDDDDK的蛋白酶经过Ni-NTA柱纯化及透析之后，再重新挂Ni-NTA柱，使用肠激酶在柱上酶切去除重组蛋白酶N端组氨酸标签，则标签留在柱上，而目的蛋白酶从柱上被切落，通过收集流穿得到切除了标签的重组蛋白酶。

本发明的有益效果在于：本发明将编码甲醛脱氢酶及甲醛氧化物歧化酶的重组质粒分别转化含分子伴侣共表达质粒的表达菌株，使蛋白酶与分子伴侣共表达，获得了蛋白酶的可溶重组表达(含组氨酸标签或不含组氨酸标签)。本发明将甲醛脱氢酶及甲醛氧化物歧化酶与组氨酸标签融合表达，可溶重组蛋白，经组氨酸标签亲和纯化可获得蛋白纯度大于90％。收获的1克菌体平均能够纯化获得约1毫克的蛋白酶。本发明在组氨酸标签与蛋白酶之间引入肠激酶酶切序列，可有效酶切去除标签，无载体氨基酸残留。

附图说明

图1是本发明实施例中甲醛氧化物歧化酶(Formaldehyde Dismutase来自Pseudomonas putida F 61)的重组表达电泳图；图1中，泳道1：pColdII重组质粒在含分子伴侣共表达质粒的pG-Tf2菌株中的重组表达，IPTG诱导前全菌样品；泳道2：pColdII重组质粒在含分子伴侣共表达质粒的pG-Tf2菌株中的重组表达，IPTG诱导后全菌样品；泳道3：pColdII重组质粒在含分子伴侣共表达质粒的pG-Tf2菌株中的重组表达，IPTG诱导后，破菌上清可溶样品，箭头所示为重组表达的蛋白酶。泳道4：pColdII重组质粒在含分子伴侣共表达质粒的pG-Tf2菌株中的重组表达，IPTG诱导后，破菌沉淀。泳道5：蛋白Marker(94，62，45，30，20，14kDa)；泳道6：pColdII重组质粒在BL21(DE3)菌株中的重组表达，IPTG诱导前全菌样品；泳道7：pColdII重组质粒在BL21(DE3)菌株中的重组表达，IPTG诱导后全菌样品；。泳道8：pColdII重组质粒在BL21(DE3)菌株中的重组表达，IPTG诱导后，破菌上清样品；泳道9：pColdII重组质粒在BL21(DE3)菌株中的重组表达，IPTG诱导后，破菌沉淀。

图2是本发明实施例中的纯化电泳图；图2中，泳道1：蛋白Marker(94，62，45，30，20，14kD)；泳道2：挂Ni-NTA柱前蛋白酶溶液(即破菌上清，图1，泳道3样品)；泳道3，4：挂Ni-NTA柱后流穿；泳道5：含50mM咪唑缓冲液洗脱样品；泳道6：含100mM咪唑缓冲液洗脱样品；泳道7：含250mM咪唑缓冲液洗脱样品；泳道8：含500mM咪唑缓冲液洗脱样品。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

1、基因来源

蛋白酶序列可经由Uniprot蛋白质数据库获得，序列号为E4RD31，B7V5W2，Q52078。对蛋白酶氨基酸序列进行反向转录获得基因核苷酸(DNA)序列，对DNA序列做大肠杆菌偏好的密码子优化(密码子优化在下述网站上完成：http://www.jcat.de/)。基因合成经密码子优化的基因序列，测序正确，获得目的基因。序列号为E4RD31的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；序列号为B7V5W2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；序列号为Q52078的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2、表达载体pCold重组质粒的构建

将经基因合成获得的基因序列(含NdeI及HindIII克隆酶切位点)，以NdeI和HindIII酶切位点克隆到以相同的两个酶双酶切的pCold载体(pColdII载体或pColdV载体(Takara产品))中，测序正确。pCold载体含有cspA冷激启动子，对蛋白酶的可溶表达起重要作用。pCold载体含有氨苄青霉素抗性筛选基因。

当将目的基因构建在pColdII载体中时，该pColdII载体含有编码标签序列MNHKVHHHHHH的核苷酸序列，编码DDDK酶切序列的核苷酸可通过设计引物做PCR反应引入目的基因。如需要在载体构建中在N端标签序列后引入DDDDK肠激酶酶切序列时，设计并合成引物，正向引物含有编码DDDDK的核苷酸序列GACGACGACGACAAG，通过PCR反应扩增基因片段，胶纯化，基因片段做双酶切，再做胶纯化，将目的基因连接构建到以相同酶双酶切的pColdII载体中。

(1)以SEQ ID NO.4为例，设计及合成的引物序列如下所示(Invitrogen提供引物合成)：

正向引物序列包含NdeI限制性内切酶位点及编码DDDDK的核苷酸：

5’-GTACATATGGACGACGACGACAAG ATGTCTGGTAACCGTGGTGTT-3’，如SEQ IDNO.7所示；

反向引物序列包含HindIII限制性内切酶位点：

5’-CATAAGCTTTTAAGCAGCACGGAACAGG-3’，如SEQ ID NO.8所示。

(2)以SEQ ID NO.2为例，设计及合成的引物序列如下所示(Invitrogen提供引物合成)：

5’-GTACATATGGACGACGACGACAAGATGTCTGGTAACCGTGGTGTT-3’，如SEQ IDNO.9所示；

注意：SEQ ID NO.2的正向引物和SEQ ID NO.4的正向引物相同

反向引物序列包含HindIII限制性内切酶位点：

5’-CATAAGCTTTTAAGCAGCACCCCACATTT-3’，如SEQ ID NO.10所示。

(3)以SEQ ID NO.6为例，设计及合成的引物序列如下所示(Invitrogen提供引物合成)：

5’-GTACATATGGACGACGACGACAAGATGGCTGGTAACAAATCTGTTG-3’，如SEQ IDNO.11所示；

反向引物序列包含HindIII限制性内切酶位点：

5’-CATAAGCTTTTATTTGTTTTTCAGCATACCGTG-3’，如SEQ ID NO.12所示。

上述(1)、(2)、(3)设计的引物做PCR反应，PCR反应体系及反应条件具体如下：

PCR反应体系80ul：

(1).2XPfu master mix 40ul

(2).正向引物(10uM) 1ul

(3).反向引物(10uM) 1ul

(4).合成的目的基因模板质粒(10ng/ul) 1ul

(5).双蒸水 37ul

2XPfu master mix为Novoprotein产品

PCR反应条件：

(1).94℃ 5分钟

(2).94℃ 25秒

(3).55℃ 25秒

(4).72℃ 1分30秒

(5).(2)，(3)，(4)步骤循环30次

(6).72℃ 5分钟

3、重组蛋白的表达

a.重组蛋白酶在大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株(BL21(DE3)感受态细胞购自Invitrogen)中的表达

pCold重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；经转化的BL21(DE3)感受态细胞涂布含100ug/ml氨苄青霉素抗性的LB-琼脂平板(Luria-Bertani，LB)，筛选出阳性转化子；使用LB培养液，摇瓶37℃培养阳性转化子，大肠杆菌OD₆₀₀(600nm处吸光度值)达到0.5-0.6，降低温度至16℃，加入终浓度0.2mM IPTG诱导重组蛋白酶的表达；诱导表达12小时后收菌；还原性SDS-PAGE检测蛋白酶的表达情况及其可溶性(大肠杆菌感受态细胞转化及SDS-Page电泳参照分子克隆：实验室手册标准操作)。

b.重组蛋白酶在含分子伴侣共表达质粒的大肠杆菌pG-Tf2表达菌株(Takara产品)中的表达

pCold重组表达质粒转化大肠杆菌pG-Tf2；经转化的pG-Tf2感受态细胞涂布含100ug/ml氨苄青霉素抗性的LB-琼脂平板(Luria-Bertani，LB)，筛选出阳性转化子；使用LB培养液，摇瓶37℃培养阳性转化子，大肠杆菌OD₆₀₀(600nm处吸光度值)达到0.5-0.6，加入四环素(1-10ng/ml)37℃诱导表达分子伴侣，30分钟。降低温度至16℃，加入终浓度0.2mM IPTG诱导重组蛋白酶的表达；诱导表达12小时后收菌；还原性SDS-PAGE检测蛋白酶的表达情况及其可溶性(大肠杆菌感受态细胞转化及SDS-Page电泳参照分子克隆：实验室手册标准操作)。

4、重组蛋白酶的纯化

步骤3.b中以pColdII载体重组表达收获的菌体，按菌体重量及缓冲液体积w/v：1∶10，加入缓冲液a(PBS，pH7.4)重悬，冰水浴超声裂解。细胞裂解液12000g离心30分钟，获得上清，为柱色谱上样前上清样品。Ni-NTA柱平衡缓冲液为缓冲液a，以3倍柱体积的平衡缓冲液平衡Ni-NTA柱，加上清样品挂柱，以0.5ml/min流速缓慢流出，收集此馏分为挂柱后流穿样品。以2倍柱体积的缓冲液a洗柱。再依次使用洗脱缓冲液：含50，100，250，500mM咪唑的缓冲液a，将挂柱蛋白洗脱下来。收集各馏分，以SDS-PAGE检测含目的蛋白酶的馏分。蛋白酶溶液经透析去除咪唑。

5、重组蛋白酶N端His标签的切除

步骤4中纯化获得的蛋白酶溶液以缓冲液b(50mM PB，50mM NaCl，pH7.4)透析，透析后挂Ni-NTA柱(Ni-NTA柱以缓冲液b平衡)，蛋白酶挂Ni-NTA柱后，加10unit肠激酶(Enterokinase，EK酶为Novoprotein产品)/mg含组氨酸标签的重组蛋白酶(N端标签序列及酶切序列为：MNHKVHHHHHHDDDDK)，20℃酶切6小时，收集流穿，被切掉N端组氨酸标签的蛋白酶处于此馏分中。

6、实验结果

重组蛋白表达的实验结果如图1所示，实验表明采用pCold表达载体(pColdII载体或pColdV载体)，含分子伴侣共表达质粒的pG-Tf2表达菌株，图1中的泳道1，2显示：与诱导前样品比较，IPTG诱导后目标蛋白酶有过量表达。图1中的泳道3，4显示：蛋白酶有可溶表达，也有一部分蛋白酶形成沉淀。采用pCold表达载体，BL21(DE3)表达菌株，图1中的泳道6，7显示：IPTG诱导表达后，目标蛋白酶有过量表达。图1中的泳道8，9显示：蛋白酶在上清部分分辨不出有可溶表达，而主要形成沉淀。采用重组pColdII载体(有标签，N端标签序列为MNHKVHHHHHH或MNHKVHHHHHHDDDDK)与pColdV载体(无标签)，表达获得含标签和不含标签的重组蛋白在电泳图中的表观分子量相近(约45kDa)，无法区分。

重组蛋白酶纯化的实验结果如图2所示，实验表明含组氨酸标签的重组蛋白酶(采用pColdII载体)经Ni-NTA柱色谱纯化可得到纯度大于90％的蛋白酶(如图2中泳道8箭头所示)。图2中的泳道5，6显示：包括分子伴侣在内的杂质蛋白主要在含50-100mM咪唑缓冲液中被洗脱去除。图2中的泳道7，8显示：目的蛋白酶主要在含250-500mM咪唑缓冲液中被洗脱。

Claims

1.一种重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(4)重组蛋白酶的纯化。

2.如权利要求1所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：甲醛脱氢酶和甲醛氧化物歧化酶的氨基酸序列经由Uniprot蛋白质数据库获得，分别为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示氨基酸序列，对该氨基酸序列进行反向转录获得基因核苷酸序列，分别为：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6所示核苷酸序列，对核苷酸序列做大肠杆菌偏好的密码子优化，基因合成经密码子优化的基因序列，测序正确，获得目的基因。

3.如权利要求1所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述pCold载体含有cspA冷激启动子；所述pCold载体为pColdII载体或pColdV载体。

4.如权利要求1所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：重组表达质粒转化大肠杆菌pG-Tf2；阳性转化子的表达筛选；培养大肠杆菌及IPTG诱导重组蛋白的表达；SDS-PAGE检测蛋白酶的表达情况及其可溶性。

5.如权利要求1或4所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述共表达的分子伴侣有groES，groEL及tig。

6.如权利要求3所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，如步骤(2)中将目的基因构建在pColdII载体中，则在步骤(3)中含有组氨酸标签的蛋白酶获得可溶表达；如步骤(2)中将目的基因构建在pColdV载体中，则在步骤(3)中不含组氨酸标签的蛋白酶获得可溶表达。

7.如权利要求1所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，步骤(4)中，通过组氨酸标签亲和色谱纯化获得90％以上纯度的蛋白酶。

8.如权利要求6所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，如步骤(2)中将目的基因构建在pColdII载体中，该pColdII载体含有编码标签序列MNHKVHHHHHH的核苷酸序列，编码DDDK酶切序列的核苷酸通过设计引物做PCR反应引入目的基因；则在步骤(3)中含有组氨酸标签的蛋白酶获得可溶表达，所述含有组氨酸标签的蛋白酶，其N端组氨酸标签序列为MNHKVHHHHHH或者MNHKVHHHHHHDDDDK。

9.如权利要求8所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，如步骤(3)中含有组氨酸标签的蛋白酶，其N端组氨酸标签序列为MNHKVHHHHHHDDDDK，则在步骤(4)之后增加如下步骤(5)：切除重组蛋白酶N端组氨酸标签。

10.如权利要求9所述的重组蛋白酶与分子伴侣共表达制备酶的方法，其特征在于，步骤(5)具体为：含N端组氨酸标签MNHKVHHHHHHDDDDK的蛋白酶经过Ni-NTA柱纯化及透析之后，再重新挂Ni-NTA柱，使用肠激酶在柱上酶切去除重组蛋白酶N端组氨酸标签，则标签留在柱上，而目的蛋白酶从柱上被切落，通过收集流穿得到切除了标签的重组蛋白酶。