CN102242083A - 抗新i型鸭肝炎病毒3d蛋白单克隆抗体 - Google Patents
抗新i型鸭肝炎病毒3d蛋白单克隆抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102242083A CN102242083A CN2011101121601A CN201110112160A CN102242083A CN 102242083 A CN102242083 A CN 102242083A CN 2011101121601 A CN2011101121601 A CN 2011101121601A CN 201110112160 A CN201110112160 A CN 201110112160A CN 102242083 A CN102242083 A CN 102242083A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hepatitis virus
- monoclonal antibody
- duck hepatitis
- protein
- novel duck
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明是一种新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体,属于分子生物学技术领域,涉及基因工程和免疫学技术。将新I型鸭肝炎病毒3D蛋白抗原纯化。用纯化抗原免疫BALB/c小鼠,经融合、间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞和有限稀释法克隆化后,获得分泌抗鸭肝炎IC型病毒3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9,保藏号为CGMCC-4580;其ELISA效价为1×10-6以上,能特异识别新I型鸭肝炎病毒感染细胞的病毒3D蛋白,其Ig亚型重链为IgG1,轻链为κ。本发明为新I型鸭肝炎病毒的检测、新I型鸭肝炎病毒3D蛋白结构和功能研究以及病毒的致病机理研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及抗体工程技术,具体为涉及抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体。
背景技术
I型鸭病毒性肝炎是由I型鸭病毒性肝炎病毒(duck hepatitisvirus serotype I,DHV-I)引起雏鸭的一种急性高度致死性传染病。I型鸭肝炎病毒(DHV-1C)属小RNA病毒科(Picornaviridae),其病毒核衣壳为对称的二十面体,无囊膜,无血凝性,直径大小为20-40nm。1994年Kim等在韩国发现一种新I型鸭肝炎病毒,命名为DHV-1C,并报道了此新I型鸭肝炎病毒基因序列,分析结果表明DHV-1与DHV-1C属于同一个病毒属的不同血清型,同源性为68.5%-73.2%。由5′非编码区(5′UTR)、一个大的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)、3′非编码区(3′UTR)和Poly(A)尾巴组成,ORF编码2249个氨基酸多聚蛋白。该蛋白在病毒包装过程中,裂解为结构蛋白VP0、VP1、VP3和非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。全长为7792bp,3D基因位于基因组的6050bp-7408bp,全长1358bp,编码453个氨基酸(Kim M C,Kwon Y K,Joll S J.Recent Korean isolates of duck hepatitis virus reveal the presence of anew gene-and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 typestratus.Arch Virol,2007,152(11):2059-2072.)。3D蛋白是病毒RNA依赖的RNA聚合酶,又称病毒相关抗原,是非结构蛋白,催化病毒RNA的合成。
本研究以纯化的新I型鸭肝炎病毒3D蛋白为抗原进行抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单抗的制备,期望筛选到能与新I型鸭肝炎病毒反应的单抗。以新I型鸭肝炎病毒3D重组蛋白制备特异性单克隆抗体可为新I型鸭肝炎病毒的研究提供必要的试剂和技术手段,对探讨3D蛋白在新I型鸭肝炎病毒形成及其致病方面具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供抗DHV-1C 3D蛋白单克隆抗体。
本发明的单抗隆抗体是用纯化的DHV-1C 3D重组蛋白为抗原,通过杂交瘤细胞方法获得的,能够特异识别DHV-1C感染细胞病毒3D蛋白的单克隆抗体。DHV-1C 3D重组蛋白是将DHV-1C 3D基因克隆与原核表达载体pET-30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化的3D重组蛋白。
该单克隆抗体的具体制备方法如下:
1、根据DHV-1C 3D基因cDNA序列设计一对引物,通过PCR扩增得到全长3D基因,将DHV-1C N株3D基因克隆于原核表达载体pET-30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达3D蛋白;进行SDS-PAGE检测及Westernblot分析鉴定后,裂解表达菌体,分离包涵体,用pH 8.0的尿素裂解沉淀,离心后取上清经镍亲和层析过柱纯化(购自Qiagen公司,Valencia,CA公司),将纯化后蛋白用6mol/L尿素进行梯度透析复性获得3D重组蛋白。
2、用DHV-1C 3D重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,以HAT培养基(购自Invitrogen公司)选择性培养后,经3D重组蛋白和His蛋白进行双重ELISA筛选和有限稀释法克隆化,获得分泌抗3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9;将杂交瘤细胞注BALB/c小鼠诱生腹水,对获得抗3D蛋白单克隆抗体特性进行鉴定。
3、以ELISA测定抗3D蛋白单克隆抗体的腹水效价,间接免疫荧光鉴定抗3D蛋白单克隆抗体与DHV-1C病毒蛋白的反应性和特异性,用单克隆抗体亚型测定试剂盒(Zymed Laboratories,Inc.)鉴定抗3D蛋白单克隆抗体的Ig亚类。
本发明的优点是:(1)本发明提供的DHV-1C 3D重组蛋白制备方法简单,纯度高;(2)本发明提供抗DHV-1C 3D蛋白的单克隆抗体特异性强,制备方法简单;(3)抗DHV-1C 3D蛋白单克隆抗体可用于3D蛋白结构和功能研究。
具体地,在一个方面,本发明提供分泌抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,其保藏号为CGMCC No.4580。
另一方面,本发明提供针对新I型鸭肝炎病毒3D蛋白的单克隆抗体,其由保藏号为CGMCC No.4580的杂交瘤细胞系分泌。
再一方面,本发明提供用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的药物组合物,其包含上述定义的单克隆抗体。
在另一个发明,本发明提供用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的试剂盒,其包含上述定义的单克隆抗体。
在另一个方面,本发明提供上述定义的单克隆抗体在制备用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的药物中的应用。
在又一个方面,本发明涉及所述单克隆抗体在制备检测新I型鸭肝炎病毒的药物中的应用。
杂交瘤细胞株2D9,于2011年2月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,100101),保藏号为CGMCC No.4580。
附图说明
图1为DHV-1C 3D基因PCR产物(A)和pET 30a-3D酶切鉴定图(B),其中A中的泳道1:3D基因的PCR产物;泳道M:DNA分子质量标准;B中的泳道1:pET30a-3D的BamH1和Hind III双酶切产物;泳道M:2kb DNA分子质量标准。
图2为DHV-1C 3D表达蛋白的SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)鉴定图,其中泳道M是蛋白质Marker,泳道2-5分别是BL21(DE3)/pET30a-3D在1、2、3和4小时诱导表达的菌体,泳道1是BL21(DE3)/pET-30a载体诱导表达菌体;图(B)泳道2和1分别是BL21(DE3)/pET30a-3D和BL21(DE3)/pET-30a诱导表达菌体在鸭抗DHV-1CN株阳性血清下的Western blotting结果。
图3为3D蛋白单克隆抗体2D9的Western blotting鉴定图,图中泳道1是3D蛋白,泳道2是大肠杆菌菌体蛋白,泳道M是蛋白质Marker。
图4为抗3D蛋白单克隆抗体2D9的IFA鉴定图,图中A和B分别是单克隆抗体2D9与N株感染的鸭胚成纤维细胞及正常鸭胚成纤维细胞的反应结果,其中A图表示单克隆抗体2D9可以检测出N株病毒感染的鸭胚成纤维细胞的3D蛋白,显示绿色荧光;B图表示未感染病毒的鸭胚成纤维细胞没有荧光。
具体实施方式
下文将参考实施例详细描述本发明,所述实施例仅是意图举例说明本发明,而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例1.DHV-1C 3D重组蛋白的制备
根据DHV-1C序列设计引物,PCR扩增DHV-1C 3D基因,将其克隆于原核表达载体PET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达DHV-1C3D蛋白;收集表达菌体,冻融3次后,离心分离包涵体,用pH 8.0的尿素裂解沉淀,经镍亲和层析纯化,获得DHV-1C 3D重组蛋白,最后该蛋白经6M尿素进行梯度透析复性。
1).3D重组表达质粒的构建
根据DHV-1C 3D核苷酸序列(SEQ ID NO:1)设计合成特异性引物,上游引物3DF:5’TCGGGATCCGCTATTGTTGAGAAAAAGTATTCAG3’(SEQ ID NO:2下划线为BamH1位点),下游引物3DR:5’CAGAAGCTTTTATATAATCATGCAGGCAGTATATG 3’(SEQ ID NO:3,下划线为Hind III位点)。以PCR从DHV-1CN株(哈尔滨兽医研究所)按常规方法反转录的cDNA中扩增3D基因(PCR反应条件为:94℃5min;94℃30s,56℃30s,72℃3min,32个循环;72℃延伸10min,4℃保存)。扩增片段大小为1359bp(见图1A)。pET30a(购自Novagen公司)经BamH1/Hind III双酶切消化后,将扩增的3D基因连接到原核表达载体pET-30a的BamH1/Hind III位点间,转化大肠杆菌Top10,提取转化细菌的质粒,以上述PCR反应和BamH1/Hind III酶切鉴定重组表达质粒(PCR反应结果参见图1A,酶切结果参见图1B),经序列测定验证,获得3D重组表达质粒pET30a-3D。阳性重组表达质粒pET30a-3D转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Invitrogen公司),SDS-PAGE和Western blotting表明(图2),表达的65.8kDa重组3D蛋白(泳道2)可被DHV-1C病毒阳性血清所识别,空载体pET30a诱导蛋白(泳道1)不能被DHV-1C病毒阳性血清所识别。其中DHV-1C病毒阳性血清是利用由哈尔滨兽医研究所的DHV-1C病毒N株免疫番鸭制备,即将纯化的100μgDHV-1C N株与弗氏佐剂等比例混合,充分乳化,制备免疫抗原,免疫4周龄鸭。免疫3次,每次100μg/每只(0.2mL);第一次以弗氏完全佐剂免疫抗原,肌肉注射;间隔14天,用弗氏不完全佐剂免疫抗原进行第二次免疫;间隔14天,用不加佐剂的免疫抗原进行三免,肌肉注射;免疫10天后,采血,分离DHV-1C病毒阳性血清。
2).DHV-1C 3D重组蛋白的表达与纯化
以氯化钙法将重组表达质粒pET30a-3D转化大肠杆菌BL21(DE3),取阳性克隆用LB液体培养基(含50μg/mL Kan),37℃250r/min振荡培养过夜,次日按1∶100的比例接种于含10mL新鲜LB培养基100mL锥形瓶中,37℃300r/min振荡培养,当OD600=0.6时,加入终浓度为1mM IPTG诱导表达2h,4℃12000r/min离心30sec,收集菌体,冻融三次,4℃12000r/min离心10min,SDS-PAGE分析裂解菌体的上清和沉淀,分析3D蛋白的表达情况。加入5倍体积8M尿素溶解沉淀,振荡至溶液澄清,4℃12000r/min离心10min,弃沉淀,上清转移至镍离子亲和层析柱中(购自Qiagen公司,Valencia,CA),振荡1h,由pET-30a表达的带有His标签的VP3表达蛋白与镍离子螯合,先后用2倍体积柱床体积pH=8.0的8M尿素溶液,3倍柱床体积pH=6.3的8M尿素,3倍柱床体积pH=5.9的8M尿素和5倍柱床体积pH=4.5的8M尿素洗脱柱床,收集洗脱液1ml/管;用SDS-PAGE分析洗脱液,经6mol/L尿素进行梯度透析复性,获得高纯度的3D重组蛋白。
实施例2.抗3D蛋白单克隆抗体的制备
用等量弗氏佐剂(Sigma公司)乳化纯化的100ug 3D重组蛋白,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,15天后用不完全弗氏佐剂(Sigma公司)乳化等体积蛋白进行二次免疫,二次免疫后十天断尾采血用ELISA方法检测小鼠血清效价,此时小鼠血清效价已经明显上升,经第三次免疫后检测小鼠血清效价,阳性值达1.0以上,P/N大于10时取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇(Invitrogen公司)作用下进行细胞融合,用HAT培养基(购自Invitrogen公司)进行选择性培养;以纯化的3D重组蛋白和His蛋白(购自KPL)为检测抗原,用双重ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行筛选,阳性杂交瘤经连续5次有限稀释法克隆化,获得稳定分泌抗3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9,将其于2011年2月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,100101),保藏号为CGMCC No4580;将杂交瘤细胞注入致敏小鼠腹腔诱生腹水,获得抗N株3D蛋白单克隆抗体2D9。具体如下。
1).小鼠免疫
分别将纯化的DHV-1C 3D重组蛋白与弗氏佐剂等比例混合,充分乳化,制备3D免疫抗原,免疫6周龄BALB/c小鼠8只(购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心)。免疫3次,每次100μg/每只(0.2mL);第一次以弗氏完全佐剂免疫抗原,背部皮下多点注射;间隔20天,用弗氏不完全佐剂免疫抗原进行第二次免疫,腹腔注射;间隔20天,用不加佐剂的3D免疫抗原进行三免,肌肉注射;免疫15天后,尾静脉采血,以3D重组蛋白为检测抗原,用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清的抗体水平,免疫小鼠抗体滴度达到1∶4000以上,表明小鼠获得良好免疫效果。
2).杂交瘤细胞株的建立
i)细胞融合
细胞融合前3天,以不加佐剂的3D重组蛋白尾静脉注射小鼠,每只100μg(0.1mL),无菌取脾脏,分离脾细胞,计数后按5∶1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞(2×107)混合,在PEG4000作用下进行细胞融合(《实用免疫学》,杨廷彬主编,长春出版社,1994年12月出版);用HAT选择培养基(购自Invitrogen公司)重悬,置5%CO2 37℃进行选择性培养,5天后半量换液,10天后改为HAT培养基(购自Invitrogen公司)。待细胞克隆长至1/4-1/2培养孔时,取细胞培养上清检测分泌抗体。
ii).杂交瘤细胞筛选
分别用纯化的3D重组蛋白和His蛋白(购自KPL公司)作为检测抗原,对杂交瘤细胞培养上清中的分泌抗体进行双重ELISA检测,筛选阳性杂交瘤细胞。用0.05M碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀释纯化的VP3重组蛋白或His蛋白,按100μL 0.045μg/孔加入酶标板中,37℃包被1h后转入4℃过夜;用含0.05%吐温20的PBS缓冲液(PBST)洗涤3次,加5%脱脂奶粉37℃封闭1h,每孔加入杂交瘤细胞培养上清100μL,37℃孵育2h;PBST洗3次,加入1∶5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),37℃孵育1h,PBST洗4次,加入显色底物OPD-H2O2(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),避光反应10min后,用2M H2SO4终止反应,用酶标仪读取OD490值,以与阴性OD490值的比值大于2.1判为阳性。3D重组蛋白阳性而His蛋白阴性检测的杂交瘤细胞孔为阳性克隆。
iii).有限稀释法克隆化获得杂交瘤细胞系和保藏
用HT培养基将杂交瘤细胞稀释至20个/ml,每孔0.1ml接入96孔培养板,细胞含量分别为2个/孔和1个/孔,置5%CO2 37℃培养,5-7天观察细胞克隆生长情况,选取单克隆生长孔细胞上清,以ELISA检测分泌抗体;对阳性克隆进行连续5次克隆,获得稳定分泌抗VP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9,使其抗体分泌阳性率达95%以上。杂交瘤细胞株2D9扩大培养,500转/分钟离心5分钟,收集细胞培养上清,将细胞沉淀用37℃提前预热的DMEM冻存液(含7份DMEM+2份血清+1份二甲亚砜)重悬,每管2ml分装,-70℃冻存细胞。该杂交瘤细胞株于2011年2月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC,中国,北京),保藏号为CGMCC-4580。
3).抗3D蛋白单克隆抗体2D9的制备。
成年雌性BALB/c小鼠经0.2ml/只降植烷腹腔注射,致敏1周后,腹腔注射杂交瘤细胞2D9悬液5×106-1×107,7-10天后采集腹水,12000g离心5min,收集上清。上清加入等量PH7.2巴比妥缓冲盐水(VBS;0.004mol/L巴比妥,0.15mol/L NaCl,0.8mmol/L Mg2+,0.3mmol/L Ca2+)稀释;每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅(Sigma公司),混匀,悬液在室温孵育30分钟,摇动;2000g离心20分钟,即得到澄清的单克隆抗体2D9腹水,-70℃冻存。
4).抗3D蛋白单克隆抗体2D9的腹水效价的测定。
首先抗3D蛋白单克隆抗体2D9腹水用PBS缓冲液1000倍稀释,然后倍比稀释,3D重组蛋白(2μg/ml)100μL/孔包被的酶标板(购自Corning公司),37℃孵育2h;加入倍比稀释(1∶2000)的抗3D蛋白单克隆抗体2D9腹水100μl,37℃孵育1h,PBST洗涤3次后加入1∶5000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG抗体,37℃孵育1h,PSBT洗涤后,加入显色底物OPD-H2O2(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),避光反应10min,用2M H2SO4终止反应,用酶标仪读取OD490值,以与阴性OD490值比值大于2.1判为阳性,以阳性孔的最大稀释度为抗3D蛋白单克隆抗体2D9腹水效价。结果测得单克隆抗体2D9腹水的ELISA效价分别为:6.4×10-6。
实施例3.抗3D蛋白单克隆抗体2D9的特性鉴定
以纯化3D重组蛋白为检测抗原用间接ELISA方法测定抗3D蛋白单克隆抗体2D9的腹水效价;以间接免疫荧光鉴定抗3D蛋白单克隆抗体2D9与DHV-1C病毒蛋白的反应性和特异性;用Zymed Laboratories,Inc公司亚型测定试剂盒鉴定抗3D蛋白单克隆抗体2D9重链和轻链的Ig亚型。
i).抗3D蛋白单克隆抗体2D9与DHV-1C的反应性和特异性鉴定
以间接免疫荧光测定抗3D蛋白单克隆抗体与DHV-1C病毒蛋白的反应性和特异性。鸡胚成纤维细胞DF1经DHV-1C病毒(哈尔滨兽医研究所)感染24h,PBS洗两次;100μl/孔加入甲醇固定,1h后弃固定液,分别加入单克隆抗体2D9的细胞培养上清,100μl/孔,37℃孵育1h;PSB洗涤3次,加入1∶100稀释的FITC标记羊抗鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),37℃孵育30min;PBS洗涤后,加入PBS 100μl,荧光显微镜观察并照相。结果单克隆抗体2D9株均特异识别DHV-1CC病毒3D蛋白(图4A),而阴性对照则没有荧光(图4B)。
ii).抗3D蛋白单克隆抗体的Ig亚型测定。
利用Zymed Laboratories,Inc.公司亚型测定试剂盒测定抗3D蛋白单克隆抗体Ig亚型。结果显示,单克隆抗体2D9的重链为IgG1,轻链均为κ。
Claims (6)
1.分泌抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,其保藏号为CGMCC No.4580。
2.针对新I型鸭肝炎病毒3D蛋白的单克隆抗体,其由保藏号为CGMCCNo.4580的杂交瘤细胞系分泌。
3.用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的药物组合物,其包含权利要求2所述的单克隆抗体。
4.用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的试剂盒,其包含权利要求2所述的单克隆抗体。
5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的药物中的应用。
6.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测新I型鸭肝炎病毒的药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201110112160 CN102242083B (zh) | 2011-04-26 | 2011-04-26 | 抗新i型鸭肝炎病毒3d蛋白单克隆抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201110112160 CN102242083B (zh) | 2011-04-26 | 2011-04-26 | 抗新i型鸭肝炎病毒3d蛋白单克隆抗体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102242083A true CN102242083A (zh) | 2011-11-16 |
CN102242083B CN102242083B (zh) | 2012-12-26 |
Family
ID=44960331
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 201110112160 Expired - Fee Related CN102242083B (zh) | 2011-04-26 | 2011-04-26 | 抗新i型鸭肝炎病毒3d蛋白单克隆抗体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102242083B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104258376A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-01-07 | 四川农业大学 | 可溶性i型鸭肝炎病毒3d蛋白在制备i型鸭病毒性肝炎疫苗的免疫增强剂中的应用 |
CN104297493A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-01-21 | 四川农业大学 | 可溶性i型鸭肝炎病毒3d蛋白在制备elisa试剂中的应用及其elisa试剂盒 |
CN104293823A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-01-21 | 四川农业大学 | 可溶性i型鸭肝炎病毒3d蛋白的制备方法和应用 |
CN105368786A (zh) * | 2015-05-19 | 2016-03-02 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 分泌鸭1型甲肝病毒亚型单克隆抗体的杂交瘤细胞株 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1851463A (zh) * | 2006-03-10 | 2006-10-25 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法 |
WO2007106050A1 (en) * | 2006-03-16 | 2007-09-20 | National Environment Agency | Competitive enzyme linked immunosorbent assay (c-elisa) for the detection of a flavivirus specific antibody |
CN101948515A (zh) * | 2010-09-10 | 2011-01-19 | 南京农业大学 | 猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp7蛋白的表达及检测方法 |
-
2011
- 2011-04-26 CN CN 201110112160 patent/CN102242083B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1851463A (zh) * | 2006-03-10 | 2006-10-25 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 间接酶联免疫吸附试验检测马动脉炎病毒的方法 |
WO2007106050A1 (en) * | 2006-03-16 | 2007-09-20 | National Environment Agency | Competitive enzyme linked immunosorbent assay (c-elisa) for the detection of a flavivirus specific antibody |
CN101948515A (zh) * | 2010-09-10 | 2011-01-19 | 南京农业大学 | 猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp7蛋白的表达及检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
杨萍萍等: "鸭肝炎病毒单克隆抗体的研制", 《中国预防兽医学报》, vol. 28, no. 02, 1 March 2006 (2006-03-01), pages 212 - 216 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104258376A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-01-07 | 四川农业大学 | 可溶性i型鸭肝炎病毒3d蛋白在制备i型鸭病毒性肝炎疫苗的免疫增强剂中的应用 |
CN104297493A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-01-21 | 四川农业大学 | 可溶性i型鸭肝炎病毒3d蛋白在制备elisa试剂中的应用及其elisa试剂盒 |
CN104293823A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-01-21 | 四川农业大学 | 可溶性i型鸭肝炎病毒3d蛋白的制备方法和应用 |
CN105368786A (zh) * | 2015-05-19 | 2016-03-02 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 分泌鸭1型甲肝病毒亚型单克隆抗体的杂交瘤细胞株 |
CN105368786B (zh) * | 2015-05-19 | 2018-08-31 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 分泌鸭1型甲肝病毒亚型单克隆抗体的杂交瘤细胞株 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102242083B (zh) | 2012-12-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101818129B (zh) | 一种分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其所分泌的单克隆抗体 | |
CN101833005B (zh) | 一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的竞争elisa试剂盒 | |
CN112175086B (zh) | 一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体及应用 | |
CN104086652B (zh) | 抗o型***病毒特异性单域抗体及其重组表达载体 | |
CN101825633B (zh) | 用于检测非洲猪瘟病毒的竞争elisa试剂盒 | |
CN101831407A (zh) | 抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其所分泌的单克隆抗体 | |
CN104862285A (zh) | 猪流行性腹泻病毒抗体捕获elisa检测方法及应用 | |
CN102242083B (zh) | 抗新i型鸭肝炎病毒3d蛋白单克隆抗体 | |
CN112921005B (zh) | 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用 | |
CN103014047A (zh) | 一种具有天然活性的重组人胱抑素c蛋白及其制备方法 | |
CN101914499B (zh) | 抗水禽细小病毒vp3蛋白单克隆抗体 | |
CN1458280A (zh) | 两个人工合成prrs病毒多表位串联核苷酸序列及应用 | |
CN112048483B (zh) | 1型PAstV衣壳蛋白的抗原表位、单克隆抗体及其制备 | |
CN113150126A (zh) | 一种兔源抗猪细小病毒6型vp2蛋白抗体及其制备方法 | |
CN102229915B (zh) | Ev71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用 | |
CN103983782A (zh) | 一种检测猪瘟病毒Erns IgM抗体的ELISA试剂盒 | |
CN103204936A (zh) | 沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法 | |
CN114989295B (zh) | 抗MERS-CoV单克隆抗体及其应用 | |
CN103509115A (zh) | 人胱抑素c纳米抗体及其应用 | |
CN103044544A (zh) | 一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的elisa试剂盒及应用 | |
CN102329378B (zh) | 一种丙型肝炎病毒核心抗原及其抗体以及分泌该抗体的杂交瘤细胞株 | |
CN116338193A (zh) | 一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接elisa抗体检测试剂盒及其应用 | |
CN101121748B (zh) | 抗传染性法氏囊病病毒vp4蛋白单克隆抗体 | |
CN106397546A (zh) | 一种o型***病毒人工重组抗原及其制备与应用 | |
CN105255837A (zh) | 抗蓝舌病病毒ns3蛋白的单克隆抗体btv-ns3-3d8及其识别的b细胞表位和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121226 Termination date: 20130426 |