CN102241750B - 一种生产阿维菌素的基因工程方法及其专用菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产阿维菌素的基因工程方法及其专用菌株。本发明提供的蛋白，是突变后的HrdB蛋白，具体是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与阿维链霉菌生产阿维菌素相关的由1)衍生的蛋白质。本发明提供的突变后的hrdB基因导入ZLX6003菌株中后得到的重组菌，在摇瓶培养240小时后的阿维菌素产量可达5732.05±91.26μg/ml。本发明工程菌ZLX6056，在180吨罐上的生长曲线表明该基因工程菌保持了原高产菌株的优良形状，产量达到6382ug/ml。

Description

一种生产阿维菌素的基因工程方法及其专用菌株

技术领域

本发明涉及一种生产阿维菌素的基因工程方法及其专用菌株。

背景技术

阿维菌素(avermectin，AVM)是一种由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生的大环内酯类抗生素，它有八个组分(A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a，B2b)，其中B1a组分的杀虫活性最强，对线虫、螨虫和节肢动物具有良好的杀灭作用，杀虫活性比一般化学农药高出几十倍。阿维菌素的作用机理与常规化学杀虫剂不同，它的作用靶点是线虫及节肢动物类寄生虫的神经传导介质γ-氨基丁酸(GABA)，对哺乳动物的毒性很小，选择性极高。该抗生素在植物中残留时间很短，并且在土壤中很快被微生物分解为无毒物质。由于阿维菌素的这些突出的优点，其被公认为是一种最为安全有效的微生物来源的杀虫剂，因此它在农业、林业、医药和兽用上具有非常广阔的市场前景和应用价值。同时以阿维菌素为母体，还可以开发出一系列活性更高、选择性更强、使用更加安全的衍生新品种，已商品化的品种包括伊维菌素、埃玛菌素、多拉菌素、埃珀利诺菌素和塞拉菌素等。此外，近年来又有研究者发现阿维菌素有抗肿瘤的功效，并且对肿瘤细胞的抗药性也有一定的抑制作用。

目前，阿维菌素已在国内实现了产业化，取得了巨大的经济和社会效益。但我国阿维菌素的生产菌株还存在着发酵单位低，生产成本高等问题，如何提高阿维菌素的产量，降低生产成本，将为我国的农业生产发展起到促进作用。此外，不仅是阿维菌素，如何筛选和优化菌株、使产率和原料利用率实现最大化是我国微生物发酵工程面临的普遍问题。目前用于提高链霉菌的抗生素产量的方法主要包括两大类，一类是传统的诱变育种方法，通过物理化学方法对菌株进行诱变，然后在诱变后代中筛选高产菌株；另一类是通过遗传学的方法，对菌株进行直接的遗传改变，提高抗生素的产量。通过物理化学方法对菌株进行诱变虽然已经取得了一定的成绩，得到了大量的高产菌株，但它们的不足之处也很明显，主要包括耗费大量人力、物力和时间，筛选工作比较复杂，存在一定盲目性，在引入有利变异的同时可能也会产生很多有害的变异，而有害的菌种变异往往会影响发酵过程的优化和放大；这些传统的菌种选育方式由于对引起功能变化的生物学基础不了解，因此较难推广应用于其他菌种。随着细菌基因组研究的不断深入，对细菌基因功能的认识不断深刻，人们越来越倾向于用遗传学手段对菌株进行改造。用遗传学的方法可以将功能已知的基因进行改造，增强了操作的针对性，而且使工作量大大降低，筛选时间也得到缩短。因此，通过基因工程手段改造阿维链霉菌以提高阿维菌素的产量，具有重要的意义。

2001年Kitasato研究所完成了阿维链霉菌的基因组测序，对其中负责阿维菌素生物合成基因簇进行序列和功能分析，该基因簇全长82kb，共有18个开放阅读框架。基因簇内部有4个大的阅读框架(AveA1-AveA2和AveA3-AveA4)，编码多功能的聚酮体合成酶；aveC和aveE基因位于aveA1-aveA2和aveA3-aveA4基因之间，与聚酮体的修饰有关；在基因簇的右侧邻近aveA4的上游，是一套涉及齐墩果二糖的合成和转移的8个基因(aveB I-aveBV III)；紧邻aveA1的上游(左方)是编码C5-O-甲基转移酶的aveD，负责将甲基转给阿维菌素B的C5的OH上而形成阿维菌素A。aveF紧邻aveD的下游，二者转录方向一致，可能属于同一转录单位。aveF编码C5酮基还原酶，催化阿维菌素B的生成。aveR位于aveF的下游(但转录方向相反)，属于途径特异性调控基因，是阿维菌素生物合成全基因簇的正调控基因。

在抗生素产生过程中基因水平的分子调控起着至关重要的作用，通过遗传学方法对链霉菌进行改造，提高抗生素产量。主要是通过改造抗生素产生的调节基因来进行的，有既与抗生素生物合成相关又与形态分化相关的调控基因，如bldA，relC，relA等；也有参与抗生素生物合成的全局性调控基因，如absA，absB，afsR等；还有参与抗生素生物合成的特异性调控基因，如ActII-ORF4，aveR，dnrI，redD，sanG，ccaR等。对抗生素生物合成起正调节作用的基因，可以通过提高它在菌株中的拷贝数或者改变启动子提高其表达量来提高抗生素的产量，对起负调节作用的基因，则可以通过敲除该基因来提高抗生素的产量。但是，通过提高拷贝数的方法得来的菌株往往稳定性较差，因为高拷贝的遗传载体往往不稳定，容易丢失，若考虑到后期的工业生产，可能更多尝试通过同源重组整合到染色体上，更加稳定的维持高产相关基因在工程菌株的稳定存在。对能同时调控多种抗生素产量的调节基因进行改造比改造只调控单一抗生素产量的调节基因更加有效。

在阿维链霉菌中，对aveC随机突变后能够得到多拉菌素“1”组分含量提高的突变株；对途径特异性调控基因aveR，增加拷贝数并未提高阿维菌素产量，反而使得宿主菌株不再产生阿维菌素。在aveR基因的上游存在负调控基因aveR1和aveR2，这两个基因中的任何一个基因或同时两个基因失活都会使阿维菌素产量有大幅度的提高。(美国专利US6197591，Stutzman-Engwall)。位于阿维菌素生物合成基因簇中的调控基因外，研究人员也致力于寻找其它调控基因，特别是全局性调控基因(global regulatorygene)，如afsR2和orfX，从而更有效地提高阿维菌素的产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与阿维链霉菌生产阿维菌素相关的蛋白。

本发明提供的蛋白，是突变后的HrdB蛋白，具体是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与阿维链霉菌生产阿维菌素相关的由1)衍生的蛋白质。

为了使1)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述的蛋白的编码基因(突变后的hrdB基因)也属于本发明的保护范围之内。

上述基因可以是如下1)或2)或3)：

1)编码序列如序列表中序列3所示；

2)在严格条件下与1)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

3)与1)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列3是突变后的hrdB基因的序列(1539个核苷酸)，可编码序列表中序列4所示的突变后的hrdB蛋白。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有上述的基因的重组载体也属于本发明的保护范围之内。

进一步，上述重组载体具体可以是将含有启动子和上述的基因的DNA片段***质粒pSET152的多克隆位点中，得到的重组表达载体；所述含有启动子和上述的基因的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示。

含有上述的基因的表达盒或转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。

含有上述的基因的重组菌也属于本发明的保护范围之内。

进一步，上述重组菌是将上述的重组载体导入目的阿维链霉菌中得到的重组菌。

上述目的阿维链霉菌可以为阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)ZLX6003CGMCC №.3229。ZLX6003已于2009年08月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。ZLX6003是通过传统育种方法选育获得的阿维菌素高产菌株，在工业上已应用于生产，在平板上产灰色孢子。

更进一步，上述重组菌是阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)ZLX6056 CGMCC№.3796。ZLX6056已于2010年5月4日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.3796。基因工程菌株ZLX6056中的突变HrdB存在6个突变氨基酸，分别为A137S，K139E，E163G，M356V，V357A，M389I。

ZLX6003和ZLX6056均是好氧的革兰氏阳性嗜温放线菌，形成分枝状基生菌丝和长的紧密螺旋的气生菌丝。孢子链由15个或以上的表面光滑的圆形或卵形孢子构成。在燕麦培养基上形成灰色的气生孢子团，菌落背面黑褐色。在蛋白陈酵母提取物和铁培养基上产生黑色素。

上述的蛋白、上述的基因和任一上述的重组菌在生产阿维菌素中的应用也属于本发明的保护范围之内。

本发明在证实阿维链霉菌中RNA聚合酶σ因子对阿维菌素增产有直接作用的基础上，通过对其编码基因hrdB定向进化构建突变载体库，并导入到阿维链霉菌中筛选得到产量提高的重组菌株，其中增效基因hrdB为适合阿维菌素生物合成的优化状态。

具体采用如下方法构建工程菌，设计引物通过PCR扩增阿维菌素野生菌中带有自身启动子的hrdB基因，构建含hrdB基因的整合型表达质粒，并将构建好的重组质粒转化到阿维链霉菌菌株中得到重组菌库，通过高通量筛选的方法获得产量提高的重组菌。以上所述表达载体是整合型表达载体，能稳定应用到生产中，出发载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pSET152。

将hrdB基因表达载体突变库转化阿维链霉菌的方法优选为PEG介导的原生质体转化法，为提高转化效率，可在构建时直接通过电转化的方法将突变表达载体库转化到限制修饰作用缺陷的大肠杆菌ET12567中，收集抗性菌落并从中提取质粒再转化阿维链霉菌的原生质体；但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例如电转化法、接合转移法等。

用于构建重组菌的出发菌株可为任意一种阿维链霉菌的菌株，考虑到高产菌株通过传统诱变方法更难提高产量，本发明中以现有的阿维菌素高产工业菌株(阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)ZLX6003 CGMCC 3229)为出发菌株。本发明提供的突变后的hrdB基因导入ZLX6003菌株中后得到的重组菌，在摇瓶培养240小时后的阿维菌素产量可达5732.05±91.26μg/ml，是出发菌株阿维菌素产量的148.23％。

本发明工程菌ZLX6056，在180吨罐上的生长曲线表明该基因工程菌保持了原高产菌株的优良形状，产量达到6382ug/ml，能很好的适应大规模发酵，可直接用于阿维菌素的发酵生产，使阿维菌素的产量提高，从而降低生产成本。

本发明的工作中用于本发明中涉及到的σ^hrdB为链霉菌中的主要的σ因子，主要负责初级代谢基因转录水平的调控。编码基因hrdB基因的全序列及两侧片段序列可以在公共数据库中检索得到，位于基因组上从2976855到2978393(互补链上)的碱基，它所编码的蛋白序列在Genbank数据库中的编号为NP_823620，GI号为29606091。虽然阿维链霉菌基因组序列已经测定并发表，hrdB的全序列已经可以在Genbank数据库中得到，但是，关于该基因对于链霉菌次级代谢产物的生物合成的影响并不清楚，在现有的文献中，还没有利用该基因提高链霉菌抗生素产量的报道。本发明通过实验证实了hrdB对于阿维菌素生物合成的调控作用，并利用该基因的遗传操作来提高阿维菌素的产量。

附图说明

图1HrdB蛋白体外表达和纯化及体外转录试验论证其对于阿维菌素生物合成的调控；1A)HrdB蛋白体外诱导表达和纯化，1B)体外转录试验证实其对于阿维菌素生物合成的调控。

图2含有hrdB基因及其自身启动子的重组质粒pZY126的质粒图谱。

图3为高产工业阿维链霉菌及其不同转化子的阿维菌素发酵单位。

图4为阿维链霉菌突变高产菌ZLX6056中突变σ因子的突变位点分析。

图5为出发工业菌株ZLX6003和突变高产菌ZLX6056的发酵单位曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、HrdB蛋白对阿维菌素生物合成特异性调控基因aveR转录的调控作用

一、体外表达HrdB蛋白

1、hrdB结构基因的扩增及纯化

设计引物，用于扩增位于基因组DNA上的hrdB结构基因序列，上游引物HBNde01：5′-GCCATATGTCGGCCAGCACATCC-3′，位于hrdB基因起始密码子ATG位置，下游引物HBSal02：5′--GCGTCGACTAGTCGAGGTAGTCGC-3′，位于hrdB基因终止密码子TAG处，带下划线的碱基为限制性内切酶NdeI和SalI识别位点，扩增产物应为1540bp。

以阿维链霉菌ZLX6003(保藏于CGMCC，NO.3229)的基因组DNA为模板，以HBNde01和HBSal02为引物，进行PCR扩增，采用TaKaRa公司的LA-Taq酶和GC buffer I进行PCR扩增，扩增条件为95℃，3min；(95℃，1min；60℃，1min；72℃，1.5min)×25个循环；72℃，10min。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约1.5kb处有一条特异性的扩增条带。

2、HrdB蛋白表达载体构建

用琼脂糖胶回收试剂盒切胶回收PCR扩增产物，与T载体pMD 18-T(TaKaRa公司)进行连接，经过测序比对表明，所扩增的片段确实为hrdB基因结构基因(编码序列如序列表中序列1所示，可编码序列表中序列2所示的蛋白)。将含有hrdB结构基因的T载体经NdeI和SalI酶切后，回收1.5kb的hrdB片段，将此片段和经NdeI和XhoI酶切的载体pET28b(Novagen)相连，连接产物转化大肠杆菌DH5a的感受态细胞。从转化子中提取质粒进行酶切验证，将正确的重组质粒分别命名为pZY165。

二、蛋白表达纯化及HrdB蛋白对aveR的转录的影响

1、HrdB蛋白表达和纯化

从平板上挑单克隆到5ml的LB液体培养基中(含相应抗生素)，过夜培养至对数生长期；加IPTG至终浓度为0.4mM继续培养10h，取200ul菌液进行SDS-PAGE胶电泳检测蛋白表达情况。在非变性条件下超声破碎细胞后，用5ml的HisTrap HP亲和柱(GE Healthcare)进行初步纯化后，抽滤浓缩后进行分子筛分离。纯化后蛋白(HrdB蛋白)结果如图1A所示。

2、HrdB蛋白对aveR的特异性调控作用

将RNA中心酶和纯化定量的HrdB蛋白按1∶1浓度比例混合，聚合酶混合物放置在30℃水浴5min；加入3.5ul含有[a-32P]CTP(400Ci/mmol)底物混合物继续温浴15分钟；反映结束后加入上样缓冲液进行5％polyacrylamide gel(含7M尿素)电泳检测，放射自显影后结果如图1B所示。

图2结果表明HrdB蛋白能够在体外特异性的识别aveR上游启动子序列，并启动HrdB蛋白对aveR的转录，且随着HrdB蛋白浓度的增加，aveR的转录产物的量呈现递增趋势，结果表明HrdB蛋白能够参与调控aveR的转录水平。

体外转录试验方法参照文献(Hahn MY，Bae JB，Park JH，Roe JH.Isolation andcharacterization of Streptomyces coelicolor RNA polymerase，its sigma，and antisigmafactors.Methods Enzymol 2003，370：73-82)。

实施例2、hrdB基因表达载体的构建

一、含有hrdB基因及其自身启动子的重组质粒的构建

1、含自身启动子的hrdB基因的扩增

设计引物，用于PCR扩增位于阿维链霉菌染色体上含自身启动子的hrdB基因[NC_003155.4，complement(2976855..2978393)]，上游引物PodP1：5′-CACTCTAGACCCTGAGGTGGAGCGTGTG-3′位于hrdB起始密码子上游649bp处，下游引物PodP2：5′-CTCGAATTCGGTCATGGAATACCCAGAGTGAT-3′，位于hrdB终止密码子下游120bp处，带下划线的碱基为限制性内切酶XbaI和EcoRI识别位点，扩增产物应为2352bp。

以阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267的总DNA为模板，以PodP1和PodP2为引物，采用TaKaRa公司的LA-Taq酶和GC buffer I进行PCR扩增，扩增条件为95℃，3min；(95℃，1min；64.6℃，1min；72℃，2.5min)×25个循环；72℃，10min。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约2.3kb处有一条特异性的扩增条带。

2、重组质粒pZY126的构建

用琼脂糖胶回收试剂盒切胶回收PCR扩增产物，与T载体pMD 18-T(TaKaRa公司)进行连接，经过测序比对表明，所扩增的片段确实为含自身启动子的hrdB基因。将含有hrdB基因的T载体经XbaI和EcoRI酶切后，回收2.3kb的hrdB片段，将此片段和经同样酶切的载体pSET152(Bierman M，Logan R，O′Brien K，et al.Plasmid cloningvectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.Gene，1992，116：43-49)相连，连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞。从转化子中提取质粒进行酶切验证，将正确的重组质粒分别命名为pZY126。pZY126的质粒图谱如图2所示。

二、基于pZY126质粒的hrdB基因突变库的构建

1、突变hrdB结构基因的扩增及纯化

设计引物，用于扩增位于pZY126质粒上的hrdB结构基因序列，上游引物PodP3：5′-TGTTCGTGTCGGCCAGCAC-3′，位于hrdB基因起始密码子上游5bp处，下游引物PodP4：5′-TGCGTACAGCCGAGACCTAGTC-3′，位于hrdB基因终止密码子下游14bp处，扩增产物应为1560bp。

以纯化后的pZY126质粒DNA为模板，以PodP3和PodP4为引物，进行PCR扩增，采用Stratagene公司的Mutazyme II DNA Polymerase酶进行PCR扩增，扩增条件为95℃，2min；(95℃，1min；59℃，1min；72℃，1.5min)×30个循环；72℃，10min。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约1.6kb处有一条特异性的扩增条带。

采用PCR产物纯化试剂盒纯化回收PCR扩增产物，取1ul纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行nanodrop检测进行纯化产物的定量。

2、含有突变hrdB片段的pZY126*质粒片段库的构建

以上述纯化后PCR产物为引物，按照GeneMorph II EZClone产品说明书中配制反应体系，扩增条件为95℃，1min；(95℃，50sec；60℃，50sec；68℃，3min)×25个循环；反应结束后冰上放置2分钟。

向扩增产物中加入DpnI酶，以消化扩增产物中原用于模板的质粒DNA。

至此，含有突变hrdB片段的pZY126*表达质粒载体库构建完成。

实施例3、突变质粒库的转化

一、突变质粒库的扩增

由于阿维链霉菌中存在很强的限制修饰作用，用提取来自E.coli DH5α的质粒直接转化阿维链霉菌，转化效率极低，有时甚至得不到转化子。而用来自没有限制修饰作用的受体菌E.coli ET12567的质粒，其转化效率明显提高。因此，将构建好的突变质粒库以及对照质粒先分别转化到E.coli ET12567(pUZ8002)(记载过该材料的非专利文献是MacNeil DJ，Gewain KM，Ruby CL，et al(1992)Analysis of Streptomyces avermitilisgenes required for avermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector.Gene1992，111：61-68.，公众可从中国科学院微生物研究所获得)中以获得非甲基化的DNA，然后再用非甲基化的质粒DNA转化阿维链霉菌的原生质体。

将通过实施例1构建含有突变hrdB片段的pZY126*表达质粒载体库和作为对照的原始质粒pZY126和pSET152电击转化E.coli ET12567的感受态细胞，涂布于含有卡纳霉素、氯霉素和安普霉素的LB平板，37度放置培养。待平板上长出可见菌落，用新鲜液体LB收集所有菌落后，加入15％甘油保存到-80℃中，或直接接入含有相应抗生素的LB中培养进一步扩增质粒，提取质粒DNA，酶切验证。

二、突变质粒库转化阿维链霉菌

本例选用了阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)ZLX6003 CGMCC 3229作为出发菌株，ZLX6003已于2009年08月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。ZLX6003是通过传统育种方法选育获得的阿维菌素高产菌株，在工业上已应用于生产，在平板上产灰色孢子。

制备阿维链霉菌菌株ZLX6003的原生质体，用步骤一中从E.coliET12567(pUZ8002)中提取的各个质粒(pZY126*、pZY126和pSET152)转化出发菌株ZLX6003的原生质体，涂于已吹干的不加抗生素的RM 14平板上，28℃培养16-20h后，在平板上覆盖1mL含1mg安普霉素的水溶液，在28℃继续培养7-10天，长出的菌落即为转化子。随机挑取菌落形态均匀的转化子，接种于含20ug/mL安普霉素的MS平板上，28℃培养7天恢复产袍。转化子经质粒提取及PCR验证正确后，进行下一步的发酵研究。

本实施例中大肠杆菌的转化、阿维链霉菌原生质体的制备及转化方法、RM 14及MS培养基的配制参见张晓琳的博士论文(张晓琳.阿维链霉菌中聚酮合酶基因的遗传改造.博士学位论文，2004，北京：中国农业大学)。

实施例4、转化子的发酵

一、ZLX6003及其转化子的发酵及产量分析

1、阿维链霉菌的高通量筛选

阿维链霉菌出发菌株ZLX6003及其不同的转化子在斜面培养基上长出丰富的孢子后，对阿维链霉菌转化子的阿维菌素产量水平进行测试，采用高通量筛选方法进行初筛(Gao H，Liu M，Zhou X et al.Identification of avermectin-high-producing strains byhigh-throughput screening methods.Appl Microbiol Biotechnol，2009，85：1219-1225.)

初筛得到的产量提高的菌株选作摇瓶发酵进行验证，挖取斜面菌苔1cm²，将其接入装有40mL灭过菌的种子培养基的种子瓶，28℃摇床培养44-48小时，转速200rpm，旋转半径为50mm，得到种子培养液。取上述种子培养液按5％(体积百分比)的接种量接种于装有30mL灭过菌的发酵培养基的三角瓶中，28℃摇床培养10天，放瓶，用HPLC法测定阿维菌素的发酵单位，具体HPLC分析如下述的步骤2所述。

本实施例中斜面培养基，种子培养基和发酵培养基的配制参见已有专利(No.200810227639.8，一种制备阿维菌素的方法及其专用菌株)。

2、发酵产物的HPLC分析

1)样品处理：取1.0mL发酵液，加入9.0mL甲醇，以200rpm的速度(旋转半径为50mm)振摇6小时，以8000rpm的速度离心5min；

2)取1mL上清，用0.45um的微孔滤膜过滤，获得滤液进行HPLC分析。

3)取步骤1的发酵滤液，自动进样器进样，进样量10ul；

以甲醇∶水(体积比为9∶1)为流动相进行分离，流速为1mL/min，利用UV检测器在波长245nm处检测并自动形成分离图谱；在此色谱条件下，阿维菌素B1a标准品(DR，Germany)的保留时间为6分钟左右。计算发酵滤液中保留时间为6分钟左右处的洗脱峰面积，计算阿维菌素B1a的量。实验设3次重复，结果取平均数。

图3的发酵结果表明，对照质粒pZY126(图中以pSET152-hrdB表示)和空白对照质粒pSET152的转化出发菌株ZLX6003后的阿维菌素产量与出发菌株ZLX6003的阿维菌素的产量没有显著性差异；而上述产量提高的菌株(含有突变hrdB基因的转化子)的阿维菌素的产量较原出发菌株ZLX6003的产量增加了52％，该高产菌株作为工程菌，是阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)ZLX6056 CGMCC №.3796，已于2010年5月4日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3796。

二、重组菌株中的突变hrdB基因测序及序列分析以及对阿维菌素产量影响的验证

1、突变hrdB基因的测序和序列分析

提取工程菌ZLX6056的基因组DNA，用PstI进行完全酶切，并经乙醇沉淀纯化酶切片段后自连，将自连产物转化大肠杆菌感受态细胞，涂布到含有安普霉素抗性的LB平板，37℃培养至出现白色菌落。挑取单菌落培养后提取质粒DNA，经XbaI和EcoRI酶切后回收2.3kb的含启动子在内的突变hrdB基因片段，将该2.3kb的基因片段和经同样酶切的载体pUC18连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布到含有氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃培养至出现白色菌落。挑取单菌落培养后提取质粒DNA，经酶切验证后送北京华大公司进行测序。测序结果表明，该2.3kb的基因片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示。其中序列5的自5’末端的第658-2197位所示的核苷酸序列与序列表中序列3一致，是突变后的hrdB基因的序列，可编码序列表中序列4所示的突变后的hrdB蛋白。

针对序列4所示的突变后的HrdB蛋白与序列2所示的突变前的HrdB蛋白进行序列进行比对并对分析其保守的功能结构域。结果如图4所示，突变前后的蛋白序列，全长均为512AA。在突变位点集中在1.1和2.4区。在突变后的hrdB蛋白中存在6个点突变，分别为A137S，K139E，E163G，M356V，V357A，and M389I。文献报道2.4区主要负责基因的启动子-10区的结合，稳定性非常高，而在工程菌ZLX6056中存在2个点突变。结果进一步表明，工程菌ZLX6056中增加一个拷贝的突变hrdB基因，影响了阿维菌素生物合成相关途径的基因表达水平，从而使得阿维菌素产量得到提高。

2、突变hrdB片段对阿维菌素产量影响的验证

1)重组表达载体的构建

将步骤1中回收的2.3kb的含启动子在内的突变hrdB基因片段和经XbaI、EcoRI双酶切后的载体pSET152(记载过该材料的非专利文献是Bierman M，Logan R，O′BrienK，et al.Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli toStreptomyces spp.Gene，1992，116：43-49)，公众可从中科院微生物研究所获得)连接，得到重组表达载体。然后将该重组表达载体转化大肠杆菌E.coli ET12567(记载过该材料的非专利文献是MacNeil DJ，Gewain KM，Ruby CL，et al(1992)Analysis ofStreptomyces avermitilis genes required for avermectin biosynthesis utilizing a novelintegration vector.Gene 111：61-68.，公众可从中科院微生物研究所获得)感受态细胞，涂布到含有氯霉素、卡那霉素和安普霉素抗性的LB平板，37℃培养至出现白色菌落。挑取单菌落培养后提取质粒DNA，经酶切验证后进一步测序，表明得到的重组表达载体是序列表中序列5所述的DNA片段***到pSET152的XbaI和EcoRI酶切位点之间构成的。

2)转化阿维链霉菌ZLX6003菌株并进行发酵

将步骤1)获得的重组表达载体转化到阿维链霉菌ZLX6003菌株的原生质体，涂于已吹干的不加抗生素的RM 14平板上，28℃培养16-20h后，在平板上覆盖1mL含1mg安普霉素的水溶液，在28℃继续培养7-10天，长出的菌落即为转化子。随机挑取菌落形态均匀的转化子，接种于含20ug/mL安普霉素的MS平板上，28℃培养7天恢复产袍。。PCR验证正确的转化子命名为pZY148-hrdB^ZLX6056，然后随机挑选5个PCR验证过的转化子，经实施例4中步骤一步骤2的方法进行发酵。

同时将载体pSET152转化到阿维链霉菌ZLX6003菌株的原生质体，得到空载体对照菌株。

然后将空载体对照菌株、出发菌株ZLX6003和工程菌ZLX6056同样进行上述的发酵培养。

发酵实验重复3次，结果如表2(以出发菌株ZLX6003发酵240小时后的B1a产量定为100％)所示，重组菌pZY148-hrdB^ZLX6056发酵240小时后可达148.23％，能够恢复工程菌ZLX6056的生长和产量特性，而空载体对照菌株的产量与出发菌株ZLX6003的B1a产量没有显著性差异。

由此可以确定序列表中序列3所示的突变后的hrdB基因能够提高阿维菌素产量。

表2、突变后的hrdB基因的功能验证

实施例5、工程菌株遗传稳定性检测

将本发明工程菌株ZLX6056进行斜面传代，共传5代，28℃培养至生长出旺盛孢子后(约12～15天)，每代培养得到的菌均按照实施例4步骤一步骤1中的摇瓶发酵方法进行发酵，按实施例4步骤一步骤2中所述方法进行发酵和提取，并计算菌株生产阿维菌素B1a的能力。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明本发明的工程菌株ZLX6056在5次传代后，生产能力还能保持原来水平，表明本发明工程菌株ZLX6056的遗传稳定性好。

实施例6、工程菌株的发酵放大

本实施例比较了出发菌株ZLX6003和含有突变后的hrdB基因的工程菌株ZLX6056在180吨发酵罐上的阿维菌素产素能力，发酵过程中间歇取样对阿维菌素产量的变化情况进行分析。

其中发酵步骤如下：

在投料池中按配方配制发酵培养基并调pH，将配制好的培养基泵入到180m³的发酵罐中，复调pH后，121℃～130℃灭菌30分钟～1小时，灭菌完毕后冷却至28度，复调pH后备用。将培养至对数期的种子，在无菌情况下将10m³(±20％)左右种子液泵入上述灭过菌的发酵罐中，启动发酵培养程序，28～29℃培养，控制DO在50％左右，pH控制在7.8左右，搅拌速度前期为0～100rpm，24h以后为100～200rpm，72小时后约为200～300rpm。定期检测菌丝生长及产素情况，发酵罐运行约312小时后放罐。

本实施例中种子培养基和发酵培养基的配制参见已有专利(No.200810227639.8，一种制备阿维菌素的方法及其专用菌株)。

结果如图5所示，工程菌株ZLX6056在大规模发酵罐上在200小时后仍然能够保持产量增长的优势，在312小时的时候本发明工程菌株生产阿维菌素B1a的能力达到6382μg/ml发酵液，较出发菌株ZLX6003菌株(4167μg/ml)的产素能力提高53.1％。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种生产阿维菌素的基因工程方法及其专用菌株

<130>CGGNARL102312

<160>5

<210>1

<211>1539

<212>DNA

<213>阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)

<400>1

gtgtcggcca gcacatcccg tacgctcccg ccggagatcg ccgagtccgt ctctgtcatg   60

gcgctcatcg agcggggaaa ggctgagggg cagatcgccg gcgatgacgt gcgtcgggcc  120

ttcgaagctg accagattcc ggccactcag tggaagaacg tactgcgcag cctcaaccag  180

atcctcgagg aagagggtgt gacgctgatg gtcagtgccg cggagcccaa gcgcacccga  240

aagagcgtcg cagcgaagag tccggccaag cgcaccgcca ccaagaccgt cgcggcgaag  300

acggtgactg ccaagaaggc gaccgccacc gccgccccgg ctgtgcccgt cggcgacgat  360

ccggctgagg acgcgtccgc caagaaggca gctgccaaga agacgaccgc caagaaggcg  420

gtcgcgaaga agaccgtcgc caagaagacg gcggccaaga agaccaccgg caagaaggac  480

gacgtcgagc tgctcgacga cgaggcggtc gaggagaccg ctgcacccgg caaggccggc  540

gaggagcccg agggcaccga gaacgccggc ttcgtactct ccgacgagga cgaggacgac  600

gcgcccgcgc agcaggtcgc cgcggccggt gccaccgccg acccggtcaa ggactacctc  660

aagcagatcg gcaaggtccc cctgctcaac gccgagcagg aggtcgagct cgccaagcgc  720

atcgaggcgg gcctcttcgc cgaggacaag ctggccaacg ccgacaagct tgcccccaag  780

ctcaagcgcg agctggagat catcgccgag gacggccgcc gcgccaagaa ccacctcctg  840

gaggccaacc tccgtctggt ggtctccctg gccaagcgct acaccggccg cggcatgctc   900

ttcctggacc tcatccagga gggcaacctc ggtctgatcc gcgcggtgga gaagttcgac   960

tacaccaagg gctacaagtt ctccacgtac gccacctggt ggatccgtca ggcgatcacc  1020

cgcgccatgg ccgaccaggc ccgcaccatc cgtatcccgg tgcacatggt cgaggtcatc  1080

aacaagctcg cgcgcgtgca gcgtcagatg ctccaggacc tgggccgtga gcccaccccg  1140

gaggagctgg ccaaggagct cgacatgacc cctgagaagg tcatcgaggt ccagaagtac  1200

ggccgtgagc ccatctcgct gcacaccccg ctgggtgagg acggtgacag cgagttcggt  1260

gacctcatcg aggactccga ggccgtcgtc ccggccgacg cggtcagctt cacgctcctc  1320

caggagcagc tgcactctgt cctcgacacc ctgtcggagc gcgaggcggg cgtcgtctcg  1380

atgcgcttcg gtctcaccga cggtcagccg aagactctcg acgagatcgg caaggtgtac  1440

ggcgtgacgc gtgagcgcat ccgccagatc gagtccaaga cgatgtcgaa gctgcgtcac  1500

ccgtcgcgtt cgcaggtgct gcgcgactac ctcgactag                         1539

<210>2

<211>512

<212>PRT

<213>阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)

<400>2

Val Ser Ala Ser Thr Ser Arg Thr Leu Pro Pro Glu Ile Ala Glu Ser

1               5                   10                  15

Val Ser Val Met Ala Leu Ile Glu Arg Gly Lys Ala Glu Gly Gln Ile

            20                  25                  30

Ala Gly Asp Asp Val Arg Arg Ala Phe Glu Ala Asp Gln Ile Pro Ala

        35                  40                  45

Thr Gln Trp Lys Asn Val Leu Arg Ser Leu Asn Gln Ile Leu Glu Glu

    50                  55                  60

Glu Gly Val Thr Leu Met Val Ser Ala Ala Glu Pro Lys Arg Thr Arg

65                  70                  75                  80

Lys Ser Val Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys Arg Thr Ala Thr Lys Thr

                85                  90                  95

Val Ala Ala Lys Thr Val Thr Ala Lys Lys Ala Thr Ala Thr Ala Ala

            100                 105                 110

Pro Ala Val Pro Val Gly Asp Asp Pro Ala Glu Asp Ala Ser Ala Lys

        115                 120                 125

Lys Ala Ala Ala Lys Lys Thr Thr Ala Lys Lys Ala Val Ala Lys Lys

    130                 135                 140

Thr Val Ala Lys Lys Thr Ala Ala Lys Lys Thr Thr Gly Lys Lys Asp

145                 150                 155                 160

Asp Val Glu Leu Leu Asp Asp Glu Ala Val Glu Glu Thr Ala Ala Pro

                165                 170                 175

Gly Lys Ala Gly Glu Glu Pro Glu Gly Thr Glu Asn Ala Gly Phe Val

            180                 185                 190

Leu Ser Asp Glu Asp Glu Asp Asp Ala Pro Ala Gln Gln Val Ala Ala

        195                 200                 205

Ala Gly Ala Thr Ala Asp Pro Val Lys Asp Tyr Leu Lys Gln Ile Gly

    210                 215                 220

Lys Val Pro Leu Leu Asn Ala Glu Gln Glu Val Glu Leu Ala Lys Arg

225                 230                 235                 240

Ile Glu Ala Gly Leu Phe Ala Glu Asp Lys Leu Ala Asn Ala Asp Lys

                245                 250                 255

Leu Ala Pro Lys Leu Lys Arg Glu Leu Glu Ile Ile Ala Glu Asp Gly

            260                 265                 270

Arg Arg Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu Val Val

        275                 280                 285

Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Leu Phe Leu Asp Leu

    290                 295                 300

Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp

305                 310                 315                 320

Tyr Thr Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg

                325                 330                 335

Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile Arg Ile

            340                 345                 350

Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Ala Arg Val Gln Arg

        355                 360                 365

Gln Met Leu Gln Asp Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Glu Glu Leu Ala

    370                 375                 380

Lys Glu Leu Asp Met Thr Pro Glu Lys Val Ile Glu Val Gln Lys Tyr

385                 390                 395                 400

Gly Arg Glu Pro Ile Ser Leu His Thr Pro Leu Gly Glu Asp Gly Asp

                405                 410                 415

Ser Glu Phe Gly Asp Leu Ile Glu Asp Ser Glu Ala Val Val Pro Ala

            420                 425                 430

Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Glu Gln Leu His Ser Val Leu

        435                 440                 445

Asp Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Ser Met Arg Phe Gly

    450                 455                 460

Leu Thr Asp Gly Gln Pro Lys Thr Leu Asp Glu Ile Gly Lys Val Tyr

465                 470                 475                 480

Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr Met Ser

                485                 490                 495

Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr Leu Asp

            500                 505                 510

<210>3

<211>1539

<212>DNA

<213>阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)

<400>3

gtgtcggcca gcacatcccg tacgctcccg ccggagatcg ccgagtccgt ctctgtcatg     60

gcgctcatcg agcggggaaa ggctgagggg cagatcgccg gcgatgacgt gcgtcgggcc    120

ttcgaagctg accagattcc ggccactcag tggaagaacg tactgcgcag cctcaaccag    180

atcctcgagg aagagggtgt gacgctgatg gtcagtgccg cggagcccaa gcgcacccga    240

aagagcgtcg cagcgaagag tccggccaag cgcaccgcca ccaagaccgt cgcggcgaag    300

acggtgactg ccaagaaggc gaccgccacc gccgccccgg ctgtgcccgt cggcgacgat    360

ccggctgagg acgcgtccgc caagaaggca gctgccaaga agacgacctc caaggaggcg    420

gtcgcgaaga agaccgtcgc caagaagacg gcggccaaga agaccaccgg caagaaggac    480

gacgtcgggc tgctcgacga cgaggcggtc gaggagaccg ctgcacccgg caaggccggc    540

gaggagcccg agggcaccga gaacgccggc ttcgtactct ccgacgagga cgaggacgac    600

gcgcccgcgc agcaggtcgc cgcggccggt gccaccgccg acccggtcaa ggactacctc    660

aagcagatcg gcaaggtccc cctgctcaac gccgagcagg aggtcgagct cgccaagcgc    720

atcgaggcgg gcctcttcgc cgaggacaag ctggccaacg ccgacaagct tgcccccaag    780

ctcaagcgcg agctggagat catcgccgag gacggccgcc gcgccaagaa ccacctcctg    840

gaggccaacc tccgtctggt ggtctccctg gccaagcgct acaccggccg cggcatgctc    900

ttcctggacc tcatccagga gggcaacctc ggtctgatcc gcgcggtgga gaagttcgac    960

tacaccaagg gctacaagtt ctccacgtac gccacctggt ggatccgtca ggcgatcacc   1020

cgcgccatgg ccgaccaggc ccgcaccatc cgtatcccgg tgcacgtggc cgaggtcatc   1080

aacaagctcg cgcgcgtgca gcgtcagatg ctccaggacc tgggccgcga gcccaccccg   1140

gaggagctgg ccaaggagct cgacattacc cctgagaagg tcatcgaggt ccagaagtac   1200

ggccgtgagc ccatctcgct gcacaccccg ctgggtgagg acggtgacag cgagttcggt   1260

gacctcatcg aggactccga ggccgtcgtc ccggccgacg cggtcagctt cacgctcctc   1320

caggagcagc tgcactctgt cctcgacacc ctgtcggagc gcgaggcggg cgtcgtctcg   1380

atgcgcttcg gtctcaccga cggtcagccg aagactctcg acgagatcgg caaggtgtac   1440

ggcgtgacgc gtgagcgcat ccgccagatc gagtccaaga cgatgtcgaa gctgcgtcac   1500

ccgtcgcgtt cgcaggtgct gcgcgactac ctcgactag                          1539

<210>4

<211>512

<212>PRT

<213>阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)

<400>4

Val Ser Ala Ser Thr Ser Arg Thr Leu Pro Pro Glu Ile Ala Glu Ser

1               5                   10                  15

Val Ser Val Met Ala Leu Ile Glu Arg Gly Lys Ala Glu Gly Gln Ile

            20                  25                  30

Ala Gly Asp Asp Val Arg Arg Ala Phe Glu Ala Asp Gln Ile Pro Ala

        35                  40                  45

Thr Gln Trp Lys Asn Val Leu Arg Ser Leu Asn Gln Ile Leu Glu Glu

    50                  55                  60

Glu Gly Val Thr Leu Met Val Ser Ala Ala Glu Pro Lys Arg Thr Arg

65                  70                  75                  80

Lys Ser Val Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys Arg Thr Ala Thr Lys Thr

                85                  90                  95

Val Ala Ala Lys Thr Val Thr Ala Lys Lys Ala Thr Ala Thr Ala Ala

            100                 105                 110

Pro Ala Val Pro Val Gly Asp Asp Pro Ala Glu Asp Ala Ser Ala Lys

        115                 120                 125

Lys Ala Ala Ala Lys Lys Thr Thr Ser Lys Glu Ala Val Ala Lys Lys

    130                 135                 140

Thr Val Ala Lys Lys Thr Ala Ala Lys Lys Thr Thr Gly Lys Lys Asp

145                 150                 155                 160

Asp Val Gly Leu Leu Asp Asp Glu Ala Val Glu Glu Thr Ala Ala Pro

                165                 170                 175

Gly Lys Ala Gly Glu Glu Pro Glu Gly Thr Glu Asn Ala Gly Phe Val

            180                 185                 190

Leu Ser Asp Glu Asp Glu Asp Asp Ala Pro Ala Gln Gln Val Ala Ala

        195                 200                 205

Ala Gly Ala Thr Ala Asp Pro Val Lys Asp Tyr Leu Lys Gln Ile Gly

    210                 215                 220

Lys Val Pro Leu Leu Asn Ala Glu Gln Glu Val Glu Leu Ala Lys Arg

225                 230                 235                 240

Ile Glu Ala Gly Leu Phe Ala Glu Asp Lys Leu Ala Asn Ala Asp Lys

                245                 250                 255

Leu Ala Pro Lys Leu Lys Arg Glu Leu Glu Ile Ile Ala Glu Asp Gly

            260                 265                 270

Arg Arg Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu Val Val

        275                 280                 285

Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Leu Phe Leu Asp Leu

    290                 295                 300

Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp

305                 310                 315                 320

Tyr Thr Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg

                325                 330                 335

Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile Arg Ile

            340                 345                 350

Pro Val His Val Ala Glu Val Ile Asn Lys Leu Ala Arg Val Gln Arg

        355                 360                 365

Gln Met Leu Gln Asp Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Glu Glu Leu Ala

    370                 375                 380

Lys Glu Leu Asp Ile Thr Pro Glu Lys Val Ile Glu Val Gln Lys Tyr

385                 390                 395                 400

Gly Arg Glu Pro Ile Ser Leu His Thr Pro Leu Gly Glu Asp Gly Asp

                405                 410                 415

Ser Glu Phe Gly Asp Leu Ile Glu Asp Ser Glu Ala Val Val Pro Ala

            420                 425                 430

Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Glu Gln Leu His Ser Val Leu

        435                 440                 445

Asp Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Ser Met Arg Phe Gly

    450                 455                 460

Leu Thr Asp Gly Gln Pro Lys Thr Leu Asp Glu Ile Gly Lys Val Tyr

465                 470                 475                 480

Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr Met Ser

                485                 490                 495

Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr Leu Asp

            500                 505                 510

<210>5

<211>2352

<212>DNA

<213>阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)

<400>5

cactctagac cctgaggtgg agcgtgtggt gcccgcgccg cgcgagcact gacggtgcgc   60

cgtgggcggc gcggtcgggg gccgaccgcc ctcgcccgct ctcgcccggc cggtgggccc  120

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gacggcatgc ggagtccggg aatcggcatg gctcggcggc gtacggagcc cgggagccgc  300

tgaggtccga cggcgagcga cccggcggcc aaccgctgat tcggcggccc ggaagtccac  360

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ctgtgcatct tcccggcccc acccgcgccg tcggcccatc cccaagtcgg cggtcgtcgg     600

ttcctgtccg ttacggacgg ggccggaagc cgttttccaa cgttccgaga ggttgttcgt     660

gtcggccagc acatcccgta cgctcccgcc ggagatcgcc gagtccgtct ctgtcatggc     720

gctcatcgag cggggaaagg ctgaggggca gatcgccggc gatgacgtgc gtcgggcctt     780

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cctcgaggaa gagggtgtga cgctgatggt cagtgccgcg gagcccaagc gcacccgaaa     900

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cctggacctc atccaggagg gcaacctcgg tctgatccgc gcggtggaga agttcgacta    1620

caccaagggc tacaagttct ccacgtacgc cacctggtgg atccgtcagg cgatcacccg    1680

cgccatggcc gaccaggccc gcaccatccg tatcccggtg cacgtggccg aggtcatcaa    1740

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ggagctggcc aaggagctcg acattacccc tgagaaggtc atcgaggtcc agaagtacgg    1860

ccgtgagccc atctcgctgc acaccccgct gggtgaggac ggtgacagcg agttcggtga    1920

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accgaattcg ag                                                        2352

Claims (12)

1. 一种蛋白，是由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述的蛋白的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将含有启动子和权利要求2或3所述编码基因的DNA片段***质粒pSET152的多克隆位点中，得到的重组表达载体；所述含有启动子和权利要求2或3所述编码基因的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示。

6.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。

7.含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。

8.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组菌。

9.如权利要求8所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组载体导入目的阿维链霉菌中得到的重组菌。

10.如权利要求9所述的重组菌，其特征在于：所述目的阿维链霉菌为阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis） ZLX6003，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC №.3229。

11.如权利要求8或9所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis） ZLX6056，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC №.3796。

12.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述编码基因或者权利要求8-11中任一所述的重组菌在生产阿维菌素中的应用。

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