CN102240670B

CN102240670B - 一种重金属污染土壤的微生物修复方法

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Publication number: CN102240670B
Application number: CN 201110122739
Authority: CN
Inventors: 范文宏; 贾莹莹; 姜维; 吴矿
Original assignee: Beihang University
Current assignee: Beihang University
Priority date: 2011-05-12
Filing date: 2011-05-12
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2031-05-12
Also published as: CN102240670A

Abstract

本发明提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，具体包括：步骤一：分离球形红细菌；步骤二：球形红细菌的培养；步骤三：球形红细菌修复重金属污染土壤。本发明提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法可以有效改善重金属在土壤中的存在形态，并大大降低了重金属在植物积累量。本发明提出的重金属污染土壤的微生物修复方法属于原位修复，操作简单、成本低廉、修复效果好，并且不破坏土壤肥力、对环境不存在二次污染。

Description

一种重金属污染土壤的微生物修复方法

技术领域

本发明属于土壤微生物修复领域，具体涉及一种重金属污染土壤的微生物修复方法。

背景技术

土壤重金属污染具有污染物在土壤中移动性差、滞留时间长、不能被微生物降解的特点，并可经水、植物等介质最终影响人类健康。历史上发生的“骨痛病”和“水俣病”就是由于重金属污染而致病的典型案例。面对如此严峻的土壤重金属污染问题，研究出切实可行的处理技术是现在的当务之急。

近年来人们对于土壤的污染问题日益重视，为减轻重金属对土壤的污染，人们做了许多研究，开发出了各种不同的处理技术，一是活化作用，主要利用不同的手段增加土壤中重金属的活动性，最终将重金属从土壤中排除出去：二是固定化作用，利用不同的手段将土壤中的重金属转变为更稳定的组分，使其难以被作物利用而达到保护作物的目的。

目前学者研究的基于活化作用的修复方法主要包括电动修复方法、化学淋洗方法以及植物修复方法等，这类方法的优点是能够清除土壤中的重金属，但是应用中存在着耗能高、难于实现原位修复等缺点。相对于活化方法来说，固定方法虽然不能实现重金属的去除，但是操作简便、成本低廉，易于实现原位修复，传统的的固定化方法主要是向土壤中添加不同类型的化学物质，与重金属发生吸附、螯合和沉淀作用来实现重金属的固定化。

球形红细菌属于光合细菌紫色非硫菌群的红细菌属，球形红细菌是具有原始光能合成体系的原核微生物，兼性厌氧细菌，可以随着生存环境灵活地改变代谢类型。与其他微生物材料相比，球形红细菌对重金属具有极强的耐受能力，在实际应用过程中具有较大的优越性。目前，国外已有关于球形红细菌吸附水体中重金属镉的研究，也有国内学者利用球形红细菌处理矿山废水，取得了很好的去除效果，但是对球形红细菌修复重金属污染的土壤尚未见报道，与传统的固定化方法相比，微生物固定方法具有费用低、效果好、无二次污染的特点。

发明内容

本发明提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法。该方法采用添加分离鉴定后的球形红细菌至重金属污染土壤中，在淹水状态下修复重金属污染土壤中重金属，使种植在修复后重金属污染土壤中小麦幼苗体内金属含量明显下降。

本发明提出的一种重金属污染土壤的微生物修复方法，具体包括以下几个步骤：

步骤一：分离球形红细菌：

利用涂布及画线分离方法从采油驱注水中分离得到球形红细菌。

利用涂布及画线分离方法从采油驱注水中分离得到球形红细菌的方法具体为：

(1)在三角烧瓶中加入100ml进行灭菌处理的液体培养基，然后加入1～2ml油田采油驱注水，在25～35℃环境下培养2～3天，得到添加有油田采油驱注水的培养基，反复重复上述过程，共制备多瓶添加有油田采油驱注水的培养基；

(2)从步骤(1)中制备的多瓶添加有油田采油驱注水的培养基中选取浊度最高的培养基，从中取出1ml，与9ml无菌水进行十倍稀释，再从混合液中取1ml，加入9ml无菌水进行十倍稀释，如此重复操作共5～6次，得到稀释倍数为10-5～10-6的稀释液；

(3)将步骤(2)中得到的稀释液在25～35℃条件下培养1～2天，然后从中取1～1.5ml稀释液在5～10g固体培养基中进行涂布，再25～35℃条件下培养1～2天，选取在固体培养基上高浓度区域分散的单菌落，将单菌落中直径大于0.3cm的单菌落分别用接种针挑取，置于5～10g固体培养基的培养皿上进行划线处理，于25～35℃条件下培养1～2天，完成分离得到球形红细菌的过程。

步骤二：球形红细菌的培养：

将步骤一中分离得到的球形红细菌按照每毫升液体培养基中接种8×10⁷～2×10⁸个细菌，在黑暗条件下进行培养，设定接种有细菌的液体培养基的pH值为6～8，培养温度为25～35℃，测定细菌生长曲线，培养5～30小时后，获得处于生长对数期的培养菌液，测定培养菌液的浓度为每毫升菌液中含有1×10⁸～3×10⁸个细菌。

步骤三：球形红细菌修复重金属污染土壤：

将步骤二中得到的培养菌液，在室温为20～30℃的条件下，加入重金属污染土壤中，添加比例满足每千克重金属污染土壤中接种50～200mL培养菌液，加入培养菌液后，若液面高度不满足液面与重金属污染土壤上层之间的高度差为3～5cm，需使用自来水填充，使重金属污染土壤保持淹水状态，修复30～35天，完成微生物修复全过程。

本发明具体有的优点在于：

(1)本发明提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，可以有效改善重金属在土壤中的存在形态，并大大降低了重金属在植物积累量。

(2)本发明提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，属于原位修复，操作简单、成本低廉、修复效果好，并且不破坏土壤肥力、对环境不存在二次污染。

附图说明

图1：本发明中得到的球形红细菌在显微镜400倍放大倍数下的示意图；

图2：本发明中得到的经球形红细菌的修复后的重金属污染土壤的扫描形貌图；

图3：本发明中得到的经球形红细菌的修复后的重金属污染土壤的的能谱分析结果。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，具体包括以下几个步骤：

步骤一：分离球形红细菌：

利用涂布及画线分离方法从油田采油驱注水中分离得到球形红细菌。该分离得到的球形红细菌经16sRNA基因序列测定数据以及细胞形态和生理生化实验数据鉴定，确定为球形红细菌。

利用涂布及画线分离方法从中国北方油田采油驱注水中分离得到球形红细菌具体为：

(1)在三角烧瓶中加入100ml进行灭菌处理的液体培养基，然后加入1～2ml油田采油驱注水，在25～35℃环境下培养2～3天，得到添加有油田采油驱注水的培养基，反复重复上述过程，共制备多瓶(大于等于3瓶，优选为3～5瓶)添加有油田采油驱注水的培养基。

(2)从步骤(1)中制备的多瓶添加有油田采油驱注水的培养基中选取浊度最高的培养基，从中取出1ml，与9ml无菌水进行十倍稀释，再从混合液中取1ml，加入9ml无菌水进行十倍稀释，如此重复操作共5～6次，得到稀释倍数为10^-5～10^-6的稀释液。

(3)将步骤(2)中得到的稀释液在25～35℃条件下培养1～2天，然后从中取1～1.5ml稀释液在5～10g固体培养基中进行涂布，再25～35℃条件下培养1～2天，选取在固体培养基上高浓度区域分散的单菌落，将单菌落中直径大于0.3cm的单菌落分别用接种针挑取，置于另一固体培养基(5～10g)的培养皿上进行划线处理，于25～35℃条件下培养1～2天，完成从油田采油驱注水中分离得到细菌的过程。可以将分离纯化后的单菌落移到另一固体培养基中，于0～4℃条件下进行保存。

从油田采油驱注水中分离得到的细菌经16sRNA基因序列测定数据以及细胞形态和生理生化实验数据鉴定，为球形红细菌，其生理特征为：革兰氏阴性菌，杆状，有鞭毛，细菌大小0.6～1微米，***繁殖。该细菌能在厌氧光照的条件下进行光能异养生长，而且能在好氧黑暗条件下进行好气异养生长。

分离得到的球形红细菌在400倍放大倍数的显微镜下观察，如图1所示，该球形红细菌的形态为杆状，有鞭毛可进行移动，细菌大小为0.6～1微米，生殖方式为***生殖。

所述的液体培养基成分为：每1L水中含有KH₂PO₄ 0.2～0.7g、NH₄Cl 0.5～1.5g、CaSO₄0.5～1.5g、MgSO₄·7H₂O 1.5～2.5g、乳酸3.0～4.0g、酵母膏0.5～1.5g、抗坏血酸0.05～0.15g、巯基醋酸0.05～0.15g和FeSO₄·7H₂O 0.2～0.7g，培养基的pH值为7.0～7.5。

所述的固体培养基的成分为：每1L水中含有琼脂10～20g、KH₂PO₄ 0.2～0.7g、NH₄Cl0.5～1.5g、CaSO₄ 0.5～1.5g、MgSO₄·7H₂O 1.5～2.5g、乳酸3.0～4.0g、酵母膏0.5～1.5g、抗坏血酸0.05～0.15g、巯基醋酸0.05～0.15g和FeSO₄·7H₂O 0.2～0.7g，培养基的pH值为7.0～7.5。

步骤二：球形红细菌的培养：

将步骤一中分离得到的球形红细菌按照每毫升液体培养基中接种8×10⁷～2×10⁸个细菌，在黑暗条件下进行培养，设定接种有细菌的液体培养基的pH值为6～8(优选为7)，培养温度为25～35℃(优选为30℃)，测定细菌生长曲线，培养5～30小时(优选为15～30小时)后，获得处于生长对数期的培养菌液，测定培养菌液的浓度为每毫升菌液中含有1×10⁸～3×10⁸个细菌。

步骤三：球形红细菌修复重金属污染土壤：

重金属污染土壤包括Zn、Pb、Cu或Hg中任意的一种金属元素污染的土壤，还包括Cd、Zn、Pb、Cu和Hg中两种以上的金属元素污染的土壤。且该重金属污染土壤的类型为褐土、红壤或棕壤。上述的金属元素污染的浓度分别为：Cd元素的浓度为1～60mg·kg^-1，Zn元素的浓度为500～3000mg·kg^-1，Pb元素的浓度为500～3000mg·kg^-1，Cu元素的浓度为400～2000mg·kg^-1之间，Hg元素的浓度为1.5～50mg·kg^-1，均超出中华人民共和国土壤环境质量标准三级标准。

对应用本发明提出的重金属污染土壤的微生物修复方法修复的重金属污染土壤的修复效果，同时采用小麦幼苗实验法和Tessier连续提取法进行评价，小麦幼苗实验法描述了修复前后土壤中金属生物有效性的变化，直接反映出修复效果，Tessier连续提取法描述了修复前后土壤中金属的形态变化，表明土壤中金属转变为更佳稳定的形态。结果表明，本发明提出的重金属污染土壤的微生物修复方法可以有效改善土壤中重金属形态分布，大大降低了重金属在植物体内的积累量，达到了良好的修复效果。

实施例1：

本实施例中提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，具体包括以下几个步骤：

步骤一：分离球形红细菌：

利用涂布及画线分离方法从的采油驱注水中分离得到球形红细菌，该分离得到的细菌经16sRNA基因序列测定数据以及细胞形态和生理生化实验数据鉴定，确定其为球形红细菌。

(1)在三角烧瓶中加入100ml进行灭菌处理的液体培养基，然后加入1ml油田采油驱注水，在25℃环境下培养2天，得到添加有油田采油驱注水的培养基，反复重复上述过程，共制备3瓶添加有油田采油驱注水的培养基。

(2)从步骤(1)中制备的3瓶添加有油田采油驱注水的培养基中选取浊度最高的培养基，从中取出1ml，与9ml无菌水进行十倍稀释，再从混合液中取1ml，加入9ml无菌水进行十倍稀释，如此重复操作共5次，得到稀释倍数为10^-5的稀释液。

(3)将步骤(2)中得到的稀释液在25℃条件下培养1天，然后从中取1ml稀释液在5g固体培养基中进行涂布，再25℃条件下培养1天，选取在固体培养基上高浓度区域分散的单菌落，将单菌落中直径大于0.3cm的单菌落分别用接种针挑取，置于另一固体培养基(5g)的培养皿上进行划线处理，于30℃条件下培养1天，完成从油田采油驱注水中分离得到细菌的过程。将分离纯化后的单菌落移到另一固体培养基中，于0℃条件下进行保存。

所述的液体培养基成分为：每1L水中含有KH₂PO₄ 0.2g、NH₄Cl 0.5g、CaSO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 1.5g、乳酸3.0g、酵母膏0.5g、抗坏血酸0.05g、巯基醋酸0.05g和FeSO₄·7H₂O0.2g，培养基的pH值为7.0。

所述的固体培养基的成分为：每1L水中含有琼脂10g、KH₂PO₄0.2g、NH₄Cl 0.5g、CaSO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O 1.5g、乳酸3.0g、酵母膏0.5g、抗坏血酸0.05g、巯基醋酸0.05g和FeSO₄·7H₂O 0.2g，培养基的pH值为7.0。

步骤二：球形红细菌的培养：

将步骤一中分离得到的球形红细菌按照每毫升液体培养基中接种1×10⁸个细菌，在黑暗条件下进行培养，设定接种有细菌的液体培养基的pH值为6，培养温度为25℃，测定细菌生长曲线，培养5小时后，获得处于生长对数期的培养菌液，测定培养菌液的浓度为每毫升菌液中含有1×10⁸个细菌。

步骤三：球形红细菌修复重金属Cu污染土壤：

将步骤二中得到的培养菌液，在室温为20℃的条件下，加入重金属污染土壤中，该重金属污染土壤为Cu元素污染土壤，土壤中Cu元素的浓度为400mg·kg^-1，土壤类型为褐土，添加比例满足每千克重金属污染土壤中接种50mL培养菌液，加入培养菌液后，若液面高度不满足液面与重金属污染土壤上层之间的高度差为3cm，需使用自来水填充，使重金属污染土壤保持淹水状态，修复30天，完成微生物修复全过程。

采用Tessier连续提取法测定修复前后重金属污染土壤中金属含量和金属形态。

采用小麦幼苗实验法测定修复效果，小麦种子为中国农业科学院作物科学研究所选育的“轮选987”品种。小麦种子用70％的酒精消毒后用去离子水冲洗后在20±2℃恒温培养箱中催芽12～18h。选取出芽的的种子种植在分别装有修复前以及修复后土壤的盆中，种植密度为100粒/盆，在温度为20±2℃，光照为4000lx，湿度为50～95％RH，每日照射12h的人工气候箱中培养，培养14d后，取出小麦植株，用去离水冲洗干净，将叶和根分开，烘干后利用硝酸-高氯酸消解直至澄清透明，然后利用ICP-AES方法测定小麦根和叶中的金属积累量。

采用Tessier连续提取法结果表明土壤修复前后的Cu含量没有发生变化，但其化学形态发生了显著变化，土壤中可交换态铜的浓度明显降低，去除率达高达60％。利用小麦幼苗实验法评价修复效果，表明球形红细菌的修复效率在25％～50％之间，最高可达50％。土壤中金属铜的毒性和生物有效性发生明显的变化，说明球形红细菌对金属铜污染的土壤修复效果显著。

实施例2：

本实施例提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，具体包括以下几个步骤：

步骤一：分离球形红细菌：

利用涂布及画线分离方法从采油驱注水中分离得到球形红细菌。该分离得到的细菌经16sRNA基因序列测定数据以及细胞形态和生理生化实验数据鉴定，其为球形红细菌。

利用涂布及画线分离方法从中国北方油田采油驱注水中分离得到细菌具体为：

(1)在三角烧瓶中加入100ml进行灭菌处理的液体培养基，然后加入2ml油田采油驱注水，在35℃环境下培养3天，得到添加有油田采油驱注水的培养基，反复重复上述过程，共制备5瓶添加有油田采油驱注水的培养基。

(2)从步骤(1)中制备的5瓶添加有油田采油驱注水的培养基中选取浊度最高的培养基，从中取出1ml，与9ml无菌水进行十倍稀释，再从混合液中取1ml，加入9ml无菌水进行十倍稀释，如此重复操作共6次，得到稀释倍数为10^-6的稀释液。

(3)将步骤(2)中得到的稀释液在35℃条件下培养2天，然后从中取1.5ml稀释液在5～10g固体培养基中进行涂布，再35℃条件下培养2天，选取在固体培养基上高浓度区域分散的单菌落，将单菌落中直径大于0.3cm的单菌落分别用接种针挑取，置于另一固体培养基10g的培养皿上进行划线处理，于25℃条件下培养2天，完成从油田采油驱注水中分离得到细菌的过程。可以将分离纯化后的单菌落移到另一固体培养基中，于4℃条件下进行保存。

所述的液体培养基成分为：每1L水中含有KH₂PO₄ 0.7g、NH₄Cl 1.5g、CaSO₄ 1.5g、MgSO₄·7H₂O 2.5g、乳酸4.0g、酵母膏1.5g、抗坏血酸0.15g、巯基醋酸0.05～0.15g和FeSO₄·7H₂O 0.7g，培养基的pH值为7.5。

所述的固体培养基的成分为：每1L水中含有琼脂20g、KH₂PO₄ 0.7g、NH₄Cl 1.5g、CaSO₄1.5g、MgSO₄·7H₂O 2.5g、乳酸4.0g、酵母膏1.5g、抗坏血酸0.15g、巯基醋酸0.15g和FeSO₄·7H₂O 0.7g，培养基的pH值为7.5。

步骤二：球形红细菌的培养：

将步骤一中分离得到的球形红细菌按照每毫升液体培养基中接种8×10⁷个细菌，在黑暗条件下进行培养，设定接种有细菌的液体培养基的pH值为8，培养温度为35℃，测定细菌生长曲线，培养30小时后，获得处于生长对数期的培养菌液，测定培养菌液的浓度为每毫升菌液中含有3×10⁸个细菌。

步骤三：球形红细菌修复重金属污染土壤：

将步骤二中得到的培养菌液，在室温为30℃的条件下，加入重金属污染土壤中，该土壤为Cd/Zn污染土壤，土壤类型为红壤。Cd元素的浓度为1mg·kg^-1，Zn元素的浓度为500mg·kg^-1，添加比例满足每千克重金属污染土壤中接种200mL培养菌液，加入培养菌液后，若液面高度不满足液面与重金属污染土壤上层之间的高度差为5cm，需使用自来水填充，使重金属污染土壤保持淹水状态，修复35天，完成微生物修复全过程。

采用Tessier连续提取法测定发现，球形红细菌不改变土壤中存在的金属含量，但是金属的形态发生了明显的变化，从不稳定状态向稳定状态发生变化，其中镉可交换态的去除率为0～35％，锌可交换态的去除率在60％以上。

采用小麦幼苗实验法发现，麦幼苗叶、根中镉和锌含量均随着土壤中镉浓度和可交换态镉的浓度的升高而升高，镉之间的关系可利用线性方程来描述，锌之间的关系符合指数性关系。用小麦幼苗叶评价球形红细菌的修复效果对镉、锌的修复效果均为20％～60％，小麦幼苗根评价球形红细菌的修复效果对镉的修复效果为5％～50％。

实施例3：

步骤一：分离球形红细菌：

利用涂布及画线分离方法从采油驱注水中分离得到球形红细菌，该分离得到的细菌经16sRNA基因序列测定数据以及细胞形态和生理生化实验数据鉴定，其为球形红细菌。

(1)在三角烧瓶中加入100ml进行灭菌处理的液体培养基，然后加入1.5ml油田采油驱注水，在30℃环境下培养2天，得到添加有油田采油驱注水的培养基，反复重复上述过程，共制备4瓶添加有油田采油驱注水的培养基。

(2)从步骤(1)中制备的多瓶添加有油田采油驱注水的培养基中选取浊度最高的培养基，从中取出1ml，与9ml无菌水进行十倍稀释，再从混合液中取1ml，加入9ml无菌水进行十倍稀释，如此重复操作共5次，得到稀释倍数为10^-5的稀释液。

(3)将步骤(2)中得到的稀释液在35℃条件下培养1天，然后从中取1.2ml稀释液在8g固体培养基中进行涂布，再30℃条件下培养2天，选取在固体培养基上高浓度区域分散的单菌落，将单菌落中直径大于0.3cm的单菌落分别用接种针挑取，置于另一固体培养基(8g)的培养皿上进行划线处理，于35℃条件下培养1天，完成从油田采油驱注水中分离得到细菌的过程。将分离纯化后的单菌落移到另一固体培养基中，于2℃条件下进行保存。

所述的液体培养基成分为：每1L水中含有KH₂PO₄ 0.5g、NH₄Cl 1.0g、CaSO₄ 1.0g、MgSO₄·7H₂O2.0g、乳酸3.5g、酵母膏1.0g、抗坏血酸0.1g、巯基醋酸0.1g和FeSO₄·7H₂O 0.5g，培养基的pH值为7.2。

所述的固体培养基的成分为：每1L水中含有琼脂15g、KH₂PO₄ 0.5g、NH₄Cl 1.0g、CaSO₄ 1.0g、MgSO₄·7H₂O 2.0g、乳酸3.5g、酵母膏1.0g、抗坏血酸0.1g、巯基醋酸0.1g和FeSO₄·7H₂O 0.5g，培养基的pH值为7.2。

步骤二：球形红细菌的培养：

将步骤一中分离得到的球形红细菌按照每毫升液体培养基中接种2×10⁸个细菌，在黑暗条件下进行培养，设定接种有细菌的液体培养基的pH值为7，培养温度为30℃，测定细菌生长曲线，培养15h后，获得处于生长对数期的培养菌液，测定培养菌液的浓度为每毫升菌液中含有2×10⁸个细菌。

步骤三：球形红细菌修复重金属Pb污染土壤：

将步骤二中得到的培养菌液，在室温为25℃的条件下，加入重金属污染土壤中，为重金属Pb污染土壤，Pb元素的浓度为500mg·kg^-1，添加比例满足每千克重金属污染土壤中接种100mL培养菌液，加入培养菌液后，若液面高度不满足液面与重金属污染土壤上层之间的高度差为4cm，需使用自来水填充，使重金属污染土壤保持淹水状态，修复32天，完成微生物修复全过程。

采用Tessier连续提取法对修复结果进行测定，结果表明，残渣态是金属铅存在的主要形态，其所占总铅的比例在40％～60％之间。在球形红细菌的修复作用下，土壤中铅的形态发生了明显变化，从不稳定的可交换态、有机结合态向更稳定的残渣态转化。修复后土壤中小麦幼苗根内金属铅浓度明显低于修复前小麦根内金属铅浓度，其减小的幅度在10％～26.2％之间，说明球形红细菌的修复效率最高达26.2％。小麦叶重金属铅浓度的变化率在15％～52.7％之间，即球形红细菌的修复效率最高达52.7％。

实施例4：

本实施例中提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其具体过程与实施例1的区别仅在于步骤三中的重金属污染土壤为金属Zn污染的土壤，Zn的浓度为500mg·kg^-1，其他各步骤与实施例1完全相同。

将完成经球形红细菌的修复后的重金属污染土壤进行扫描电镜观察，如图2所示，观察该球形红细菌在扫描电镜(SEM)中的形态，可以观察到在重金属Zn污染物存在条件下，球形红细菌细胞周围紧密结合一些球状的颗粒物，对小范围颗粒物进行能谱分析，结果如图3表示，具有明显的锌峰，充分表明了球形红细菌表面吸附了大量的锌。

实施例5：

本实施例中提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其具体过程与实施例1的区别仅在于步骤三中的重金属污染土壤为金属Zn污染的土壤，Zn的浓度为3000mg·kg^-1，其他各步骤与实施例1完全相同。

实施例6：

本实施例中提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其具体过程与实施例1的区别仅在于步骤三中的重金属污染土壤的Cu元素的浓度为2000mg·kg^-1，其他各步骤与实施例1完全相同。

实施例7：

本实施例中提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其具体过程与实施例2的区别仅在于步骤三中的重金属污染土壤的Cd元素的浓度为60mg·kg^-1，Zn元素的浓度为3000mg·kg^-1，其他各步骤与实施例1完全相同。

实施例8：

本实施例中提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其具体过程与实施例3的区别仅在于步骤三中的重金属污染土壤的Pb元素的浓度为3000mg·kg^-1，其他各步骤与实施例1完全相同。

实施例9：

本实施例中提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其具体过程与实施例2的区别仅在于步骤三中的重金属污染土壤为金属Hg污染的土壤，Hg的浓度为1.5mg·kg^-1，其他各步骤与实施例1完全相同。

实施例9：

本实施例中提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其具体过程与实施例2的区别仅在于步骤三中的重金属污染土壤为金属Hg污染的土壤，Hg的浓度为50mg·kg^-1，其他各步骤与实施例1完全相同。

实施例10：

本实施例中提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其具体过程与实施例2的区别仅在于步骤三中的重金属污染土壤为金属Cd/Zn/Pb复合污染的土壤，Cd元素的浓度为20mg·kg^-1，Zn的浓度为500mg·kg^-1，Pb元素的浓度为500mg·kg^-1，其他各步骤与实施例1完全相同。

实施例11：

本实施例中提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其具体过程与实施例2的区别仅在于步骤三中的重金属污染土壤为金属Zn/Pb/Cu/Hg复合污染的土壤，Zn的浓度为3000mg·kg^-1，Pb元素的浓度为3000mg·kg^-1，Cu元素的浓度为400mg·kg^-1，Hg的浓度为1.5mg·kg^-1，其他各步骤与实施例1完全相同。

实施例12：

本实施例中提供一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其具体过程与实施例2的区别仅在于步骤三中的重金属污染土壤为金属Cd/Zn/Pb/Cu/Hg复合污染的土壤，Cd元素的浓度为20mg·kg^-1，Zn的浓度为3000mg·kg^-1，Pb元素的浓度为3000mg·kg^-1，Cu元素的浓度为400mg·kg^-1，Hg的浓度为1.5mg·kg^-1，其他各步骤与实施例1完全相同。

Claims

1.一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于：具体包括以下几个步骤：

步骤一：分离球形红细菌：

利用涂布及画线分离方法从采油驱注水中分离得到球形红细菌；

步骤二：球形红细菌的培养：

将步骤一中分离得到的球形红细菌按照每毫升液体培养基中接种8×10⁷～2×10⁸个细菌，在黑暗条件下进行培养，设定接种有细菌的液体培养基的pH值为6～8，培养温度为25～35℃，测定细菌生长曲线，培养5～30小时后，获得处于生长对数期的培养菌液，测定培养菌液的浓度为每毫升菌液中含有1×10⁸～3×10⁸个细菌；

步骤三：球形红细菌修复重金属污染土壤：

2.根据权利要求1所述的一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于：所述的步骤一中利用涂布及画线分离方法从采油驱注水中分离得到球形红细菌的方法具体为：

（1）在三角烧瓶中加入100ml进行灭菌处理的液体培养基，然后加入1～2ml油田采油驱注水，在25～35℃环境下培养2～3天，得到添加有油田采油驱注水的培养基，反复重复上述过程，共制备多瓶添加有油田采油驱注水的培养基；

（2）从步骤（1）中制备的多瓶添加有油田采油驱注水的培养基中选取浊度最高的培养基，从中取出1ml，与9ml无菌水进行十倍稀释，再从混合液中取1ml，加入9ml无菌水进行十倍稀释，如此重复操作共5～6次，得到稀释倍数为10^-5～10^-6的稀释液；

（3）将步骤（2）中得到的稀释液在25～35℃条件下培养1～2天，然后从中取1～1.5ml稀释液在5～10g固体培养基中进行涂布，再25～35℃条件下培养1～2天，选取在固体培养基上高浓度区域分散的单菌落，将单菌落中直径大于0.3cm的单菌落分别用接种针挑取，置于5～10g固体培养基的培养皿上进行划线处理，于25～35℃条件下培养1～2天，完成分离得到球形红细菌的过程。

3.根据权利要求1所述的一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于：所述的液体培养基成分为：每1L水中含有KH₂PO₄ 0.2～0.7g、NH₄Cl 0.5～1.5g、CaSO₄ 0.5～1.5g、MgSO₄·7H₂O 1.5～2.5g、乳酸3.0～4.0g、酵母膏0.5～1.5g、抗坏血酸0.05～0.15g、巯基醋酸0.05～0.15g和FeSO₄·7H₂O 0.2～0.7g，培养基的pH值为7.0～7.5。

4.根据权利要求2所述的一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于：所述的固体培养基的成分为：每1L水中含有琼脂10～20g、KH₂PO₄ 0.2～0.7g、NH₄Cl 0.5～1.5g、CaSO₄ 0.5～1.5g、MgSO₄·7H₂O 1.5～2.5g、乳酸3.0～4.0g、酵母膏0.5～1.5g、抗坏血酸0.05～0.15g、巯基醋酸0.05～0.15g和FeSO₄·7H₂O 0.2～0.7g，培养基的pH值为7.0～7.5。

5.根据权利要求1所述的一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于：所述的重金属污染土壤的类型为褐土、红壤或棕壤。

6.根据权利要求1所述的一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于：所述的步骤三中的重金属污染土壤包括Zn、Pb、Cu或Hg中任意的一种金属元素污染的土壤。

7.根据权利要求1所述的一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于：所述的步骤三中的重金属污染土壤包括Cd、Zn、Pb、Cu和Hg中两种以上的金属元素污染的土壤。

8.根据权利要求1所述的一种重金属污染土壤的微生物修复方法，其特征在于：所述的步骤三中的重金属污染土壤中Cd元素的浓度为1～60mg·kg^-1，Zn元素的浓度为500～3000mg·kg^-1，Pb元素的浓度为500～3000mg·kg^-1，Cu元素的浓度为400～2000mg·kg^-1之间，Hg元素的浓度为1.5～50mg·kg^-1。