CN102232956A - 一种防治代谢性疾病的化合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防治高脂血症、动脉粥样硬化症和II型糖尿病等代谢性疾病的化合物及其用途。本发明首次揭示了一种新的SREBP途径的抑制剂，该抑制剂通过抑制SREBP途径而特异性抑制胆固醇、脂肪酸和甘油三酯等脂质合成，降低脂质水平，从而为肥胖症、动脉粥样硬化症和II型糖尿病等代谢性疾病的预防和治疗提供新的途径。

Description

一种防治代谢性疾病的化合物及其用途

技术领域

本发明属于药物学领域；更具体地，本发明涉及一种防治高脂血症、动脉粥样硬化症和II型糖尿病等代谢性疾病的化合物及其用途。 

背景技术

代谢性疾病如动脉粥样硬化症，II型糖尿病等已经成为越来越严重的世界性健康难题，已知其发生与高脂血症有密切关系。例如血液中胆固醇水平过高引起高胆固醇血症，进而诱发动脉粥样硬化症，动脉粥样硬化症又是引起冠心病、中风、心肌梗塞等心血管疾病的最常见原因；血液脂肪酸和甘油三酯水平过高将会引起高甘油三酯血症，后者是诱发胰岛素抵抗及II型糖尿病的主要原因。由于高血脂的致病性，在代谢性疾病的治疗与预防方案中都把降脂作为重要组成。 

已知哺乳动物调控胆固醇和脂肪酸合成的关键因子是一类转录因子蛋白：甾醇反应元件结合蛋白(SREBP)(Goldstein，J.L.等(2006).Protein sensors formembrane sterols.Cell 124，35-46)。这一类蛋白质的前体首先在内质网(ER)上合成，前体通过SREBP切割激活蛋白(SCAP)转运到高尔基体，然后经过两种蛋白酶(site-1protease(S1P)和site-2protease(S2P))酶切，释放其N端的活性结构域，进入细胞核发挥转录因子作用，与靶基因启动子区的SREBP反应元件(SRE)结合，启动下游基因的表达。SREBP蛋白的剪切成熟严格受细胞内甾醇(胆固醇或氧化型甾醇如25-羟胆固醇)水平的调控。细胞内甾醇水平过高时，SCAP与内质网上的Insig蛋白结合将SREBP前体滞留在ER，降低细胞脂质合成基因表达。反之，核内活性形式的SREBP增多，促进细胞脂质合成。 

已知哺乳动物细胞有三种不同形式的SREBP：SREBP-1a，-1c和SREBP-2(Horton，J.D.等(2002).SREBPs：activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver.J.Clin.Invest 109，1125-1131)，它们具有相同的剪切入核调控特征，其成熟过程均如上所述。三种亚型的区别在于：它们靶基因不同，SREBP-1a，-1c主要调控脂肪酸合成途径的基因的表达，SREBP-2主要调控胆固醇合成途径的基因的表达以及低密度脂蛋白受体基因 表达。肝脏特异性敲除SCAP或者S1P基因的小鼠，其SREBP剪切成熟过程受到抑制，进而表现为其脂质合成显著下调，血液胆固醇和甘油三酯水平明显降低。提示SERBP途径特异性抑制剂可作为一种潜在的降血脂物质(Yang，J.等(2001).Decreased lipid synthesis in livers of mice with disrupted Site-1protease gene.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98，13607-13612；Matsuda，M.等(2001).SREBP cleavage-activating protein(SCAP)is required for increased lipid synthesis in liver induced by cholesterol deprivation and insulin elevation.Genes Dev.15，1206-1216)。 

LXR是另一类受甾醇调控的核受体因子，其内源性激动剂主要包括24，25-环氧胆固醇和25-羟胆固醇(Repa，J.J.等(2000).The role of orphan nuclear receptors in the regulation of cholesterol homeostasis.Annu.Rev.Cell Dev.Biol.16，459-481)。它能够活化细胞内包括ABCA1，ABCG5/8及Cyp7a1在内的参与胆固醇外排的基因的表达，这一优点使其具有促进血液脂质水平下降的功能。因此，采用药理学配体活化LXR能够有效降低血清胆固醇水平起到良好的抗动脉粥样硬化作用。然而另一方面，LXR还具有激活SREBP-1c的作用，最终将导致脂肪肝引起的肝坏死及高甘油三酯血症(Schultz，J.R.等(2000).Role ofLXRs in control of lipogenesis.Genes Dev.14，2831-2838)。 

目前已知的细胞内源性SREBP抑制剂如24-羟胆固醇，25-羟胆固醇(25-HC)和27-羟胆固醇，它们也是LXR的激动剂，这类小分子无法作为针对高血脂相关疾病的潜在药物组成。因此，需要寻找新的SERBP途径的特异性抑制剂，使其特异性抑制SERBP-1，SREBP-2活化，同时不激活LXR信号通路。这将为高脂血症、动脉粥样硬化症和II型糖尿病等代谢性疾病的预防和治疗提供新的途径。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种防治高脂血症、动脉粥样硬化症和II型糖尿病等代谢性疾病的化合物及其用途。 

在本发明的第一方面，提供一种具有如式I所示的母核结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗代谢性疾病的组合物中的用途： 

在一个优选例中，所述的组合物是药物。 

在另一优选例中，所述的化合物具有如式II所示的结构。 

其中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、C1-C4烷氧基、卤素。 

在另一优选例中，所述的化合物具有式III所示的结构： 

在另一优选例中，所述的代谢性疾病包括：II型糖尿病、高脂血症、高胆固醇症、脂肪肝、胰岛素抵抗、肥胖症、动脉粥样硬化症、冠心病、中风、心肌梗塞等。 

在另一优选例中，所述高脂血症是包括但不仅限于动脉粥样硬化症或II型糖尿病。 

在另一优选例中，所述的组合物还用于： 

特异性的抑制甾醇反应元件结合蛋白(SREBP)途径；或 

促进SREBP切割激活蛋白(SCAP)和Insig蛋白(胰岛素诱导基因)的相互作用。 

在另一优选例中，所述的组合物还用于： 

下调甾醇反应元件结合蛋白-1(SREBP-1)，甾醇反应元件结合蛋白 -2(SREBP-2)，β-羟[基]-β-甲[基]戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)，β-羟[基]-β-甲[基]戊二酸单酰辅酶A合成酶(HMGCS)，鲨烯环氧酶(SE)，SC4MOL(sterol-C4-methyl oxidase-like)，24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)，FPPS，7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)，甲羟戊酸激酶(MvK)，羊毛固醇合成酶(LSS)，FDFT1(farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1)，低密度脂蛋白受体(LDLR)，胰岛素诱导基因(Insig)，鲨烯合成酶(SS)，脂肪酸合成酶(FAS)，ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)，硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(SCD-1)，硬脂酰辅酶A去饱和酶-2(SCD-2)，甘油-3-磷酸转酰酶(GPAT)，乙酰辅酶A羧化酶α(ACC)，脂肪酸去饱和酶-1(FADS-1)或脂肪酸去饱和酶-2(FADS-2)的表达。 

在另一优选例中，所述的组合物还用于： 

下调胆固醇、甘油三酯或脂肪酸生物合成； 

降低细胞脂质水平； 

降低血液和肝脏的总胆固醇和总甘油三酯水平； 

降低血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)含量，升高血液高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)含量； 

减小白色脂肪组织和褐色脂肪组织中脂肪细胞的大小； 

改善胰岛素抵抗，减低血糖，或提高胰岛素敏感性； 

减少动脉粥样硬化斑块面积；或 

增加动脉粥样硬化斑块稳定性。 

在本发明的另一方面，提供一种制备药物的方法，所述的药物用于预防或治疗代谢性疾病，所述方法包括：将有效量的具有如式I所示的母核结构的化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合： 

在本发明的另一方面，提供一种体外降低细胞胆固醇和脂肪酸生物合成的方法，对细胞施用具有如式I所示的母核结构的化合物或其药学上可接受的盐： 

在一个优选例中，所述细胞是肝脏细胞。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1.筛选调节SRE启动子转录活性的化合物。 

A.表达质粒pSRE-Luciferase的部分结构示意图。 

B.白桦酯醇能有效降低Huh-7/SRE-Luc细胞的荧光素酶活性。Huh-7/SRE-Luc细胞在含有10％去脂蛋白血清，1μM洛伐他汀及50μM甲羟戊酸的培养基A中处理16小时，这一过程能够有效上调细胞内源性活性形式的SREBP-2。再给细胞换成含有10％去脂蛋白血清，1μM洛伐他汀，50μM甲羟戊酸及不同候选物质的培养基A(其中不同化合物作用浓度在0.5-5μM范围内)，培养6小时后测定细胞荧光素酶活性变化。与对照相比，能够有效降低(低于50％)细胞荧光素酶活性的物质即为潜在的SREBP途径抑制剂。本发明中，通过对2000种候选物质进行检测，最终发现化合物白桦酯醇能有效降低Huh-7/SRE-Luc细胞的荧光素酶活性。 

图2.白桦酯醇特异性抑制SREBP途径。 

A.白桦酯醇对内源性SREBP蛋白剪切的影响。CRL-1601细胞在含有10％去脂蛋白去脂肪酸血清，1μM洛伐他汀及微少量的甲羟戊酸(50μM)的培养基A中处理16小时，再加入不同浓度梯度的白桦酯醇或1μg/ml 25-HC处理细胞6小时后，收集细胞的全蛋白裂解液，蛋白免疫杂交检测细胞内源性SREBP-1，SREBP-2蛋白的剪切调控的变化。结果显示：白桦酯醇能够显著减少细胞核内活性形式的内源性SREBP-1(n-SERBP-1)，SREBP-2蛋白(n-SERBP-2)。 

B.白桦酯醇对HMGCR蛋白稳定性的影响。采用FuGENE6转染方法向CHO细胞中共转染HMGCR、Insig1表达质粒。转染24小时后给细胞换培养基E处理 16小时，再加入不同浓度梯度的25-羟胆固醇或者白桦酯醇同时均加入10mM甲羟戊酸，处理细胞6小时后，收集细胞的全蛋白裂解液，蛋白免疫杂交检测细胞外源性HMGCR蛋白量的变化。免疫印迹采用抗-T7抗体(抗HMGCR)或抗-Myc抗体(抗Insig-1)。结果显示：与25羟胆固醇不同，白桦酯醇特异性抑制SREBP途径，对HMGCR蛋白的稳定性没有影响。 

C.白桦酯醇对外源性SREBP蛋白剪切的影响。转染前一天将SRD-13A细胞按照4×10⁵每60-mm培养皿的密度接种在培养基C中。24小时后给细胞换培养基B并采用FuGENE 6试剂(Roche)进行转染。质粒DNA总转染量是3μg每盘细胞。不足用pTK空载或pcDNA3补平。转染8小时后给细胞换培养基E再加上1％CDX。37℃培养1小时，PBS洗细胞两次，换培养基E再加上甾醇或者白桦酯醇，对照细胞加DMSO(所有细胞中DMSO终浓度为0.1％)。换液6小时后，PBS洗细胞并收集细胞蛋白，蛋白免疫杂交检测细胞外源性SREBP-1，SREBP-2蛋白的剪切调控的变化。免疫印迹采用抗-SREBP-2抗体、抗SCAP抗体或抗-Myc抗体(抗Insig-1)。结果显示：白桦酯醇能够显著减少细胞核内活性形式的外源性SREBP-2蛋白，且这一抑制效果是Insig蛋白依赖性的。 

D.白桦酯醇抑制SREBP途径的作用机制。采用FuGENE6转染方法向SRD-13A细胞中共转染SREBP-2、SCAP、Insig1表达质粒。转染24小时后给细胞换培养基E处理16小时，再加入白桦酯醇处理细胞6小时后，蛋白免疫共沉淀外源性Insig蛋白，再通过蛋白免疫杂交检测与之结合的外源性SCAP蛋白量的变化。裂解物用抗-Myc抗体免疫沉淀；免疫印迹采用抗SCAP抗体或抗-Myc抗体(抗Insig-1)。结果显示：白桦酯醇能够显著促进SCAP与Insig蛋白相互作用，从而抑制细胞SREBP蛋白剪切成熟。 

图3.对化合物白桦酯醇构效关系的研究。 

A.白桦酯醇及其类似物的结构。 

B.白桦酯醇特异性抑制细胞核内活性形式的SREBP-2的产生。在CHO-7细胞中，首先利用培养基E处理细胞16小时，再采用白桦酯醇及其结构类似物处理细胞6小时后，收集细胞全蛋白裂解液，用IgG-7D4(抗-SREBP-2抗体)进行蛋白免疫杂交实验，结果显示：化合物白桦酯醇特异性减少细胞核内活性形式的SREBP-2。 

C.白桦酯醇通过减少细胞核内活性形式的SREBP而抑制细胞胆固醇合成，降低细胞胆固醇水平。CHO-7细胞中，用含有5％去脂蛋白血清和不同浓度 梯度的白桦酯醇的培养基B培养细胞10天后，无水乙醇固定细胞，结晶紫染色检测细胞生长情况，正常生长的细胞可以被固定并结晶紫染色后显示紫色。结果显示：随着白桦酯醇处理浓度的升高，细胞死亡，补充了外源胆固醇能够使细胞存活，提示白桦酯醇通过降低细胞胆固醇水平使细胞死亡。 

图4.化合物白桦酯醇特异性抑制细胞胆固醇合成及脂肪酸合成途径的基因和酶类的表达，从而显著抑制细胞脂质合成，降低细胞胆固醇水平和脂肪酸及中性脂质的水平。 

A-C.白桦酯醇对胆固醇合成途径及脂肪酸合成途径中一系列基因的表达调控。CRL-1601细胞在含有10％去脂蛋白去脂肪酸血清，1μM洛伐他汀及微少量的甲羟戊酸(50μM)的培养基A中处理16小时，再加入不同浓度梯度的白桦酯醇处理细胞6小时后，收集细胞RNA。逆转录得到cDNA，通过荧光实时定量PCR方法检测胆固醇合成途径及脂肪酸合成途径中一系列SREBP靶基因的表达调控。结果显示：白桦酯醇能够显著减少胆固醇合成途径及脂肪酸合成途径中一系列SREBP靶基因的表达(A-B)。采用同样的方法，还分析了白桦酯醇对LXR信号通路基因的表达调控。结果显示：白桦酯醇特异性减少胆固醇合成途径及脂肪酸合成途径中一系列SREBP靶基因的表达，但是对于对LXR信号通路基因的表达基本上没有影响，说明其调控具有特异性(C)。 

D-E.白桦酯醇对细胞胆固醇合成及脂肪酸合成过程的调控。CRL-1601细胞培养在含有10％去脂蛋白去脂肪酸血清，1μM洛伐他汀及微少量的甲羟戊酸(50μM)的培养基A中同时加入不同浓度梯度的白桦酯醇处理细胞16小时后，给细胞换成含有10％去脂蛋白去脂肪酸血清的培养基A，同时不同浓度梯度的白桦酯醇的培养基，并向细胞中加入一定浓度的¹⁴C标记的乙酸盐作为胆固醇和脂肪酸从头合成的底物，示踪细胞胆固醇和脂肪酸的合成，标记2个小时后收集细胞。采用有机溶剂抽提的方法获得细胞胆固醇和脂肪酸组分，通过薄层层析方法分离各个脂质组分，然后利用放射自显影方法分析不同条件下细胞胆固醇和脂肪酸的合成情况。结果显示：随着白桦酯醇处理浓度的增加，细胞胆固醇和脂肪酸的从头被显著抑制。而他汀仅能够抑制胆固醇合成，不能够抑制脂肪酸合成。 

F、H.Fillipin染色方法分析白桦酯醇对细胞胆固醇水平的影响。在CRL-1601细胞中，首先利用含有5％去脂蛋白血清1μM洛伐他汀，50μM甲羟戊酸的培养基A处理细胞16小时，给细胞换含有5％去脂蛋白血清，500μM甲 羟戊酸的培养基A，同时采用不同浓度的白桦酯醇处理细胞12小时后，4％PFA固定细胞，进行Fillipin染色，结果显示：白桦酯醇显著降低细胞内胆固醇水平。 

G、I.Nile-red染色方法分析白桦酯醇对细胞中性脂质水平的影响。在CRL-1601细胞中，首先利用无血清培养基处理细胞16小时，给细胞换含有5％去脂蛋白血清，1μM洛伐他汀，500μM甲羟戊酸的培养基A，同时采用不同浓度的白桦酯醇处理细胞12小时后，4％PFA固定细胞，进行Nile red染色，结果显示：白桦酯醇显著降低细胞内中性脂质的水平。 

图5.在动物水平上检测化合物白桦酯醇对小鼠血液及肝脏脂肪组织脂质水平的影响。 

8周龄的C57BL/6小鼠分为4组，每组5-7只，分别喂养基础饲料(Chow)、高胆固醇高脂肪饲料(WD)+生理盐水、WD+洛伐他汀(30mg/kg/天)、WD+白桦酯醇(30mg/kg/天)。6周后处死小鼠进行下一步实验。 

A.各处理组中小鼠的食物摄入量没有明显异常。 

B.与喂养基础饲料的小鼠相比，高胆固醇高脂肪组小鼠的体重随时间有显著上升趋势，洛伐他汀和白桦酯醇均能显著降低小鼠的体重增加值。 

C-D.核磁共振(MRI)分析小鼠脂肪组织与肌肉组织的百分比值变化。结果显示：与基础饲料组相比，高胆固醇高脂肪加生理盐水的处理组小鼠脂肪组织与肌肉组织百分比值显著增加而洛伐他汀和白桦酯醇均能显著降低小鼠的这一比值的增加(C)，而且小鼠脂肪组织占总体重的百分比也呈现同样变化趋势即：与对照组相比，高胆固醇高脂肪加生理盐水的处理组小鼠脂肪组织占总体重的百分比显著增加，而洛伐他汀和白桦酯醇均能显著降低小鼠的脂肪组织占总体重比例的增加值(D)。 

E-H.分析小鼠血液总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、LDL胆固醇(LDL-c)和HDL-胆固醇(HDL-c)水平的变化。结果显示：白桦酯醇显著降低血液TC、TG、LDL-c，并显著增加HDL-c水平。 

I-J.分析小鼠肝脏总胆固醇、总甘油三酯水平的变化。结果显示：白桦酯醇显著降低高胆固醇高脂肪喂养条件下小鼠肝脏脂质水平。 

K.对小鼠白色脂肪组织(WAT)、褐色脂肪组织(BAT)切片进行HE染色。肝脏组织切片用油红O染色。结果显示：与对照组相比，高胆固醇高脂肪加生理盐水的处理组小鼠脂肪细胞显著增生肥大，而洛伐他汀和白桦酯醇均能显著抑制其细胞增生和肥大。 

图6.在动物水平上检测化合物白桦酯醇对小鼠胰岛素抵抗的作用效果。 

8周龄的C57BL/6小鼠分为4组，每组5-7只，分别喂养基础饲料(Chow)、高胆固醇高脂肪饲料(WD)+生理盐水、WD+洛伐他汀(30mg/kg/天)、WD+白桦酯醇(30mg/kg/天)。8周后，进行葡萄糖耐受及胰岛素耐受实验，测试前，小鼠禁食12小时，采取腹腔注射方式给小鼠注射2g/kg葡萄糖或者0.75U/kg胰岛素，不同时间点尾尖取血，检测各时间点血液葡萄糖水平。L：洛伐他汀；D：白桦酯醇。3天后，处死小鼠并再次检测小鼠血液葡萄糖水平和血液胰岛素水平。 

A.与生理盐水组相比，白桦酯醇显著改善小鼠葡萄糖耐受。 

B.根据(A)结果，统计曲线下面积。 

C.与生理盐水组相比，白桦酯醇显著改善小鼠胰岛素耐受。 

D.根据(C)结果，统计曲线下面积。 

E-F.白桦酯醇显著降低血液葡萄糖水平并提高胰岛素敏感性。 

糖耐量这些结果显示：白桦酯醇能显著改善糖代谢，增加胰岛素敏感性糖耐量、降低血液中的葡萄糖水平和胰岛素水平。 

图7.在动物水平上检测化合物白桦酯醇对小鼠肝脏及脂肪组织脂质代谢基因的表达调控。 

8周龄的C57BL/6小鼠分为4组，每组5-7只，分别喂养基础饲料(Chow)、高胆固醇高脂肪饲料(WD)+生理盐水、WD+洛伐他汀(30mg/kg/天)、WD+白桦酯醇(30mg/kg/天)。6周后处死小鼠分离肝脏组织和白色脂肪组织，制备RNA，采用荧光实时定量PCR(Q-PCR)方法统计分析小鼠肝脏胆固醇代谢、脂肪酸代谢相关基因、载脂蛋白类基因、糖代谢相关基因及白色脂肪组织中能量代谢相关基因的表达变化。 

A.与对照组相比，白桦酯醇处理组胆固醇合成途径的基因和酶类(如HMGCR，HMGCS，SS等)的mRNA水平平均下调31-65％。 

B.与对照组相比，白桦酯醇处理组脂肪酸合成途径的基因和酶类，如SREBP-1c下调约32％，FAS约39％，SCD-1约～20％。同时脂质分解相关酶如Malic酶和PPARα分别上调约31％和59％。 

C.与对照组相比，白桦酯醇处理组肝酯酶(hepatic lipase，HL)与载脂蛋白ApoE均有上调效果。 

D.与对照组相比，白桦酯醇处理组G-6-PD基因有1.2倍的上调效果，而PEPCK，IRS-1，IRS-2表达基本上没有变化，提示白桦酯醇有促进肝脏糖代谢 的功能。 

E.与对照组相比，白桦酯醇处理组adiponectin，LPL和PPAR-γ基因均有2-3.5倍上调变化，已知这些基因的上调具有抗糖尿病抗炎症的作用。 

图8.在动物水平上检测白桦酯醇对小鼠动脉粥样硬化形成的作用效果。 

8周龄LDLR^-/-小鼠分成2组，分别喂养高胆固醇高脂肪饲料(WD)+生理盐水、WD+白桦酯醇(30mg/kg/天)，10周后处死小鼠进行实验。 

A.取小鼠主动脉，固定后苏丹IV染色6分钟，80％乙醇复染3分钟。 

B-E.根据A中染色结果，对动脉粥样硬化斑块的定量。结果显示：与对照组相比，白桦酯醇能够显著减少饮食引起的LDLR基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的数量和大小。 

F.取小鼠近心脏处主动脉组织块，固定后进行组织切片染色及采用巨噬细胞标志分子MOMA-2和肌肉细胞标志分子α-actin免疫组化，分析比较小鼠动脉粥样硬化斑块处中性脂质沉积情况及巨噬细胞和肌肉细胞的分布情况。 

G-I.根据F中染色结果，对动脉粥样硬化斑块的定量。结果显示，与对照组相比，白桦酯醇能够显著降低小鼠动脉粥样硬化的斑块处脂质沉积和巨噬细胞增多，能够显著增加斑块的稳定性。 

图中，所有数据代表平均值±标准差；每组包括5只小鼠。 

图9.白桦酯醇特异性结合SCAP蛋白。 

A.基于白桦酯醇合成的光亲和标记探针(化合物1)及体外光亲和标记实验流程示意图。 

B.CHO-7细胞在含有5％LPDS，10μM compactin和10μM mevalonate的常规培养基中培养16小时后，白桦酯醇处理细胞6小时后，收集细胞膜组分和核组分，检测SREBP-2剪切调控。 

C.CHO-7细胞饥饿培养16小时后，收集细胞膜组分，光亲和标记探针的靶蛋白，然后通过click反应使偶联上生物素基团，利用生物素亲和素结合反应富集靶蛋白。WB检测SCAP和转铁蛋白受体(transferrin receptor)。其中，Betulin指白桦酯醇；Compound1指化合物1。 

图10.白桦酯醇显著减低血液脂质水平是SCAP蛋白依赖性的。C57BL/6J小鼠在喂养高胆固醇高脂肪饲料的同时分别通过灌胃的方法给予生理盐水、洛伐他汀(30mg/kg/day)或者白桦酯醇(30mg/kg/day)，4周后按照每只小鼠5×10⁸pfu的感染量对小鼠采用尾静脉注射腺病毒。此后继续灌胃5天，处死小鼠，取 血液和肝脏组织检测肝脏基因表达变化(A)和血液脂质水平变化(B-E)。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示具有式(I)所示的母核结构的化合物对于代谢性疾病的防治具有极其显著的效果。本发明人鉴定出白桦酯醇是SREBP途径的特异性抑制剂，它特异性地促进SCAP和Insig的相互作用，抑制SREBP蛋白剪切成熟，下调胆固醇、脂肪酸和甘油三酯合成途径的一系列基因和酶类的表达，因此可知与白桦酯醇母核结构一致的一类化合物对于代谢性疾病的防治是有用的。本发明为开发以调节SREBP为靶点的多功能药物提供了有效途径。 

化合物 

本文所用的术语“烷基”指直链或支链饱和的、含有1-4个碳原子(较佳地1-2个碳原子)的脂族烃类基团。例如，烷基包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基。 

本文所用的术语“链烯基”包括含有至少一个碳碳双键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。 

本文所用的术语“链炔基”包括含有至少一个碳碳三键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。 

本文所用的术语“卤素”指F、Cl、Br、或I。 

其中，烷基、链烯基、链炔基等均可以含有或不含有取代基。例如，它们可以被含有1-3个(更佳地1-2个)选自(但不限于)：C_1-4的烷基，C_2-4链烯基，C_2-4链炔基，卤素的基团所取代。 

本文所用的术语“异构体”包括：几何异构体、对映异构体、非对映异构体(如顺反异构体，构象异构体)。 

本发明首先提供了一种具有如结构式(I)所示母核结构的化合物： 

本发明人对白桦酯醇及其衍生物进行了实验，发现其17位上的CH₂OH乃是抑制SREBP的关键性位点。因此，可以对其它位点进行修饰，而仍然保留其活性。结构式(I)所示母核结构形成一种适合的化合物空间构型，具有该结构的化合物可以以SREBP途径为靶点，通过与SREBP途径的相关蛋白发生相互作用，从而通过抑制SREBP途径实现防治代谢性疾病的目的。也即：所述的具有如结构式(I)所示母核结构的化合物是一种SREBP途径的抑制剂。 

作为本发明的优选方式，所述的化合物具有式(II)所示的结构： 

其中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、C1-C4烷氧基、卤素。 

较佳地，式(II)化合物中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C2烷基、C2-C3链烯基、C2-C3链炔基。 

如 的表示方法是本领域人员熟知的，其表示基团R可以取代在环上的任意一个或多个可被取代的位置。并且，在不同的取代位置上，R的选择可以是不同的。 

本发明还包括上述化合物的药学上可接受的盐、水合物或前体，只要它们也具有防治代谢性疾病的作用。所述的“药学上可接受的盐”是指一类化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。 

所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成具有结构式(I)所示母核结构的一种化合物，或结构式(I)所示母核结构的一个化合物所组成的盐或溶液。 

本发明还包括上述化合物的异构体、外消旋体，只要它们也具有防治代谢 性疾病的作用。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。 

作为本发明的一种优选方式，所述的化合物具有式(III)所示的结构。 

本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。 

合成化学改造、保护官能团方法学(保护或去保护)对合成应用化合物是很有帮助的，并且是现有技术中公知的技术，如R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，3^rd Ed.，John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser and M.Fieser，Fieser and Fieser”s Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；和L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)中都有公开。 

一些具有式(I)所示母核结构的化合物也可自生物(如动物或植物)中提取、分离和纯化。例如，式(III)化合物(白桦酯醇)是一类在自然界丰富存在的五环三萜类物质，可以通过简单的分离方法(分离得率在30％以上)从桦树皮中进行大量的抽提制备。 

用途 

基于本发明人的新发现，本发明提供了具有式(I)所示的母核结构的化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体的用途，用于制备防治代谢性疾病的药物(或组合物)。 

所述的代谢性疾病是指新陈代谢不正常而引起的疾病。代谢性疾病的病理基础是糖，脂肪和蛋白质代谢失常。代谢性疾病虽然不会直接危及生命，但却 可以导致其它严重威胁生命的疾病。判断代谢性疾病的指标主要有：血糖、甘油三酯、总胆固醇(TC)、不饱和游离脂肪酸(NFFA)和尿酸；上述指标超过正常水平，则可患有代谢性疾病。代谢性疾病主要包括：胰岛素抵抗、高胰岛素血症、糖尿病(特别是II型糖尿病)、糖耐量减低、肥胖、高胆固醇血症、脂质代谢异常、动脉硬化、冠心病、高血压、高尿酸血症和痛风等，其临床主要表现为腹部肥胖、粥样硬化性血脂异常、血压升高、胰岛素抵抗(伴或不伴糖耐量异常)以及栓塞和炎性反应状态等。 

动脉粥样硬化症由胆固醇及胆固醇酯在动脉壁下沉积引起，是导致冠心病和脑中风的主要致病因素，降低血液胆固醇水平是临床治疗该类疾病的主要手段。脂肪酸和甘油三酯代谢异常会直接引起胰岛素抵抗，是导致II型糖尿病的关键致病因素。在本发明的具体实例中，本发明人采用高胆固醇高脂肪饲料喂养小鼠的条件下，白桦酯醇显著降低小鼠体内血液和组织的脂质水平，减少体重增加，提高其胰岛素敏感性。进一步，在动脉粥样硬化模型小鼠低密度脂蛋白受体(LDLR)基因敲除小鼠中，检测到白桦酯醇能够有效减小动脉粥样硬化斑块的大小，并显著改善斑块的稳定性。 

现有技术已经发现，SREBP是一类非常重要的转录因子，它激活胆固醇、脂肪酸和甘油三酯等脂质的生物合成过程。在本发明的具体实例中，本发明所述的化合物的作用机理是特异性地阻断SREBP的成熟，抑制其活性。在细胞水平，所述化合物能显著抑制胆固醇、脂肪酸和甘油三酯等脂质合成基因的表达，减少脂质合成，降低细胞内脂质含量。在动物个体水平上，所述化合物表现为显著抑制高脂饮食引起的小鼠体重上升，降低动物血液、肝脏和脂肪等组织中的脂质水平，提高肥胖小鼠对胰岛素的敏感性，对II糖尿病有明显的治疗作用。同时，所述化合物能够显著减少高胆固醇饮食诱导的动脉内粥样硬化斑块的形成，并能有效增加斑块的稳定性，具有良好的抗动脉粥样硬化作用。 

与目前临床广泛应用的一线降胆固醇药物(如：洛伐他汀)相比，在给予相同剂量条件下，本发明的化合物具有与洛伐他汀相似甚至更好的疗效。例如在本发明的具体实例中证明：1)白桦酯醇能更显著地降低血液和组织中脂质水平；2)白桦酯醇能够抑制脂肪酸和甘油三酯合成，而他汀类药物则无此功效，因此白桦酯醇能显著提高胰岛素敏感性，对II型糖尿病有治疗作用；3)多数糖尿病患者并发有严重的动脉粥样硬化症，与目前常用的治疗糖尿病药物相比，白桦酯醇不仅改善胰岛素的敏感性，而且对动脉粥样硬化斑块有很明显的 疗效。总之，本发明的化合物通过全新的机制调控脂质代谢，对II型糖尿病和动脉粥样硬化症等有显著疗效。 

组合物 

如本文所用，术语“本发明的组合物”通常是药物组合物，其含有式(I)所示母核结构的化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体作为防治代谢性疾病的活性成分；以及药学上可接受的载体或赋形剂。 

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。 

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)即有合理的效益/风险比的物质。 

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的具有式(I)所示母核结构的化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。 

本发明还提供了制备防治代谢性疾病的组合物的方法，包括使用具有式(I)所示的母核结构的化合物。可将有效量的式(I)化合物与药学上可接受的载体混合获得本发明的组合物，活性成分在组合物中的重量比例例如可以是0.0001-50wt％；较佳地可以是0.001-20wt％。 

本发明的组合物也可以是一种中药或天然产物提取物，其中含有本发明的具有式(I)所示母核结构的化合物作为活性成分，提取可以采用一些已知的方法。 

本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物患处的剂型都是可以的。从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是一种口服或注射的制剂。比如可选自：颗粒剂、片剂、胶囊剂、溶液、或悬浮液、粉末剂。其中具有式(I)所示母核结构的化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。本发明的组合物中可以加入制备不同剂型时所需要的各种常规载体或辅料，如填充剂、矫味剂、抗氧化剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲物质等。这些添加剂都是本领域人员所熟知 的。 

本发明还提供了一种防治代谢性疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用有效量的式(I)化合物。活性成分的给药量是治疗有效量。当外用时，本发明所述的化合物的安全有效量通常约0.1ng-100mg/kg体重；较佳的约1ng-10mg/kg体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、用药者健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。 

此外，本发明所述的化合物还可与其他活性成分或治疗剂(如其它降血脂药物、降胆固醇药物、糖尿病药物等)一起使用。 

本发明的主要优点在于： 

(1)首次揭示了一类新的SREBP途径的抑制剂，其在抑制SREBP途径的同时，不会激活LXR信号通路，从而为动脉粥样硬化和II型糖尿病等代谢性疾病的预防和治疗提供新的途径。 

(2)本发明的化合物完全可以通过人工合成的方式生产，成本低。 

(3)如白桦酯醇等化合物可以大量地从自然界中分离得到，来源丰富，毒副作用小，成本低廉。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

材料与方法 

材料 

辣根过氧化物酶结合的驴抗鼠和抗兔IgG：获自Jackson免疫研究实验室。 

甲羟戊酸(mevalonate)，菲律宾菌素(Filipin)获自Sigma。 

白桦酯醇及其类似物获自中国上海药谷生物公司。白桦酯醇及其结构类似物的纯度经气相色谱鉴定高于99％。 

甲基-β-环化糊精(CDX)：获自Cyclodextrin Technologies DevelopmentInc.。 

各类甾醇获自Steraloids，Inc.。 

荧光素酶分析用试剂盒及细胞裂解缓冲液获自Promega。 

¹⁴C标记的乙酸盐获自PerkinElmer。 

去脂血清(LPDS，d＞1.215g/ml)：从新生小牛血清通过超离心获得。 

蛋白免疫杂交用抗体 

抗T7的一抗获自Novagen；抗Myc的一抗(IgG-9E10)获自Roche；抗人SREBP-1(IgG-H160)获自Santa Cruz；抗仓鼠SREBP-2的一抗(IgG-7D4)，抗仓鼠SCAP的一抗(IgG-9D5)，抗HMGCR的一抗(IgG-A9)及抗人SREBP-2的一抗(IgG-1D2)均常规方法制备自小鼠杂交瘤细胞系(ATCC)；抗gp78，抗GFP及抗HMGCR多克隆抗体均常规方法获自兔子抗血清。 

质粒 

pCMV-Insig-1-Myc，pCMV-HMGCR-T7质粒信息参见文献Sever et al.，Insig-dependent ubiquitination and degradation of mammalian 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase stimulated by sterols and geranylgeraniol.J Biol Chem.2003Dec 26；278(52)：52479-90；pCMV-SCAP，pTK-BP2质粒信息参见文献Daisuke et al.，Three mutations in sterol-sensing domain of SCAP block interaction with insig and render SREBP cleavage insensitive to sterols Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：16672-16677。pSRE-Luciferase启动子区来自以5’-GCGGGATCCCACAAAACAAAAAATATTTTTTTGG-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GCCAAGCTTTCGCAGCCTCTGCCAGGCAGTGTCC-3’(SEQ ID NO：2)作为引物，PCR扩增人肝cDNA获得人LDLR启动子区-588～+92核苷酸序列(SEQID NO：3)，并通过BamHI，HindIII双酶切位点克隆接入载体pGL3-Basic(购自Promega)，获得表达质粒pSRE-Luciferase。 

CACAAAACAAAAAATATTTTTTTGGCTGTACTTTTGTGAAGATTTTATTTAAATTCCTGATTGATCAGTGTCTATTAGGTGATTTGGAATAACAATGTAAAAACAATATACAACGAAAGGAAGCTAAAAATCTATACACAATTCCTAGAAAGGAAAAGGCAAATATAGAAAGTGGCGGAAGTTCCCAACATTTTTAGTGTTTTCCTTTTGAGGCAGAGAGGACAATGGCATTAGGCTATTGGAGGATCTTGAAAGGCTGTTGTTATCCTTCTGTGGACAACAACAGCAAAATGTTAACAGTTAAACATCGAGAAATTTCAGGAGGATCTTTCAGAAGATGCGTTTCCAATTTTGAGGGGGCGTCA GCTCTTCACCGGAGACCCAAATACAACAAATCAAGTCGCCTGCCCTGGCGACACTTTCGAAGGACTGGAGTGGGAATCAGAGCTTCACGGGTTAAAAAGCCGATGTCACATCGGCCGTTCGAAACTCCTCCTCTTGCAGTGAGGTGAAGACATTTGAAAATCACCCCACTGCAAACTCCTCCCCCTGCTAGAAACCTCACATTGAAATGCTGTAAATGACGTGGGCCCCGAGTGCAATCGCGGGAAGCCAGGGTTTCCAGCTAGGACACAGCAGGTCGTGATCCGGGTCGGGACACTGCCTGGCAGAGGCTGCGA(SEQ ID NO：3) 

培养基 

培养基A组分是Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基，含有100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。培养基B组分是Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基与F12培养基等比例混合，含有100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。培养基C组分是培养基B再加上5％FBS。培养基D组分是培养基C再加上5μg/ml胆固醇，1mM甲羟戊酸钠，及20μM油酸钠。培养基E组分是培养基B再加上5％LPDS，1μM洛伐他汀加上50μM甲羟戊酸钠。 

细胞培养 

CRL-1601(McArdle RH7777大鼠肝癌细胞；购自ATCC)和HuH7(人肝癌细胞系；购自ATCC)单细胞层在37℃和5％CO₂中，细胞生长在培养基A(Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基，含有100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)再加上10％FBS。CHO-7(CHO-K1细胞在去脂蛋白血清培养基中筛选得到的单克隆细胞；购自ATCC)单细胞层在37℃和5％C0₂中，细胞生长在培养基B(Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基与F12培养基等比例混合，含有100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)再加上5％FBS。SRD-13A(SCAP缺陷细胞株，来自CHO-7；购自ATCC)单细胞层在37℃和5％CO₂中，细胞生长在培养基D中。 

Huh-7/SRE-Luc细胞株建立及其筛选候选物质的方法 

将pSRE-Luciferase与pEGFP-N1(Invitrogen)按照5∶1的比例共转染Huh-7细胞48小时后给细胞换液，换成培养基A加10％FBS，700μg/ml G418。此后每2-3天换液一次，2周后形成独立的单克隆。挑取单克隆并鉴定其荧光素酶表达调控特征。最终选取表达量高且调控好的细胞株，命名为Huh-7/SRE-Luc。鉴定荧光素酶活性采用的是荧光素酶分析用试剂盒方法，检测过程中，绿荧光 蛋白的量作为内参。 

对候选物质进行筛选时，Huh-7/SRE-Luc细胞在含有去脂蛋白血清，他汀及微少量的甲羟戊酸钠(50μM)的培养基中处理16小时，这一去除胆固醇的过程能够有效上调细胞内源性活性形式的SREBP。给细胞换含有不同候选物质的培养基(其中不同化合物作用浓度在0.5-5μM范围内)，培养6小时后测定细胞荧光素酶活性变化。 

SRD-13A细胞中瞬时转染实验 

转染前一天将SRD-13A细胞(CHO-7细胞来源的SCAP基因缺陷细胞株，经体细胞遗传学方法获得；CHO-7细胞获自ATCC；SRD-13A细胞，参见Rawson RB，DeBose-Boyd R，Goldstein JL，Brown MS.Failure to cleave sterol regulatory element-binding proteins(SREBPs)causes cholesterol auxotrophy in Chinese hamster ovary cells with genetic absence of SREBP cleavage-activating protein.JBiol Chem.1999Oct 1；274(40)：28549-56)按照4×10⁵每60-mm培养皿的密度接种在培养基C中。24小时后给细胞换培养基B并采用FuGENE 6试剂(Roche)进行转染。质粒DNA总转染量是3μg每盘细胞，不足用pTK空载或pcDNA3(购自Promega)补平。转染24小时后给细胞换培养基E再加上1％CDX。37℃培养1小时，PBS洗细胞两次，换培养基C再加上甾醇或者白桦酯醇。对照细胞加DMSO(所有细胞中DMSO终浓度为0.1％)。换液6小时后，PBS洗细胞并收集细胞蛋白，下一步进行免疫杂交或免疫共沉淀实验。 

蛋白免疫杂交实验 

1.收集细胞全蛋白裂解液 

1)收集细胞并将其重悬于预冷的120μl  RIPA裂解液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl/0.1％(w/v)SDS，1.5％(w/v)NP40，0.5％deoxycholate，2mM MgCl₂)中，裂解液中需预先加入预冷的蛋白酶抑制剂(10μg/mlleupeptin，5μg/ml pepstatin A，25μg/ml ALLN，1mM PMSF和10μM MG132)。 

2)用7号针头剪切10次后，12000rpm冷冻离心10分钟，收集上清即为细胞全蛋白裂解液。样品蛋白浓度根据Lowry方法(Bio-Rad)进行定量后，加入4×SDS上样缓冲液(150mM Tris-HCl(pH 6.8)，12％SDS，30％(v/v)甘油，0.02％(w/v)溴酚蓝，6％(v/v)2-巯基乙醇)。 

3)100℃加热10分钟后上样，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。转移到硝酸纤维素膜，蛋白免疫杂交。各个抗体的使用浓度：IgG-1D2，3μg/ml；IgG-H160，0.2μg/ml。 

2.收集细胞膜蛋白 

1)收集细胞并将其重悬于预冷的500μl缓冲液A(10mM HEPES/KOH(pH 7.6)，1.5mM MgCl₂，10mM KCl，5mM EDTA，5mM EGTA，250mMSucrose)裂解液中需预先加入预冷的蛋白酶抑制剂(10μg/ml Leupeptin，5μg/ml Pepstatin A，25μg/ml ALLN，1mM PMSF和10μM MG132)。用7号针头剪切30次后1000g，4℃离心7分钟。 

2)沉淀重悬于0.1ml缓冲液C(20mM HEPES/KOH，pH7.6；2.5％(V/V)甘油；1.5mM MgCl₂；0.42M NaCl；1mM EDTA；1mM EGTA)裂解液中需预先加入预冷的蛋白酶抑制剂(10μg/ml Leupeptin，5μg/ml Pepstatin A，25μg/ml ALLN，1mM PMSF和10μM MG132)4℃低速旋转1h使缓冲液C充分作用于细胞，然后10⁵g 4℃高速离心30分钟。上清即为膜蛋白。 

3)在步骤1)中1,000g离心这一步得到的上清再次10⁵g，4℃离心30分钟后，沉淀用0.1ml SDS裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH6.8；100mM NaCl；1％SDS；1mM EDTA；1mM EGTA)重悬，室温1000rpm震荡摇匀30分钟后即为细胞核蛋白。 

蛋白免疫共沉淀方法 

1)收集细胞并将其重悬于预冷的600μl缓冲液B(50mM HEPES-KOH(pH 7.4)；100mM NaCl；1.5mM MgCl₂；0.1％(v/v)Nonidet P-40)裂解液中需预先加入预冷的蛋白酶抑制剂(同上)。 

2)用7号针头剪切15次，16,000g，4℃离心10分钟。每个样品上清中加入60μl交联了anti-Myc抗体的beads，4℃旋转2小时。1000g，4℃离心3分钟，保留上清样品，弃去剩余上清。 

3)向沉淀的beads中加入1ml缓冲液B，于4℃旋转5分钟后4℃，1000g离心5分钟，弃去上清，如此反复3次。 

4)弃去上清，每份样品中加入100μl的2×上样缓冲液，100℃空气浴处理10分钟。 

5)混匀，室温13200rpm离心1分钟。转移90μl上清到新的1.5ml的管 子当中，用于Western Blot检测。 

同位素示踪胆固醇和脂肪酸合成实验方法 

CRL-1601细胞培养在含有10％去脂蛋白去脂肪酸血清，1μM洛伐他汀及微少量的甲羟戊酸(50μM)的培养基A中同时加入不同浓度梯度的白桦酯醇处理细胞16小时后，给细胞换成含有10％去脂蛋白去脂肪酸血清的培养基A，同时不同浓度梯度的白桦酯醇的培养基，并向细胞中加入¹⁴C标记的乙酸盐(6μCi/ml)作为胆固醇和脂肪酸从头合成的底物，示踪细胞胆固醇和脂肪酸的合成，2个小时后收集细胞。采用有机溶剂抽提的方法获得细胞胆固醇和脂肪酸组分，通过薄层层析方法分离各个脂质组分，然后利用放射自显影方法分析不同条件下细胞胆固醇和脂肪酸的合成情况。 

菲律宾(Filipin)染色方法和尼罗红(Nile-Red)染色方法 

新鲜的Filipin储液浓度是5mg/ml，工作液是0.5mg/ml，稀释在无水乙醇中。用4％多聚甲醛(paraformaldehyde，稀释在PBS中)室温固定细胞30分钟，用PBS洗细胞3次，然后用0.5μg/ml工作液避光处理细胞30分钟。Filipin信号用Zeiss LSM 510confocal microscope双光子激光共聚焦显微镜观察，激发光720nm。新鲜的Nile-Red储液浓度是0.5mg/ml，工作液浓度是0.5μg/ml，稀释在含有10血清的PBS中，用4％多聚甲醛室温固定细胞后，用PBS洗细胞3次，然后用0.5μg/ml Nile-Red工作液避光37℃处理细胞10分钟。Nile-Red信号用Zeiss LSM 510confocal microscope观察，激发光523nm。 

荧光定量 

将对照细胞的平均信号强度定义为1，在每次实验里的每个实验组中，任意选择50个细胞作为定量对象。用Image Pro Plus 5.02软件荧光定量。 

荧光实时定量PCR(Q-PCR) 

1.RNA抽提与定量 

1)收集培养处理后的细胞或者动物组织，动物组织等量取自4-5只小鼠。 

2)裂解细胞。每个60mm培养皿中加入1ml Trizol试剂(Invitrogen)，室温处理10分钟。 

3)将细胞裂解液转移到1.5ml Eppendorf管中。 

4)每份样品加入200μl的氯仿，振荡低速混匀。 

5)4℃，13200rpm离心15分钟，转移500μl的上层水相至新的1.5mlEppendorf管中。 

6)每份样品中加入500μl异戊醇，振荡低速混匀。 

7)4℃，13200rpm离心10分钟，弃去上清，每份样品中加入1ml的70％乙醇，颠倒混匀。 

8)4℃，13200rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀室温晾干，加入适量的DEPC处理过的去离子水，充分溶解。 

9)取适量RNA稀释，测定260nm的光吸收值，计算样品浓度，测定260nm与280nm光吸收值的比值，计算样品纯度，最终调整样品浓度为1μg/μl。 

2.逆转录反应 

cDNA合成采用Promega公司的逆转录酶与缓冲液。每一体系含有4μg的RNA，0.5μg的OligodT(T15V1)，终浓度各0.4mM的dNTP。 

1)每一体系中加入4μg的RNA，0.5μg的OligodT(T15V1)，10.5μl DEPC水，混匀。 

2)70℃变性5分钟，冰上骤冷。 

3)每一反应体系中加入3μl DEPC水，5μl 5×MLV缓冲液，1μl dNTP(各10mM)，1μl M-MLV逆转录酶，混匀。 

4)37℃反应1小时。 

5)70℃延伸10分钟。 

3.实时定量PCR 

Realtime PCR采用20μl体系。使用Takara公司的HS Taq酶与缓冲液。每一体系含有0.5U HS Taq酶，终浓度0.5×SYBR绿，终浓度1.5mM MgCl₂，终浓度各62.5μM dNTP，终浓度0.6μM引物，1.5μl模板cDNA(逆转录产物稀释4倍用)。 

1)将水，缓冲液，dNTP，镁离子，引物，模板与酶加入反应体系，混匀。 

2)按照以下反应条件进行反应：a.94℃预变性5分钟，b.94℃变性30秒，c.60℃退火30秒，d.72℃延伸30秒，e.b-d循环40次，f.72℃延伸10分钟。 

2)根据荧光读数计算结果(所用的读数***为Stratagene Mx30005P^TMQPCR Systems)。 

本发明中荧光实时定量PCR采用的部分引物序列见表1。上述所有反应都进行三次独立的实验。 

表1 

其中，细胞水平的实时荧光定量PCR是在大鼠细胞系，所用引物序列参考大鼠的引物列表；动物水平的PCR是在小鼠个体上进行的，所用引物序列参考小鼠引物列表。 

动物实验方法 

所有实验用动物的饲养方法都按照上海实验动物中心的动物饲养及使用条例。 

a)出生8周后的雄性C57BL/6J获自上海Slaccas实验动物中心。将小鼠随机分笼后，给小鼠喂养基础饲料或高脂肪高胆固醇的饲料(高脂肪高胆固醇饲料组成是在基础饲料加1.25％胆固醇和20％猪油)洛伐他汀和白桦酯醇的给药量是30mg/kg/天，给药方式是灌胃。每周统计小鼠的体重，摄食量。6周后采用NMR(Bruker，Houston)方法统计分析小鼠脂肪组织的含量。随后将小鼠禁食14小时，取血液和各个器官组织。 

b)实验验证体内条件下白桦酯醇对小鼠胰岛素抵抗的作用效果：小鼠随机分组后，分别喂养基础饲料或者高脂肪高胆固醇饲料，同时灌胃洛伐他汀或者白桦酯醇(给药量30mg/kg/天)，8周后进行胰岛素及血糖耐量的测试实验。 

c)实验分析白桦酯醇对小鼠动脉粥样硬化形成的作用效果：取出生后6周 的LDL受体缺陷小鼠(与C57BL/6J鼠反交10次获得，购自Jackson Lab)。喂养至8周后将小鼠随机分成两组，每组5只，两组小鼠在喂养高脂肪高胆固醇饲料的同时分别灌胃生理盐水或者白桦酯醇(30mg/kg/天)，灌胃10周后，取血液和各个器官组织进行实验。 

小鼠血液及肝脏脂质水平测定 

利用试剂盒(Wako，Japan)测定血液总胆固醇总甘油三酯水平，测定血液LDL胆固醇和HDL胆固醇水平的方法参试剂盒手册(Applygen，China)。将肝组织匀浆后离心，取上清测定总胆固醇和总甘油三酯水平，蛋白定量方法是Lowry定量法(BIO-RAD)。 

小鼠肝脏和脂肪组织的组织病理学分析 

用Tissue-Tek OCT cryostat molds(Leica)对小鼠肝脏组织进行切片前的包埋，-80℃预冷后切取10-μm厚度的切片，采用0.5％油红O及苏木精染色细胞。用Paraffin对小鼠脂肪组织进行切片前的包埋，切取5μm厚度切片置于多L-赖氨酸包被的玻片后hematoxylin-eosin染色。对脂肪细胞大小参照Computer-As sisted Morphometric Analysis方法进行定量。 

葡萄糖耐量、胰岛素耐受实验 

C57BL/6对照组小鼠(购自中国上海Slaccas实验动物中心)喂养基础饲料，处理组小鼠喂养高脂肪高胆固醇饲料同时分别给予特定浓度的生理盐水、洛伐他汀(30mg/kg/天)、白桦酯醇(30mg/kg/天)，8周后统计测试小鼠血糖耐量及胰岛素耐受情况。测试前，小鼠禁食12小时，采取腹腔注射方式给小鼠注射2g/kg葡萄糖，或者0.75U/kg胰岛素，15，30，60及120分钟后，尾尖取血，检测各时间点血液葡萄糖水平。3天后，再次检测小鼠血液葡萄糖水平和血液胰岛素水平。 

在动物水平上检测化合物白桦酯醇对小鼠动脉粥样硬化形成的作用效果 

8周龄LDLR-/-小鼠(购自Jackson Lab)分成2组，在喂养高脂肪高胆固醇饲料条件下，分别灌胃生理盐水和白桦酯醇(30mg/kg/天)，10周后取小鼠主动 脉，固定后苏丹IV染色6分钟，80％乙醇复染3分钟。同时10周后取小鼠主动脉近心脏处组织块，Tissue-Tek OCT cryostat molds包埋固定后进行组织切片得到10-μm厚度的组织切片，采用0.5％油红O及苏木精染色方法分析脂质沉积情况。采用巨噬细胞和肌肉细胞免疫组化染色方法分析主动脉近心脏处板块的稳定性变化，最终染色结果通过计算机软件进行定量分析。 

腺病毒包装和纯化 

1)293A细胞(购自ATCC)，消化后接种到6孔板中，接种量为4×10⁵/孔，于37℃培养24小时。 

2)利用FuGENE HD(Roche)转染试剂，将PacI内切酶消化后的病毒表达载体转染细胞，每孔细胞转染4μg质粒，37℃培养24小时。 

3)给细胞换上含有1.25％低熔点琼脂糖的膏状培养基，室温冷却使凝固。固体层上加入1ml液体培养基。37℃培养，每隔3天补加适量新鲜液体培养基，连续培养约10天，直至观察到肉眼清晰可见的病毒噬斑。 

4)移液器枪尖穿刺固体培养层，吸取空斑周围正在裂解的细胞碎片和空斑内的液体，室温和-80℃反复冻融3次后，13,200rpm，室温离心10分钟得到上清为第一代病毒粒子。 

5)293A细胞，消化后接种到24孔板中，接种量为5×10⁴/孔，于37℃培养24小时。 

6)取4)中第一代病毒粒子感染5)中细胞，每孔加入200μl病毒上清，37℃培养6小时后，补加1ml新鲜培养基，37℃培养4-7天，观察到70％细胞病变裂解时，收集细胞和培养基，室温和-80℃反复冻融后，13,200rpm，室温离心10分钟得到上清为第二代病毒粒子。 

7)取第二代病毒粒子200μl，抽提病毒基因组DNA，用于鉴定基因型。鉴定为复制缺陷且包含目的基因片段的单克隆的剩余第二代病毒粒子将再次感染293A细胞，大规模扩增。 

8)将293A细胞铺于30-40个10cm皿，待细胞长满，向每块板中加入合适滴度(约10⁷-10⁸pfu/ml)的病毒上清10ul，继续培养，待细胞完全病变后(4-7天)，向每块皿中加入约500μl10％的NP-40以裂解细胞，裂解液冻存于-80℃。 

9)提前1天将8)中裂解液从-80℃冰箱中拿出，室温(或4℃)融解。收 集整个细胞裂解物，12,000rpm离心10分钟，弃细胞碎片，收集上清。每100ml上清加入50ml PEG8000(20％PEG8000，2.5M NaCl)，冰上放置1小时沉淀病毒。12,000rpm离心上述混合物20分钟，弃上清，将沉淀物悬浮在10ml密度为1.10g/ml的CsCl溶液中(溶剂为20mM Tris-HCl，PH8.0)，4℃，7000rpm离心5分钟，取上清。 

10)CsCl梯度的制备方法如下：加入2.0ml密度为1.40g/ml的CsCl溶液(溶剂同上)，然后加入3.0ml密度为1.30g/ml的CsCl溶液，再加入5ml的病毒悬浮液。20,000rpm，室温离心2小时。 

11)收集密度在1.30g/ml和1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中(透析袋使用前用10mM的EDTA-Na₂煮沸10分钟)。在透析缓冲液(50g蔗糖，10ml1M Tris-HCl，pH8.0，2ml1M MgCl₂定容至1L)中，4℃透析24小时，中间换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度(具体测定方法见Stratagene病毒滴度定量试剂盒使用手册)。 

腺病毒介导的小鼠肝脏SCAP基因沉默 

本发明人采用AdEasy^TM腺病毒表达载体(购自Stratagene)***介导小鼠肝脏SCAP基因沉默。具体做法如下： 

小鼠SCAP shRNA序列为(SEQ ID NO：138)： 

5’-GATCCCCgatcgacatggtcaagtccTTCAAGAGAggacttgaccatgtcgatcTTTTTA-3’ 

阴性对照shRNA序列为(SEQ ID NO：139)： 

5’-GATCCCCttctccgaacgtgtcacgtTTCAAGAGAacgtgacacgttcggagaaTTTTTA-3’； 

1)将上述shRNA序列接入pEGFP-H1载体(购自Clontech)的BamHI/HindIII位点内。 

2)将shRNA序列及其上游H1启动子序列从前述载体中用XhoI/HindIII酶切后亚克隆转接入pShuttle载体(购自Stratagene)的XhoI/HindIII位点内。 

3)利用pAdEasy载体使发生重组，得到腺病毒表达载体。 

4)采用293A细胞包装腺病毒，并氯化铯密度梯度离心方法进行浓缩纯化。 

5)采用病毒滴度试剂盒(Stratagene)测定病毒滴度后，按照每只小鼠5×10⁸pfu的感染量对小鼠采用尾静脉注射，注射体积不大于200μl为佳。 

6)5天后，处死小鼠，采集血液和肝脏组织进行后续鉴定实验。 

II.实施例 

实施例1、白桦酯醇是SREBP途径的特异性抑制剂 

细胞核内活性形式的SERBP通过与靶基因启动子区域的甾醇调控元件(SRE)结合启动下游基因的表达，进而促进脂质的生物合成(Wang，X.等(1993).Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter.II.Purification and characterization.J.Biol.Chem.268，14497-14504)。本发明人构建了荧光素酶报告基因***，该荧光素酶的启动子区包含一个甾醇调控元件(SRE)，在人的肝癌细胞系Huh-7细胞中稳定表达该荧光素酶，最终得到Huh-7/SRE-Luc细胞(图1A)用作筛选SREBP途径的小分子抑制剂。采用不同的候选化合物处理该细胞一定时间后，收集细胞并检测其荧光素酶活性的变化。通过对大量的化合物进行筛选，发现化合物白桦酯醇(lup-20(29)-ene-3β，28-diol)能够有效降低荧光素酶的活性(图1B)。 

本发明人比较了白桦酯醇和25-羟胆固醇在抑制SERBP方面的作用效果及特异性。25-羟胆固醇有三个主要的效果：抑制SREBP-2剪切，减少细胞核内活性形式的SREBP-2(图2A)；激活LXR信号通路，上调SERBP-1转录，组成性的上调细胞核内活性形式的SERBP-1(图2A)；促进胆固醇合成途径HMGCR蛋白的降解(图2B)。与25-羟胆固醇不同的是，白桦酯醇能够同时抑制SREBP-1，SREBP-2的剪切(图2A)，但是不会激活LXR信号通路，而且不促进HMGCR蛋白降解(图2B)。此外，与内源性实验结果一致的是，采用瞬时转染方法检测白桦酯醇对外源性SREBP-2的剪切调控，结果显示，白桦酯醇能完全的抑制外源性SREBP-2的剪切入核，并且这一抑制效果是Insig蛋白依赖性的(图2C，泳道3-11)。所以，白桦酯醇这一化合物特异性的抑制SREBP途径，同时不会激活LXR信号通路，不促进HMGCR蛋白降解。而且，蛋白免疫共沉淀实验证实，白桦酯醇能促进SCAP和Insig蛋白的相互作用(图2D，泳道4-5)，该实验解释了白桦酯醇的作用机制。 

为进一步了解白桦酯醇的作用机制，本发明人分析比较了5种白桦酯醇的结构类似物(图3A)，它们在结构上不同主要在于化合物17位的基团，白桦酯醇17位的基团是甲醇基(-CH₂OH)决定了它抑制SREBP途径的作用效果，其他化合物是甲醛基(-CHO)，甲羟基(-COOH)，或者甲基(-CH3)则无此活性。此外原人参二醇)(20(S)-protopanaxadiol)原人参三醇)(20(s)-protopanaxatriol)也不具有上述活性(图3B)。说明白桦酯醇作用效果特异性取决于其结构特异性。此外， 白桦酯醇特异性的抑制SREBP转录因子剪切成熟，抑制细胞胆固醇合成降低细胞胆固醇水平，在一定浓度条件下使细胞因为缺少胆固醇而死亡，向细胞补充胆固醇后可以使细胞存活。因此，其17位上的羟基是其活性所必须的，-CHO，-COOH，或者-CH₃都不再具有抑制SREBP剪切的活性，另外两种结构类似物原人参二醇，原人参三醇也不具有上述活性。 

在没有外源胆固醇供给的情况下，细胞内源性的胆固醇合成是细胞生长所必须的。将CHO-7细胞培养在含有去脂蛋白血清的培养基中，该培养条件下细胞不能获得外源胆固醇，其生长所需的胆固醇来源于内源合成途径。此时给予细胞不同浓度梯度的白桦酯醇处理一段时间后，随着化合物处理浓度的升高，细胞死亡(图3C，上排)。如果在给予白桦酯醇的同时向培养基中补加一定量的外源胆固醇则能够使细胞在较高的白桦酯醇浓度下存活(图3C，下排)，说明白桦酯醇处理后细胞死亡的原因是胆固醇缺失引起，白桦酯醇抑制了细胞内源性胆固醇的合成。经验证白桦酯醇的结构类似物不具有上述特性。所以，白桦酯醇17位的基团甲醇基是其抑制SERBP剪切，抑制细胞胆固醇合成等活性所必须的。 

实施例2、白桦酯醇下调SERBP靶基因表达并降低细胞脂质合成 

由于SREBP-2是其本身的靶基因(Sato，R.等(1996).Sterol-dependent transcriptional regulation of sterol regulatory element-binding protein-2.J.Biol.Chem.271，26461-26464)，所以SERBP-2的表达在白桦酯醇处理后下调大约40％。与此同时，本发明人检测到其他参与胆固醇合成途径的数十种SREBP-2靶基因如HMGCR，HMG-CoA合成酶(HMGCS)，和Squalene Epoxidase(SE)等的表达在白桦酯醇处理后均显著下调(图4A)。同时，参与细胞脂肪酸合成途径的基因和酶类如SREBP-1c，脂肪酸合成酶(FAS)，和乙酰辅酶A羧化酶α(ACC)等表达水平均被白桦酯醇显著下调(图4B)。此外，与之前观察到的结果一致的是：LXR的靶基因如ABCG5和ABCG8的表达不受白桦酯醇的影响(图4C)。与基因表达变化结果一致的是采用同位素示踪实验检测白桦酯醇处理后细胞胆固醇和脂肪酸的从头合成过程(图4D-E)以及脂质染色试验方法分析细胞胆固醇和中性脂质(主要是胆固醇酯和甘油三酯)(图4F-I)的量的变化。结果显示与对照组相比，白桦酯醇处理后细胞胆固醇和脂肪酸的从头合成过程被显著抑制，细胞脂质水平有明显的降低。总而言之，该结果证实白桦酯醇能够抑制 SERBP途径，下调胆固醇和脂肪酸生物合成，降低细胞脂质水平。 

实施例3、白桦酯醇逆转饮食诱导肥胖小鼠的体重增加，改善小鼠血液、肝脏及脂肪组织的脂质组成 

接下来本发明人检测了白桦酯醇在动物体内的作用效果。已知洛伐他汀是HMGCR的特异性抑制剂，其对代谢性疾病的疗效已经被人们广泛接受。本发明人比较了白桦酯醇和洛伐他汀的生物学效果。8周龄C57BL/6J小鼠被随机分成4组，其中第1组小鼠喂养基础饲料(Chow)，第2-4组喂养高脂肪高胆固醇饲料(WD)，给料同时第1组2组小鼠灌胃生理盐水，第3组4组小鼠灌胃洛伐他汀(30mg/kg/天)和白桦酯醇(30mg/kg/天)。6周后，统计分析小鼠的摄食量变化，体重增加，及各个脏器的比重变化。结果显示与灌胃生理盐水的对照组相比，在食物摄取量没有明显变化(图5A)的情况下，洛伐他汀或者白桦酯醇均能显著降低小鼠的体重(约降低11％)及体重增加值(约降低40％)，见表2。所有试验数据均为平均值±标准差*，p＜0.05；**，p＜0.01为与喂养高脂肪高胆固醇组小鼠的数据比较所得(EXCEL，student test)。 

表2、白桦酯醇对小鼠摄食量，体重，器官重的影响 

核磁共振分光光度计分析小鼠的脂肪组织与肌肉组织的比值变化，及脂肪组织与体重的比值变化，结果显示：与对照组相比，这两个比值在白桦酯醇处 理后均下调了35-40％(图5C-D)。 

此外，血清总胆固醇和总甘油三酯的水平在洛伐他汀和白桦酯醇处理后均显著低于对照组(图5E-F)。而且显而易见地，白桦酯醇有效降低LDL胆固醇含量同时升高HDL胆固醇含量，这一效果与洛伐他汀相类似(图5G-H)。在肝脏当中，白桦酯醇和洛伐他汀均能够下调总胆固醇水平，但有趣的是，只有白桦酯醇能够下调总甘油三酯水平，下调约36％(图5I-J)，这显示了白桦酯醇相比他汀所具有的优势效果。 

组织病理学分析结果显示：白桦酯醇能够有效减小白色脂肪组织和褐色脂肪组织中脂肪细胞的大小，而洛伐他汀仅能够减小褐色脂肪组织中脂肪细胞的大小(图5K)。油红O对组织切片染色结果表明白桦酯醇及洛伐他汀处理组小鼠的肝脏细胞中性脂质的含量显著少于对照组(图5K)。这一结果与前面洛伐他汀和白桦酯醇降低肝脏脂质含量的结果一致(图5I-J)。 

实施例4、白桦酯醇显著提高饮食诱导肥胖小鼠的胰岛素敏感性 

已知脂肪酸和甘油三酯代谢异常是诱发胰岛素抵抗和II型糖尿病的重要原因。由于白桦酯醇能够有效降低血液和组织中包括脂肪酸和甘油三酯的脂质水平，本发明人检测了白桦酯醇对小鼠胰岛素敏感性的作用效果。与喂养基础饲料的小鼠相比，高胆固醇高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠表现出葡萄糖耐量和胰岛素耐受。白桦酯醇或者洛伐他汀处理后，可以观察到小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素耐受得到明显改善(图6A-D)。进一步，在饮食诱导的肥胖小鼠中，禁食引起的血液葡萄糖和胰岛素水平的升高在白桦酯醇处理组被显著降低，洛伐他汀则没有该效果(图6E-F)。综合来讲，上述数据说明白桦酯醇明显改善饮食诱导肥胖鼠的胰岛素耐受情况。 

实施例5、在动物体内，白桦酯醇有效调控脂质代谢基因的表达变化 

白桦酯醇对饮食诱导肥胖鼠肝脏和脂肪组织中基因表达调控特征可反映出该化合物的有益效果。白桦酯醇处理后小鼠肝脏中SREBP-2mRNA水平下调约30％(图7A)。因此，该处理组小鼠肝脏中，由SREBP-2调控的参与细胞胆固醇合成途径的一系列基因和酶类如HMGCS，HMGCR和三十碳六烯合成酶(squalene synthase，SS)等均被下调约31-65％(图7A)。同时白桦酯醇显著下调脂肪酸代谢相关基因如SREBP-1c被下调约32％，其靶基因脂肪酸合成酶 FAS被下调约39％，SCD-1被下调约20％。同时Malic酶和PPARo分别被上调约31％，59％(图7B)。提示白桦酯醇通过降低细胞脂肪酸合成，及促进脂肪水解反应起到降低脂质水平的作用(Duval，C.等(2007).PPARalpha anddyslipidemia.Biochim.Biophys.Acta 1771，961-971)。肝酯酶(HL)和载脂蛋白ApoE的mRNA水平在白桦酯醇处理后被上调(图7C)，进一步促进了白桦酯醇降血脂效果(Brown，R.J.等(2007).Lipases as modulators of atherosclerosis inmurine models.Curr.Drug Targets.8，1307-1319.；Van Dijk，K.W.等(1999).Dissection of the complex role of apolipoprotein E in lipoprotein metabolism and atherosclerosis using mouse models.Curr.Atheroscler.Rep.1，101-107)。此外，对于糖代谢相关的基因，白桦酯醇显著增加了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的mRNA水平，不影响PEPCK，IRS-1，IRS-2，或葡萄糖激酶(Glucokinase)等的表达变化(图7D)。 

褐色脂肪组织在机体能量代谢中具有重要作用，白桦酯醇能够显著促进褐色脂肪组织中Adiponectin，LPL及PPAR-γ等基因的表达(图7E)，而已知这些基因参与一系列重要生物学过程，他们的上调具有抗糖尿病和抗炎症的效果(Havel，P.J.(2002).Control of energy homeostasis and insulin action by adipocytehormones：leptin，acylation stimulating protein，and adiponectin.Curr.Opin.Lipidol.13，51-59；Tontonoz，P.等(2008).Fat and beyond：the diverse biology ofPPARgamma.Annu.Rev.Biochem.77，289-312)。总之，白桦酯醇调控小鼠肝脏和脂肪组织中一系列SREBP靶基因的表达，从而起到降低机体脂质水平，提高胰岛素敏感性的作用效果。 

实施例6、白桦酯醇有效减少动脉粥样硬化斑块形成并增加斑块的稳定性 

采用LDLR基因敲除小鼠(Ishibashi，S.等(1993).Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.J.Clin.Invest 92，883-893)作为研究对象检测白桦酯醇对动脉粥样硬化斑块形成的作用效果。结果显示白桦酯醇处理后，大动脉处斑块的数量和大小显著低于对照组(图8A-D)。需要指出的是，与对照组相比，主动脉弓和胸动脉处的斑块面积在白桦酯醇处理后分别显著减小约43％和77％(图8C-D)。在另一组实验中，取小鼠主动脉弓动脉窦的横向切片做脂质染色实验并进行定量，结果显示：与对照组相比，白桦酯醇处理能显著减少斑块的面积(图8F-G)。 

此外，本发明人通过免疫组化的实验方法检测斑块处巨噬细胞的标志分子MOMA-2和平滑肌细胞的标志分子SMC-actin的分布和面积，结果显示：与对照组相比，白桦酯醇处理后巨噬细胞斑块的累积显著减少约55％(图8F，H)，平滑肌细胞的量显著增加约21％(图8F，I)。表明LDLR基因敲除小鼠在高胆固醇高脂肪饲养条件下，白桦酯醇能够显著抑制动脉粥样硬化斑块的形成，并有效增加斑块的稳定性。 

实施例7、白桦酯醇特异性结合SCAP 

本发明人推测白桦酯醇的直接靶蛋白是SCAP蛋白，为验证这一假说，本发明人基于白桦酯醇的结构特征，合成其小分子探针并命名为化合物1(图9A)。 

化合物1(光亲和探针，获自华东师范大学)以白桦酯醇为主结构，在其侧链连接光激活基团和叠氮基团，当包含靶蛋白SCAP的膜蛋白(来源于CHO-7细胞膜的蛋白混合物)被探针分子标记之后，可收集蛋白样品，通过Click Chemistry连接叠氮修饰的报告基团，进行靶点检测、富集和鉴定。首先本发明人检测到化合物1具有类似于白桦酯醇的生物学活性(图9B)。该化合物与细胞膜蛋白孵育后经UV照射使化合物1与其靶蛋白共价结合。然后进行后续的click环加成反应，最后通过生物素-亲和素反应使靶蛋白充分富集。 

实验结果显示：在1和3μM化合物1存在的情况下SCAP与之特异性结合，这一结合作用在高浓度白桦酯醇存在的情况下受到显著抑制(图9C)作为阴性对照转铁蛋白受体(Transferrin Receptor)与探针分子结合很弱，且不被白桦酯醇竞争性抑制。上述结果证实了白桦酯醇特异性结合SCAP蛋白。 

实施例8、白桦酯醇显著降低小鼠血液脂质水平是SCAP蛋白依赖性的 

为深入探讨白桦酯醇在个体水平的作用效果是否通过调控SCAP-SREBP途径，本发明人利用腺病毒介导的RNA干扰实验使小鼠肝脏SCAP沉默表达后，检测肝脏基因表达变化及小鼠血液脂质水平的变化。腺病毒介导SCAP shRNA在小鼠肝脏表达后，肝脏SCAP基因表达水平下调大于50％(图10A)，表明基因沉默效果佳。同时，与前期结果一致的是shRNA对照组中，白桦酯醇处理前后SREBP-2、HMGCS和SS等脂质合成途径基因表达有明显下调；SCAP shRNA处理组由于SREBP无法正常入核，这些基因表达水平组成型下调，白桦酯醇处理后没有看到进一步下调效果(图10A)。小鼠血液TC、TG、LDL-c和HDL-c检测 结果显示：shRNA对照组(Ad-shControl)白桦酯醇处理前后血液脂质水平变化与前期结果一致，而SCAP shRNA处理组(Ad-shSCAP)白桦酯醇处理后没有明显效果(图10B-E)。 

该结果提示白桦酯醇在动物体内是通过抑制SCAP-SREBP途径起到降低脂质水平的作用效果。 

讨论 

SREBP蛋白是调控胆固醇脂肪酸及其他脂质生物合成的关键转录因子。本发明人构建了一个细胞生物学的分析方法，利用该方法高通量筛选特异性调控SREBP途径的小分子，并鉴定出白桦酯醇是SREBP途径的特异性抑制剂。白桦酯醇通过促进SCAP与Insig的相互作用将SREBP滞留在内质网，从而抑制SREBP剪切入核，下调胆固醇和脂肪酸合成途径的基因及酶类的表达，抑制细胞脂质合成途径，降低细胞脂质水平。在饮食诱导的肥胖的小鼠中，白桦酯醇可降低动物机体总胆固醇和总甘油三酯水平，提高胰岛素敏感性。更进一步地，白桦酯醇在动脉粥样硬化模型小鼠LDLR基因敲除小鼠中能够有效抗动脉粥样硬化的形成。作为SREBP抑制剂，在机体水平，白桦酯醇具有多方面的良好疗效，这证明SREBP途径可作为潜在的针对代谢性疾病的药物靶点。尤其针对于二型糖尿病和动脉粥样硬化症等。 

在过去的几十年中，Brown-Goldstein实验室的工作已经揭示了SREBP途径的调控特征(Goldstein，J.L.等(2006).Protein sensors for membrane sterols.Cell124，35-46；Brown，M.S.and Goldstein，J.L.(2009).Cholesterol feedback：from Schoenheimer’s bottle to Scap’s MELADL.J.Lipid Res.50 Suppl，S15-S27)。他们的工作揭示出：核内活性形式的SREBP在启动下游靶基因表达后会快速通过SCF^Fbw7介导的泛素化途径进行降解(Sundqvist，A.等(2005).Control of lipid metabolism by phosphorylation-dependent degradation of the SREBP family of transcription factors by SCF(Fbw7).Cell Metab 1，379-391)。这一调控过程的复杂性味着存在多种不同的策略可以使SREBP失去或者降低活性。例如，促进SCAP与Insig的相互作用，抑制S1P或者S2P蛋白酶活性，促进核内活性形式的SREBP降解等。在本发明中，通过建立细胞水平的报告基因分析方法，可以用它来筛选激活或者抑制SREBP途径的小分子，这些小分子的作用靶点可以作用在上述调控过程中的任何一个步骤。对白桦酯醇的筛选和鉴定的结果证实了 本发明人构建的这一***的有效性。比较有趣的一点在于，白桦酯醇的作用机制是促进SCAP与Insig的相互作用，这也正是细胞内源性的调控因子如胆固醇或者25-羟胆固醇等的调控机制。 

25-羟胆固醇是多种已知的SREBP抑制剂中效力最佳的一种，其效力是胆固醇的100倍以上，而本发明人这里鉴定得到的白桦酯醇其效力与25-羟胆固醇相当。并且，白桦酯醇不激活LXR信号通路，不促进HMGCR降解。其高效力和高特异性的特点使其具有显著降低胆固醇和脂肪酸，显著改善机体的脂质代谢情况，有效抗动脉粥样硬化和二型糖尿病。 

虽然胆固醇和25-羟胆固醇都能够促进SCAP与Insig的相互作用，但是两者的作用机制是不同的。胆固醇可以直接结合在SCAP蛋白的甾醇感受域(SSD)，25-羟胆固醇结合Insig蛋白。而白桦酯醇的直接靶点没有鉴定清楚，考虑到白桦酯醇的结构类似于甾醇，而且它不促进HMGCR降解，所以白桦酯醇可能像胆固醇一样，在生理条件下结合SCAP。 

他汀是目前被广泛应用于治疗高胆固醇症的一线药物。作为HMGCR的抑制剂，他汀有效抑制胆固醇合成，同时，肝脏中胆固醇合成受到抑制以后会上调SREBP的表达，上调LDLR的表达促进LDL的吸收。通过这两种机制，他汀有效的降低血清中胆固醇的水平。然而，他汀活化SREBP表达后将使肝脏胆固醇和脂肪酸合成途径的基因和酶类的表达，导致不良的效果(Kita，T.等(1980).Feedback regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase in livers of mice treated with mevinolin，a competitive inhibitor of the reductase.J.Clin.Invest 66，1094-1100；Singer，I.I.等(1984).Hydroxymethylglutaryl-coenzymeA reductase-containing hepatocytes are distributed periportally in normal and mevinolin-treated rat livers.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 81，5556-5560)。与此不同的是，白桦酯醇直接抑制SREBP途径，下调胆固醇和其他脂质的生物合成。小鼠在等剂量的洛伐他汀和白桦酯醇的给药条件下，白桦酯醇表现出与他汀相当甚至更佳的作用效果。例如，白桦酯醇降低小鼠血液，肝脏，褐色脂肪组织，白色脂肪组织中的脂质水平的效果佳于洛伐他汀。而且白桦酯醇在改善胰岛素抵抗方面表现出比洛伐他汀更好的效果。原因在于白桦酯醇在抑制胆固醇合成的同时还有效抑制脂肪酸甘油三酯的合成。 

综上所述，本发明人鉴定出白桦酯醇是SREBP途径的特异性抑制剂，可以显著降低脂质水平，提高胰岛素的敏感性，抗动脉粥样硬化的形成。以上实 验数据支持一种观点：抑制SREBP途径是一种有益的针对二型糖尿病和动脉粥样硬化症的策略。白桦酯醇可作为一种潜在的治疗或者控制代谢性疾病的药物组成。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.一种具有如式I所示的母核结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗代谢性疾病的组合物中的用途：

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物具有如式II所示的结构。

其中，R独立地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、C1-C4烷氧基、卤素。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的化合物具有式III所示的结构：

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的代谢性疾病包括：II型糖尿病、高脂血症、高胆固醇症、脂肪肝、胰岛素抵抗、肥胖症、动脉粥样硬化症、冠心病、中风、心肌梗塞等。 

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述高脂血症是包括但不仅限于动脉粥样硬化症或II型糖尿病。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于：

抑制甾醇反应元件结合蛋白途径；或

促进SREBP切割激活蛋白和Insig蛋白的相互作用；或

结合SREBP切割激活蛋白。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于：

下调甾醇反应元件结合蛋白-1，甾醇反应元件结合蛋白-2，β-羟[基]-β-甲[基]戊二酸单酰辅酶A还原酶，β-羟[基]-β-甲[基]戊二酸单酰辅酶A合成酶，鲨烯环氧酶，SC4MOL，24-脱氢胆固醇还原酶，FPPS，7-脱氢胆固醇还原酶，甲羟戊酸激酶，羊毛固醇合成酶，FDFT1，低密度脂蛋白受体，胰岛素诱导基因，鲨烯合成酶，脂肪酸合成酶，ATP-柠檬酸裂解酶，硬脂酰辅酶A去饱和酶-1，硬脂酰辅酶A去饱和酶-2，甘油-3-磷酸转酰酶，乙酰辅酶A羧化酶α，脂肪酸去饱和酶-1或脂肪酸去饱和酶-2的表达。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于：

下调胆固醇、甘油三酯或脂肪酸生物合成；

降低细胞脂质水平；

降低血液和肝脏的总胆固醇和总甘油三酯水平；

降低血液低密度脂蛋白胆固醇含量，升高血液高密度脂蛋白胆固醇含量；

减小白色脂肪组织和褐色脂肪组织中脂肪细胞的大小；

改善胰岛素抵抗，减低血糖，或提高胰岛素敏感性；

减少动脉粥样硬化斑块面积；或

增加动脉粥样硬化斑块稳定性。

9.一种制备药物的方法，所述的药物用于预防或治疗代谢性疾病，其特征在于，所述方法包括：将有效量的具有如式I所示的母核结构的化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体混合： 

10.一种体外降低细胞胆固醇和脂肪酸生物合成的方法，其特征在于，对细胞施用具有如式I所示的母核结构的化合物或其药学上可接受的盐：

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