CN102230920A - 一种超高液相色谱-串联质谱对动物源性食品中多粘菌素e残留量的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种超高液相色谱-串联质谱对动物源性食品中多粘菌素E残留量的测定方法。即待测试样中加入提取液,充分涡动提取,高速冷冻离心,然后过滤净化获得试样液;称取多粘菌素E标准品,用甲醇溶解后作为储备液,然后进一步用甲醇稀释为具有浓度梯度的标准使用液;利用超高效液相色谱-串联四级杆液质联用仪对试样处理液进行检测;于标准曲线上读出多粘菌素E的浓度值,然后计算出试样中多粘菌素E的结果。采用本发明的方法检测动物源性食品中多粘菌素E的残留量,快速有效,相对平均偏差小于10%。由此可见,本发明的方法,对于动物源性食品中多粘菌素E残留量的检测,提供了一种可靠的便于实施的方法,能够满足研究和生产中的需要。

Description

一种超高液相色谱-串联质谱对动物源性食品中多粘菌素E残留量的测定方法
多粘菌素E残留量的测定方法 
技术领域
本发明涉及动物源性食品中多粘菌素E残留量的测定方法,特别是涉及一种通过超高效液相色谱-串联质谱仪对动物源性食品中多粘菌素E的残留量进行检测的方法。 
背景技术
多粘菌素属于多肽类抗生素,主要有A、B、C、D、E五种成分。兽医临床应用的主要是多粘菌素B、多粘菌素E,其中以多粘菌素B,抗菌活性最强,但其毒性较大。而多粘菌素E即粘杆菌素,具有较低的毒性及良好的抗菌活力。多粘菌素E是Koyama等从福岛县土壤中分离到一株多粘芽孢杆菌抗敌素变株培养液中产生的碱性多肽类抗生素。多粘菌素E又名粘菌素、克利斯汀、粘杆菌素、抗敌素等,它是一种至少含有30多种不同成分的混和物,主要为多粘菌素E1和多粘菌素E2的混合物,粘杆菌素A和粘杆菌素B的分子式分别为C53H100N16O13和C52H98N16O13。近年来,一些国家出现假芽孢杆菌和不动杆菌的多重耐药性,多粘菌素治疗此类细菌具有较好效果。但要尽量降低其毒副作用,充分利用其促生长和预防、治疗作用;避免随意加大剂量或延长用药时间而引起不必要的毒副作用;肌肉注射粘杆菌素后要有休药期;严禁在畜禽产蛋期和产奶期使用粘杆菌素。因此建立一种快速、准确、方便和经济的检测方法,有利于监控动物源性食品中粘杆菌素的残留量。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,通过摸索提取液最佳配比,最 佳的提取时间,最佳的净化条件和最佳色谱质谱条件而提供动物源性食品中多粘菌素E的残留量测定方法。 
为实现上述目的,本发明采取以下设计方案: 
本发明的动物源性食品中多粘菌素E残留量的测定方法包括如下步骤: 
称取已粉的试样5.0g(精确至0.0001g)于50mL具塞离心管中,加入提取液25mL,均质2min后,4℃下10000r/min离心10min。转移上清液至另一离心管中,残渣中加入20mL提取液重复以上提取操作。合并2次提取上清液后,加入正己烷20mL涡旋2min,10000r/min离心10min,弃去上层液。下层液中再加入正己烷20mL重复以上脱脂操作,所得下层液待净化。 
将上述所得试样提取液转移至Oasis HLB净化柱(用甲醇和水各6mL预洗活化),先用10mL水洗涤,弃去流出液。再用3mL甲醇洗脱,收集洗脱液,于40℃水浴上氮气流下将有机相吹干。试样用甲醇溶解并定容到1.00mL后,混匀,经0.22μm滤膜过滤,得到试样处理液。 
称取多粘菌素E标准品,用甲醇溶解后作为储备液,然后进一步用甲醇稀释为具有浓度梯度的标准使用液; 
利用超高效液相色谱-串联质谱仪对标准液和试样处理液进行检测; 
计算结果,试样中多粘菌素E的计算公式为: 
X = C × V m × 1000 1000
式中: 
X-试样中多粘菌素E的残留量,单位为微克每千克(ug/kg); 
C-试样处理液中多粘菌素E的浓度(ng/mL); 
V-试样提取液的最终定容体积,单位为毫升(ml); 
m-试样的称样量,单位为克(g); 
优选地,所述提取溶剂为甲醇和甲酸水溶液,比例为10∶4。 
优选地,均质提取时间为2min。 
优选地,4℃的条件下10000r/min高速冷冻离心10.0min。 
所述利用超高效液相色谱-串联质谱仪对试样处理液进行检测的条件为: 
液相色谱条件 
分析柱:Acquity BEH-C18,2.1mm×50mm,1.7μm 
流动相:乙腈+0.1%甲酸水溶液=20+80 
流速:0.2mL/min。 
进样量:10μL。 
质谱条件 
离子源:电喷雾离子源; 
扫描方式:正离子扫描; 
检测方式:多反应监测; 
电喷雾电压:3.0kv; 
离子源温度:110℃; 
去溶剂温度:400℃; 
离子对、锥孔电压、碰撞能量见表1。 
表1多粘菌素E的离子对、锥孔电压、碰撞能量 
Figure BSA00000459258600031
并根据保留时间定性,外标峰面积法定量。 
本发明的优点是:采用本发明的方法检测动物源性食品中多粘菌素E残留量的测定方法,快速有效,RSD小于10%,检出限为25ug/kg。由此可见,本发明的方法,为检测动物源性食品中多粘菌素E的残留量,提供了一种可靠的便于实施的方法,能够满足研究和生产中的需 要。 
具体实施方式
实施例1,鸡肉中多粘菌素E残留量的精密度和回收率检测: 
称取已粉碎的试样5.0012g(精确至0.0001g)于50mL具塞离心管中,加入提取液25mL,均质2min后,4℃下离心10min。转移上清液至另一离心管中,残渣中加入20mL提取液重复以上提取操作。合并2次提取上清液后,加入正己烷20mL涡旋2min,离心10min,弃去上层液。下层液中再加入正己烷20mL重复以上脱脂操作,所得下层液待净化。 
将上述所得试样提取液转移至Oasis HLB净化柱(用甲醇和水各6mL预洗活化),先用10mL水洗涤,弃去流出液。再用3mL甲醇洗脱,收集洗脱液,于40℃水浴上氮气流下将有机相吹干。试样用甲醇溶解并定容到1.00mL后,混匀,经0.22μm滤膜过滤,供UPLC-MS/MS测定。 
称取多粘菌素E标准品(纯度97.5%)10.00mg,用甲醇溶解并定容至10.00mL,浓度为1.00mg/mL的储备液,然后进一步用甲醇稀释100倍作为标准使用液,再稀释为0.1、0.2、0.5ug/mL的标准使用液。 
检测仪器为现有的waters超高效液相色谱-串联质谱仪: 
液相色谱条件 
分析柱:Acquity BEH-C18,2.1mm×50mm,1.7μm 
流动相:乙腈+0.1%甲酸水溶液=20+80 
流速:0.2mL/min。 
进样量:10μL。 
质谱条件 
离子源:电喷雾离子源; 
扫描方式:正离子扫描; 
检测方式:多反应监测; 
电喷雾电压:3.0kv; 
离子源温度:110℃; 
去溶剂温度:400℃; 
离子对、锥孔电压、碰撞能量见表1。 
表1多粘菌素E的离子对、锥孔电压、碰撞能量 
Figure BSA00000459258600051
根据保留时间定性,外标峰面积法定量。 
计算结果,试样中多粘菌素E的计算公式为: 
X = C × V m × 1000 1000
式中: 
X-试样中多粘菌素E的残留量,单位为微克每千克(ug/kg); 
C-试样处理液中多粘菌素E的浓度(ng/mL); 
V-试样提取液的最终定容体积,单位为毫升(ml); 
m-试样的称样量,单位为克(g); 
试样中多粘菌素E的含量按公式(1)进行计算,结果如下: 
Figure BSA00000459258600053
实施例2,猪肝中多粘菌素E精密度和回收率的检测: 
称取已粉碎的试样5.0210g(精确至0.0001g)于50mL具塞 离心管中,加入提取液25mL,均质2min后,4℃下离心10min。转移上清液至另一离心管中,残渣中加入20mL提取液重复以上提取操作。合并2次提取上清液后,加入正己烷20mL涡旋2min,离心10min,弃去上层液。下层液中再加入正己烷20mL重复以上脱脂操作,所得下层液留待净化。 
将上述所得试样提取液转移至Oasis HLB净化柱(用甲醇和水各6mL预洗活化),先用10mL水洗涤,弃去流出液。再用3mL甲醇洗脱,收集洗脱液,于40℃水浴上氮气流下将有机相吹干。试样用甲醇溶解并定容到1.00mL后,混匀,经0.22μm滤膜过滤,供UPLC-MS/MS测定。 
称取多粘菌素E标准品(纯度97.5%)10.00mg,用甲醇溶解并定容至10.00mL,浓度为1.00mg/mL的储备液,然后进一步用甲醇稀释100倍作为标准使用液,再稀释为0.1、0.2、0.5ug/mL的标准使用液。 
检测仪器为现有的waters超高效液相色谱-串联质谱仪: 
液相色谱条件 
分析柱:Acquity BEH-C18,2.1mm×50mm,1.7μm 
流动相:乙腈+0.1%甲酸水溶液=20+80 
流速:0.2mL/min。 
进样量:10μL。 
质谱条件 
离子源:电喷雾离子源; 
扫描方式:正离子扫描; 
检测方式:多反应监测; 
电喷雾电压:3.0kv; 
离子源温度:110℃; 
去溶剂温度:400℃; 
离子对、锥孔电压、碰撞能量见表1。 
表1粘杆菌素的离子对、锥孔电压、碰撞能量 
Figure BSA00000459258600071
根据其质谱峰定性,外标法定量。 
计算结果,试样中多粘菌素E的计算公式为: 
X = C × V m × 1000 1000
式中: 
X-试样中多粘菌素E的残留量,单位为微克每千克(ug/kg); 
C-试样处理液中多粘菌素E的浓度(ng/mL); 
V-试样提取液的最终定容体积,单位为毫升(ml); 
m-试样的称样量,单位为克(g); 
试样中多粘菌素E的残留量按公式(1)进行计算,结果如下: 
Figure BSA00000459258600073
显而易见,本领域的普通技术人员,可以用发明的一种通过超高效液相色谱-串联质谱仪对动物源性食品中多粘菌素E残留量进行测定。 
上述实施例仅供说明本发明之用,而并非是对本发明的限制,有关技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明范围的情况下,还可以作出各种变化和变型,因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴,本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。 

Claims (7)

1.一种超高液相色谱-串联质谱对动物源性食品中多粘菌素E残留量的测定方法,其特征在于:所述测定方法包括如下步骤:
称取已粉碎的试样5.0g(精确至0.0001g)于50mL具塞离心管中,加入提取液25mL,均质2min后,4℃下10000r/min离心10min。转移上清液至另一离心管中,残渣中加入20mL提取液重复以上提取操作。合并2次提取上清液后,加入正己烷20mL涡旋2min,10000r/min离心10min,弃去上层液。下层液中再加入正己烷20mL重复以上脱脂操作,所得下层液待净化。
将上述所得试样提取液转移至Oasis HLB净化柱(用甲醇和水各6mL预洗活化),先用10mL水洗涤,弃去流出液。再用3mL甲醇洗脱,收集洗脱液,于40℃水浴上氮气流下将有机相吹干。试样用甲醇溶解并定容到1.00mL后,混匀,经0.22μm滤膜过滤,得到试样处理液。
称取多粘菌素E标准品,用甲醇溶解后作为储备液,然后进一步用甲醇稀释为具有浓度梯度的标准使用液;
利用超高效液相色谱-串联四级杆液质联用仪对标准液和试样处理液进行检测;
计算结果,试样中多粘菌素E的计算公式为:
X = C × V m × 1000 1000
式中:
X-试样中多粘菌素E的残留量,单位为微克每千克(ug/kg);
C-试样处理液中多粘菌素E的浓度(ng/mL);
V-试样提取液的最终定容体积,单位为毫升(m1);
m-试样的称样量,单位为克(g);
2.根据权利要求1所述的一种超高液相色谱-串联质谱对动物源性食品中多粘菌素E残留量的测定方法,其特征在于:所述甲醇和甲酸水溶液(6+4)提取,理想的提取液配比,很好的控制了杂质的干扰,并保证了回收率。
3.根据权利要求1所述的一种超高液相色谱-串联质谱对动物源性食品中多粘菌素E残留量的测定方法,其特征在于:均质提取时间为2min,此条件下具有最好的混合提取效率。
4.根据权利要求1所述的一种超高液相色谱-串联质谱对动物源性食品中多粘菌素E残留量的测定方法,其特征在于:4℃下离心10min,具有很好的分离效果。
5.根据权利要求1所述的一种超高液相色谱-串联质谱对动物源性食品中多粘菌素E残留量的测定方法,其特征在于:采用HLB固相萃取柱净化,具有很好的净化效果。
6.根据权利要求1所述的一种超高液相色谱-串联质谱对动物源性食品中多粘菌素E残留量的测定方法,其特征在于:所述利用超高效液相色谱-串联质谱仪对试样处理液进行检测的条件为:
液相色谱条件
分析柱:Acquity BEH-C18,2.1mm×50mm,1.7μm
流动相:乙腈+0.1%甲酸水溶液=20+80
流速:0.2mL/min
进样量:10μL
质谱条件
离子源:电喷雾离子源;
扫描方式:正离子扫描;
检测方式:多反应监测;
电喷雾电压:3.0kv;
离子源温度:110℃;
去溶剂温度:400℃;
离子对、锥孔电压、碰撞能量见表1。
表1粘杆菌素的离子对、锥孔电压、碰撞能量
Figure FSA00000459258500031
此条件下具有很好的分离效果
7.根据权利要求1所述的一种超高液相色谱-串联质谱对动物源性食品中多粘菌素E残留量的测定方法,其特征在于:利用较为先进、灵敏度高的超高效液相色谱-串联质谱仪对动物源性食品中多粘菌素E的残留量进行检测。
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