CN102228698A - Hpv58型治疗性复合基因疫苗及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HPV58型治疗性复合基因疫苗及其构建方法，该疫苗以HPV58型E6/E7融合基因为靶抗原，以GM/B7作为抗原佐剂；其中，HPV58型E6/E7融合基因去除了HPV58型E6和E7基因的终止码，同时将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第24、26和92位氨基酸都突变成甘氨酸。本发明提供的HPV58型治疗性复合基因疫苗安全性高、免疫作用强、抗肿瘤理想，为治疗与HPV58型感染相关的***及癌前病变提供了更好的选择，尤其适合HPV58型高感染的中国和亚洲***患者。

Description

HPV58型治疗性复合基因疫苗及其构建方法

技术领域

本发明涉及***防治领域，尤其是人***瘤病毒58型(以下简称HPV58型)治疗性复合基因疫苗及其构建方法。

背景技术

子***是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。我国每年有新发病例约13.15万，占世界***新发病例总数的28.8％，每年死于***的患者约5万人，大部分位于经济欠发达的西部地区如广西。目前，晚期***患者采用外科手术、放疗、化疗等传统模式疗效欠佳，5年生存率仅有50％。***的病因学研究表明：高危型HPV感染是***发生的首要因素且为始动因素。由于几乎所有***细胞中都有HPV DNA和病毒转化蛋白的表达，HPV病毒蛋白作为一种抗原可刺激机体产生针对HPV的免疫反应，这就促使人们希望通过疫苗免疫治疗的方法来治疗和预防***。HPV58型是1988年先后由中国和日本学者发现。我国最近完成的两项中国与亚洲妇女子宫颈中HPV型别分布的Meta研究结果显示：HPV58是在我国子***妇女中继HPV16和18之后的另一重要的HPV优势型别，是我国北方和南方乃至亚洲地区子***标本中均为第3位最常见的HPV型别。由于全球HPV16和18分布广泛而58型仅在亚洲各国比较常见，使西方国家对于HPV58型的研究极少。目前国外不论是已经上市或正在研究的HPV疫苗，都以16和18型为主，并没有包含58型。并且目前上市的仅有HPV预防性疫苗，对于已经罹患HPV感染甚至发展为***前病变或***的患者无效。由于HPV16、18与58基因的同源性仅有60％，一些HPV16型常用的抗原表位如HPV16E711-20、49-57在HPV58型并不存在，因此，HPV16、18型疫苗对HPV58型感染并没有交叉保护作用。目前关于HPV16和18型疫苗的研究已经很多，但对于HPV58型疫苗的研究仍然非常缺乏。面对我国***患者中HPV58高感染率的现状，HPV58型治疗性疫苗研制是非常必要和迫切的。

目前研究HPV疫苗主要有三个策略，第一种是预防HPV感染的预防性疫苗，主要通过产生中和抗体以抵抗病毒进入宿主上皮基底角化细胞内，目前最有希望的是包含有L1或L1/L2病毒壳蛋白的病毒样颗粒(VLPs)疫苗，这类疫苗主要用于年轻女性感染HPV之前，对已感染HPV或已有***前病变或***的女性无效。第二种是治疗性疫苗，主要通过刺激细胞介导的免疫反应以去除隐藏和表达病毒蛋白的细胞，这种疫苗应该能够阻止已经感染了病毒的角化细胞的增殖和促进已生长肿瘤的消退。因此，这类疫苗主要用于已经感染了HPV或已经罹患***前病变或宫颈的患者。由于HPV的早期基因E6和E7是维持其恶性表型所必需，从病毒开始感染到癌症的进展期，在肿瘤发展的所有阶段均有表达，能诱发机体产生并维持较强的以病毒抗原为靶分子的特异性CTL，因而，迄今仍是研制HPV治疗性疫苗所共同选择的靶抗原。第三策略是兼具预防和治疗作用的联合疫苗，这种疫苗的靶抗原既包含有L1或L1/L2病毒壳蛋白又包含HPV的早期基因E6和E7。因此，这种疫苗既能产生强的中和抗体，又能诱发特异性CTL反应，以产生预防和治疗的效果，防止病毒的感染和扩散，清除手术或治疗后残余的肿瘤细胞。

采用HPV58型衣壳蛋白L1或L1/L2为靶抗原研制的病毒样颗粒(VLPs)疫苗的报道有：①田厚文等于2002年构建的表达人***瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株；②李文生等于2007年预防性重组HPV58-减毒志贺氏杆菌载体活疫苗；③Zhang T等于2010年构建的HPV16/18/58三价VLPS疫苗。然而，此类疫苗存在如下问题：由于L1、L2衣壳蛋白在***及癌前病变组织中不表达，故上述疫苗只能用于预防HPV58型感染，但对已发生感染或病变的宫颈组织治疗无效。

采用HPV58早期蛋白E1或E2为靶抗原研制的疫苗的报道有：张晓丽等于2009年构建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2，但仅进行了体液免疫检测证明有抗E2特异性抗体产生，而没有进行细胞免疫相关实验的检测。此类疫苗存在如下问题：E1和E2蛋白虽然涉及病毒游离基因的复制和病毒早期基因的转录，可能是感染早期好的靶抗原，但由于E1和E2蛋白的表达水平非常低以至难以被免疫***所识别，而让病毒逃逸。而且，这两个基因通常在肿瘤生长的早期即病毒基因整合入宿主染色体时被敲出，因此，并不是理想的靶抗原。

采用HPV58早期蛋白E6或E7为靶抗原(目前HPV治疗型疫苗研制过程中最常用的两个靶抗原)研制的疫苗的报道有：(1)单独使用E6或E7基因作为靶抗原，罗利群等于2003年制备了含HPV58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果，发现经定点突变的HPV58E7基因转化活性显著降低，免疫小鼠后能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期，说明该疫苗有一定的抗肿瘤效果。然而，此类疫苗存在如下问题：由于仅利用了HPV58E7基因作为抗原而忽略了另一个重要基因E6的抗原性，并且没有协同相关的佐剂来打破免疫耐受，因此该疫苗的作用尚待提高。(2)未见使用E6和E7融合基因作为靶抗原。

暂无采用HPV58L1和L2联合E6和E7为靶抗原研制的嵌合疫苗的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种安全性高、免疫作用强、抗肿瘤理想的HPV58型治疗性复合基因疫苗及其构建方法，用于治疗与HPV58型感染相关的***及癌前病变。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：HPV58型治疗性复合基因疫苗，该疫苗以HPV58型E6/E7融合基因为靶抗原，以GM/B7作为抗原佐剂；HPV58型E6/E7融合基因去除了HPV58型E6和E7基因的终止码，同时将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第24、26和92位氨基酸都突变成甘氨酸。

靶抗原由HPV58型E6/E7融合基因片段***pCI-Fc-GPI载体中，构建过渡性真核质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI片段从pCI载体上切下来而得。

该疫苗采用的载体为pVAX1-IRES-GM/B7，它对靶抗原sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI和GM/B7可共表达。

该疫苗是PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称PVAX1-HPV58mE6E7FcGB)。

HPV58型治疗性复合基因疫苗的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

<1>制备靶抗原：先去除HPV58型E6和E7基因的终止码，将E6和E7基因融合成HPV58mE6E7融合基因，其中，将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第24、26和92位氨基酸都突变成甘氨酸；然后，把HPV58mE6E7融合基因片段***pCI-Fc-GPI载体中，构建过渡性真核质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将复合基因片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI从pCI载体上切下来；

<2>选择载体：选用GM-CSF和B7.1双亚基共表达的疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7；

<3>制备疫苗：将步骤<1>的复合基因片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI***步骤<2>的疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7的IRES上游，即得HPV58型治疗性复合基因疫苗PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7。

本发明将HPV58型E6和E7制成融合基因HPV58mE6E7，并通过6个定点突变消除了其转化活性而保留其抗原性，避免了潜在的致癌风险，最大程度地确保了以其作为靶抗原的HPV58型治疗性复合基因疫苗(PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7)的安全性。该疫苗用于治疗与HPV58型感染相关的***及癌前病变。由于采用了安全性更高的载体，并引入抗原佐剂GM/B7帮助打破免疫耐受发挥协同作用从而改善了疫苗的抗肿瘤功能。此外，该疫苗包含人Igκ链前导信号肽(sig)可有效促进基因的真核表达，而人IgG Fc段则增强了融合基因的抗原性且利于鉴定，引入GPI锚定蛋白达到增强免疫识别的作用，可在激发细胞免疫反应上占优。研究表明，本发明的治疗性复合基因疫苗安全性有效性较佳，可作为HPV58型阳性相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的候选疫苗。

附图说明

图1是PVAX1-HPV58mE6E7FcGB质粒双酶切鉴定图，图中M：DNA marker(DL5000)，1：PVAX1-HPV58mE6E7FcGB质粒，2：PVAX1-HPV58mE6E7FcGB质粒经NheI和PmeI双酶切鉴定结果，3：PVAX1-HPV58mE6E7FcGB质粒经NheI和PvuI双酶切鉴定结果。

图2是瞬时转染PVAX1-HPV58mE6E7FcGB的293T细胞免疫荧光检测图，图中A：FITC(物镜40×)，B：PE(物镜40×)，C：FITC+PE(物镜40×)。

图3是瞬时转染PVAX1-HPV58mE6E7FcGB的293T细胞流式细胞术检测图，图中A：PVAX1对照组(FITC+PE，红色荧光+绿色荧光)，B：PVAX1-HPV58mE6E7FcGB实验组(FITC+PE，红色荧光+绿色荧光)，R1：总细胞数，R2：显色绿色荧光(FITC)细胞占总细胞数的比例，R3：显示红色荧光(PE)细胞占总细胞数的比例，R4：显示双色(红、绿)荧光细胞占总细胞数的比例。

图4是融合蛋白突变前后氨基酸位点比较图，图中：序列1是突变前序列HPV58E6E7，序列2是突变后序列HPV58mE6E7。

图5是PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗的构建流程图。

图6是预防模型免疫示意图。

图7是治疗模型免疫示意图。

图8是CTL加样示意图。

具体实施方式

HPV58型疫苗的安全性及有效性研究

一、PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗构建(如图5)

免疫治疗的两大关键是合适的抗原及高效的载体。在抗原选择方面，由于HPV的早期基因E6和E7是维持其恶性表型所必需，从病毒开始感染到癌症的进展期，在肿瘤发展的所有阶段均有表达，能诱发机体产生并维持较强的以病毒抗原为靶分子的特异性CTL，因而，迄今仍是研制HPV治疗性疫苗所共同选择的靶抗原。发明人在设计抗原时，首先去除HPV58型E6和E7基因的终止码，将E6和E7基因融合成HPV58E6E7融合基因。由于HPV E6和E7为癌蛋白，病毒DNA有可能整合入宿主细胞基因组，诱发细胞的恶性转化，具有潜在的致癌风险，出于对DNA疫苗安全性的考虑，在利用E6和E7基因作为靶抗原之前，必须消除E6、E7基因的转化活性所导致的潜在致癌风险，以保证疫苗的安全性。对E6、E7基因的转化活性位点进行点突变是目前消除其转化活性的常用方法。据文献报道，E6第50位上的Leu(亮氨酸)在所有致癌HPV中高度保守，提示其可能在E6蛋白的转化功能中起重要作用；第63和106位上的Cys(半胱氨酸)则位于E6蛋白一对锌指结构的两侧，对其与抑癌基因P53的结合和降解有重要作用；E7除第24位上的Cys和26位上的Glu(谷氨酰胺)位于E7蛋白一对锌指结构的两侧外，还有第92位的Cys位于一个单独的锌指结构上，这些锌指结构都可与抑癌基因PRb基因使其降解失活。由于既往文献报道都是突变E6或E7基因中的1-2个点，因此，综合文献报道，本研究首创对HPV58E6E7基因融合基因进行6个定点突变以彻底消除其转化活性而保留其抗原性，最大程度确保疫苗的安全性。即将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第24、26和92位氨基酸，都突变成Gly(甘氨酸)，构建了HPV58mE6E7(突变后)融合基因(编码的融合蛋白突变前后氨基酸位点比较见图4)。通过对突变前HPV58E6E7(序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，1-447位为E6基因，448-741位为E7基因)和突变后HPV58mE6E7(序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列，点突变处148-150位tta->ggt、187-189位tgt->ggt、316-318位tgt->ggt、517-519位tgc->ggc、523-525位gag->ggg、721-723位tgc->ggc)融合基因转化活性实验的对比分析，证实了点突变后的HPV58mE6E7融合基因已消除了转化活性，可作为HPV58型新型治疗性疫苗研制的靶抗原。

随后，发明人将已证实消除转化活性的HPV58mE6E7融合基因片段***pCI-Fc-GPI载体中，构建了过渡性真核质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI片段从pCI载体上切下来，形成一段包含人Igκ链前导信号肽(sig)、HPV58mE6E7融合基因、人IgG-Fc段和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽的复合基因片段——sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI。发明人前导肽的设计选用Invitrogen公司的pSecTag2哺乳动物表达载体公布的信号肽序列，它是Igκ链V-J2-C区域的分泌信号序列，并在起始密码子ATG前加入了Kozak序列，对基因在真核细胞内获得有效表达起到了促进的作用。之后发明人将HPV58mE6E7抗原与人IgG Fc段进行融合表达。人IgG Fc段能与免疫效应细胞表面的Fcγ受体结合，起到了免疫黏附素的作用。由于DC和NK细胞表面带有Fcγ受体，IgG Fc段与DC和NK细胞结合后，就能加强免疫应答的抗原呈递功能，发挥其调节免疫效应、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用以及激活吞噬细胞的作用等，并可延长重组蛋白的半衰期，增强了HPV58mE6E7的抗原性。同时带有Fc段的嵌合蛋白，还可以将Fc段作为检测标签，对HPV58mE6E7-Fc融合蛋白的鉴定带来了很大的方便，特别是在没有HPV58mE6E7蛋白的商品化抗体的情况下优势更为明显。GPI锚定蛋白是一类通过其羧基末端的糖基化磷脂酰肌(glycosylphosphatidylinositol，GPI)结构锚定于真核细胞膜表面的蛋白。它的基本化学结构主要由胆胺甘露糖、葡萄糖胺和肌醇连接而成。肌醇最终通过磷酸基团与细胞膜中的磷脂结构相连，胆胺则与蛋白质的羧基端相连形成GPI锚定蛋白。它们与传统的跨膜型表面蛋白不同，没有跨膜区和胞内部分，不跨越细胞膜脂质双层，只通过其羧基末端的GPI结构锚定于细胞膜上。GPI锚定蛋白合成是在粗面内质网内进行的：在内质网的胞浆面，完整的GPI分子转入内质网腔内后与新生蛋白连接形成GPI锚定蛋白。蛋白通过GPI结构锚定于细胞膜表面而不跨越其磷脂膜双层结构。当它与细胞共同孵育时，可自动整合至细胞膜表面，并可保持其生物学活性。本研究利用GPI的目的，就是要将表达的HPV58mE6E7-Fc融合蛋白抗原锚定在细胞膜上，从而达到增强免疫识别的作用。而且目前的研究认为，以膜形式表达的抗原要比分泌形式表达的抗原，在激发细胞免疫反应的能力上有更大优势。

此外，疫苗构建面临的另一个重要问题就是载体。目前常用的负载靶抗原的载体主要为病毒载体和非病毒载体。在构建HPV疫苗常用的病毒载体中，痘苗病毒和腺病毒载体是常用的两种。二者虽然具有抗原性稳定，免疫原性持久，能够同时诱发体液和细胞免疫等优点，但这二者都存在安全性的隐忧。并且存在痘苗病毒在种痘后局部反应较大，重复免疫后容易产生针对痘苗病毒而不是靶抗原的免疫反应，在人接种后有百万分之一发生全身性发痘和种痘后脑炎等并发症倾向；腺病毒存在编码蛋白作为异种抗原易被机体清除，在全身用药时可能产生致命的过敏反应等缺点。因此，这些载体都存在一定局限性。非病毒载体中的PVAX1是Invitrogen公司出品的一种在载体pcDNA3.1的基础上改建而成的一种真核表达载体，它是由美国食品和药品管理委员会(FDA)推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒，具有自身体积小、表达容量大的优点。因此，发明人利用本室前期改造的抗原与细胞因子GM-CSF/共刺激分子B7-1(GM/B7)双亚基可共表达的新型疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7，将复合抗原片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI***载体PVAX1-IRES-GM/B7的IRES上游，成功构建新型复合基因疫苗PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称PVAX1-HPV58mE6E7Fc-GM/B7)并成功实现其真核表达。恶性肿瘤在体内能长期存在的一个重要原因就是免疫耐受。引入GM-CSF不仅可以刺激巨噬细胞生成，还可促进单核巨噬细胞MHC II类分子、粘附分子及其刺激分子的表达，具有激活树突细胞等专职抗原递呈细胞作用；B7-1也可增强抗原提呈效应，有效活化T淋巴细胞成为细胞毒性T细胞(CTL)，是目前最常用的共刺激分子。因此，GM/B7联合应用作为抗原佐剂可以在一定程度上打破免疫耐受，提高肿瘤细胞的免疫原性和对肿瘤相关抗原的免疫力，并且激活特异性和非特异性免疫细胞，活化局部的免疫微环境，直接杀伤肿瘤。通过IRES上游的复合抗原与下游的分子佐剂的共表达，使二者能够协同作用，在一定程度上免疫耐受、发挥比较理想的抗肿瘤作用，成为治疗与HPV58型感染相关的***及癌前病变的新型DNA疫苗。

二、PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗的鉴定

①酶切鉴定

PVAX1-HPV58mE6E7FcGM/B7疫苗质粒经分别经NheI/PmeI和NheI/PvuI双酶切(如图1)鉴定证实，目的片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI已连入真核表达载体PVAX1-IRES-GM/B7中，疫苗质粒PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7构建成功，简称为PVAX1-HPV58mE6E7FcGB。

②瞬时转染细胞的免疫荧光检测

在发明人构建的重组质粒中，HPV58mE6E7基因的羧基端融合了人IgG Fc段基因，可作为检测融合蛋白表达的标签。用FITC标记的山羊抗人IgG抗体与转染48h后的细胞进行孵育，用以检测IRES上游的***片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI在293T细胞中的表达情况。IRES下游的GM和B7.1融合蛋白经PE标记的兔抗人B7.1抗体染色可检测其表达情况。经荧光显微镜观测发现，PVAX1-HPV58mE6E7FcGB组细胞有荧光显示，主要分布于细胞膜上(图2)，且PVAX1-HPV58mE6E7FcGB组上下游分别有绿、红荧光显示，而未转染重组质粒的293T细胞为阴性，证明***片段HPV58mE6E7-Fc-GPI及GM/B7能够有效表达。

③瞬时转染细胞的流式细胞仪分析

瞬时转染48h后的293T细胞用FITC标记的山羊抗人IgG抗体孵育IRES上游的人IgGFc段基因，IRES下游的GM和B7.1融合蛋白经PF标记的兔抗人B7.1抗体染色后，经流式细胞仪检测结果如图3所示，约有14％的细胞表达(包括单独表达和共表达)IRES上游的sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI融合基因，约有17％的细胞表达(包括单独表达和共表达)IRES下游的GM/B7融合基因。

三、PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗的具体构建工艺(如图5)

1.重组质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI的构建及鉴定

1.1重组质粒pGEM-T easy/HPV58mE6E7和真核表达载体pCI-Fc-GPI双酶切及纯化

1.1.1酶切

将重组质粒pGEM-T easy/HPV58mE6E7和载体pCI-Fc-GPI分别用XhoI和EcoRI双酶切，酶切体系如下：

酶切条件：37℃水浴4h。

1.1.2酶切产物的纯化回收

酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，按照北京三博远志生物基因技术有限责任公司“胶回收试剂盒”说明书进行纯化回收。

1.2HPV58mE6E7和pCI-Fc-GPI的连接、转化及阳性克隆的鉴定

酶切、纯化后的HPV58mE6E7片段与载体pCI-Fc-GPI 16℃连接过夜，转化大肠杆菌E.coli DH5α。经氨苄青霉素筛选后，菌落PCR挑选阳性克隆；再经NheI和NotI双酶切鉴定，鉴定正确的菌株送北京英骏生物技术有限公司进行测序。

1.2.1HPV58mE6E7片段与pCI-Fc-GPI载体连接

连接体系如下：

连接条件：16℃，过夜。

1.2.2连接产物的转化、挑选阳性克隆

1.2.3重组质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI酶切鉴定

酶切体系：

酶切条件：37℃水浴4h。

2.疫苗PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称PVAX1-HPV58mE6E7FcGB)的构建及鉴定

2.1重组质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI的酶切、粘端补平及回收

2.1.1 NotI单酶切

鉴定正确的阳性重组质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI先经NotI单酶切并纯化，酶切体系如下：

酶切条件：37℃水浴4h。

2.1.2补平

经过Not I单酶切并纯化回收后的片段用Klenow酶补平单酶切后产生的粘性末端，补平体系如下：

补平条件：25℃水浴30min。

2.1.3Nhe I单酶切

补平纯化后的产物再用Nhe I进行单酶切，酶切体系如下：

酶切条件：37℃水浴4h。

2.1.4酶切补平后的片段回收

随后切胶回收含有sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI(简称HPV58mE6E7-Fc-GPI)的目的片段(5’-端为Nhe I酶切后产生的粘性末端，3’-端为Klenow补平后产生的平端)。

2.2载体PVAX1-IRES-GM/B7的酶切、粘端补平及回收

2.2.1 Cla I单酶切

先经Cla I单酶切并纯化，酶切体系如下：

酶切条件：37℃水浴4h。

2.2.2补平

经过Cla I单酶切并纯化回收后的片段用Klenow酶补平单酶切后产生的粘性末端，补平体系如下：

补平条件：25℃水浴30min。

2.2.3Nhe I单酶切

补平纯化后的产物再用Nhe I进行单酶切，酶切体系如下：

酶切条件：37℃水浴4h。

2.2.4酶切补平后的片段回收

随后切胶回收含有PVAX1-IRES-GM/B7的载体(5’-端为Nhe I酶切后产生的粘性末端，3’-端为Klenow补平后产生的平端)。

3.sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI和PVAX1-IRES-GM/B7连接、转化及阳性克隆的鉴定

酶切纯化的sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI与载体PVAX1-IRES-GM/B7 4℃连接过夜，转化大肠杆菌E.coli DH5α。经卡那霉素(100μg/mL)筛选后，菌落PCR挑选阳性克隆；再经NheI和PmeI、NheI和PvuI双酶切鉴定，酶切鉴定正确的阳性重组质粒即为基因疫苗PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRESGM/B7，简称PVAX1-HPV58mE6E7GB。

连接体系如下：

酶切鉴定体系如下：

四、动物实验

1.1动物分组

6-8周龄C57雌性小鼠随机分为5组，每组15只，5只进行形态学检测、5只进行生存率检测、5只进行免疫学检测。A空白组：PBS；B空载体组：PVAX1；C单纯抗原组：PVAX1-HPV58mE6E7；D组：PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12疫苗1组；E：PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗2组。

1.2皮下移植瘤攻击

①预防模型：

分别收取对数生长期的单克隆B16-HPV58E6E7细胞，制备单细胞悬液，PBS洗两次，调整细胞浓度至2×10⁶个/mL，于末次免疫后1天在小鼠背部右侧皮下接种100μl细胞悬液即2×10⁵个/只。

②治疗模型：

分别收取对数生长期的单克隆B16-HPV58E6E7细胞，制备单细胞悬液，PBS洗两次，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL，于初次免疫前1天在小鼠背部右侧皮下接种100μl细胞悬液即1×10⁵个/只。

1.3免疫C57BL/6小鼠

①预防模型

C57小鼠在进行移植瘤攻击前30天，连续进行3次疫苗接种，每间隔10天免疫1次。免疫采用股四头肌肌肉注射同时局部电脉冲刺激，空白组注射100μl PBS/只，其余各组分别注射相应的DNA质粒50μg/100μl/只，分别于d1、d11和d22共免疫三次。在末次免疫后1天进行移植瘤攻击。攻击后每隔2天观察一次移植瘤生长，记录瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；末次免疫后第7和14天分别取各组免疫小鼠血清进行Elisa实验，检测体液免疫情况；免疫后第14天收集小鼠的脾细胞，进行Elispot和CTL杀伤实验，检测细胞免疫情况；在移植瘤攻击后2周断颈处死每组5只小鼠，手术剥取肿瘤组织并记录各种数据。具体免疫程序见图6和表1。

②治疗模型

C57小鼠在皮下移植瘤攻击1天后开始免疫，每间隔7天免疫1次。免疫采用股四头肌肌肉注射并同时进行电脉冲刺激，空白组注射100μl PBS/只，其余各组分别注射相应的DNA质粒50μg/100μl/只，分别于d1、d9和d17共免疫三次。在初次免疫前1天进行移植瘤攻击。攻击后每隔2天观察一次移植瘤生长，记录瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；于末次免疫后第7和14天分别取各组免疫小鼠血清进行Elisa实验，检测体液免疫情况；免疫后第14天收集小鼠的脾细胞，进行Elispot和CTL杀伤实验，检测细胞免疫情况；在进行移植瘤攻击后第25天断颈处死每组5只小鼠，手术剥取肿瘤组织并记录各种数据。具体免疫程序见图7和表2。

1.4疫苗免疫保护效果观察和检测

皮下移植瘤攻击后，观察小鼠体内肿瘤的生长情况。待肿瘤结节形成后(可扪及)，记录每组小鼠的成瘤时间；以后每间隔两天用游标卡尺测量一次肿瘤的垂直长径和垂直短径，依照公式计算移植瘤体积，绘制小鼠体内肿瘤的生长曲线；待肿瘤生长至一定天数时，断颈处死每组各5只小鼠并拍照，手术剥取肿瘤组织并称取瘤重，依照公式计算肿瘤的抑制率。公式如下：

1.5免疫学检测

①血清抗体的ELISA检测

末次免疫后第7和14天，取各组免疫小鼠静脉血，室温放置3h后3000rpm离心10min，取上层血清，-20℃保存备用。用发明人纯化的HPV58E6E7-GST融合蛋白分别包板，ELISA法检测免疫小鼠血清中特异的抗体滴度。

a.包被：将纯化后的HPV58E6E7-GST融合蛋白用包被液稀释至终浓度为2.5μg/mL，100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜；

b.洗涤：甩弃ELISA板孔中的包被液，PBST洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干；

c.封闭：100μL/孔加入5％小牛血清，37℃封闭2h，弃去封闭液，PBST洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干；

d.检测：将各组免疫鼠血清(一抗)用PBS倍比稀释后加入各孔，100μL/孔，37℃湿盒反应2h，弃去鼠血清，PBST洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干；

e.6标记：100μL/孔加入HRP标记的羊抗鼠IgG(二抗)，37℃湿盒反应1h，弃去二抗，PBST洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干；

f.显色：每孔加入TMB显色液100μL，室温显色30min，2M硫酸终止反应。

SPECTRAⅢ酶联仪检测450nm的OD值。结果判定：待测样品的OD值≥0.1为阳性，显示阳性结果的最大抗体稀释度为免疫小鼠血清的抗体效价。

②免疫小鼠脾脏单个核细胞悬液的制备及Elispot检测

末次免疫后第10-15天，先后断颈处死每组5只小鼠，在无菌条件下取小鼠的脾脏制备脾细胞悬液，具体操作如下：

(1)小鼠脾脏单个核细胞悬液的制备：

a.打开超净工作台的紫外灯照射30min，断颈处死小鼠，浸泡于75％乙醇中5min后随即放入超净台内小鼠解剖板上左侧卧位；

b.用75％乙醇消毒小鼠腹部，无菌手术开腹腔取出脾脏，去除脂肪和***，剪碎(5-7段)后放于200目不锈钢网筛，将网筛置于预先放入2mL含5％血清PBS的平皿中，用研磨棒挤压出脾细胞，尽量挤压干净；

c.用含5％血清PBS冲洗不锈钢网筛，轻柔吹打、充分混匀上一步研磨出来的脾细胞；

d.在透明刻度离心管中分别加入5mL淋巴细胞分离液，将脾细胞悬液(约5mL)缓慢加在分离液上方，离心，2000rpm/min，30min；

e.离心后取白膜，加入10mL含5％血清PBS洗2次(1500rpm/min，10min)；重悬于10mL含5％血清RPMI1640培养液中，计数；

(2)Mouse IFN-γprecoated ELISPOT kit检测小鼠脾细胞

第一天：接种细胞，加入刺激物，培养(严格注意无菌操作)

a.整个实验每一个细胞样品(同一实验动物)设置1组正对照(PMA刺激)、设1组负对照(不加刺激物)，同时整块板还要加1组背景负对照(不含细胞，只加培养基和所有检测试剂)；

b.取出预包被好的板，每孔先加入200μL的Lympho-Spot^TM无血清培养基室温避光静置10min活化，然后倾倒；

c.细胞上板：按照既定安排，接种不同组免疫小鼠的脾细胞，100μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀；

d.(1)正对照：细胞浓度为1×10⁵cells/well；

(2)细胞样品：样品细胞浓度为4×10⁵cells/well；

(3)背景负对照：加入100μL的Lympho-Spot^TM无血清培养基，该孔即为背景负对照孔；

e.正对照孔每孔加入10μL PMA，终浓度1-4μg/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌；

f.实验孔加入刺激物：即重组抗原：纯化后的HPV58E6E7-GST融合蛋白，8μg/孔；

g.加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37℃培养24-36h；

第二天：培养后操作(不再需要无菌操作)

h.裂解细胞：倾倒孔内的细胞及培养基，加入200μL/孔冰冷的去离子水，4℃冰浴10min(低渗法裂解细胞)；

i.洗涤：每孔加入200μL洗涤液，浸泡3-5mins后扣出，重复5次，最后一次，在吸水纸上扣干；

j.加入检测抗体：每孔加入100μL稀释好的生物素标记检测抗体，37℃孵育1h；

k.洗涤：每孔加入200μL洗涤液，浸泡3-5mins后扣出，重复5次，最后一次，在吸水纸上扣干；

l.加入酶标亲和素：每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素，37℃孵育1h；

m.洗涤：每孔加入200μL洗涤液，浸泡3-5mins后扣出，重复5次，最后一次，在吸水纸上扣干；

n.显色：根据说明书配好AEC显色液，每孔加入100μL的，室温避光静置45-60min；

o.待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程，将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30min，让膜自然晾干；

p.将ELISPOT板置于Biosys Bioreader自动读板仪内，调节好合适的参数，斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。

③细胞免疫的检测-特异性CTL的测定

(1)效应细胞的制备

经过3次免疫后的C57BL/6小鼠断颈处死，整体置于75％乙醇中消毒处理5min，无菌条件下在超净台中取出脾脏，培养皿中加入5mL含5％血清PBS，并将200目不锈钢网筛置于其中，用研磨棒挤压出脾细胞，尽量挤压干净，直至留下白色***。移去网筛及白色***，用移液管吹打开脾细胞，用含5％血清PBS冲洗不锈钢网筛，轻柔吹打、充分混匀上一步研磨出来的脾细胞。在透明刻度离心管中加入5mL小鼠淋巴细胞分离液，将脾细胞悬液(约5mL)缓慢加在分离液上方，离心，2000rpm/min，30min。离心后取白膜，加入10mL含5％血清PBS洗2次(1500rpm/min，10min)，最后将脾细胞重悬于10mL含5％血清RPMI1640培养液中，计数。计数后的脾细胞置于6孔板中，用含IL-2、阳性刺激物(PMA)、重组抗原(纯化后的HPV58E6E7-GST融合蛋白)及10％血清的RPMI1640培养基在5％二氧化碳培养箱、37℃培养5-7天，作为效应细胞。

(2)靶细胞的制备

本实验中将表达HPV58E6E7融合基因的B16-HPV58E6E7单克隆细胞作为靶细胞。参考试剂盒中的操作步骤，先进行最适靶细胞数的确定。具体步骤为：离心收集细胞，计数细胞数，调整细胞浓度为2×10⁵cell/mL。96孔细胞培养板中，每孔加不同数量的靶细胞0，5000，10000，20000，40000。补加培养液至总体积为200μL，设置3个复孔。每孔再加入10μL 10×裂解液，37℃孵育45min，1000rpm离心4min，每孔吸出50μL上清至96孔酶标板中，再加入50μL预先配好的底物混合液，室温避光孵育30min，最后加入50μL终止液。酶标仪上测定OD₄₉₀。最适靶细胞数的反应孔的OD₄₉₀值至少为对照孔OD₄₉₀值平均值的2倍以上。

(3)特异性CTL活性的测定

参照CytoTox96

Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒说明书。

取一96孔U形底细胞培养板。实验孔中每孔加入1×10⁴个/50μl(最适靶细胞数，即2×10⁵个/mL)的靶细胞，再加入不同数量和体积的效应细胞(将每只小鼠的效应细胞调整至相同浓度，比较方便后续实验)，使之形成不同的效靶比(分别为10∶1、20∶1、40∶1)，并补含5％血清的RPMI1640培养基至总体积200μl，每组设3个复孔。同时设立以下对照：效应细胞自发释放(与对应的实验孔相比，不加靶细胞)、靶细胞自发释放、靶细胞最大释放、培养基空白对照和总体积校正对照，各对照也设3个复孔，每孔总体积200μl。

培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育4hr，培养结束前45min，于靶细胞最大释放孔及体积校正孔中加入10×裂解液20μl。培养结束后，将培养板350g/min离心4min，小心吸取每孔上清50μl重新置于另一96孔平底酶标板上对应的孔中(见图8)，加入50μl乳酸脱氢酶底物液，室温下避光反应30min，最后加入50μl终止液。酶标仪上以490nm或492nm测量OD值。计算公式如下：

1.6 PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗免疫效果

由于E6和E7基因的分子量较小，表达的蛋白半衰期短，仅有3～4h，因而抗原性弱。我们将HPV58型E6基因与E7基因融合形成E6E7融合基因，并在其前方加上信号肽，后方融合人IgG Fc段及锚定蛋白GPI，共同构成sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI融合抗原片段，使整个抗原分子量变大从而使所得蛋白的结构稳定，并利用人IgG Fc段加强免疫应答的抗原呈递功能，以及GPI将融合蛋白抗原锚定在细胞膜上，有利于免疫识别。动物实验中发现，通过融合抗原的方法增大蛋白分子量后，在一定程度上增强了体液免疫，提高了抗体滴度，使PVAX1-HPV58mE6E7Fc-h IL12(疫苗1)组与PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2)组的最高抗体滴度可达到1∶25600，与PBS和PVAX1空载体对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)。在动物实验中我们还看到，注射PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗免疫的小鼠，对HPV58E6E7阳性肿瘤的攻击具有免疫保护作用。在抗肿瘤移植保护实验中，虽然接种了2×10⁵/只B16-HPV58E6E7细胞的各组(PBS、PVAX1空载体、、PVAX1-HPV58mE6E7单纯抗原、PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12(疫苗1)、PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2))小鼠成瘤率均为100％，但疫苗组小鼠皮下肿瘤成瘤时间(15.57±1.53天)晚于PBS(9.00±1.58天)、PVAX1空载体(9.06±1.52天)(P＜0.05)，与单纯抗原组(11.35±1.66)、PVAX1-HPV58mE6E7-h IL12(疫苗1)组(13.60±1.48天)无显著差异(P＞0.05)，说明两种疫苗组都有抗肿瘤移植保护的作用，但PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2)效果较优。在肿瘤生长抑制实验中，疫苗组小鼠肿瘤生长速度较PBS、PVAX1空载体和单纯抗原组明显减慢，最终使小鼠生存期延长，平均瘤重较低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；PVAX1-HPV58mE6E7-h IL12(疫苗1)组肿瘤生长速度、小鼠生存期、平均瘤重与PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2)组相当(P＞0.05)。说明疫苗1及疫苗组都有2组都有抑制肿瘤生长的作用。同时，在ELISPOT实验中，虽然PVAX1-HPV58mE6E7-h IL12(疫苗1)、PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2)及单独抗原组都能检测到分泌IFN-γ的特异性CTL，但从显现的斑点数可以表明，疫苗2组小鼠被激活的特异性、分泌IFN-γ的效应T细胞数(288.78±18.67个/4×10⁵个脾淋巴细胞)明显多于疫苗1组(215.24±25.12个/4×10⁵个脾淋巴细胞)单独抗原组(147.50±25.32个/4×10⁵个脾淋巴细胞)(P＜0.05)，而其他三组(PBS、PVAX1空载体和单纯佐剂组)检测到的斑点数均在15个左右。通过LDH法，我们还检测到PVAX1-HPV58mE6E7-h IL12(疫苗1)、PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2)都可以诱导C57BL/6小鼠产生杀伤B16-HPV58E6E7细胞的CTL，疫苗1和疫苗2的免疫保护率最高分别为60％和68％，而单独HPV58mE6E7融合基因抗原的免疫保护率最高为为40％，而其他三组(PBS、PVAX1空载体和单纯佐剂组)没有免疫保护作用。说明没有特异性抗原(HPV58mE6E7)无法有效激活的特异性、分泌IFN-γ的效应T细胞；PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2)对小鼠的免疫保护率68％高于PVAX1-HPV58mE6E7-h IL12(疫苗1)和单独抗原组。

本研究结果表明，PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗可以诱发免疫后小鼠产生特异性抗体和细胞免疫应答，在一定程度上保护免疫小鼠免受B16-HPV58E6E7细胞(2×10⁵)的攻击，免疫保护率最高为68％。因此，该疫苗也可作为HPV58阳性相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的候选疫苗。

Claims (5)

1.一种HPV58型治疗性复合基因疫苗，其特征在于该疫苗以HPV58型E6/E7融合基因为靶抗原，以GM/B7作为抗原佐剂；所述HPV58型E6/E7融合基因去除了HPV58型E6和E7基因的终止码，同时将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第24、26和92位氨基酸都突变成甘氨酸。

2.根据权利要求1所述的HPV58型治疗性复合基因疫苗，其特征在于所述靶抗原由所述HPV58型E6/E7融合基因片段***pCI-Fc-GPI载体中，构建过渡性真核质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI片段从pCI载体上切下来而得。

3.根据权利要求2所述的HPV58型治疗性复合基因疫苗，其特征在于该疫苗采用的载体为pVAX1-IRES-GM/B7，它对所述靶抗原sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI和GM/B7可共表达。

4.根据权利要求3所述的HPV58型治疗性复合基因疫苗，其特征在于该疫苗是PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7。

5.根据权利要求1至4任一所述HPV58型治疗性复合基因疫苗的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

<1>制备靶抗原：先去除HPV58型E6和E7基因的终止码，将E6和E7基因融合成HPV58mE6E7融合基因，其中，将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第24、26和92位氨基酸都突变成甘氨酸；然后，把HPV58mE6E7融合基因片段***pCI-Fc-GPI载体中，构建过渡性真核质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将复合基因片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI从pCI载体上切下来；

<2>选择载体：选用GM-CSF和B7.1双亚基共表达的疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7；

<3>制备疫苗：将步骤<1>的复合基因片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI***步骤<2>的疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7的IRES上游，即得HPV58型治疗性复合基因疫苗PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7。

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