CN102227440A

CN102227440A - 改良的抗体文库

Info

Publication number: CN102227440A
Application number: CN2009801477246A
Authority: CN
Inventors: C-M.谢; Y.A.库茨科瓦; J.E.梅莫特
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG
Current assignee: AbbVie Inc
Priority date: 2008-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2011-10-26
Also published as: US8404445B2; AU2009298501A1; ZA201102119B; EP2340256A4; NZ591543A; WO2010039852A3; IL211552A0; JP2012504416A; CA2736430A1; KR20110061629A; EP2340256A2; TW201028432A; US20100099103A1; RU2011117213A; MX2011003380A; WO2010039852A2

Abstract

本发明的特征在于改良的体外RNA展示文库，以允许从表达文库中可靠表达和选择scFv抗体分子。本发明的scFv抗体文库包含最优化的、缩短的结构域间接头，其改善表达scFv抗体表达。scFv抗体文库还包括短核酸条形码，其允许鉴定个别文库克隆、文库或其亚群。还提供了用于生成、扩增且对本发明的scFv抗体文库进行谱型分析的引物。

Description

改良的抗体文库

相关申请

本申请要求于2008年9月30日提交的美国临时申请号61/101,483的优先权，其内容在此引入作为参考。

发明领域

本发明涉及改良的抗体文库以及用于制备其的方法和材料。

发明背景

以高特异性和亲和力与几乎任何结构表位结合的抗体常规用作研究工具和FDA批准的治疗剂。因此，治疗用和诊断用单克隆抗体构成全世界数十亿美元的市场。

使动物免疫接种以获得抗体的传统方法是缓慢且麻烦的。因此，已开发了使用合成抗体文库用于先体外后体内选择针对所需靶分子的抗体的几种方法。在一些方法中，抗体或其片段的文库展示在生物（例如，酵母细胞、细菌细胞或哺乳动物细胞）或亚显微因子（例如，噬菌体或病毒）的表面上，并且就所需抗体的表达选择生物或亚显微因子。在其他方法中，在无细胞体外***中表达且选择抗体文库。目前的体外表达***尽管善于表达单个抗体可变结构域，但在表达多结构域抗体例如单链抗体（scFv）分子方面无效。这是由于目前的scFv抗体文库的结构和目前的体外表达***的反应条件。

因此，本领域需要改良的抗体文库用于选择针对所需靶的scFv抗体。

发明概述

本发明通过提供改良的体外展示RNA文库以允许可靠表达和选择scFv抗体分子解决了前述问题。

本发明具有几个优点，这包括但不限于下述：

· 提供包含最优化的结构域间接头用于改善表达的改良的体外展示scFv抗体文库；

· 提供包含短核酸条形码（barcodes）的改良的体外展示scFv抗体文库；

· 提供引物以生成改良的体外展示scFv抗体文库；

· 提供引物以对本发明文库中的scFv抗体分子的重链可变区的CDR3区进行谱型分析（spectratype）；和

· 制备改良的体外展示文库的方法。

在一个方面，本发明提供了由如SEQ ID NOs：1-14、19-42、和58-210的任何一个中所示的核酸序列组成的寡核苷酸。在另一个方面，本发明提供了包括如SEQ ID NOs：1-14、19-42、和58-210的任何一个中所示的核酸序列的寡核苷酸。

在另一个方面，本发明提供了由如SEQ ID NOs：14-16、和43-57的任何一个中所示的核酸序列组成的寡核苷酸。在另一个方面，本发明提供了包括如SEQ ID NOs：14-16、和43-57的任何一个中所示的核酸序列的寡核苷酸。

在另外一个方面，本发明提供了由如SEQ ID NOs：17或18中所示的核酸序列组成的寡核苷酸。在另一个方面，本发明提供了包括如SEQ ID NOs：17或18中所示的核酸序列的寡核苷酸。

在一个实施方案中，本发明提供了SEQ ID NOs：1-210中所示的任何序列用于文库扩增、文库逆转录和/或文库谱型分析的用途。

在另一个方面，本发明提供了用于表达单链抗体（scFv）的核酸文库，所述文库包括编码重链可变结构域和轻链可变结构域的序列谱（repertoire），其中所述文库的每个成员包含可读框，所述可读框包括重链可变结构域、轻链可变结构域和接头区域，并且其中所述文库使用SEQ ID NOs：1-210中所示的一种或多种寡核苷酸生成。

在一个实施方案中，文库进一步包括编码小于20个氨基酸的接头区域。在另一个实施方案中，文库进一步包括编码15个氨基酸的接头区域。

在一个实施方案中，文库的每个成员进一步包括与可读框可操作地连接的启动子。在另一个实施方案中，启动子选自T7、SP6和T3。在另外一个实施方案中，启动子是T7启动子。

在一个实施方案中，文库的每个成员进一步包括能够增强它与之可操作地连接的基因转录的5'非翻译区（5’UTR）。在另一个实施方案中，5’UTR是烟草花叶病毒5’UTR或其活性片段。在另一个实施方案中，文库的每个成员进一步包括聚腺嘌呤序列。

在另外一个实施方案中，文库进一步包括核酸条形码。在另一个实施方案中，核酸条形码包括8个核苷酸。

在另一个实施方案中，文库的每个成员进一步包括编码附加表位的核酸序列。在另外一个实施方案中，附加表位是FLAG标记。在另外一个实施方案中，核酸序列是scFv的接头区域的部分。在另一个实施方案中，文库进一步包括编码抗体恒定区或其片段的核酸序列。

在一个实施方案中，文库进一步包括核糖体中止（pause）序列。

在一个实施方案中，文库进一步包括肽接纳体。在另一个实施方案中，肽接纳体经由包括补骨脂素C6分子的接头共价附着。在另外一个实施方案中，接头是5'（补骨脂素C6）2’Ome（U AGC GGA UGC）XXX XXX CC（嘌呤霉素），其中X是三甘醇接头或PEG-150，并且CC是DNA主链。

在另一个方面，本发明提供了产生用于表达单链抗体（scFv）的核酸文库的方法，其包括（a）提供核酸组合物，其中组合物中的至少部分核酸包括编码抗体可变结构域的至少一个可读框，和（b）使用SEQ ID NOs 1-210中所示的一种或多种寡核苷酸扩增多个抗体可变结构域。

在另一个方面，本发明提供了用于对包括至少一个可读框的核酸进行谱型分析的方法，所述可读框编码抗体可变结构域，所述方法包括（a）提供核酸组合物，其中所述组合物中的至少部分核酸包括编码抗体可变结构域的至少一个可读框，和（b）使用SEQ ID NOs 1-210中所示的一种或多种寡核苷酸扩增所述可变结构域的CDR3区。

附图简述

图1描述了在本发明的特定实施方案中关于mRNA-scFv展示技术的一般方案。

图2描述了在本发明的特定实施方案中关于mRNA-scFv展示技术的一般方案。

图3描述了文库DNA构建体的一般描述。

图4描述了作为mRNA-scFv分子生成的功能scFv。

图5描述了显示在mRNA-scFv分子形式中附着的scFv在功能上等价于游离scFv分子的结果。

图6描述了在17/9 mRNA-scFv构建体的TMV-UTR和Kozak共有序列之间***的4个8-bp标记。

图7描述了示例性构建体和控制序列。

图8描述了在3轮选择中鉴定的随机标记序列。

图9描述了在一轮mRNA-scFv选择前和后定量17/9 scFv的结果。

图10描述了在D2E7和2SD4之间的嵌合体。

图11描述了关于不同TNFα结合剂的K_D曲线。

图12描述了mRNA-scFv分子的热稳定性。

图13描述了显示RNA可以在mRNA-scFv分子的高温处理后回收的结果。

图14描述了在首次用于实验的人PBMCκscFv PROfusion文库中PBMCs供体的年龄、种族划分和性别分布。

图15描述了在构建的首次用于实验的人PBMCκscFv PROfusion文库中的VH家族特异性PCR片段。

图16描述了在构建的首次用于实验的人PBMCκscFv PROfusion文库中的Vκ家族特异性PCR片段。

图17描述了在构建的首次用于实验的人PBMCκscFv PROfusion文库中的VH-Vκ scFv PCR产物。

图18描述了在构建的首次用于实验的人PBMCκscFv PROfusion文库中的VH和Vκ家族分布。

图19描述了首次用于实验的人PBMC抗体CDR3大小的谱型分析。

图20描述了VH/Vκ文库通过谱型分析的质量控制。

图21描述了在首次用于实验的人PBMCλscFv PROfusion文库中的Vλ家族特异性PCR片段。

图22描述了在构建的首次用于实验的人PBMCλscFv PROfusion文库中的VH-Vλ scFv PCR产物。

图23描述了在构建的首次用于实验的人PBMCλscFv PROfusion文库中的VH和Vλ家族分布。

图24描述了首次用于实验的人***κ和λscFv PROfusion文库中PROfusion文库构建的图解。

图25描述了在构建的首次用于实验的人***κ和λscFv PROfusion文库中的VH家族特异性PCR片段。

图26描述了在构建的首次用于实验的人***κ和λscFv PROfusion文库中的Vκ家族特异性PCR片段。

图27描述了在构建的首次用于实验的人***κ和λscFv PROfusion文库中的Vλ家族特异性PCR片段。

图28描述了在构建的首次用于实验的人***κ和λscFv PROfusion文库中的VH-Vκ和VH-Vλ scFv PCR产物。

图29描述了在构建的VH-Vκ scFv文库中的VH和Vκ家族分布。

图30描述了在构建的VH-Vλ scFv文库中的VH和Vλ家族分布。

图31描述了在构建的VH-Vλ scFv文库中VH-Vκ和VH-Vλ文库通过谱型分析的质量控制。

发明详述

为了本发明可以更容易理解，首先定义了特定术语。

I. 定义

术语“抗体”包括单克隆抗体（包括全长单克隆抗体）、多克隆抗体、多特异性抗体（例如，双特异性抗体）、嵌合抗体、CDR嫁接的抗体、人源化抗体、人抗体、鼠抗体及其片段，例如抗体轻链（VL）、抗体重链（VH）、单链抗体（scFv）、F（ab’）2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、和单结构域抗体片段（DAb）。

术语“抗体文库”指包含可读框（ORF）的多个DNA或RNA分子，所述可读框编码抗体或其片段。它还包括由所述DNA或RNA分子表达的多个抗体蛋白质和核酸/抗体融合分子。

术语“重链可变结构域”指编码抗体重链可变区的核酸和所述核酸的蛋白质产物。

术语“轻链可变结构域”指编码抗体轻链可变区的核酸和所述核酸的蛋白质产物。

术语“谱型分析”指基于PCR的方法，其基于CDR3长度使编码抗体的遗传序列分开。CDR3长度分布中的改变与抗体谱中的改变相关（Janeway等人"Immunobiology"，第5版Garland Publishing，New York and London,（2001））。

术语“附加表位”指由抗体特异性识别的短氨基酸序列，其与分子化学或遗传地附着，以允许其通过所述抗体的检测，例如FLAG标记、HA标记、MYC标记或T7标记。

术语“核酸条形码”指在本发明文库的非翻译区中包括的短核酸。条形码是用来给个别克隆或多个文库成员提供独特标识符的随机或预定序列。

术语“非抗体序列”指在本发明的抗体文库中出现的任何核酸或氨基酸序列，其不是原始抗体序列的部分。此种序列包括例如附加表位或核酸条形码。

术语“控制序列”指在具体宿主生物、亚显微因子或体外表达***中表达可操作地连接的编码序列所需的核酸序列或遗传元件。此种序列是本领域众所周知的。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。当核酸置于与另一种核酸序列的功能关系内时，它是“可操作地连接的”。例如，启动子或增强子与编码序列可操作地连接，如果它影响序列的转录的话；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，如果它如此放置，以便促进翻译的话。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的核酸序列是邻接的。然而，增强子无需是邻接的。例如，连接通过在方便的限制位点上的连接来完成。如果此种位点不存在，那么依照常规实践使用合成寡核苷酸衔接头或接头。

术语“特异性结合”或“与之特异地结合”指结合分子以至少约1 x 10^-6 M、1 x 10^-7 M、1 x 10^-8 M、1 x 10^-9 M、1 x 10^-10 M、1 x 10^-11 M、1 x 10^-12 M或更多的亲和力与靶结合，和/或以是其对于非特异性抗原的亲和力至少2倍的亲和力与靶结合的能力。

术语“靶”指由抗体识别的抗原或表位。靶包括例如任何肽、蛋白质、糖、核酸、脂质和对于其生成特异性抗体的小分子。在一个实施方案中，抗体针对人蛋白质，例如TNFα、IL-12或IL-1α。

“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中得到限定。

术语“RNA展示”或“mRNA展示”指体外技术，其中所表达的蛋白质或肽与其编码mRNA共价或通过紧密的非共价相互作用连接，以形成“RNA/蛋白质融合”分子。就与所需靶的结合选择RNA/蛋白质融合物的蛋白质或肽组分，并且通过测序所附着的编码mRNA组分来测定蛋白质或肽的特性。此种方法是本领域众所周知的，并且例如在美国专利号7,195,880；6,951,725；7,078,197；7,022,479，6,518,018；7,125,669；6,846,655；6,281,344；6,207,446；6,214,553；6,258,558；6,261,804；6,429,300；6,489,116；6,436,665；6,537,749；6,602,685；6,623,926；6,416,950；6,660,473；6,312,927；5,922,545；和6,348,315中描述。

术语“单链Fv抗体”或“scFv”指使用重组方法通过使得其能够制备为单条蛋白质链的合成接头连接的轻链可变区的抗原结合部分和重链可变区的抗原结合部分，其中VL和VH区配对以形成单价分子（称为单链Fv（scFv）；参见例如，Bird等人（1988）Science 242:423-426；和Huston等人（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85:5879-5883）。

术语“功能部分”指对其与之附着的分子赋予另外功能性的任何生物或化学实体。

术语“选择”指使分子与群体中的其他分子基本上分开。如本文使用的，“选择”步骤提供在选择步骤后相对于群体中不希望有的分子，所需分子至少2倍、优选30倍、更优选100倍、且最优选1000倍富集。如本文指出的，选择步骤可以重复任何次数，并且不同类型的选择步骤可以在给定方法中组合。

术语“中止序列（pause sequence）”指促使核糖体减慢或停止其翻译速率的核酸序列。

术语“固体支持体”指但不限于亲和复合物可以与之直接或间接（例如通过其他结合配偶体中间物，例如其他抗体或A蛋白）结合，或亲和复合物可以包埋入其中（例如，通过受体或通道）的任何柱（或柱材料）、珠、试管、微量滴定皿、固体颗粒（例如，琼脂糖或琼脂糖凝胶(sepharose)）、微芯片（例如，硅、硅-玻璃或金芯片）、或膜（例如，脂质体或小泡的膜）。

术语“接头区域”指使scFv抗体基因中编码抗体VH和VL结构域的核酸序列连接的核酸区域。接头区域与编码抗体VH和VL的核酸序列符合读框，从而使得形成包含VH、VL和接头区域的邻接可读框。该术语还指在scFv蛋白质中连接VH和VL的区域。

术语“肽接纳体”指通过核糖体肽基转移酶的催化活性能够添加到成长中的蛋白质链的C末端的任何分子。一般地，此种分子包含（i）核苷酸或核苷酸样部分（例如，嘌呤霉素及其类似物）），（ii）氨基酸或氨基酸样部分（例如，20种D-或L-氨基酸中的任何一种或其任何氨基酸类似物（例如，由Ellman等人（1991）Meth. Enzymol. 202:301描述的O-甲基酪氨酸或任何类似物），和（iii）2个之间的键（例如在3'位置上或较不优选地在2'位置上的酯、酰胺或酮键）；优选地，这种键不显著干扰来自天然核糖核苷酸构象的环结构。此外，这个术语包括但不限于与蛋白质编码序列共价键合（直接或通过间插核酸序列间接）的肽接纳体分子，以及通过一些非共价方法与蛋白质编码序列连接的那种，例如通过使用第二种核酸序列的杂交，所述第二种核酸序列在蛋白质编码序列的3'末端上或接近3'末端处结合，并且其自身与肽接纳体分子结合。

II. 概述

本发明的特征在于改良的体外RNA展示文库，以允许从表达文库中可靠表达和选择scFv抗体分子。RNA展示方法一般涉及蛋白质或肽文库的表达，其中所表达的蛋白质或肽与其编码mRNA共价或通过紧密的非共价相互作用连接，以形成RNA/蛋白质融合分子。可以就与所需靶的结合选择RNA/蛋白质融合物的蛋白质或肽组分，并且通过测序所附着的编码mRNA组分来测定蛋白质或肽的特性。

本发明的scFv抗体文库包含最优化的、缩短的结构域间接头，其改善表达scFv抗体表达。scFv抗体文库还包括短核酸条形码，其允许鉴定个别文库克隆、文库或其亚群。

本发明还提供了用于生成、扩增且对本发明的scFv抗体文库进行谱型分析的新引物。

III. 文库构建

作为生成单克隆抗体药物候选物的抗体技术开发，本发明公开了2种重组抗体生成方法的开发，PROfusion（mRNA展示）和酵母表面展示。PROfusion mRNA展示技术是用于筛选人抗体文库的从头开始方法。酵母表面展示技术是用于筛选在酵母表面上特异性展示的单克隆抗体的细胞方法。

在一个方面，本发明的特征在于能够表达抗体分子的新抗体文库。本发明的文库由能够与靶结合的任何抗体片段生成。在一个实施方案中，生成抗体可变结构域的文库。在一个实施方案中，这些是VH和/或VL结构域。在另一个实施方案中，生成scFv文库。

本发明的文库还可以包括编码在可变区外的区域的抗体核酸序列，例如其恒定区或片段，或铰链区。

本发明的核酸文库可以包括RNA、DNA或RNA和DNA元件。

1）核酸输入多样性的生成

用于生成本发明的抗体文库的核酸序列可以得自任何来源。在一个实施方案中，本发明的文库可以得自任何动物的抗体谱，包括但不限于，啮齿类动物、灵长类动物、骆驼科物种（camelid）、鲨鱼或包含人免疫球蛋白基因谱的任何转基因动物。用于分离和克隆编码生物的抗体补体可变区的核酸的技术是本领域众所周知的。事实上，包含编码抗体可变区的核酸的许多cDNA文库是商购可得的，例如由各种免疫细胞生成的人抗体可变区文库，例如外周血单核细胞（PBMC）、脾或***。在另一个实施方案中，本发明的文库可以通过编码一种或多种抗体的核酸的从头开始合成获得。

本发明的文库可能需要通过引入核酸置换和/或缺失将另外的多样性引入，这导致在表达的抗体分子中的一个或多个氨基酸置换和/或缺失。预期了任何领域公认的诱变方法，例如随机诱变、“步移（walk through）”诱变和“审核（look through）”诱变。可以通过使用例如易错PCR、酵母或细菌的“增变”株、或在所有或部分抗体的从头开始合成过程中随机或限定的核酸改变的掺入来达到抗体的此种诱变。在一个实施方案中，可以生成抗体分子的文库，其中一个或多个氨基酸是随机突变的。在另一个实施方案中，可以生成抗体分子的文库，其中一个或多个氨基酸突变为一个或多个预定的氨基酸。

2）控制序列

本发明的核酸文库可以包含另外的控制序列，以促进编码的抗体在体外的表达和筛选。

一种此种控制序列可以是与用于mRNA合成的所需RNA聚合酶一起使用的启动子。如本文描述的，可以使用能够指导来自线性双链DNA的合成的任何启动子，例如T7、SP6或T3噬菌体启动子。

第二种控制序列可以被称为5'非翻译区（或5'UTR），并且与翻译起始位点的RNA上游对应。可以利用任何其他合适的5'UTR（参见例如，Kozak（1983）Microbiol. Rev. 47:1）。在一个实施方案中，5'UTR（被称为“TE”）可以是烟草花叶病毒5'非翻译区的缺失突变体，并且特别与TMV翻译起始直接5'的碱基对应；这种UTR的序列如下：rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rA（其中***第一个3 G核苷酸以增加转录）。

第三种元件可以是翻译起始位点。一般而言，这是AUG密码子。然而，存在其中除AUG外的密码子用于天然存在的编码序列中的例子，并且这些密码子也可以用于本发明的选择方案中。这种翻译起始位点优选在被称为“Kozak”序列的合适序列背景中（参见例如，Kozak（1983）Microbiol. Rev. 47:1）。

第四种元件可以是包含5'终止密码子的聚腺苷酸（poly A）序列。聚腺苷酸序列可以置于在核酸文库构建体内的抗体编码序列后。此种序列是本领域众所周知的，并且预期了任何此种序列。

3）另外的核酸序列元件

本发明的核酸文库还可以包括掺入编码抗体的mRNA转录物内的另外序列元件。这些可以包括非抗体序列。

在一个实施方案中，短核酸序列或“核酸条形码”可以掺入抗体mRNA转录物的非翻译部分内。这些条形码序列可以充当独特标识符，以区别核酸文库的个别成员或区别不同文库。短核酸序列优选包含小于50个碱基、小于20个碱基或小于10个碱基。在一个实施方案中，短核酸序列包括8个碱基。

在其他实施方案中，编码特异性非抗体氨基序列的核酸序列元件可以掺入本发明核酸文库的可读框（ORF）内，从而使得编码的氨基酸序列掺入表达的抗体内。在一个实施方案中，非抗体核酸序列元件可以掺入在VH和VL区之间的scFv的ORF内，以充当接头区域。编码缺乏终止密码子的邻接氨基酸序列的任何核酸序列可以预期用于接头区域。接头区域的长度小于50个氨基酸、或小于20个氨基酸、或小于16个氨基酸。

在另一个实施方案中，编码一种或多种附加表位（例如FLAG标记）的核酸序列元件可以掺入抗体编码序列内。这些序列可以导致产生具有在任何位置上存在的附加表位的抗体，例如在N末端、C末端上或在scFv抗体分子的VH和VL结构域之间的接头区域中。在一个实施方案中，编码抗体恒定区或其片段的序列可以包括在本发明核酸文库的ORF的3'部分中。这个抗体恒定区或其片段在特定文库的所有成员中是等同的。

在其他实施方案中，编码特异性非抗体氨基序列的核酸序列元件可以掺入载体内，所述载体用于在酵母细胞的表面上特异性表达本发明中的核酸文库。这些元件可以包括但不限于，本领域已知的跨膜结构域。在一个实施方案中，这些元件可以掺入本发明核酸文库的ORF内，从而使得所编码的氨基酸序列掺入所表达的抗体内。在另一个实施方案中，这些元件可以掺入载体序列内，而不是本发明抗体文库的ORF内。这些元件可以帮助表达、稳定性、折叠和表位呈递，或本发明和上文提及的核酸文库的其他特征。

4）寡核苷酸引物

在一个方面，本发明的特征在于适合于合成和/或扩增本发明的抗体文库的核寡核苷酸引物。示例性引物包括SEQ ID NOs：1-13（表6）。

在另一个方面，本发明的特征在于适合于逆转录由本发明的文库产生的mRNA的核寡核苷酸引物（表3）。示例性引物包括SEQ ID NOs：14-16（表3）。

在另一个方面，本发明的特征在于适合于对文库或其选择输出中的VH CDR3大小分布进行谱型PCR分析的寡核苷酸引物（表4）。谱型分析可以是用于评估抗体文库多样性和选择进展的有用工具。示例性谱型分析PCR引物包括SEQ ID NOs：17-18。

5）核酸与肽接纳体的连接

在一个实施方案中，本发明的抗体核酸文库可以进行修饰以包含肽接纳体部分。这促进核酸表达文库的个别成员与其关连蛋白质产物的共价附着。预期了任何领域公认的肽接纳体与核酸附着的方法。

在一个方面，本发明的特征在于用于使肽接纳体与核酸文库附着的新方法和组合物。在一个实施方案中，可以合成包括补骨脂素C6分子和肽接纳体分子的连接分子，其中补骨脂素C6分子和肽接纳体分子可以与核酸序列融合，其中所述核酸序列可以与核酸文库的3'末端上的序列互补。此种连接分子可以经由互补碱基配对与核酸文库克隆的3'末端结合。补骨脂素C6对紫外（UV）线敏感，并且将使接头与核酸文库克隆交联，从而使肽接纳体与核酸文库克隆共价连接。在另一个实施方案中，接头分子的核酸部分可以包含修饰的核苷酸，例如2’甲氧基（2'OMe）核糖核苷酸。在另一个实施方案中，接头分子可以进一步包括使包含补骨脂素C6分子和肽接纳体分子的核酸区域分离的三甘醇或PEG-150接头。在一个实施方案中，接头可以是：5'（补骨脂素C6）2'OMe（U AGC GGA UGC）XXX XXX CC（嘌呤霉素）3'，（其中X是三甘醇或PEG-150，并且CC是标准DNA主链）。在一个实施方案中，此种接头通过例如TriLink BioTechnologies，Inc（San Diego，CA）定制合成。

IV. 谱型分析方法

谱型分析方法是在临床和基础免疫学背景中使用的方法，其中评估抗原受体长度多样性作为功能多样性的替代物（参见例如，Cochet，M.,等人（1992）Eur. J. Immunol.，22:2639–2647；Pannetier，C.,等人（1993）Proc. Natl Acad. Sci. USA，90:4319–4323；Pannetier，C.,等人（1997） In Austin，O.J.R.（Ed.）. The Antigen T Cell Receptor：Selected Protocols and Applications，TX Landes，第287–325页）。谱型分析测定可以使用例如从来自受试者的外周血样品中分离的CD4或CD8T细胞，而在其他情况下使用总CD3或PBMC细胞。

在本发明中，PCR可以用于特异性复制可变长度区（CDR3），用于基于CDR3长度分析编码抗体的遗传序列。CDR3长度分布中的改变与抗体谱中的改变相关。在一些实施方案中，对本发明实践中构建的个别文库特异的引物可以用于提供用于每种文库的独立谱型（spectratype）。在一个优选实施方案中，分别与VH的构架3区和J区退火的荧光染料标记的5'正向引物（6-FAM-PanVHFR3-Fwd，5’-GACACGGCCGTGTATTACTGT-3’，SEQ ID NO：17）和反向引物（PanJH-Rev，5’-GCTGAGGAGACGGTGACC-3’，SEQ ID NO：18），可以用于通过PCR扩增跨越VH结构域的CDR3区。在其他实施方案中，可以使用本领域已知的其他引物，其与编码抗体文库的多核苷酸序列上的相同区域或其他区域特异性退火。在一个优选实施方案中，所得到的CDR3复制子混合物可以通过电泳进行大小分离，并且通过光密度测定法进行定量。在其他实施方案中，本领域已知的其他方法可以用于表征所得到的CDR3复制子。

在一个优选实施方案中，可以对VH cDNA片段执行在不同VH家族中CDR3大小分布的谱型分析。在一个实施方案中，示例性VH家族可以得自单个种系或不同VH家族，例如VH1-46、VH2、VH5和VH6。在一个优选实施方案中，用于谱型分析的模板可以选自例如人***文库、酵母脾文库、首次用于实验的人λ文库、人PBMC κ文库、VH-Vλ scFv文库、VH-Vκ scFv文库。在其他实施方案中，用于谱型分析的模板可以选自其他文库。

V. 一般筛选方法

在一个方面，本发明的特征在于筛选本发明的表达文库的方法，以鉴定能够与所需靶结合的抗体。预期了基于抗体与靶分子的结合，允许从表达文库中选择抗体的任何体外或体内筛选方法。

在一个实施方案中，本发明的表达文库可以使用领域公认的体外无细胞表型-基因型连接的展示进行筛选。此种方法是本领域众所周知的，并且例如在美国专利号7,195,880；6,951,725；7,078,197；7,022,479，6,518,018；7,125,669；6,846,655；6,281,344；6,207,446；6,214,553；6,258,558；6,261,804；6,429,300；6,489,116；6,436,665；6,537,749；6,602,685；6,623,926；6,416,950；6,660,473；6,312,927；5,922,545；和6,348,315中描述。这些方法涉及以这样的方式从核酸体外转录蛋白质，从而使得蛋白质与它源于其的核酸在物理上缔合或结合。通过用靶分子选择表达的蛋白质，还可以选择编码蛋白质的核酸。

为了改善scFv蛋白质的表达，上文提及的体外筛选测定可能需要特定试剂的添加或去除。在一个实施方案中，蛋白质二硫键异构酶可以添加到体外表达***中，以改善功能scFv分子的生产。在另一个实施方案中，温和氧化剂（例如GSSG（氧化谷胱甘肽）/GSH（还原谷胱甘肽），例如100mM GSSG /10mM GSH）可以添加到scFv蛋白质的体外翻译反应混合物中，以允许scFv分子的VH和VL区中的链内二硫键形成。在另一个实施方案中，还原剂（例如，二硫苏糖醇（DTT））可从scFv的体外翻译反应混合物中去除。

在另一个实施方案中，一种或多种标记的氨基酸或其衍生物可以添加到体外翻译***中，从而使得一种或多种标记的氨基酸掺入所得到的抗体内。预期了任何领域公认的标记的氨基酸，例如放射性标记的氨基酸，例如³⁵S标记的甲硫氨酸或半胱氨酸。

在一个实施方案中，本发明的体外筛选测定需要在抗体或多种抗体的体外选择后，可以使与抗体或多种抗体在物理上结合的mRNA逆转录，以生成编码所述抗体或多种抗体的cDNA。预期了用于逆转录的任何合适方法，例如酶介导的，例如莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶。

在本发明中采用的筛选方法可能需要扩增编码与所需靶特异性结合的抗体的核酸。在一个实施方案中，可以使与抗体或多种抗体在物理上结合的mRNA扩增，以产生更多mRNA。预期了任何领域公认的RNA复制方法，例如使用RNA复制酶。在另一个实施方案中，在通过PCR扩增前，首先使与抗体或多种抗体在物理上结合的mRNA逆转录成cDNA。在一个实施方案中，PCR扩增使用高保真度的校正聚合酶完成，例如来自Thermococcus kodakaraensis的KOD1热稳定性DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）。在另一个实施方案中，PCR扩增可以在导致突变引入扩增的DNA内的条件下执行，即易错PCR。

在本发明中采用的筛选方法还可能需要增加靶-结合筛选测定的严格性，以选择对于靶具有改善的亲和力的抗体。预期了增加抗体-靶相互作用测定的严格性的任何领域公认的方法。在一个实施方案中，可以改变一种或多种测定条件（例如，测定缓冲液的盐浓度），以减少抗体分子对于所需靶的亲和力。在另一个实施方案中，可以减少允许抗体与所需靶结合的时间长度。在另一个实施方案中，竞争结合步骤可以添加到抗体-靶相互作用测定中。例如，可以首先允许抗体与所需固定化靶结合。随后可以添加特定浓度的非固定化靶，其用来与固定化靶竞争结合，从而使得从固定化靶中洗脱对于抗原具有最低亲和力的抗体，从而导致具有改善的抗原结合亲和力的抗体富集。在一个实施方案中，通过增加添加到测定中的非固定化靶的浓度，可以进一步增加测定条件的严格性。

本发明的筛选方法还可能需要多轮选择，以富集具有改善的靶结合的一种或多种抗体。在一个实施方案中，在每轮选择时，进一步的氨基酸突变可以使用领域公认的方法引入抗体内。在另一个实施方案中，在每轮选择时，可以增加与所需靶结合的严格性，以选择对于所需靶具有增加的亲和力的抗体。

本发明的筛选方法可能需要从体外翻译***的组分中纯化RNA-抗体融合蛋白。这可以使用任何领域公认的分离方法完成。在一个实施方案中，使用聚脱氧胸苷（polydeoxythimidine）（poly dT）树脂通过层析分离RNA-抗体融合蛋白。在另一个实施方案中，通过层析使用对于RNA-抗体融合蛋白的抗体组分中存在的表位特异的抗体，可以分离RNA-抗体融合蛋白。在一个实施方案中，表位可以是掺入RNA-抗体融合蛋白的抗体组分的氨基酸序列内的氨基酸序列标记，例如FLAG或HA标记，例如在N末端、C末端上或在可变区间接头中。

从本发明的文库中选择抗体可能需要使用固定化的靶分子。在一个实施方案中，靶分子可以与固体基质例如琼脂糖珠直接连接。在另一个实施方案中，靶分子可以首先进行修饰，例如生物素化，并且可以使修饰的靶分子经由修饰与固体支持体结合，例如链霉抗生物素蛋白-M280、中性抗生物素蛋白（neutravidin）-M280、SA-M270、NA-M270、SA-MyOne、NA-MyOne、SA-琼脂糖、和NA-琼脂糖。

本发明通过不应解释为限制性的下述实施例进一步举例说明。

本发明的例证

实施例自始至终，使用下述材料和方法，除非另有说明。

材料与方法

一般而言，除非另有说明，否则本发明的实践采用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学（尤其是例如免疫球蛋白技术）和畜牧业的常规技术。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）；Antibody Engineering Protocols（Methods in Molecular Biology），510，Paul，S.，Humana Pr（1996）；Antibody Engineering：A Practical Approach（Practical Approach Series，169），McCafferty，Ed.，Irl Pr（1996）；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等人，C.S.H.L. Press，Pub.（1999）；Current Protocols in Molecular Biology，编辑Ausubel等人，John Wiley & Sons（1992）。

实施例1

用于scFv分子的mRNA展示规程

mRNA展示可以根据图2中所示的方法进行。这种方法的具体实施方案在下文更详细地描述。这些实施方案预期举例说明本发明的方法，并且不应解释为限制性的。

1. 抗体文库模板的设计

根据图3中所述的图解设计文库DNA构建体。双链DNA构建体一般从5'到3'末端包含下述功能元件。T7启动子可以用于体外RNA转录。TMV-UTR（烟草花叶病毒非翻译区）可以用于体外蛋白质翻译。任选标记包含对于每个文库独特的8碱基对序列，其可以用于鉴定属于给定文库的构建体。Kozak共有序列促进蛋白质翻译的起始。目的抗体文库可以包含编码scFv、VH或VL的序列。在优选实施方案中，抗体文库编码scFv。在一个实施方案中，还包括了在所有抗体文库的3'末端上不变的部分抗体恒定区序列。在一些实施方案中，构建体另外包括对于亲和力纯化有用的FLAG标记。在其他实施方案中，构建体含有包含退火位点的接头退火序列，其中补骨脂素和嘌呤霉素修饰的DNA寡核苷酸接头可以在规程的后续步骤中与构建体交联。在一个实施方案中，具有5'终止密码子的聚腺苷酸序列可以用于通过寡脱氧胸苷酸纤维素分批纯化的mRNA稳定性和纯化。

2.靶抗原的制备

一般地，mRNA展示抗体文库可以针对生物素化的抗原进行选择。虽然关于每种靶的最优抗原应基于具体情况（case-by-case）进行测定，但下述考虑可以用作一般指导。靶抗原一般是充分表征的，并且是相关或显性遗传同种型，如通过多态性（SNP和单元型）和/或药物遗传学分析测定的。靶抗原另外可以具有合理生物活性（可与天然抗原比较）、良好可溶性以及良好的化学和物理性质，并且可以以足够量制备以用于文库选择或筛选和下游生物测定。对于文库选择有用的示例性靶抗原量在下表1中指出。

表1：文库选择所需的靶抗原量

3.文库DNA的制备

文库DNA及其选择输出可以通过PCR进行扩增。用于文库扩增的示例性引物显示于表2中。

表2：用于文库扩增的引物

PCR扩增可以使用本领域已知的方法执行。PCR反应一般包含DNA模板、反应缓冲液、dNTP、用于扩增的引物、DNA聚合酶和水。多个反应管由主混合物同时设立，以增加扩增的DNA得率。25个PCR循环一般给出足够扩增，但多达35个循环可以用于获得更多产物。

4.文库DNA纯化

如果来自上述PCR的产物是正确大小（对于scFv ~850 bp，对于VH或VL文库~500 bp）且包含最低限度非特异性产物，那么它们可以直接用于转录反应中。可替代地，产物可以进行凝胶纯化。如果对于PCR产物执行凝胶纯化，那么可以在制备型琼脂糖凝胶上分离产物，并且可以切出包含PCR产物的特异性条带。DNA随后可以通过凝胶提取从条带中纯化，其中使用本领域已知的标准方法，并且在分光光度计上测量其浓度。

5. RNA转录

来自文库DNA的RNA转录可以使用本领域已知的标准方法执行。大反应体积可以用于转录足够的DNA模板，以取样整个文库多样性。在示例性实施方案中，1 x 10¹³文库模板拷贝可以用于RNA转录反应中。RNA转录反应一般包含5-10 μg PCR产物、反应缓冲液、加上ATP、CTP、GTP、UTP和T7 RNA聚合酶。RNA转录反应可以在37℃运行2小时至过夜。在初始选择循环后可以使用较短的时间。在RNA转录后，DNA模板可以使用DNA酶I从反应混合物中去除。

6.通过NAP柱层析的RNA纯化

在RNA转录后，RNA可以使用NAP-10柱（GE Healthcare，Piscataway，NJ）进行分级分离。最高达1 mL转录反应可以装载到NAP-10柱上用于RNA纯化。在分级分离前，柱可以使用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的dH₂O进行平衡。总洗脱体积应小于150％的转录反应体积。RNA可以另外或可替代地使用NAP-25柱（GE Healthcare，Piscataway，NJ）进行分级分离。

7. RNA质量控制和定量

RNA样品的大小和得率可以使用凝胶电泳进行监控。RNA得率一般达到~20 nmol/mL转录反应的最大限度。

8. RNA与接头的连接

在其3'末端上包含肽接纳体分子的DNA接头可以与每种RNA分子的3'末端共价连接。可以进入核糖体A位点且与新生多肽链的羧基末端共价偶联的肽接纳体，最终将使得mRNA（基因型）能够与由这种RNA编码的蛋白质（表型）共价结合。示例性PEG6/10接头可以具有下式：

5'（补骨脂素C6）2'OMe（U AGC GGA UGC）XXX XXX CC（嘌呤霉素）3'。

补骨脂素C6 5'修饰是光敏感的，并且作用于通过UV交联在接头和mRNA之间产生共价键。2'OMe（U AGC GGA UGC）主链区域与mRNA上的FLAG序列3'的接头退火位点退火（参见图1）。在上文序列中，X指示“间隔区9”，可替代地称为三甘醇或PEG-150。这个间隔区已得到最优化，以提供用于嘌呤霉素***真核核糖体A位点内的柔性。CC包括标准DNA主链。嘌呤霉素3'修饰***核糖体A位点内，以在接头和新生肽之间产生稳定连接。关于本文描述的接头的消光系数是147.7 OD₂₆₀/μmole。因为这种接头是光敏感的，所以包含这种接头的溶液应被保护不受光。

对于文库选择的初始循环，推荐大规模连接反应（3.1 × 10¹⁵转录的RNA分子），以取样文库的整个多样性。这种RNA量可以设为确保足够模板置于翻译反应内，且产生~10 pmol功能mRNA展示分子。在随后循环中，RNA输入可以减少至0.5 nmol/选择。在示例性实施方案中，RNA连接反应可以包含下述组分：RNA、水、化学连接缓冲液和PEG6/嘌呤霉素接头（1mM）。在示例性实施方案中，总反应体积是100 μL。在优选实施方案中，接头/RNA摩尔比可以大于1.5。在一个实施方案中，反应中的最终接头浓度可以是约15 μM，并且反应中的RNA浓度范围可以为约3 – 10 μM（= 0.3 – 1 nmol RNA输入）。作为参考，1 mg/mL 的850 nt scFv RNA= 3.56 μM和可达到的最大限度连接浓度是3.16 μM（= 0.32 nmol）。

退火反应（这使接头与转录的RNA退火）可以在热循环仪中执行。在优选实施方案中，通过在约85℃温育样品30秒，随后在约4℃，可以执行退火反应，其中使用约0.3℃/秒的斜升速率。反应随后可以在4℃保持。

退火的接头/RNA的连接可以通过UV交联完成。这可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。在一个实施方案中，反应管可以置于手提式UV灯（长波长，约365 nm）中心上，并且交联约15分钟。制冷器包可以置于灯上，以帮助消散在UV照射过程中生成的热。一般连接效率是约50 – 90％，并且通常不需要纯化。连接产物可以贮存于-80℃。

9. 翻译反应

在示例性实施方案中，在所有反应和纯化后，约~0.1％输入RNA可以制备成mRNA展示分子。体外翻译可以使用本领域技术人员已知的方法和试剂进行。在一个实施方案中，使用scFv文库的翻译反应可以使用在约15 mL的反应体积中的约5 nmol RNA模板连同约10 mL网织红细胞裂解物。

在用于翻译反应的制备中，GSSG/GSH（氧化谷胱甘肽/还原谷胱甘肽）溶液可以以约100 mM GSSG/10 mM GSH的最终浓度制备。通过使PDI粉末溶解于dH₂O内可以制备PDI（蛋白质二硫键异构酶），以达到约1单位/μL的浓度。PDI溶液可以贮存于-20℃。

示例性翻译反应可以如下设立：

翻译反应在30℃水浴中温育1 – 2小时。当翻译体积超过1.5 mL时，观察到RNA/蛋白质融合物得率中的显著降低。因此，如果反应体积将大于1.5 mL，那么可以制备翻译反应的主混合物，然后将其分成更小等分试样。

10. RNA/蛋白质融合物形成

在翻译反应后，对于每300μL翻译反应混合物，可以添加约100 μL 2M KCl和约20 μL 1M MgCl₂，并且在室温温育1小时。这使在mRNA模板末端上的中止的核糖体稳定，并且允许在DNA接头的末端上的嘌呤霉素进入中止的核糖体的A位点，这使翻译的scFv蛋白质与其mRNA模板永久连接。如果反应将在-20℃贮存过夜，那么室温温育可以缩短。反应可以通过添加50 μL 0.5 M EDTA以破坏核糖体得到终止。反应可以贮存于-20℃。可以取出5 μL等分试样用于随后闪烁计数。

11. 通过寡脱氧胸苷酸纤维素的RNA/蛋白质融合物纯化

这个步骤从翻译/融合反应中纯化mRNA展示分子和剩余的RNA模板。对于寡脱氧胸苷酸结合，可以估计捕获所有RNA模板所需的预洗涤的寡脱氧胸苷酸纤维素量。足够体积的寡脱氧胸苷酸结合缓冲液可以添加到融合反应，以达到约1X最终浓度。随后可以添加预洗涤的寡脱氧胸苷酸纤维素，并且使反应在4℃执行1小时。反应可以任选在4℃以约1500 rpm离心5分钟，并且弃去上清液。可以转移寡脱氧胸苷酸纤维素珠，并且使用旋转柱，用1X寡脱氧胸苷酸结合缓冲液洗涤约6次，并且缓冲液一般可以通过使柱以约1000 rpm旋转10秒去除。可以弃去流通物（flow-through），但可以保存末次洗涤用于闪烁计数。通过将dH₂O添加到珠中且在室温温育5分钟，可以洗脱mRNA展示分子（和游离RNA模板）。通过以约4000 rpm旋转20秒可以收集洗脱物。洗脱一般可以重复1次，且组合洗脱物。可以取出5 μL洗脱物用于闪烁计数。还可以通过在NanoDrop分光光度计机器（NanoDrop Technologies，Wilmington，DE）上在260 nm的OD（OD₂₆₀）评估寡脱氧胸苷酸纯化的效率。所有剩余的RNA模板和mRNA展示分子在理论上通过寡脱氧胸苷酸珠回收。5X FLAG结合缓冲液可以添加到洗脱物中，以达到约1X最终浓度。样品可以贮存于-80℃，如果未进行至下一个FLAG纯化步骤的话。

寡脱氧胸苷酸回收可以如下计算。计数约5μL输入（来自融合反应）、来自末次洗涤的100 μL、和5 μL输出（来自寡脱氧胸苷酸纯化的洗脱物）。末次洗涤用于评估洗涤程度，并且其他2个计数用于计算来自原始RNA模板输入的RNA/蛋白质融合物回收。RNA/蛋白质融合物得率（pmol）=（CPM_输出 × 体积_输出 × 5 μM × 体积_裂解物）/ [CPM_输入 × 体积_输入 ×（产物中的甲硫氨酸#）]。这个公式假定网织红细胞裂解物中的5μM甲硫氨酸浓度，并且计算中使用的所有体积表示为μL。对于较早的选择循环，mRNA展示分子的得率一般是0.5 – 2％，但在随后循环中可以增加至10％。

12. 通过抗FLAG M2琼脂糖的RNA/蛋白质融合物纯化

这个步骤从剩余的RNA模板中纯化mRNA展示分子。可以估计捕获所有mRNA展示分子所需的预洗涤的抗FLAG M2琼脂糖珠的量。在一个实施方案中，珠的结合容量是约6 nmol融合蛋白/mL 50％浆。为了具有足够的珠体积用于在结合和洗涤过程中处理，不推荐使用小于200 μL预洗涤的珠。下文给出的例子用于初始300μL翻译反应。

对于FLAG纯化，宽口移液管管尖可以用于将300 μL预洗涤的抗FLAG M2琼脂糖转移至寡脱氧胸苷酸纯化的输出。混合物可以混合，并且通过在4℃旋转1小时进行温育。与抗FLAG M2琼脂糖温育可继续过夜。抗FLAG M2琼脂糖可以任选在4℃在离心机中以约1500 rpm旋转1分钟，并且可以弃去上清液。抗FLAG珠可以用1X FLAG结合缓冲液洗涤约5次，其中使用旋转柱和对于每次洗涤以约1000 rpm离心10秒。可以弃去流通物。通过以约1000 rpm离心10秒，珠可以另外用700 μL选择缓冲液（参见下文）洗涤2次。可以保存末次洗涤用于闪烁计数。通过添加约400 μL 100 μg/mL FLAG肽（在选择缓冲液中）且在室温温育5分钟，可以洗脱mRNA展示分子。洗脱物可以通过以约3000 rpm旋转20秒进行收集，且通过添加约400 μL 100 μg/mL FLAG肽，可以再洗脱一次。2种洗脱物可以组合，并且可以取出5 μL组合的洗脱物用于闪烁计数。这个体积的FLAG肽一般足以洗脱最高达约1 mL 50％浆，并且如果使用较少的浆和/或需要更高的RNA/蛋白质融合物浓度，那么可以减半（cut in half）（200 μL）。为了预防在贮存和抗原选择过程中的RNA降解，合适量的本领域已知的RNA酶抑制剂（即，1 – 2 U/μL RNaseOUT和0.02 μg/mL酵母tRNA）可以添加到纯化的mRNA展示文库中。如果不进行至下一个抗原选择步骤，那么将样品贮存于-80℃。

为了定量FLAG回收，可以在β计数器上计数约5 μL洗脱输出和来自末次洗涤的约100 μL。可以预期10-30％或更高的回收，并且可以根据下式进行计算：

PROfusion分子回收％=（CPM_输出 × 体积_输出）/（CPM_输入 × 体积_输入）。

13. 通过生物素化的抗原的文库选择

设计选择以富集与目的靶特异性结合的分子。可能需要阴性选择（预澄清），以去除非特异性和基质结合剂。依赖于靶形式，选择规程改变。下述是用于与生物素化的靶一起使用的示例性选择规程。这种规程可以进行修饰，以适应以其他形式的靶抗原，并且依赖于所需输出可以按比例扩大或缩小。

A. 在选择前的制备

链霉抗生物素蛋白（SA）磁珠可以用于捕获，并且一般在使用前预封闭。SA珠可以从原始瓶转移到1.5或2 mL管，并且用2 mL 1X FLAG结合缓冲液洗涤2次。珠随后可以用2 mL选择缓冲液在4℃伴随旋转封闭2小时到过夜。应制备足够珠用于预澄清和选择捕获。预封闭的珠贮存于4℃。约100 μL珠一般用于每10 pmol生物素化的抗原。

1.5 mL或2 mL微量离心（microfuge tube）管用1X FLAG结合缓冲液预封闭约1小时到过夜。预封闭的管可以用于所有预澄清和选择步骤。一般地需要4个管用于每个样品：2个用于预澄清，1个用于珠，并且1个用于选择。

最优结果可以通过使文库预澄清获得。FLAG纯化的mRNA展示文库可以添加到SA珠（与缓冲液分离）。SA珠的体积可以等于捕获体积一半。在使用磁体使预澄清的mRNA展示文库与SA珠分离前，总混合物可以在30℃伴随旋转温育30分钟。再重复一次这个预澄清步骤，并且第二次预澄清的SA珠可以如上文所述洗涤且计数，以测定本底是否高。这还可以充当‘无抗原’阴性对照。

B. 文库选择：结合

对于第一轮选择，生物素化的靶可以添加到（100 nM）整个预澄清的文库，并且在30℃伴随旋转温育1小时。对于随后的选择循环，当抗原结合分子的回收预期超过1％时，预澄清的文库可以分成2个相等等分试样。生物素化的抗原可以添加到一个等分试样，并且另一个充当‘无抗原’阴性对照。可替代地，洗涤的第二次预澄清珠也可以被视为‘无抗原’对照，如上所述，尽管这些珠将具有一次较少的‘预澄清’程序。当抗原结合分子的回收超过5％时，随后循环中的抗原浓度可能降低。

C. 文库选择：捕获

预封闭的SA珠（与缓冲液分离）可以添加到结合反应，并且在30℃伴随旋转温育5 – 10分钟。用于捕获的SA珠的量应基于容量和选择中使用的靶浓度进行计算（参见上文）。当降低靶浓度以避免SA珠结合剂时，SA珠的量应降低，但一般使用不小于50 μL的珠。

D. 文库选择：洗涤

SA珠可以使用磁体进行收集，并且可以用1 mL选择缓冲液洗涤1分钟。珠再次使用磁体进行收集，并且再洗涤约5次（总共约6次）。洗涤时间可以在随后循环中增加，以对一些靶掺入解离速率选择策略。珠可以用适合于逆转录的1 mL 1X缓冲液洗涤最后一次。用磁体收集珠，并且在水中重悬浮（上文计算的捕获珠体积的四分之一）。

E. 文库选择：计数和回收计算

从第3轮开始，计数约10 – 20％的末次洗涤和珠。一般仅计数小于100 μL珠，因为更多的珠可以猝灭计数。文库选择回收根据下式进行计算：

选择回收％= 100 × CPM_总珠 / CPM_总输入。

14. 通过RT-PCR再次扩增文库DNA

逆转录可以使用由文库捕获的材料执行。本领域已知的试剂和规程适合于执行逆转录反应。反应体积可以根据在选择后的珠体积按比例扩大或缩小。

用于逆转录的示例性引物显示于表3中，尽管可以使用本领域已知的方法设计另外引物。Cκ反向引物用于κ文库，CJL反向引物用于λ文库，并且Lib-GS-Rev用于人PBMC VH文库。

表3：适合于逆转录的示例性引物

示例性逆转录反应可以包含来自文库选择的珠（在水中）、约10 μM反向引物和约10 mM dNTP。反应在65℃温育5分钟，并且在冰上冷却。随后一般将第一链合成缓冲液、0.1M DTT和RNA酶抑制剂添加到反应中。在添加逆转录酶前，逆转录反应在42℃温育2分钟。反应随后在42℃伴随偶尔搅动温育50分钟，并且进一步在95℃温育5分钟。珠随后通过磁体进行收集，并且将上清液转移至新管，如果它来自相同选择输出，那么可以将其合并。使珠重悬浮于水中（一半RT体积），并且在管中在95℃温育5分钟。珠再次使用磁体进行收集，并且上清液与先前转移的上清液合并。这包含用于选择输出的PCR扩增的cDNA模板。

谱型分析PCR可以用于分析文库或其选择输出中的VH CDR3大小分布。它是评估文库多样性和选择进展的有用工具。初始少数轮文库选择输出和在选择前的文库应是非常多样的，并且CDR3大小分布近似高斯分布。示例性谱型分析PCR引物显示于表4中。

表4：示例性谱型分析PCR引物

示例性谱型分析PCR反应显示于下表5中，尽管反应组分可以用本领域已知的可比较试剂置换，并且可以调整反应体积以适应选择反应的规模。

表5：示例性谱型分析PCR反应

cDNA模板 2.0 μL

dH₂O 18.1μL

5X热稳定的DNA聚合酶反应缓冲液 6.0 μL

25 mM MgCl₂ 1.8 μL

10 mM dNTP 0.6 μL

5’正向引物（10 μM） 0.6 μL

3’反向引物（10 μM） 0.6 μL

热稳定的DNA聚合酶 0.3 μL

-----------------------------------------------------------------------

总体积 30.0 μL

本领域已知的热稳定的DNA聚合酶适合于这个反应。在示例性实施方案中，最终Mg²⁺浓度是1.5 mM。作为示例性热循环程序，反应在94℃温育2分钟，并且随后实施30个热循环，以延长DNA。对于每个循环，反应在94℃温育20秒，在55℃进行20秒，并且随后在72℃进行30秒。在30个循环后，反应进一步在72℃温育5分钟，并且随后贮存于4℃。在PCR后，将10μL PCR产物装载到2％琼脂糖凝胶上，以证实反应是成功的。反应和剩余的产物通过谱型分析电泳进行分析。

扩增的DNA产物具有下述组织：

5'-FR3（27 bp）–VH CDR3–FR4（35 bp）-3'。

VH CDR3大小可以由表观DNA产物大小推断。这可以使用下述计算通过Rox染料大小标记进行测定：

大小_VH CDR3 =（Size-_{表观DNA产物大小}– 60）/ 3

其中60 =（62_{在2个末端上的构架} – 1_{3’ A突出端}+ 3_{DNA标记低估}）。

15. 用于文库DNA模板扩增的PCR

对于来自第一轮和第二轮的选择输出，cDNA（来自RT反应的上清液）可以针对水进行透析，其中使用8 kDa截止，并且完整量的cDNA可以用作PCR模板。对于来自后续循环的选择输出，10％cDNA用作用于PCR的模板，并且透析一般不是必需的。示例性扩增引物显示于表6中。

表6：扩增引物

用于文库DNA模板扩增的示例性PCR反应显示于下表7中。

表7：用于文库DNA模板扩增的示例性PCR反应

在示例性实施方案中，1 mL PCR反应用于第1和2轮输出，并且0.5 mL反应用于来自后面循环的输出。应由主混合物制备100μL反应的等分试样。用于文库DNA模板扩增的示例性热循环条件显示于下表8中。

表8：用于文库DNA模板扩增的热循环条件

*注：25个循环一般给出足够扩增，但它可以增至多达35个循环以获得更多产物。对于另外扩增循环，各种大小的非特异性产物可以变得更明显，并且产物可能需要进行凝胶纯化。若可能，则增加DNA模板输入而不是扩增循环数目可能是有帮助的。

在PCR后，将5 - 10 μL产物装载到具有合适DNA大小标记的1.2％琼脂糖凝胶上，以检查结果。如果产物是正确大小（对于scFv ~850 bp，对于VH或VL文库~500 bp），并且具有最低限度非特异性产物，那么它们可以直接用于下一轮转录反应中。产物可能需要进行凝胶纯化。如果将对于PCR产物进行凝胶纯化，那么在制备型琼脂糖凝胶上分离所有剩余的产物，并且可以切出包含产物的特异性条带用于凝胶提取。凝胶纯化的DNA的定量可能是易误解的，这是因为DNA中的残留EtBr趋于干扰UV吸光度。在凝胶提取过程中更强烈的洗涤步骤可以帮助减轻这种干扰。若可能，则DNA浓度应在分光光度计上进行测量，这是因为UV扫描痕量在干净的DNA样品和具有残留的EtBr的DNA之间是非常不同的。随后重复这种规程以进行多轮选择。

16. 示例性试剂和缓冲液组成

10X化学连接缓冲液

Tris，pH 7 250 mM

NaCl 1 M

寡脱氧胸苷酸结合缓冲液 1X 2X 3X

Tris，pH 8 100 200 300 mM

NaCl 1 2 3 M

Triton X-100 0.05 0.1 0.15％

FLAG结合缓冲液 1X 5X

基于磷酸盐的缓冲液

PBS 1X 5X

Triton X-100 0.025 0.125％

可替代的基于HEPES的缓冲液

HEPES 50 250 mM

NaCl 150 750 mM

Triton X-100 0.025 0.125％

选择缓冲液

基于磷酸盐的缓冲液

PBS 1X

BSA 1 mg/mL

鲑精DNA 0.1 mg/mL

Triton X-100 0.025％

酵母tRNA（任选的，在使用前添加） 20 ng/mL

可替代的基于HEPES的缓冲液

HEPES 50 mM

NaCl 150 mM

BSA 1 mg/mL

鲑精DNA 0.1 mg/mL

Triton X-100 0.025％

酵母tRNA（任选的，在使用前添加） 20 ng/mL

第一链缓冲液

Tris-HCl，pH 8.3 250 mM

KCl 375 mM

MgCl₂ 15 mM

50X FLAG母液

FLAG肽 25 mg

选择缓冲液 5 mL

制备1 mL等分试样且贮存于-20℃。

FLAG洗脱缓冲液

50X FLAG母液 1 mL

选择缓冲液 49 mL

制备1 mL等分试样且贮存于-20℃

寡脱氧胸苷酸纤维素制剂

可将2.5 g寡脱氧胸苷酸纤维素转移到50 mL管内，且与25 mL 0.1 N NaOH混合。混合物可以以1500 rpm离心3分钟，且弃去上清液。随后可以用25 mL 1X寡脱氧胸苷酸结合缓冲液洗涤寡脱氧胸苷酸纤维素，并且以1500 rpm离心3分钟。可以弃去上清液。洗涤步骤可以再重复3次，并且测量上清液的pH。pH应与洗涤缓冲液相同（~ pH 8.5）。通过添加1X寡脱氧胸苷酸结合缓冲液，可以使寡脱氧胸苷酸纤维素重悬浮至25 mL的最终体积，以制备约50％浆，并且贮存于4℃。最终浓度 = 100 mg/mL = 1 nmol RNA容量。

抗FLAG M2琼脂糖制剂

25 mL M2琼脂糖珠可以转移到50 mL管内，并且在Beckman离心机（Beckman Coulter，Fullerton，CA）中以1000 rpm离心5分钟。可以通过抽吸去除上清液。所得到的珠可以重悬浮，在等体积的10 mM甘氨酸（pH 3.5）中洗涤，并且以1000 rpm离心5分钟。再次通过抽吸去除上清液。用1柱体积的1X FLAG结合缓冲液使珠重悬浮，并且以1000 rpm离心5分钟。通过抽吸去除上清液。这个洗涤步骤可以重复3次，并且用1柱体积的1X结合缓冲液（包含1 mg/mL BSA和100 mg/mL鲑精DNA）使珠重悬浮。混合物可以在4℃旋转1小时或过夜，并且若需要则分成2 mL级分的等分试样，并且保持在4℃。

实施例2

功能mRNA-scFv分子的证实

4种抗体用于证实功能mRNA-scFv分子可以展示且与其各自抗原结合：D2E7（人抗hTNF）、Y61（人抗hIL-12）、17/9（小鼠抗HA）和MAK195（小鼠抗hTNF）。使用表9中的下述引物，通过PCR生成MAK195 scFv。

表9：用于构建MAK195 mRNA-scFv构建体的寡核苷酸引物

基于由NCBI的数据库下载的蛋白质序列A31790和B31790（参见下表10），使用下述引物，通过PCR生成抗HA 17/9 scFv（参见Schulze-Gahmen等人（1993）J. Mol. Biol. 234（4）：1098-118）。

表10：用于构建17/9 mRNA-scFv构建体的寡核苷酸引物

17/9抗体序列使用登记号A31790和B31790从NCBI数据库中检索。

关于这些scFv的DNA构建体在体外转录，并且随后在兔网织红细胞裂解物中翻译为mRNA-scFv（蛋白质经由具有嘌呤霉素修饰的接头与mRNA附着）或游离scFv（蛋白质不与mRNA附着）。纯化2种类型的分子且通过相应生物素化的抗原实施拉下（pull-down）测定（参见图4）。

图4中的数据显示功能mRNA-scFv（与生物素化的抗原结合）分子通过链霉抗生物素蛋白-磁珠拉下，尽管以比游离scFv分子更低的百分比回收。进一步的实验显示这种差异仅仅是由于与scFv栓系的大RNA分子。来自mRNA-scFv分子的RNA部分的RNA酶降解使通过抗原的scFv回收恢复至与游离scFv分子的那种相同的水平（参见图5）。

实施例3

mRNA-scFv文库构建

来自18个供体的人外周血单核细胞（PBMC）得自SeraCare。下表11显示了通过荧光激活细胞分选（FACS）法的PBMC分析。随后提取聚腺苷酸RNA用于文库构建。

表11：通过FACS的PBMC分析

实施例4

文库标记选择

选择4个8碱基对标记（SEQ ID NOs：39-42），并且将其***17/9 mRNA-scFv构建体的TMV-UTR和Kozak共有序列之间（参见图6）。标记序列设计为不包括腺苷且在3轮选择后鉴定。如图6中可见，第一个位置优选G，并且第二个位置优选T。通过设计在5’UTR的TMV和Kozak共有序列之间具有8个随机（B=G、C、T）核苷酸***的5'引物生成随机序列标记（参见图7）。随后扩增17/9 scFv，并且通过2-3轮选择进行选择，其中后续循环用5'引物再扩增。随后处理序列输出，以鉴定经过选择过程的标记。来自每个循环的不同输出标记显示于图8中。一些重复序列在每个循环内部可见，然而，标记序列在多个循环中不可见。应当指出在第2轮中在标记中存在一个可能突变，因为ATG序列在标记序列中应是不可能的。

实施例5

关于17/9 scFv的文库选择

为了证实mRNA-scFv分子可以使用本文描述的mRNA展示方法通过几轮选择进行富集，通过重叠PCR法构建具有多样性25的scFv文库。为了生成scFv文库，如上所述使用17/9、D2E7、2SD4、Y61和MAK195的VH和VL片段。随后通过生物素化的HA标记从这种文库中选择17/9 scFv。在选择后，通过克隆和集落PCR检查17/9富集。定量在一轮mRNA-scFv选择前和后的17/9 scFv的结果显示于图9中。

实施例6

mRNA展示技术用于区别具有不同亲和力的scFv结合剂

为了测定mRNA展示技术即如上所述是否用于区别具有不同亲和力的scFv结合剂，制备在D2E7和2SD4之间的嵌合体。2SD4是对于TNFα显示出低亲和力（KD ~ 200 nM作为游离蛋白质）的D2E7 scFv前体。图10描述了嵌合体。

对于游离蛋白质执行滴定。图11显示在不同嵌合体之间在抗原结合后的回收百分比，以及在抗原选择后标准化的回收百分比。上述结果显示如本文描述的mRNA展示技术可以用于区别具有不同亲和力的结合剂。

实施例7

mRNA-scFv分子的热稳定性

为了测定mRNA-scFv分子的热稳定性，D2E7-scCk和Y61-scCk以mRNA-scFv形式翻译且纯化，如本文描述的。mRNA-scFv分子随后在抗原选择前在不同温度温育30分钟。在抗原选择后标准化的回收百分比显示于图12中。

图13显示了RNA可以在mRNA-scFv分子的高温处理后回收。此处，在具有回收的Y61-scCl mRNA-scFv分子的珠上执行RT-PCR。

实施例8

由人PBMC RNA构建首次用于实验的κPROfusion scFv文库

下述实施例描述了使用PROfusion技术生成适合于选择的人首次用于实验的κscFv文库。

人外周血单核细胞（PBMCs）购自SeraCare（Milford，MA，目录# 72000）。来自不同供体的细胞通过用抗人CD20-FITC（BD Pharmingen，San Diego，CA，目录# 556632）和抗人CD27-PE（BD Pharmingen，目录# 555441）抗体染色进行表征。根据制造商的规程，使用RNeasy Midi Kit（QIAGEN，Valencia，CA，目录# 75144）从PBMCs中分离总RNA。简言之，使冷冻的细胞在37℃快速解冻，重悬浮于含有异硫氰酸胍的缓冲液中，并且通过多次经过21G针进行匀浆。添加乙醇，并且将裂解物应用于RNeasy midi柱（总共18个柱）。洗涤柱，并且用无RNA酶水洗脱总RNA。通过测量OD 260 nm吸光度来测定RNA浓度和得率。随后使用Invitrogen Fastrack MAG Maxi mRNA Isolation kit（目录#K1580-02），根据试剂盒手册从总RNA中分离mRNA。在程序过程中添加RNA酶抑制剂（Invitrogen ，Carlsbad，CA，目录#10777-019），以使RNA降解降到最低。首先用DNA酶（Invitrogen，目录#18-68-015）处理总RNA，以使基因组DNA污染降到最低。简言之，首先洗涤寡脱氧胸苷酸磁珠，并且随后添加到总RNA中，在65℃温育10分钟，并且随后允许在室温结合30分钟。使珠洗涤几次，并且通过无RNA酶水洗脱结合的mRNA。通过测量OD₂₆₀ nm吸光度来定量mRNA。

逆转录

随后根据制造商的规程，通过SuperScript II Reverse Transcriptase（Invitrogen，Carlsbad，CA，目录# 18064-014）和15种引物的混合物（100 nM总浓度）（表12），由37 μg mRNA合成第一链cDNA。反应以各0.9 ml的2个等分试样完成。通过经过36 MicroSpin S-200 HR柱（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，目录# 27-5120-01）（50 μl/柱）纯化RT反应（1.8 ml总体积）。使柱洗脱物与RNA酶H在37℃温育20分钟。

表12 逆转录引物

VH cDNA扩增

在包含VH前导序列（LS）特异性正向引物（200 nM总浓度）的混合物和JH特异性反向引物（200 nM总浓度）的混合物的反应中（表13），通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，目录# 11304-102），对三分之一的上述RT反应实施限制性扩增。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（60秒）的10个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。随后根据制造商的规程，通过QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN，Valencia，CA，目录# 28106）纯化PCR产物。小规模预实验证实cDNA的至少100倍扩增。

表13 用于VH片段扩增的引物

1/100的纯化PCR产物用作模板用于扩增每种VH家族特异性cDNA。在包含个别VH LS特异性正向引物（200 nM）和JH特异性反向引物（200 nM总浓度）的混合物的反应中（表13），通过PCR用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）执行扩增。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（40秒）的25个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

随后根据制造商的规程，通过QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN，Valencia，CA）纯化上述PCR产物。随后在包含相应VH特异性嵌套正向引物（200 nM）和JH特异性反向引物（200 nM总浓度）的混合物的PCR反应中（表14），通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）扩增每种PCR产物。每次反应中的正向引物携带8核苷酸“标记”（有下划线的），其被引入以增加后续文库扩增过程中的特异性。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（40秒）的25个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

表14 用于嵌套式VH特异性PCR的引物

对PCR产物实施1％琼脂糖凝胶电泳，并且通过QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，Valencia，CA，目录# 28704）纯化。通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）和200 nM下述通用引物，在PCR反应中以大规模进一步扩增这些PCR产物的等分试样：

。

这些引物给PCR产物的5'末端添加T7启动子和TMV-UTR序列，且给PCR产物的3'末端添加部分甘氨酸-丝氨酸（G4S）接头。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（40秒）的26个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN，Valencia，CA）纯化PCR产物，通过在260 nm下的UV吸光度定量，并且通过1％琼脂糖凝胶电泳显现这些产物的等分试样，以证实纯度。使用TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen，目录# 45-0641）克隆VH家族特异性cDNA片段的等分试样，并且通过测序分析个别克隆。

Vκ cDNA扩增

在包含Vκ前导序列（LS）特异性正向引物（总浓度200 nM）和Cκ特异性反向引物（200 nM）的混合物的反应中（表15），通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA），对由前述RT反应生成的三分之一cDNA实施限制性扩增。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（60秒）的10个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。分开的小规模实验证实cDNA通过此种PCR的10 - 100倍扩增。

根据制造商的规程，用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN，Valencia，CA,）纯化PCR产物。1/500的纯化PCR产物用作模板用于扩增每种Vκ家族特异性cDNA。在包含个别Vκ LS特异性正向引物（200 nM）和Cκ特异性反向引物（200 nM）的反应中（表16），通过PCR用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）完成扩增。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（40秒）的25个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

表15 用于Vκ片段扩增的引物

表16 用于嵌套式Vκ特异性PCR的引物

根据制造商的规程，用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）纯化PCR产物。随后在包含相应Vκ特异性嵌套正向引物（200 nM）和Cκ特异性反向引物（200 nM）的PCR反应中（表13），通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）扩增每种PCR产物。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（40秒）的25个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

对PCR产物实施1％琼脂糖凝胶电泳，并且通过QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，Valencia，CA）纯化。在包含Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）和下述通用引物（200 nM）的PCR反应中，以大规模进一步扩增这些PCR产物的等分试样：

。

这些引物给PCR产物的5'末端添加部分G4S-接头，且给所得到的PCR产物的3'末端添加FLAG标记、接头退火位点和聚腺苷酸尾。

PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（30秒）的26个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN，Valencia，CA）纯化PCR产物，通过在260 nm下的UV吸光度定量，并且通过1％琼脂糖凝胶电泳显现这些产物的等分试样，以证实纯度。使用TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen，目录# 45-0641）克隆所得到的Vκ家族特异性cDNA片段的部分，并且通过测序分析个别克隆。

VH-Vκ scFv构建

根据每个家族中的种系数目混合VH和Vκ cDNA片段（表17和18）。

表17 VH片段的混合比

表18 关于Vκ片段的混合比

总共10 μg VH cDNA片段（2x10¹³分子）和总共10 μg Vκ cDNA片段（2x10¹³分子）用作模板用于重叠PCR。在30 ml的体积中，用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity以及引物T7TMVTag2（200 nM）和FlagA20Rev（200 nM）完成PCR。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（60秒）的17个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。使用TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen，目录# 45-0641）克隆PCR产物的等分试样，并且通过测序分析个别克隆。

谱型分析

分别与VH的构架3区和J区退火的荧光染料标记的5'正向引物（6-FAM-PanVHFR3-Fwd，5’-GACACGGCCGTGTATTACTGT-3’，SEQ ID NO：17）和反向引物（PanJH-Rev，5’-GCTGAGGAGACGGTGACC-3’，SEQ ID NO：18），用于通过PCR扩增跨越VH结构域的CDR3区。在包含200 nM 6-FAM-PanVHFR3-Fwd引物、200 nM PanJH-Rev引物、200 μM dNTP、1 x GoTaq缓冲液、和1.5 U GoTaq（Promega，Madison，WI）的30 μl反应体积中，使用50 ng scFv文库DNA模板。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和72℃（30秒）的30个循环；随后为5分钟的72℃延伸和4℃贮存步骤。在PCR后，将10μL产物装载到2％琼脂糖凝胶上，以证实成功反应，并且使用ABI测序仪（Applied Biosystems，Foster City，CA）对剩余的产物实施谱型分析电泳。通过从产物长度中扣除60 bp侧翼构架序列计算CDR3长度，所述产物长度通过ROX染料标记的DNA标记进行测定。

结果

人PBMC表征

通过流式细胞术就B（CD20⁺）和记忆B（CD27⁺）细胞预筛选来自20个供体的PBMC样品导致10个供体的选择（在PMBC中> 9 ％B和在总B细胞中< 35％记忆B细胞），并且允许供体年龄、性别和种族划分分布最优化至供体可用性的最优程度（图14）。

RNA纯化

为了获得抗体cDNA谱用于文库构建，从具有估计2.6 × 10⁸ B细胞的2.3 × 10⁹人PBMCs获得1.9 mg总RNA。来自总RNA的后续聚腺苷酸mRNA纯化获得42.2 μg mRNA。

VH cDNA片段的扩增

通过琼脂糖凝胶电泳显现通过VH通用引物（T7TMVTag2，SEQ ID NO：80和文库-GS-Rev，SEQ ID NO：16）扩增的~ 500 bp VH家族特异性cDNA片段的等分试样（图15）。

个别VH克隆的测序分析呈现于表19中。克隆的VH序列与已知VH种系序列的比较证实通过VH家族特异性引物的高特异性扩增。

Vκ片段的扩增

通过琼脂糖凝胶电泳显现用通用引物（文库-GS-Fwd，SEQ ID NO：94和FlagA20Rev，SEQ ID NO：95）扩增的Vκ家族特异性cDNA片段的等分试样（图16）。个别Vκ克隆的测序分析呈现于表20中。数据证实对于Vκ种系家族各自的引物特异性。

表19 VH家族特异性PCR产物的测序分析

VH-Vκ scFv构建

执行重叠PCR，以构建VH-Vκ scFv cDNA片段。通过琼脂糖凝胶电泳显现所获得的产物的部分（图17）。所生成的VH-Vκ scFv片段具有通过PROfusion mRNA展示技术选择的所有必需元件（图17）。个别VH-Vκ scFv克隆的测序分析证实绝大多数具有功能性间插G4S接头的正确VH-Vκ重组。在构建的scFv文库中各种VH和Vκ家族的分布与先前文献报道一致（图18，还参见Tsuiji等人（2006）. Exp. Med.；V.203（2），第393–400页和Arons等人（2006）British Journal of Haematology V.133，第504-512页）。

表20 Vκ家族特异性PCR产物的测序分析

谱型分析

正好在其装配成scFv文库前，对VH cDNA片段执行在不同VH家族中的CDR3大小分布的谱型分析（图19）。如在具有高度多样性的cDNA文库中将预期的，观察到的CDR3大小在分析的所有家族中极大改变。观察到的不同CDR3大小的峰高度呈现正态分布特有的钟形曲线，并且指示非常大的群体大小。这在得自单个种系或非常小VH家族例如VH1-46、VH2、VH5和VH6的结果中尤其明显。指出不同VH家族中CDR3大小的轻微差异也是有趣的。例如，VH1和VH2趋于具有更多15-16个残基的CDR3s，而VH3具有更多13个残基的CDR3s。总之，个别VH家族的谱型分析证实在cDNA文库中的高多样和非常大VH序列。

随机取样8个scFv文库模板，并且如前所述实施谱型分析。得自所有8种样品的结果是不能区别的，从而暗示每个等分试样中的文库模板是可重现地相似的（图20）。文库VH CDR3大小具有正态分布，并且大多数介于6 – 24个残基之间，并且集中于13 – 16个残基之间。这个分布为如预期的并且与个别VH家族谱型分析结果一致。

结论

高质量人抗体前导的选择是关于成功的治疗用抗体药物开发的必要条件。除强选择技术外，抗体文库质量（来源、多样性和构建）极大地决定其产生良好前导的有用性。许多人供体就更大的多样性进行预筛选，并且设计具有极高特异性的PCR引物以覆盖所有抗体种系序列，从而使得可以捕获在供体集合内的所有多样性。构建的抗体scFv文库具有来自超过2× 10⁸ B细胞的大于2 × 10¹²的理论多样性，这已通过测序多个克隆且通过谱型分析加以证实。

实施例9

由人PBMC RNA构建首次用于实验的λPROfusion scFv文库

总RNA和mRNA纯化、mRNA逆转录和通过PCR的VH cDNA扩增已在实施例1中描述。

Vλ cDNA扩增

在包含Vλ前导序列（LS）特异性正向引物（总浓度200 nM）和Cλ特异性反向引物（200 nM）的混合物的反应中（表21），通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA），对由前述RT反应生成的三分之一cDNA实施限制性扩增。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（60秒）的10个循环；随后为5分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。分开的小规模实验证实cDNA通过此种PCR的10 - 100倍扩增。

表21 用于Vλ片段扩增的引物

根据制造商的规程，使用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）纯化PCR产物。1/250的纯化PCR产物用作模板用于扩增每种Vλ家族特异性cDNA。在包含个别Vλ LS特异性正向引物（200 nM）和Cλ特异性反向引物（200 nM）的反应中（表22），通过PCR用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）完成扩增。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（60秒）的35个循环；随后为5分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

表22 用于巢式Vλ特异性PCR的引物

根据制造商的规程，在2％琼脂糖凝胶上运行PCR产物，并且使用QuantumPrep FreezeNSqueeze Columns（Biorad，Hercules，CA）纯化。随后在包含相应Vλ特异性嵌套正向引物（200 nM）和Cλ特异性反向引物（200 nM）的PCR反应中（表13），通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）扩增每种PCR产物。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（60秒）的35个循环；随后为5分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

在2％琼脂糖凝胶上运行PCR产物，并且使用QuantumPrep FreezeNSqueeze Columns（Biorad，Hercules，CA）纯化。在包含Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）和下述通用引物（200 nM）的PCR反应中，以大规模进一步扩增这些PCR产物的等分试样：

。

这些引物给PCR产物的5'末端添加部分G4S-接头，且给所得到的PCR产物的3'末端添加FLAG标记、接头退火位点和聚腺苷酸尾。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（30秒）的35个循环；随后为5分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。使用Purelink PCR Purification Kit（Invitrogen，Carlsbad，CA）纯化PCR产物，通过在260 nm下的UV吸光度定量，并且通过2％琼脂糖凝胶电泳显现这些产物的等分试样，以证实纯度。

使用TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen，目录# 45-0641）克隆所得到的Vλ家族特异性cDNA片段的部分，并且通过测序分析个别克隆。

VH-Vλ scFv构建

根据由每种PCR产物表示的种系多样性混合VH和Vλ cDNA片段（表23和24）。

表23 VH片段的混合比

表24关于Vλ片段的混合比

总共10 μg VH cDNA片段（2x10¹³分子）和10 μg VλcDNA片段（2x10¹³分子）用作模板用于重叠PCR。在30 ml的体积中，用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity以及引物T7TMVTag2（200 nM）和FlagA20Rev（200 nM）完成PCR。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（60秒）的17个循环；随后为5分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。使用TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen，目录# 45-0641）克隆PCR产物的等分试样，并且通过测序分析个别克隆。

结果

Vλ片段的扩增

通过琼脂糖凝胶电泳显现用通用引物（文库-GS-Fwd和FlagA20Rev）扩增的Vλ家族特异性cDNA片段的等分试样（图21）。

个别Vλ克隆的测序分析呈现于表25中。数据证实对于Vλ种系家族各自的引物特异性，其中一个错配以粗体突出显示（VL1 LS3，种系V1-3）。

表25 Vλ家族特异性PCR产物的测序分析

VH-Vλ scFv构建

执行重叠PCR，以构建VH-Vλ scFv cDNA片段。通过琼脂糖凝胶电泳显现所获得的产物的部分（图22）。所生成的VH-Vλ scFv片段具有通过PROfusion mRNA展示技术选择的所有必需元件（图23）。

个别VH-Vλ scFv克隆的测序分析证实绝大多数具有功能性间插G4S接头的正确VH-Vλ重组。

实施例10

由人***mRNA构建首次用于实验的κ和λPROfusion scFv文库

这个实施例描述了由***mRNA生成PROfusion人首次用于实验的scFv文库（PBMCκ和PBMCλ）。

10.1逆转录

根据制造商的规程，通过SuperScript II Reverse Transcriptase（Invitrogen，目录# 18064-014）和15种引物的混合物（100 nM总浓度）（表12），由40 μg mRNA合成第一链cDNA。反应以各0.1 ml的16个等分试样完成。使RT反应合并（1.6 ml总体积），与20 μl RNA酶H在37℃温育20分钟，并且随后针对水透析。

10.2 PCR

10.2.1 VH cDNA扩增

在包含VH前导序列（LS）特异性正向引物（200 nM总浓度）的混合物和JH特异性反向引物（200 nM总浓度）的混合物的反应中（表13），通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，目录# 11304-102），对三分之一的上述RT反应实施限制性扩增。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（60秒）的10个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。随后根据制造商的规程，通过QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN，目录# 28106）纯化PCR产物。小规模预实验证实cDNA的至少10倍扩增。

将一半纯化的PCR产物分成7个相等等分试样，并且每个等分试样用作模板用于扩增VH家族特异性cDNA之一。在包含个别VH LS特异性正向引物（200 nM）和JH特异性反向引物（200 nM总浓度）的混合物的反应中（表13），通过PCR用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）执行扩增。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（40秒）的25个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

根据制造商的规程，通过QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）纯化上述PCR产物。随后在包含相应VH特异性嵌套正向引物（200 nM）和JH特异性反向引物（200 nM总浓度）的混合物的PCR反应中（表26），通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）扩增每种PCR产物。每次反应中的正向引物携带8核苷酸“标记”（有下划线的），其被引入以增加后续文库扩增过程中的特异性。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（40秒）的25个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

对PCR产物实施1％琼脂糖凝胶电泳，并且通过QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，目录# 28704）纯化。通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）和200 nM通用引物（T7TMVTag4s和Lib-GSv2-Rev），在PCR反应中以大规模进一步扩增这些PCR产物的等分试样。这些引物给PCR产物的5'末端添加T7启动子和TMV-UTR序列，且给PCR产物的3'末端添加部分甘氨酸-丝氨酸（G4S）接头。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（40秒）的25个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）纯化PCR产物，通过在260 nm下的UV吸光度定量，并且通过1％琼脂糖凝胶电泳显现这些产物的等分试样，以证实纯度。使用TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen，目录# 45-0641）克隆VH家族特异性cDNA片段的等分试样，并且通过测序分析个别克隆。

表26 用于嵌套式VH特异性PCR的引物

10.2.2 Vκ cDNA扩增

在包含Vκ前导序列（LS）特异性正向引物（总浓度200 nM）和Cκ特异性反向引物（200 nM）的混合物的反应中（表15），通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA），对由前述RT反应生成的三分之一cDNA实施限制性扩增。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（60秒）的10个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。分开的小规模实验证实cDNA通过此种PCR的最高达10倍扩增。

根据制造商的规程，用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）纯化PCR产物。将一半纯化的PCR产物分成6个相等等分试样，并且每个等分试样用作模板用于扩增个别Vκ家族特异性cDNA。在包含个别Vκ LS特异性正向引物（200 nM）和Cκ特异性反向引物（200 nM）的反应中（表15），通过PCR用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）完成扩增。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（40秒）的25个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

根据制造商的规程，对PCR产物实施1％琼脂糖凝胶电泳，并且用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）纯化。随后在包含相应Vκ特异性嵌套正向引物（200 nM）和Cκ特异性反向引物（200 nM）的PCR反应中（表27），通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）扩增每种PCR产物。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（40秒）的25个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

在包含Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）和200 nM通用引物（Lib-GSv2-Fwd和CKReverse）的PCR反应中，以大规模进一步扩增这些PCR产物的等分试样。

引物Lib-GSv2-Fwd在Vκ上游添加部分G4S-接头。编码G4S-接头的通用引物的序列（Lib-GSv2-Fwd和Lib-GSv2-Rev）由用于人PBMC文库构建的引物的那种（文库-GS-正向和文库-GS-反向）进行修饰。完成这种修饰以避免与VH3家族种系的构架1退火的引物文库-GS-反向的交叉引发问题，这产生截短的VH序列。

表27 用于嵌套式Vκ特异性PCR的引物

PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（40秒）的25个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）纯化PCR产物，通过在260 nm下的UV吸光度定量，并且通过1％琼脂糖凝胶电泳显现这些产物的等分试样，以证实纯度。使用TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen，目录# 45-0641）克隆所得到的Vκ家族特异性cDNA片段的部分，并且通过测序分析个别克隆。

10.2.3 Vλ cDNA扩增

在包含Vλ前导序列（LS）特异性正向引物（总浓度200 nM）和Cλ特异性反向引物（200 nM）的混合物的反应中（表21），通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA），对由前述RT反应生成的三分之一cDNA实施限制性扩增。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（40秒）的10个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。分开的小规模实验证实cDNA通过此种PCR的最高达10倍扩增。

根据制造商的规程，使用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）纯化PCR产物。将一半纯化的PCR产物分成16个相等等分试样，并且每个等分试样用作模板用于扩增个别Vλ家族特异性cDNA。在包含个别Vλ LS特异性正向引物（200 nM）和Cλ特异性反向引物（200 nM）的反应中（表21），通过PCR用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）完成扩增。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（40秒）的30个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

根据制造商的规程，用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）纯化PCR产物。在后续扩增前合并下述片段：VL-1 LS-1和VL1 LS-3片段以3:2比合并成VL1 LS混合物片段；VL-2 LS-3和VL2 LS-4片段以3:2比合并成VL2 LS混合物片段；VL3 LS-2、VL3 LS-3、VL3 LS-4和VL3 LS-5片段以1:6:1:1比合并成VL3 LS混合物片段。随后在包含相应Vλ特异性嵌套正向引物（200 nM）和Cλ特异性反向引物（200 nM）的PCR反应中（表22），通过Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）扩增对应于个别家族的PCR产物。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（40秒）的25个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

对PCR产物实施1％琼脂糖凝胶电泳，并且通过QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）纯化。在包含Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity（Invitrogen，Carlsbad，CA）和200 nM通用引物（Lib-GSv2-Fwd和CJLReverse）的PCR反应中，以大规模进一步扩增这些PCR产物的等分试样。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（30秒）、55℃（30秒）和68℃（30秒）的25个循环；随后为5分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。

用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN）纯化PCR产物，通过在260 nm下的UV吸光度定量，并且通过1％琼脂糖凝胶电泳显现这些产物的等分试样，以证实纯度。先前证实了VL家族特异性引物的特异性。

10.2.4 VH-Vκ scFv构建

根据每个家族中的种系数目混合VH和Vκ cDNA片段（基于NCBI）（表17和18）

总共10 μg VH cDNA片段（2 × 10¹³分子）和总共10 μg Vκ cDNA片段（2 × 10¹³分子）用作模板用于重叠PCR。在30 ml的体积中，用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity以及引物T7TMVUTR（200 nM）和Cκ5-FlagA20 Rev（200 nM）完成PCR，具有下述步骤：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（60秒）的12个循环；随后为3分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。使用TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen，目录# 45-0641）克隆PCR产物的等分试样，并且通过测序分析个别克隆。

。

引物Ck5-FlagA20 Rev在PCR产物的3'末端上添加聚腺苷酸尾。因此，序列用于PROfusion分子的寡脱氧胸苷酸纯化。

10.2.5 VH-Vλ scFv构建

根据由每种PCR产物表示的种系多样性混合VH和Vλ cDNA片段（表18和28）。总共10 μg VH cDNA片段（2 × 10¹³分子）和10 μg VλcDNA片段（2 × 10¹³分子）用作模板用于重叠PCR。在30 ml的体积中，用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity以及引物T7TMVUTR（200 nM）和CL5 FlagA20（200 nM）完成PCR。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和68℃（60秒）的10个循环；随后为5分钟的68℃延伸和4℃贮存步骤。使用TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen，目录# 45-0641）克隆PCR产物的等分试样，并且通过测序分析个别克隆。

表28 关于Vλ片段的混合比

引物CL5-FlagA20在PCR产物的3'末端上添加聚腺苷酸尾。因此，序列用于PROfusion分子的寡脱氧胸苷酸纯化。

10.3谱型分析

分别与VH的构架3区和J区退火的荧光染料标记的5'正向引物（6-FAM-PanVHFR3-Fwd，5’-GACACGGCCGTGTATTACTGT-3’，SEQ ID NO：17）和反向引物（PanJH-Rev，5’-GCTGAGGAGACGGTGACC-3’，SEQ ID NO：18），用于通过PCR扩增跨越VH结构域的CDR3区。在包含200 nM 6-FAM-PanVHFR3-Fwd引物、200 nM PanJH-Rev引物、200 μM dNTP、1 x GoTaq缓冲液、和1.5 U GoTaq（Promega，Madison，WI）的30 μl反应体积中，使用50 ng scFv文库DNA模板。PCR条件如下：初始2分钟的94℃变性；94℃（20秒）、55℃（20秒）和72℃（30秒）的30个循环；随后为5分钟的72℃延伸和4℃贮存步骤。在PCR后，将10μL产物装载到2％琼脂糖凝胶上，以证实成功反应，并且使用ABI测序仪对剩余的产物实施谱型分析电泳。通过从产物长度中扣除60 bp侧翼构架序列计算CDR3长度，所述产物长度通过ROX染料标记的DNA标记进行测定。

结果

PROfusion ScFv文库构建的概述

表示PROfusion文库构建中的不同步骤的流程图呈现于图24中。

VH cDNA片段的扩增

通过琼脂糖凝胶电泳显现通过VH通用引物（T7TMVUTR和Lib-GSv2-Rev）扩增的VH家族特异性cDNA片段（~ 500 bp）的等分试样（图25）。VH家族特异性引物的特异性先前已进行测试，并且对于扩增具有大量种系的家族的引物再次得到证实（表29）。

Vκ片段的扩增

通过琼脂糖凝胶电泳显现用通用引物（Lib-GSv2-Fwd:和CK反向）扩增的Vκ家族特异性cDNA片段的等分试样（图26）。Vκ家族特异性引物的特异性先前已进行测试，并且再对于扩增具有大量种系的家族的引物再次得到证实（表30）。

表29 VH家族特异性PCR产物的测序分析

表30 Vκ家族特异性PCR产物的测序分析

Vλ片段的扩增

通过琼脂糖凝胶电泳显现用通用引物（Lib-GSv2-Fwd，SEQ ID NO：140,和CJL反向，SEQ ID NO：15）扩增的Vλ家族特异性cDNA片段的等分试样（图27）。先前测试了Vλ家族特异性引物的特异性。

VH-Vκ和VH-Vλ scFv构建

执行重叠PCR，以构建VH-Vκ和VH-Vλ scFv cDNA片段。通过琼脂糖凝胶电泳显现所获得的产物的部分（图27）。所生成的VH-Vκ和VH-Vλ scFv片段具有通过PROfusion mRNA展示技术选择的所有必需元件（图28）。

个别VH-Vκ和VH-Vλ scFv克隆的测序分析证实绝大多数克隆中具有功能性间插G4S接头的正确VH-Vκ和VH-Vλ重组。在构建的scFv文库中各种VH和Vκ和Vλ家族的分布与先前文献报道一致（图29，图30，还参见Tsuiji等人（2006）. Exp. Med.；V.203（2），第393–400页和Arons等人（2006）British Journal of Haematology V.133，第504-512页）。

谱型分析

对通过逆转录用反向引物的混合物由***RNA获得的cDNA（参见10.1）、对正好在其装配成scFv文库前VH DNA片段的混合物、和对最终VH-Vκ和VH-Vλ scFv片段，执行VH CDR3大小分布的谱型分析（图31）。如在具有高度多样性的cDNA文库中将预期的，观察到的CDR3大小具有正态分布，并且大多数介于6 – 22个残基之间，并且集中于11 – 14个残基之间。

结论

高质量人抗体前导的选择是关于成功的治疗用抗体药物开发的必要条件。除强选择技术外，抗体文库质量（来源、多样性和构建）极大地决定其产生良好前导的有用性。在本发明中，来自多个供体的mRNA用于增加文库多样性，并且设计高度特异性PCR引物以覆盖所有抗体种系序列，从而使得可以捕获在供体集合内的所有多样性。分开构建VH-Vκ和VH-Vλ scFv文库，以增加选择来自相同RNA来源的多种抗体前导的机会。通过谱型分析且通过测序多个克隆证实2个文库的大多样性。2个文库都用于针对不同靶的PROfusion mRNA展示选择。

实施例11

用于PROfusion构建体的测序引物

这个实施例提供了用于PROfusion构建体的测序引物。

用于所有scFv和VH文库的正向引物：

用于所有Vκ和Vλ文库的正向引物：

用于所有κscFv和Vκ文库的反向引物：

用于所有λscFv和Vλ文库的反向引物：

用于所有VH文库的反向引物：

在逆转录中用于合成第一链cDNA的引物：

用于VH片段扩增的引物：

用于嵌套式VH特异性PCR的引物：

用于Vκ片段扩增的引物：

文库Gly-Ser重叠引物：

用于Vλ片段扩增的引物：

用于嵌套式VH特异性PCR的引物：

用于Vλ片段扩增的引物：

制备具有Cμ间隔区的VH结构域文库的引物：

Vκ引物：

FLAG hCk引物：

VL引物：

VH引物Tag3：

VL引物：

文库GlySer接头v2：

文库GS Fwd：

文库GS Rev：

在PCR过程中的重叠

用于人扁桃体文库的具有新标记的引物

用于人骨髓文库的具有新标记的引物

再扩增Tag5 正向引物

引入作为参考

在本申请自始至终可以引用的所有引用的参考文献（包括文献参考、专利、专利申请和网站）的内容都在此特别整体引入作为参考，其中引用的参考文献也如此。除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域众所周知的免疫学、分子生物学和细胞生物学的常规技术。

等同方案

本发明可以在不背离其精神或基本特征的情况下以其他具体形式体现。前述实施方案因此在所有方面视为本文描述的本发明的举例说明而不是限制。本发明的范围因此由附加权利要求而不是前述说明书指出，并且因此预期在本文中包含在权利要求等同的含义和范围内的所有改变。