CN102224155A

CN102224155A - 蛋白酶抑制剂

Info

Publication number: CN102224155A
Application number: CN2009801480408A
Authority: CN
Inventors: V·伊瓦诺夫; B·塞缪尔森; P-O·约翰逊; P·坎伯格; H·维林
Original assignee: Medivir AB
Current assignee: Medivir AB
Priority date: 2008-09-24
Filing date: 2009-09-24
Publication date: 2011-10-19
Also published as: GB0817425D0; AU2009295899A1; BRPI0919073A2; EP2350089A1; KR20110059657A; WO2010034789A1; EA201170480A1; JP2012503626A; CA2738025A1

Abstract

式II化合物：其中R³为C₁-C₃烷基或C₃-C₆环烷基，两者中任一个任选被一个或两个甲基和/或被氟、三氟甲基或甲氧基取代，其中当R³为C₃-C₆环烷基时，作为选择它可被氟偕取代；R⁴为甲基或氟；m为0、1或2；E为化学键、或任选被甲基或氟取代的噻唑基；A₁为CH或N，A₂为CR⁶R⁷或NR⁶，条件是至少A₁和A₂之一包含N；n为0或1，使得含有A₁和A₂的环为5或6个环原子的饱和含氮环；R⁶为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄卤代烷基、C₁-C₃烷基-O-C₁-C₃烷基，或当A₂为C时，R⁶还可以为C₁-C₄烷氧基或F；R⁷为H、C₁-C₄烷基或F；或其药学上可接受的盐、N-氧化物或水合物，在治疗特征为组织蛋白酶K的不当表达或激活的疾病例如骨质疏松症、骨关节炎、风湿性关节炎或骨转移中有效。

Description

蛋白酶抑制剂

发明领域

本发明涉及半胱氨酸蛋白酶的抑制剂、特别是木瓜蛋白酶超家族的抑制剂。本发明提供可用于预防或治疗由生理蛋白酶例如组织蛋白酶K不平衡引起的疾病的新化合物。

相关技术的描述

半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族在包括哺乳动物、无脊椎动物、原生动物、植物及细菌的不同物种中广泛分布。一些哺乳动物的组织蛋白酶、包括组织蛋白酶B、F、H、K、L、O和S，已被归于该超家族，在一些代谢障碍中涉及其活性的不当调节，所述代谢障碍包括关节炎、肌肉萎缩症、炎症、肾小球性肾炎和肿瘤侵入。致病性组织蛋白酶样酶包括细菌性牙龈菌蛋白酶(gingipains)、恶性疟原虫半胱氨酸蛋白酶(malarial falcipanins)I、II、III等等和来自卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzei、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、(Crithidia fusiculata)、血吸虫(Schistosoma spp)的半胱氨酸蛋白酶。

在一些疾病包括骨质疏松症、牙龈病例如齿龈炎和牙周炎、佩吉特氏病(Paget’s disease)、恶性肿瘤的高钙血症和代谢性骨病中涉及组织蛋白酶K的不当调节。考虑到组织蛋白酶K在骨关节炎性滑膜的破软骨细胞中的水平提高，组织蛋白酶K涉及特征为过度软骨或基质降解的疾病，例如骨关节炎和风湿性关节炎。

治疗骨病和软骨病例如骨关节炎与骨质疏松症有可能需要终身施用组织蛋白酶K抑制剂，通常向在老年阶段或接近老年阶段的患者人群给药。这把非常高的要求置于计划用于这些疾病的药物的施用容易程度上。例如，正在进行尝试，延长当前二磷酸盐类骨质疏松症药物的剂量方案至一周一次或更长的给药方案以助于顺应性。然而，即使改进给药，所述二磷酸盐的其他副作用仍保留。二磷酸盐阻断骨转换，而不是像组织蛋白酶K抑制剂那样减弱骨转换。对健康的骨骼而言，维持二磷酸盐完全阻断的重塑过程是非常重要的。此外，二磷酸盐在骨中有很长的半衰期，因此如果作用例如颚的骨坏死能证明其本身，则从骨中去除二磷酸盐是不可能的。与此相反，组织蛋白酶K抑制剂通常具有快速的开始与结束速度作用模式，这意味着如果问题有待确定，则可停止给药，抑制剂不会在骨基质中累积。

因此希望得到具有良好药物动力学和/或药效学性质的可供替代的骨质疏松症和骨关节炎药物。

国际专利申请WO2008/007107号公开下式化合物

其中Rd为取代的单环，Rc为支链烷基或环烷基，Ra和Rb为各种基团，包括H、甲基、乙基、醚、硫醚、胺、磺酸酯基等等。经制备的仅有的化合物在该位置上含有H或甲氧基。

本领域依然需要组织蛋白酶K的有效抑制剂。对组织蛋白酶K、而非对其他组织蛋白酶(例如对组织蛋白酶S和/或组织蛋白酶L有选择性)显示出选择性的组织蛋白酶K抑制剂特别有益。显示出例如高渗透性和/或有益代谢分布型(profile)的组织蛋白酶K的有效抑制剂，在临床环境中可预期具有很大的价值。组织蛋白酶K相关适应症例如骨质疏松症或关节炎预料有延长的给药周期，因此理想的是所述化合物具有最小毒性或基因毒性。

发明简述

按照本发明，提供式II化合物：

其中

R³为C₁-C₃烷基或C₃-C₆环烷基，两者中任一个任选被一个或两个甲基和/或被氟、三氟甲基或甲氧基取代，当R³为C₃-C₆环烷基时，作为选择它可被氟偕取代；

R⁴为甲基或氟；m为0、1或2；

E为化学键、或任选被甲基或氟取代的噻唑基；

A₁为CH或N，

A₂为CR⁶R⁷或NR⁶，条件是至少A₁与A₂之一含有N；

R⁶为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄卤代烷基、C₁-C₃烷基-O-C₁-C₃烷基，或当A₂为C时，R⁶还可为C₁-C₄烷氧基或F；

R⁷为H、C₁-C₄烷基或F

或其药学上可接受的盐、N-氧化物或水合物。

应当理解本发明的化合物可作为水合物存在，例如以下部分结构式的水合物：

且本发明包括所有这样的可变形式。

适宜地是，R³为C₁-C₃烷基或C₃-C₆环烷基，两者中任一个任选被一或两个甲基和/或被氟、三氟甲基或甲氧基取代。

对于R³而言，环烷基的代表性基团包括环丙基、环丁基和特别是环戊基或环己基，其中任一基团被氟或偕氟取代。在环丙基的2位、环丁基或环戊基的3位或环丙基的4位的偕氟通常是合宜的。在环己基的4位的偕氟也通常是合宜的。

在本发明的一种实施方案中，R³表示亮氨酸的侧链。在本发明的第二种实施方案中，R³表示异亮氨酸的侧链。在本发明的第三种实施方案中，R³表示环己基甘氨酸的侧链。在本发明的第四种实施方案中，R³表示环戊基甘氨酸的侧链。在本发明的第五种实施方案中，R³表示O-甲基苏氨酸的侧链。在本发明的第五种实施方案中，R³表示4-氟亮氨酸的侧链。在本发明的第六种实施方案中，R³表示3-甲氧基缬氨酸的侧链。

当前R³的优选基团包括由以下部分结构体现的那些基团：

在本发明的一种实施方案中，m表示2。其中m表示1的化合物具有特殊重要性。然而本发明另外的实施方案中，m为0，特别是当相邻的噻唑基被Me或优选被F取代时。

R⁴适宜地表示甲基或氟，特别是氟。如果m为2，则当前优选每个R⁴相同。

当m表示1时，R⁴被适当地如以下部分结构所示定位：

E方便地为化学键，即携带A1与A2的含有不饱和氮的环直接连接到苯环的对位。然而，当前优选E为噻唑基，其任选被甲基或更优选被氟取代。噻唑环的优选取向为：

其中R⁵为H、甲基或氟。

含有A₁与A₂的环为5个或6个环原子的饱和含氮环。因此，n为0或1，且适宜地，n为1。因此代表性环包括吡咯烷-1-基、吡咯烷-3-基、哌嗪-1-基、哌啶-4-基及哌啶-1-基。所述环方便地被例如烷基或卤代烷基，通常被甲基或丙基或三氟甲基取代。或者所述环被醚例如甲氧基甲基或甲氧基乙基取代。当A²为碳时，作为备选方案该环可被烷氧基例如甲氧基、或氟，特别是偕氟取代。

本发明的优选实施方案具有下式IIa：

其中

R³为支链的C₂-C₆烷基或C₃-C₆环烷基，两者中任一个被卤代基或三氟甲基取代；

R⁴为甲基或氟；m为0或1或2；

R⁵为H、甲基或氟；

R⁶为C₁-C₄烷基；

或其药学上可接受的盐、N-氧化物或水合物(本文统称为本发明的化合物)。

R⁵优选氟，特别是当m为0时。其余的优选条件如上文式II中所定义。下文提及式II时应当理解为包括式IIa相应的实施方案。

式II的代表性实施方案包括：

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲基-丁基]-4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-基)-1-环己基-2-氧代-乙基]-4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-基)-1-环戊基-2-氧代-乙基]-4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-2-甲基-丁基]-4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲基-丁基]-4-[5-甲基-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-基)-1-环己基-2-氧代-乙基]-4-[5-甲基-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-2-甲基-丁基]-4-5-甲基-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲基-丁基]-4-[5-氟-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-基)-1-环己基-2-氧代-乙基]-4-[5-氟-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-基)-1-环戊基-2-氧代-乙基]-4-[5-氟-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-2-甲基-丁基]-4-[5-氟-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲基-丁基]-3-氟-4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-基)-1-环己基-2-氧代-乙基]-3-氟-4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-基)-1-环戊基-2-氧代-乙基]-3-氟-4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺；

N-[1-(6-腈-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-2-甲基-丁基]-3-氟-4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酰胺

及其药学上可接受的盐、N-氧化物和水合物。

R⁶或R⁷的C₁-C_n烷基定义意欲包括含有总数在一个与n个碳原子之间的支链和无支链两者的烷基部分。这样的R⁶基团或R⁷的实例为甲基、乙基、丙基(正丙基与异丙基)、丁基(正丁基、异丁基、叔丁基及仲丁基)。特别重要的一个R⁶基团为甲基。特别重要的第二个R⁶基团为丙基(特别是正丙基)。当R³任选被一个或两个甲基取代时，该部分还可定义多达5个C原子的支链烷基链。

在本发明的某些实施方案中，A₁为N。

本发明的其他方面包括含有如上文所定义化合物与其药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。

本发明的另一个方面是如上文所定义化合物在制备用于治疗由组织蛋白酶K介导疾病的药物中的用途，所述疾病例如：

骨质疏松症、

牙龈病(例如齿龈炎和牙周炎)、

佩吉特氏病、

恶性肿瘤的高钙血症、

代谢性骨病、

特征为过度软骨或基质降解的疾病(例如骨关节炎和风湿性关节炎)、

骨癌，包括瘤形成、

疼痛(特别是慢性疼痛)。

另外提供用于治疗或预防由组织蛋白酶K介导疾病的方法，包括施用安全和有效量的本发明化合物，以治疗或预防由组织蛋白酶K介导的所述疾病。

还提供用于治疗或预防由组织蛋白酶K介导的疾病的本发明化合物。

此外，作为本发明的一个方面提供新的中间体(如本文所描述)，其可在本发明化合物的制备中有用。

特别提供下式化合物：

或其N被保护的衍生物(例如被Boc、CBz或Fmoc保护的)。本发明还提供其相应的1，3-二氧戊环保护的类似物及N被保护的衍生物(例如Boc CBz或Fmoc被保护的)。本发明另一新的中间体具有下式：

或相应的1，3-二氧戊环保护的类似物，在每一种情况下N官能任选被常规保护基例如Boc、CBz或Fmoc保护。

本发明的化合物可形成盐，其构成本发明的另一方面。式II化合物的适当的药学上可接受的盐包括：有机酸的盐，特别是羧酸的盐，包括但不限于醋酸盐、三氟醋酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、泛酸盐、羟乙基磺酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、丁酸盐、二葡萄糖酸盐、环戊酸盐、葡萄糖庚酸盐、甘油磷酸盐、草酸盐、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸盐、烟酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、乳糖醛酸盐、新戊酸盐、樟脑酸盐、十一酸盐及琥珀酸盐，有机磺酸盐例如甲磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、樟脑磺酸盐、2-萘磺酸盐、苯磺酸盐、对氯苯磺酸盐及对甲苯磺酸盐；和无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、半硫酸盐、硫氰酸盐、过硫酸盐、磷酸盐及磺酸盐。

本发明的化合物在某些情况下可作为水合物被分离。水合物通常通过使用有机溶剂例如二

英、四氢呋喃或甲醇从含水/有机溶剂混合物中重结晶来制备。水合物还可通过向患者施用相应的酮而原位产生。

本发明化合物的N-氧化物可通过本领域普通技术人员已知的方法制备。例如，N-氧化物可通过于大约0℃在适宜的惰性有机溶剂(例如卤化烃，例如二氯甲烷)中用氧化剂(例如三氟过氧乙酸、过氧马来酸、过氧苯甲酸、过氧乙酸、间氯过氧苯甲酸或其类似物)处理本发明化合物的未氧化形式来制备。或者，本发明化合物的N-氧化物可从适当原材料的N-氧化物制备。

本发明N-氧化物的实例包括具有以下部分结构的N-氧化物：

未氧化形式的本发明化合物可于0至80℃在适宜的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、含水二

烷或其类似有机溶剂)中通过用还原剂(例如硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氢化锂、硼氢化钠、二氯化磷、三溴化磷或其类似还原剂)处理，从本发明相应化合物的N-氧化物来制备。

应该注意，定义中使用的于任何分子部分上的基团位置只要化学上稳定，可以是该部分上的任何位置。

变量定义中使用的基团包括所有可能的异构体，除非另有说明。例如丁基包括叔丁基、异丁基、正丁基等等。

当任何变量在任何成分中出现超过一次时，每个定义是独立的。

除非另有提及或说明，否则化合物的化学名称包括所述化合物可能具有的所有可能的立体化学上异构体形式的混合物。所述混合物可包含所述化合物基本分子结构的所有非对映体和/或对映体。以纯的形式或相互混合的本发明化合物的所有立体化学异构体形式都预期包含在本发明的范围内。

本文所提及的化合物和中间体的纯立体异构体形式，定义为基本上没有所述化合物或中间物相同基本分子结构的其他对映体或非对映体形式的异构体。特别的是，术语“立体化学纯的”涉及具有立体异构过量至少80％(即一种异构体最小量90％和其他可能的异构体最大量10％)多达立体异构过量100％(即100％一种异构体且无其他异构体)的化合物或中间体，更特别的是，具有立体异构过量90％到100％的化合物或中间体，甚至更特别的是具有立体异构过量94％到100％的化合物或中间体，最特别的是具有立体异构过量97％到100％的的化合物或中间体。术语“对映体纯的”与“非对映体纯的”应该按相似的方式理解，只是就讨论中混合物中各自的对映体过量和非对映体过量而论。

本发明的化合物可通过将所述化合物的外消旋混合物与旋光拆分剂反应以形成一对非对映体化合物、分离非对映体、并回收旋光对映体来作为其单独的立体异构体制备。尽管对映体的拆分可使用式II化合物的共价非对映体衍生物进行时，但优选可解离的复合物(例如结晶、非对映异构体的盐)。非对映体具有不同的物理性质(例如熔点、沸点、可溶性、反应性等等)，并可通过利用这些不同点很快分离。非对映体可通过色谱法例如HPLC分离，或优选通过以可溶性差异为基础的分离/拆分技术分离。然后借助不会引起外消旋作用的任何实用方法与拆分剂一起，回收光学纯的对映体。适用于由外消旋混合物拆分化合物立体异构体的技术的更详细描述可在Jean Jacques Andre Collet，Samuel H.Wilen，Enantiomers，Racemates and Resolutions，John Wiley & Sons，Inc.(1981)中找到。

本文所定义的式II化合物或式II的任何亚组化合物包括放射性同位素或放射标记的化合物，其中一个或更多个原子被该原子的同位素取代，同位素即与通常在自然界中发现的原子的原子序数相同、但原子质量不同的原子。可被引入式I化合物或式I的任何亚组化合物的同位素实例，包括但不限于：氢的同位素，例如²H和³H(也分别表示为D即氘和T即氚)；碳的同位素，例如¹¹C、¹³C和¹⁴C；氮的同位素，例如¹³N和¹⁵N；氧的同位素，例如¹⁵O、¹⁷O和¹⁸O；磷的同位素，例如³¹P和³²P；硫的同位素，例如³⁵S；氟的同位素，例如¹⁸F；氯的同位素，例如³⁶Cl；溴的同位素，例如⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br和⁸²Br；及碘的同位素，例如¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I。

同位素标记化合物中所包括的同位素的选择将取决于该化合物的具体应用。例如对于药物或底物组织分布分析而言，其中引入了放射性同位素例如³H或¹⁴C的化合物通常会是最有用的。对于放射成像应用例如正电子发射扫描仪(PET)而言，正电子发射同位素例如¹¹C、¹⁸F、¹³N或¹⁵O会是有用的。较重同位素例如氘即²H的引入，可为式I化合物或式I的任何亚组化合物提供更大的代谢稳定性，其可引起例如化合物的体内半衰期延长或剂量要求减小。

为了方便合成，通常优选式II化合物处于自然的同位素状态。

同位素标记的式I化合物或式II的任何亚组化合物可经使用适当的同位素标记的试剂或原材料、而不是相应的非同位素标记的试剂或原材料，通过与下文流程和/或实施例中描述的那些方法类似的方法制备，或通过本领域技术人员已知的常规技术来制备。

应当认识到，本发明延伸至前药、溶剂化物、复合物及在体内释放本发明化合物的其他形式。

虽然活性剂单独给药是可能的，但是优选其作为药物制剂的一部分而存在。这样的制剂将包含上文所定义的活性剂和一种或更多种可接受的载体/赋形剂及任选的其他治疗成分。所述载体从与制剂的其他成分相配伍的意义上说必须是可接受的，并对接受者无害。

所述制剂包括适宜用于直肠、鼻、局部(包括口腔和舌下)、***或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内及皮内)给药的制剂，但优选制剂为口服给药用制剂。所述制剂可方便地以单位剂型存在，例如片剂和缓释胶囊，且可通过药学领域内熟知的任何方法制备。

这些方法包括将上文所定义的活性剂与载体结合在一起的步骤。一般而言，所述制剂通过将活性剂与液态载体或细碎的固体载体或与这两者均匀而紧密地结合在一起，然后如有必要使产品成型来制备。本发明延伸至用于制备药物组合物的方法，其包括将式II化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体或溶媒结合在一起。如果药物制剂的制备涉及药物赋形剂与盐形式活性成分的紧密混合，则通常优选使用性质上为非碱性的赋形剂，即酸性或中性的赋形剂。

本发明中口服给药用制剂可以例如每种包含预定量活性剂的胶囊、扁胶囊或片剂的离散单位存在；以散剂或颗粒剂存在；以活性剂于含水液体或非水液体的溶液或混悬剂存在；或以水包油液体乳剂或油包水液体乳剂存在及以大丸药(bolus)存在等。

关于口服给药用组合物(例如片剂和胶囊)，术语适宜的载体包括溶媒，诸如普通赋形剂，例如粘合剂，例如糖浆、***胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基-甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填充剂和载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸氢钙、氯化钠和海藻酸；及润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸钠及其他金属硬脂酸盐、硬脂酸甘油酯、硬脂酸、硅油、滑石、蜡、油和胶态氧化硅。还可使用矫味剂例如薄荷油、冬青油、樱桃调味剂或其类似物。加入着色剂使剂型容易识别可能令人满意。片剂还可通过本领域内熟知的方法进行包衣。

片剂可通过压片或模压，任选用一种或更多种助剂来制备。压制的片剂可通过在适宜机器内将自由流动形式(例如粉末或颗粒)的活性剂压片来制备，所述活性剂任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模压的片剂可通过在适宜机器内对用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物进行模压来制备。所述片剂可任选加以包衣或划痕并可配制以便提供缓释或控释的活性剂。

其他适合用于口服给药的制剂包括糖锭，其在调味基质(通常为蔗糖和***胶或西黄蓍胶)中含有活性剂；锭剂，其在惰性基质(例如明胶和甘油)或蔗糖和***胶中含有活性剂；及漱口剂，其在适宜液态载体中含有活性剂。

本发明化合物或制剂的合适剂量将取决于适应症和患者，并容易通过常规动物试验确定。提供约为0.01-100uM、更优选0.01-10uM、例如0.1-25uM的细胞内(用于抑制木瓜蛋白酶超家族的生理蛋白酶)浓度的剂量通常令人满意并可实现。

本发明的化合物通过各种各样的液相和固相化学法来制备。

所述化合物通常以反映终产物抑制剂的P1、P2及P3部分的结构单元来制备。不希望以任何方式受理论或具体变量的试验性结合模式归因的约束，本文所使用的抽象概念P1、P2及P3仅为方便而提供，且基本上具有其常规Schlecter & Berger含义并表示抑制剂中被认为能分别占据酶的S1、S2及S3亚位点的那些部分，其中S1临近切割位点，而S3远离切割位点。式II定义的化合物计划在本发明的范围内，不管其为何种结合模式。

广义而言，所述P1结构单元将具有下式：

其中

R¹和R²如上文所定义，两个Rb基团定义缩酮，例如二甲基缩酮，或一起定义环状缩酮例如1，3-二氧戊环；

且Rc为羟基保护基团。较不常见地，在作为酮的P1结构单元被P2与P3延长的情况中，Rc为H或代表终产物抑制剂的酮官能。

WO05/066180描述了关于上述P1结构单元的中间体的制备，所述中间体包括：

在本发明化合物的合成中，第一阶段通常是在溶液中制备官能化的P1结构单元。流程1说明合宜的6-醛中间体的路线。

i)戴斯-马丁氧化剂，DCM；ii)原甲酸三甲酯，pTs，MeOH：iii)Pd(OH)₂，H₂，MeOH；iv)Boc₂O，10％Na₂CO₃，v)戴斯-马丁氧化剂，DCM：vi)1)CH₃PPh₃Br，KOtBu，THF；vii)1)9-BBN-H，THF，2)NaBO₃，H₂O，THF；viii)戴斯-马丁氧化剂，DCM.

流程1

起始双环醇(1a)可按WO05/066180中描述的来制备。例如用戴斯-马丁氧化剂(Dess-Martin Periodinane)氧化羟基官能，接着在酸如对甲苯磺酸的存在下通过用原甲酸三甲酯处理，实现将产生的酮基官能转化为二甲基缩酮来提供缩酮(1b)。使用催化剂如Pd(OH)₂或其类似物例如通过氢解作用，实现Cbz和苄基保护基的去除，接着对产生的游离胺进行boc保护，提供醇(1c)。使用例如戴斯-马丁氧化剂于溶剂如二氯甲烷中氧化产生的游离醇，接着在KOt.Bu或其类似物的存在下、使用溴化甲基三苯基膦

进行魏悌希反应(Wittig reaction)以提供烯烃(1d)。例如通过用9-BBN-H处理实现双键羟基化，提供伯醇(1e)，其随后可使用任何适宜的氧化法例如用戴斯-马丁氧化剂或其类似物处理，氧化成相应的醛(1f)。

流程2说明从流程1的6-醛中间体起始的6-腈P1结构单元的典型方法。

醛1f(流程2)转化为相应的所需腈1h(流程2)的转化通过使肟1g(流程2)脱水进行。因此溶于乙醇/水混合物的醛可用NH₂OH和乙酸钠处理，例如于室温过夜。可用TLC监控原材料已经消耗。常规后处理(work-up)提供粗肟1g(E和Z异构体)，其可不需要进一步纯化而使用。粗肟1g可在二氯甲烷中溶解并于-78℃加入三乙胺。可加入溶于有机溶剂例如二氯甲烷中的三氟甲基磺酸酸酐，通常同时让反应温热至室温。一旦反应似乎完成，就对残余物进行萃取和色谱分离，例如于硅胶上进行色谱分离，产生典型的腈结构单元1h，通常产率高。通常腈1h的唯一一种异构体，例如具有C-6S立体化学的腈1h被分离出，因为通常反应进行不会失去立体化学完整性。文献中众多实例表明，从醛至相应腈的这种转化是以保持相似立体化学来进行，所述文献例如Hutt等人，Journal of Organic Chemistry，72(26)，10130，2007。

通常为了得到最终化合物，P1结构单元例如上文的1h以常规方式进行N脱保护，例如用溶于甲醇的乙酰氯处理以去除N-Boc保护基。对于随后的游离胺，使用标准偶联条件例如HATU、DMF中的DIPEA，例如通过BocP2-OH引入P2残基。再次用溶于甲醇的乙酰氯去除末端Boc保护，并使用标准偶联条件例如HATU、DMF中的DIPEA通过P3-OH引入P3残基。最后用TFA去除二甲基缩酮保护，产生所需的最终化合物。

延长通常在适宜偶联剂例如六氟磷酸苯并***-1-基氧基三吡咯烷基磷

(PyBOP)、六氟磷酸O-苯并***-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲(HBTU)、六氟磷酸O-(7-氮杂苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲

(HATU)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)存在下，任选在1-羟基苯并***(HOBT)，和碱例如N，N-二异丙基乙胺、三乙胺、N-甲基吗啉等的存在下进行。反应通常在20至30℃进行，优选在大约25℃进行，需要2至24小时完成。适宜的反应溶剂为惰性有机溶剂，例如卤化的有机溶剂(例如二氯甲烷、氯仿等)、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、似醚的溶剂例如四氢呋喃、二

烷等。

或者，上文的延长偶联步骤可通过首先将P3/P2结构单元转化为活性酸衍生物例如琥珀酰亚胺酯，然后将其与P1胺反应来进行。反应通常需要2至3小时完成。该反应中使用的条件取决于活性酸衍生物的性质。例如如果它是酰氯衍生物，那么反应在适宜碱(例如三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶等)的存在下进行。适宜的反应溶剂为极性有机溶剂，例如乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、或其任何适宜的混合物。

P2结构单元通常是N被保护的氨基酸例如L-亮氨酸、L-异亮氨酸、O-甲基-L-苏氨酸、L-3-羟基缬氨酸、4-氟亮氨酸、L-环戊基甘氨酸或L-环己基甘氨酸，而P3通常包含封端基团，例如在对位带有例如N-烷基-哌嗪基-E部分的苯甲酸，该N-烷基-哌嗪基-E部分已被引入或用其合成子提供。

适当被保护的单个的结构单元可首先制备并随后一起偶联，优选按以下顺序偶联：P2+P1→P2-P1、接着N-烷基哌嗪基-E-苯甲酸^*+P2-P1→N-烷基哌嗪基-E-苯甲酸酯-P2-P1，其中^*表示活化形式，以便减小P2的外消旋作用。

两种氨基酸之间、一种氨基酸与一种肽之间、或两种肽片段之间的偶联可使用标准偶联方法例如下述方法进行：叠氮化物法、混合碳酸-羧酸酸酐(carbonic-carboxylic acid anhydride)(氯甲酸异丁酯)法、碳二亚胺(二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、或水溶性碳二亚胺)法、活性酯(对硝基苯酯、N-羟基琥珀酸酰亚胺酯)法、Woodward试剂K-法、羰基二咪唑法、磷试剂或氧化-还原法。这些方法中的某些方法(特别是碳二亚胺法)可通过加入1-羟基苯并***或4-DMAP得以增强。这些偶联反应可在溶液(液相)或固相中进行。

更明确地说，偶联步骤涉及在偶联剂存在下将一种反应物的游离羧基与其他反应物的游离氨基脱水偶联以形成连接酰胺键。这样的偶联剂的描述一般而言可在肽化学的教科书上找到，例如M.Bodanszky，″Peptide Chemistry″，第二版修订版，Springer-Verlag，Berlin，Germany，(1993)，其在下文简称为Bodanszky，其内容在此引入作为参考。适宜偶联剂的实例为N，N′-二环己基碳二亚胺、在N，N′-二环己基碳二亚胺存在下的1-羟基苯并***、或N-乙基-N′-[(3-二甲基氨基)丙基]碳二亚胺。实用、有用的偶联剂为商业上可获得的六氟磷酸(苯并***-1-基氧基)三-(二甲基氨基)膦本身，或在1-羟基苯并***或4-DMAP存在下的六氟磷酸(苯并***-1-基氧基)三-(二甲基氨基)膦

另一种实用、有用的偶联剂为商业上可获得的四氟硼酸2-(1H-苯并***-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲

再一种实用、有用的偶联剂为商业上可获得的六氟磷酸O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲

所述偶联反应在惰性溶剂例如二氯甲烷、乙腈或二甲基甲酰胺中进行。加入过量的叔胺如二异丙基乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基吡咯烷或4-DMAP以维持反应混合物的pH大约为8。反应温度通常在0℃和50℃之间的范围内，反应时间通常在15分钟和24小时之间的范围内。

作为组分的非天然氨基酸的官能团在偶联反应期间通常必须被保护以避免形成不需要化学键。可使用的保护基于Greene，″Protective Groups in Organic Chemistry″，John Wiley & Sons，New York(1981)和″The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology″，第3卷，Academic Press，New York(1981)中列出，下文简称为Greene，其公开说明书在此引入作为参考。

C-末端残基的α-羧基通常被保护成酯，该酯可被裂解而得到羧酸。可使用的保护基包括：1)烷基酯，例如甲基酯、三甲基甲硅烷基酯及叔丁基酯，2)芳烷基酯，例如苄基酯和取代的苄基酯，或3)经弱碱或温和还原法可被裂解的酯，例如三氯乙酯和苯乙酮酯。

有待偶联的每个氨基酸的α-氨基通常是N被保护的。可使用本领域内已知的任何保护基。这些基团的实例包括：1)酰基，例如甲酰基、三氟乙酰基、酞酰基和对甲苯磺酰基；2)芳族氨基甲酸酯基，例如苄氧基羰基(Cbz或Z)和取代的苄氧基羰基、和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；3)脂肪族氨基甲酸酯基，例如叔丁氧羰基(Boc)、乙氧基羰基、二异丙基甲氧基-羰基及烯丙氧基羰基；4)环烷基氨基甲酸酯基，例如环戊氧基羰基和金刚烷氧基羰基；5)烷基，例如三苯基甲基和苄基；6)三烷基甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基；及7)含硫醇基团，例如苯硫基羰基和二硫杂琥珀酰基。优选α-氨基保护基为Boc或Fmoc。许多适当保护用于肽合成的氨基酸衍生物为商业上可获得的。

α-氨基保护基通常在下一偶联步骤之前被切下。当使用Boc基时，选择的方法为纯三氟乙酸或溶于二氯甲烷的三氟乙酸，或溶于二

烷或乙酸乙酯的HCl。然后在偶联之前或原位用碱性溶液例如含水缓冲液，或溶于二氯甲烷或乙腈或二甲基甲酰胺的叔胺将所产生的铵盐中和。当使用Fmoc基时，供选择的试剂为溶于二甲基甲酰胺的哌啶或取代的哌啶，但是可使用任何仲胺。脱保护在温度0℃与室温通常20-22℃之间进行。

一旦抑制剂序列完成，则以根据保护基的选择所定的任何形式去除任何残余的保护基。这些方法为本领域技术人员所熟知。

N被保护的L-氨基酸形式的P2结构单元容易在商业上获得，例如L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-环己基甘氨酸、O-甲基-L苏氨酸及其他氨基酸在商业上可获得，有许多保护基变异体，例如CBz、Boc或Fmoc。R³的其他变异体容易从商业上可获得的原材料来制备。例如其中R³为-C(CH₃)₂OCH₃的化合物可通过将被CBz保护的(S)-(+)-2-氨基-3-羟基-3-甲基丁酸与3，3-二甲氧基-六氢-呋喃并(3，2b)吡咯反应以形成所需P2-P1单元来制备。现在P2侧链醇可在常规***、咪唑、THF条件下使用碘甲烷甲基化以得到所需的P2，α中心基本没有被外消旋化。该P2-P1部分现在可通过本文描述的合成，即CBz去除和偶联来进行。

WO05/565299描述了γ-氟亮氨酸P2结构单元的制备。Fmoc与N-Boc-γ氟亮氨酸结构单元的另一种合成如Truong等人Syn.Lett.2005 no 8 1278-1280中所示。

P3结构单元的制备描述于WO05/066180、WO08/007114中或容易通过类似的方法制备。例如下文的流程E表明P3结构单元的制备，其中E为被氟取代的噻唑基：

i.HOAc，Br₂，RT，2h，产率55％；ii.KF、18-冠-6、CH₃CN，90℃，16h，产率31％；iii.HOAc，Br₂，45C，4h，产率100％；iv.4-甲基哌嗪-1-硫代甲酰胺，乙醇，70℃，2h，产率74％，v.LiOH，THF，H₂O，RT，16h，产率79％。

流程E

4-[5-氟-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸的合成原材料4-乙酰基苯甲酸甲酯在商业上可获得。用溶于乙酸中的溴在相对于酮的α-位实现溴化，提供所需4-(2-溴-乙酰基)-苯甲酸甲酯。随后于90℃在18-冠-6的存在下用氟化钾处理4-(2-溴-乙酰基)-苯甲酸甲酯，在柱色谱法之后提供4-(2-氟-乙酰基)-苯甲酸甲酯。用溶于乙酸中的溴在相对于酮的α-位重复溴化，提供所需4-(2-溴-2-氟-乙酰基)-苯甲酸甲酯。噻唑的形成通常通过于70℃加热4-(2-溴-2-氟-乙酰基)-苯甲酸甲酯与4-甲基哌嗪-1-硫代甲酰胺2小时进行。冷却过程中，所需4-[5-氟-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸甲酯沉淀出。甲酯的脱保护使用氢氧化锂溶液及所需酸进行，在用盐酸进行后处理时，通常以良好产量获得4-[5-氟-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸为二盐酸盐。

本文使用的术语“N-保护基”或“N被保护的”是指计划用于保护氨基酸或肽的N-末端、或在合成过程中保护氨基免受不想要的反应的那些基团。常用的N-保护基公开于Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis”(John Wiley & Sons，New York，1981)，其在此引入作为参考。N-保护基包括：酰基，例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、酞酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基，例如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；形成氨基甲酸酯的基团，例如苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、3，4-二甲氧基苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基苄氧基羰基、3，4，5-三甲氧基苄氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧基羰基、二苯甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、环戊氧基羰基、金刚烷氧基羰基、环己氧基羰基、苯基硫羰基等；烷基，例如苄基、三苯基甲基、苄氧基甲基等；及甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基等。有利的N-保护基包括甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、苯磺酰基、苄基(bz)、叔丁氧基羰基(BOC)和苄氧基羰基(Cbz)。

羟基和/或羧基的保护基在Greene(同前)中也有广泛的综述，包括：醚，例如甲基醚、取代的甲基醚，例如甲氧基甲基、甲硫基甲基、苄氧基甲基、叔丁氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基等；甲硅烷基醚，例如三甲基甲硅烷基(TMS)醚、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)醚、三苄基甲硅烷基醚、三苯基甲硅烷基醚、叔丁基二苯基甲硅烷基醚、三异丙基甲硅烷基醚等；取代的***，例如1-乙氧基甲基、1-甲基-1-甲氧基乙基、叔丁基醚、烯丙基醚、苄基醚、对甲氧基苄基醚、二苯基甲基醚、三苯基甲基醚等；芳烷基，例如三苯甲基和苯基呫吨基(pixyl)(9-羟基-9-苯基呫吨衍生物，特别是氯化物)。酯羟基保护基包括酯，例如甲酸酯、苄基甲酸酯、氯乙酸酯、甲氧基乙酸酯、苯氧乙酸酯、新戊酸酯、金刚酸酯、

酸酯、苯甲酸酯等。碳酸酯羟基保护基包括甲基乙烯基、烯丙基、肉桂基、苄基等。

实施方案详述

现在仅根据以下实施例通过说明来描述本发明的各种实施方案。

参考例1

P3结构单元

步骤a)4-氰基苯丙酮

按照有关制备4-氰基苯乙酮所描述的(Synth.Commun 1994，887-890)，将4-溴苯丙酮(5.65g，26.4mmol)、Zn(CN)₂(1.80g，15.3mmol)及Pd(PPh₃)₄(2.95g，2.6mmol)的混合物于80℃在脱氧DMF(35mL，用

分子筛储存，使用前通入Ar)中回流18小时。混合物在甲苯(100mL)与2N NH₄OH(100mL)之间分配。有机相用2N NH₄OH(100mL)萃取，用饱和NaCl水溶液(2x100mL)洗涤，干燥并蒸发。类似地进行10mmol规模反应并将粗产物合并。快速色谱分离(330g二氧化硅，6/1石油醚-EtOAc)，得到白色固体(5.17g，89％)。

1H NMR(CDCl₃)δppm：1.22(t，3H，J＝7.2Hz)，3.00(q，2H，J＝7.3Hz)，7.75(d，2H，J＝8.8Hz)，8.03(d，2H，J＝8.4Hz)

13C NMR(CDCl₃)δppm：7.8，32.1，116.1，117.9，128.3，132.4，139.7，199.2

步骤b)4-丙酰基苯甲酸

将4-氰基苯丙酮(4.67g，29.3mmol)和2N NaOH(90mL，180mmol)与二

烷(90mL)于95℃回流过夜。混合物用水(150mL)稀释，用***(75mL)洗涤，浓HCl酸化至pH 2并用***(3x 75mL)萃取。有机相用饱和NaCl水溶液(3x75mL)洗涤，干燥并蒸发，得到黄色固体(5.12g，98％)。

1H NMR(CDCl₃+CD₃OD)δppm：1.18(t，3H，J＝7.2Hz)，2.99，(q，2H，J＝7.1Hz)，7.95(d，2H，J＝8.4Hz)，8.08(d，2H，J＝8.8Hz)

13C NMR(CDCl₃)δppm：7.9，32.1，127.7，130.0，134.0，140.0，168.0，200.8

步骤c)4-丙酰基苯甲酸甲酯

将上文的苯甲酸(890mg，5mmol)、NaHCO₃(1.26g，15mmol)及碘甲烷(935L，15mmol)的DMF(10mL)溶液于室温搅拌过夜。混合物用饱和NaCl水溶液(50mL)稀释并用***(3x 50mL)萃取。有机相用水(50mL)洗涤，干燥并蒸发。快速色谱分离(90g二氧化硅，2/1石油醚-EtOAc)得到白色固体(744mg，77％)。

1H NMR(CDCl₃)δppm：1.24(t，3H，J＝7Hz)，3.03(q，2H，J＝7Hz)，3.95(s，3H)，8.0和8.12(ABq，4H)

步骤d)4-(2-溴丙酰基)苯甲酸甲酯

在氮气下于50℃将4-丙酰基苯甲酸甲酯(744mg，3.87mmol)、吡咯烷酮三溴化氢盐(hydrotribromide)(1.98g)及2-吡咯烷酮(380mg，4.5mmol)的THF(38mL)溶液加热3小时。将混合物冷却、过滤、浓缩，然后重新溶解于***(50mL)中。将***溶液依次用水(20mL)、饱和Na₂S₂O₅水溶液(20mL)、饱和NaCl水溶液(20mL)和水(20mL)洗涤，干燥并蒸发，得到黄色油状物(1.025g)，后者直接用于Hantzsch偶联。根据1H NMR测定，该原料含有91％所需溴酮、5％起始酮及4％4-溴-1-丁醇。

1H NMR(CDCl₃)δppm：1.92(d，3H，J＝7Hz)，3.96(s，3H)，5.28(q，1H，J＝7Hz)，8.07和8.14(ABq，4H)

步骤e)4-[2-(4-叔丁氧基羰基哌嗪-1-基)-5-甲基噻唑-4-基]苯甲酸甲酯

在N₂下于70℃将上文的α-溴酮和4-硫代羰基哌嗪-1-羧酸叔丁酯(J.Med.Chem.，1998，5037-5054，917mg，3.73mmol)全部在36mLTHF中回流2小时。将沉淀物过滤，并将滤液蒸发得到黄色固体。快速柱色谱分离(二氧化硅，5/1 石油醚-EtOAc)得到624mg淡黄色固体。沉淀物经色谱分离(二氧化硅，2/1 石油醚-EtOAc)得到32mg更多化合物。总产率为44％。

1H NMR(CDCl₃)δppm：1.46(s，9H)，2.43(s，3H)，3.42，(m，4H)，3.54(m，4H)，3.90(s，3H)，7.68和8.04(ABq，4H).

步骤f)4-[2-(4-叔丁氧基羰基哌嗪-1-基)-5-甲基噻唑-4-基]苯甲酸

将上文的甲酯(564mg，1.35mmol)与1.35mL 2N NaOH、5mL THF和3.65mL水于60℃加热4小时。将反应混合物蒸发、倒入20mL饱和NaCl水溶液和20mL CH₂Cl₂中，然后在冰浴中用5％柠檬酸酸化至pH 3。将各层分离并进一步用2x10mL CH₂Cl₂萃取有机相。将有机相合并，用水(10mL)洗涤，干燥并蒸发，得到淡黄色固体(537mg，98％)。

1H NMR(CDCl₃)δppm：1.48(s，9H)，2.47(s，3H)，3.47(m，4H)，3.57(m，4H)，7.74和8.12(ABq，4H).

13C NMR(CDCl₃)δppm：12.6，28.3，42.8，48.1，80.3，119.1，127.8，128.2，130.1，140.5，145.6，154.6，167.2，171.4.

LCMS：(M+H)⁺404，(M-H)^-402.

步骤g)4-[5-甲基-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]苯甲酸

将4-[4-(4-羧基-苯基)-5-甲基-噻唑-2-基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(0.421mmol)溶解于4M HCl的1，4-二

烷溶液中，并于室温搅拌1小时。然后在真空下除去溶剂，将残余物4-(5-甲基-2-哌嗪-1-基-噻唑-4-基)-苯甲酸悬浮于甲醇(10ml)中，并用AcOH/AcONa缓冲液(pH～5.5，5ml)和甲醛(0.547mmol)处理。将反应混合物于室温搅拌1小时，然后用NaCNBH₃(0.547mmol)处理并于室温搅拌过夜。接着在真空下除去溶剂，并经柱色谱法对残余物进行纯化，得到标题化合物(0.403mmol，95％)。

MS(ES)m/z 318(100％，[M+H]⁺).

参考例2

另一种P3结构单元

3-氟-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]苯甲酸盐酸盐

步骤a)4-溴-3-氟苯甲酸甲酯

将4-溴-3-氟苯甲酸(2.46g，11.2mmol)溶解于MeOH(9mL)与甲苯(4mL)中并在冰浴中冷却。逐滴加入(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(11mL，2.0M，溶于己烷中，22mmol)直到黄色持续存在。将溶液于室温搅拌40分钟，然后在真空中浓缩。第二批羧酸(2.43g)同样进行处理。合并来自两批的粗产物并进行快速色谱分离(二氧化硅，5/1戊烷-EtOAc)得到甲酯，为白色固体(4.92g，产率95％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δppm 7.77(m，1H)，7.71(m，1H)，7.64(m，1H)，3.93(s，3H).

步骤b)4-乙酰氧基-3-氟苯甲酸甲酯

在惰性气体下，向锌粉(480mg，7.34mmol)和无水溴化钴(II)(96.6mg，0.44mmol)溶于MeCN(4mL)的混悬液中加入烯丙基氯(105μL，1.28mmol)和TFA(20μL，0.26mmol)。于室温搅拌10分钟之后，加入来自(a)的芳基溴(1.003g，4.30mmol，溶解于5mL MeCN中)，接着加入乙酸酐(0.45mL，4.79mmol)并再加入MeCN(1mL)。将混合物搅拌过夜，用1M HCl(20mL)淬灭，然后用EtOAc(3x20mL)萃取。有机相依次用饱和NaHCO₃水溶液(20mL)与饱和NaCl(2x20mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。快速色谱分离(二氧化硅，6/1至4/1石油醚-EtOAc得到回收的溴化物(161.1mg，16％)和所需酮(白色固体，305.5mg，36％)。

NMR(CDCl₃)δppm：¹H(400MHz)7.94-7.86(m，2H)，7.80(dd，1H，J＝11.2，1.6Hz)，3.95(s，3H)，2.67(d，3H，J＝4.4Hz)；¹⁹F(376MHz)-109.2(m)；¹³C(100MHz)195.4(d，J＝3.7Hz)，165.1(d，J＝2.2Hz)，161.6(d，J＝255Hz)，135.8(d，J＝8.1Hz)，130.7(d，J＝2.9Hz)，129.0(d，J＝14Hz)，125.2(d，J＝3.6Hz)，117.9(d，J＝26Hz)，52.7(s)，31.4(d，J＝7.3Hz).

步骤c)4-(2-溴乙酰氧基)-3-氟苯甲酸甲酯

向来自b)的酮(198mg，1.01mmol)与吡咯烷酮三溴化氢盐(532mg，1.07mmol)的混合物中加入THF(10mL)和2-吡咯烷酮(91μL，1.20mmol)。于60-65℃加热2小时之后，将混合物在真空下浓缩然后在EtOAc(20mL)与饱和Na₂S₂O₃(10mL)之间分配。水相用EtOAc(10mL)萃取。合并有机相，用饱和NaCl(2x10mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)并浓缩。快速色谱分离(二氧化硅，7/1石油醚-EtOAc)，得到白色固体(0.2634g)，其含有84％所需溴化物(根据¹⁹FNMR峰的积分确定)。

NMR(CDCl₃)δppm：¹H(400MHz)7.93(m，1H)，7.88(m，1H)，7.79(dd，1H，J＝11.2，1.6Hz)，4.50(d，2H，J＝2.4Hz)，3.94(s，3H)；¹⁹F(376MHz)-108.4(m).

步骤d)3-氟-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]苯甲酸甲酯

向上文的溴酮(193mg，0.70mmol)和4-甲基-哌嗪-1-硫代甲酰胺(113mg，0.71mmol)中加入EtOH(5.0mL)并于70℃将混合物加热2小时15分钟。将沉淀物过滤，用冷EtOH洗涤并在真空下干燥并表征。将该过程以1.75g溴酮(6.36mmol)更大的规模重复。

NMR(1/1 CDCl₃-CD₃OD)δppm：¹H(400MHz)8.20(m，1H)，7.86(dd，1H，J＝8.4，1.6Hz)，7.76(dd，1H，J＝11.4，1.8Hz)，7.38(d，1H，J＝2.4Hz)，4.23(br，2H)，3.95，(s，3H)，3.65(br，4H)，3.32(br，2H)，2.98(s，3H)；¹⁹F(376MHz)-114.0(m).LCMS[M+H]⁺＝336.

合并来自两次制备的沉淀物并悬浮于饱和NaHCO₃(50mL)中。将混合物用EtOAc萃取。用水洗涤有机相，干燥(Na₂SO₄)，并蒸发得到标题化合物，为膏状固体(1.76g)。

步骤e)3-氟-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]苯甲酸盐酸盐

于80℃将来自(d)的甲酯(1.76g，5.25mmol)与6M HCl(40mL)加热5.5小时。再加入6M HCl(10mL)并于90℃加热混合物1小时15分钟。冷却之后，接着将混合物在真空下蒸发并从水中冷冻干燥，得到终产物，为定量产率的膏状固体。

NMR(DMSO-d6)δppm：¹H(400MHz)11.60(br，1H)，8.18(t，1H，J＝8.0Hz)，7.82(dd，1H，J＝8.4，1.6Hz)，7.72(dd，1H，J＝12.0，1.6Hz)，7.48(d，1H，J＝2.8Hz)，4.11(m，2H)，3.58(m，2H)，3.49(m，2H)，3.19(m，2H)，2.80(d，3H，J＝4.4Hz)；¹⁹F(376MHz)-113.5(m)；¹³C(100MHz)168.9，166.0，159.0(d，J＝250Hz)，143.4，131.4(d，J＝8Hz)，129.8，125.8(d，J＝11Hz)，125.6，116.6(d，J＝24Hz)，111.1(J＝15Hz)，51.1，45.0，41.9.LCMS[M+H]⁺＝322.

参考例3

6-醛-中间体

6-甲酰基-3，3-二甲氧基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羧酸叔丁酯

步骤a

(3as，6aS)-6R-苄氧基-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羧酸苄基酯

在45分钟内，将戴斯-马丁试剂(12.5g，30mmol)溶解于DCM(250mL)中。在氮气环境下于室温向搅拌的氧化剂溶液中加入6-苄氧基-3-羟基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羧酸苄基酯(按WO05/066180中描述来制备)(7.4g，20mmol)的DCM(50mL)溶液。再搅拌90分钟之后，根据TLC认为完成反应。加入10％Na₂S₂O₃水溶液(200mL)并于室温将混合物再搅拌15分钟。两相***转移至分液漏斗并用EtOAc萃取两次(分别为200mL和100mL)。合并的有机相用饱和NaHCO₃水溶液(100mL)和盐水(100mL)洗涤一次，用Na₂SO₄干燥，过滤并将溶剂在真空中除去，产生粗产物标题化合物，为透明油状物(7.69g，)；ESI+，m/z：368(M+ +1)。

步骤b

(3aS，6aS)-6R-苄氧基-3，3-二甲氧基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羧酸苄基酯

将步骤a)的酮基衍生物(7.6g)溶解于干燥甲醇(100mL)中。于室温在氮气环境下加入原甲酸三甲酯(30mL)和pTsOH(0.2g)。将混合物于60℃加热8小时。当根据TLC认为反应已经完成时，将其冷却至室温并在真空中浓缩。将粗产物经硅胶柱色谱法纯化，用乙酸乙酯-庚烷(1∶4)洗脱得到标题化合物，为透明油状物(5.9g，经2个步骤，71％)；ESI+，m/z：382(M+ -OMe)。

步骤c

(3aS，6aS)-3，3-二甲氧基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-6R-醇

将步骤b)的化合物(2.5g，6.4mmol)的甲醇(60mL)与Pd(OH)₂(0.7g)溶液于室温在H₂环境下搅拌48小时。当根据TLC认为反应完成时，将混合物过滤并在真空中浓缩，得到粗标题化合物，为褐色油状物(1.15g)；ESI+，m/z：190(M+ +1)。

步骤d

(3aS，6aS)-6R-羟基-3，3-二甲氧基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羧酸叔丁酯

将来自步骤c)的3，3-二甲氧基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-6-醇(2.80g，14.8mmol)溶解于75mL二

烷/水(2∶1)混合物中。逐滴加入10％Na₂CO₃溶液(25mL)至pH 9-9.5。将混合物在冰-水浴中冷却至0℃并以一份加入Boc酸酐。反应物于室温搅拌过夜，如有必要通过再加入10％Na₂CO₃溶液使混合物的pH保持在9-9.5。根据TLC(50∶50 乙酸乙酯∶异己烷)来监测反应。一旦完成，就过滤混合物以消除形成的盐，并在真空中蒸发溶剂。含水混合物用3x100mL EtOAc萃取，合并的有机相用100mL水和100mL盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并在真空中蒸发溶剂，得到3.79g标题氨基甲酸酯，为透明油状物(89％)，纯度94％(HPLC)，ESI+，m/z：312(M++Na)。

步骤e

3，3-二甲氧基-6-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羧酸叔丁酯

向溶解于DCM(80mL)的来自步骤e)的醇(3.674g，12.70mmol)中加入戴斯-马丁氧化剂(7.00g，16.5mmol)并将溶液于室温搅拌3小时。然后通过加入10％Na₂S₂O₃(aq)(150mL)使反应淬灭并将生成的浆液搅拌15分钟。将混合物转移至分液漏斗中，并将各相分离。水相用DCM萃取三次，随后用饱和NaHCO₃溶液将合并的有机相洗涤两次，然后干燥，过滤并浓缩。粗物质经快速柱色谱(甲苯/乙酸乙酯 3∶1)纯化，得到标题化合物(2.882g，79％)。

步骤f

3，3-二甲氧基-6-亚甲基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羧酸叔丁酯

将来自步骤e的酮基化合物(1.10g，3.83mmol)溶解于干燥THF(30mL)中并将溶液冷却至0℃。每隔2小时加入分成3等分的溴化甲基三苯基膦

(4.0g，11.2mmol)与KOtBu(1.17g，10.5mmol)的干燥THF(40mL)溶液。6小时之后，将溶液与二***(70mL)倒入分液漏斗中并用10％柠檬酸(aq)(2*40mL)萃取。有机相用饱和NaHCO₃水溶液(40mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并将溶剂在真空中蒸发。粗产物经快速色谱分离(庚烷∶乙酸乙酯 4∶1)纯化，得到标题化合物(524mg，48％)

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.48(s，9H)，3.27(s，3H)，3.40(d，3H，J＝16.6)，3.57-3.64(m，1H)，3.84(d，1H，J＝9.5)，3.92(d，1H，J＝16.3)，4.07-4.25(m，1H)，4.35-4.49(m，1H)，4.98(bs，1H)，5.22(d，1H，J＝16.4)，5.34(s，1H).

步骤g

6-羟甲基-3，3-二甲氧基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羧酸叔丁酯

将来自步骤f)的烯烃(524mg，1.84mmol)溶解于干燥THF(70mL)中。加入9-BBN-H(0.5M，于THF中)(7.34mL，3.67mmol)并将溶液搅拌过夜。将溶剂通过旋转蒸发除去并重新溶解于THF(20mL)中。向溶液中缓慢加入MeOH(10mL)，当气体逸出已经停止时，向溶液中加入H₂O(20mL)，接着加入NaBO₃。将溶液搅拌18小时之后过滤并用EtOAc(70mL)稀释滤液，再用盐水(2*50mL)洗涤滤液。有机相用Na₂SO₄干燥，过滤并在真空中蒸发溶剂。粗产物通过快速色谱(庚烷∶乙酸乙酯 2∶1)纯化，得到标题化合物(477mg，86％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.47(s，9H)，2.09-2.25(m，2H)，3.02-3.20(m，1H)，3.29(s，3H)，3.39(s，3H)，3.65-3.93(m，4H)，4.44(d，1H，J＝5.7)，4.70-4.84(m，1H).

步骤h

向溶解于干燥DCM(10mL)的步骤g)的1g醇(370mg，1.22mmol)的溶液中加入戴斯-马丁氧化剂(673mg，1.59mmol)。将反应物搅拌40分钟，然后通过加入10mL 10％Na₂S₂O₃∶NaHCO₃(饱和)1∶1进行淬灭。将所述溶液用DCM(50mL)稀释并用10％Na₂S₂O₃∶NaHCO₃(饱和)为1∶1的混合物(50mL)萃取。有机相用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发。将粗产物经快速色谱法(庚烷∶乙酸乙酯(2∶1)纯化，得到标题化合物(290mg，79％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ1.47(s，9H)，2.90-3.06(m，1H)，3.29(s，3H)，3.38(s，3H)，3.67-3.85(m，2H)，3.88-4.55(m，3H)，4.93-5.19(m，1H)，9.64^*和9.80^*(s，1H).^*两个峰由旋转异构体所致。

参考例4

6-腈P1结构单元

步骤a)

来自参考例3的515mg(1.71mmol)6-甲酰基-3，3-二甲氧基-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羧酸叔丁酯、130.6mg(1.88mmol)盐酸羟胺及168mg(2.05mmol)乙酸钠在乙醇-水混合物(10/15ml)中于室温搅拌过夜。将混合物蒸发并在水相和乙酸乙酯相之间分配。有机相用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，蒸发并在二氧化硅(EtOAc-己烷 1∶1)上纯化，得到上文描述的顺式异构体与反式异构体的混合物。R_f0.43和0.48(EtOAc-己烷 1∶1)。产量395mg(73％)

将步骤a)的肟(114mg，0.36mmol)与三乙胺(105μL，0.757mmol)溶解于1,5ml二氯甲烷中并冷却直到-78℃。在7分钟内逐滴加入溶于600μL二氯甲烷中的三氟甲磺酸酐(61.μL，0.36mmol)。让反应混合物温热直到室温并搅拌2小时。混合物用15ml DCM稀释，用预先冷却的5％柠檬酸、碳酸氢钠、盐水洗涤，用硫酸钠干燥，蒸发并在二氧化硅(梯度EtOAc-己烷 1∶3-1∶1)上纯化。R_f 0.65(EtOAc-己烷 1∶1)。产量65mg(61％)

参考例5

典型的P1/P2脱保护和偶联

将参考例4的腈结构单元(95mg，0.032mmol)溶解于冷却至0℃的5ml甲醇中并逐滴加入0.5ml乙酰氯。将生成的混合物于室温搅拌4小时，然后蒸发。将残余物溶解于2.5ml DMF中，加入80mg(0.32mmol)Boc-Leu-OH，接着加入0.5ml二异丙基乙胺。将生成的混合物冷却直到0℃并加入160mg(0.42mmol)HATU(六氟磷酸O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲

)。让反应混合物温热直到室温并搅拌1.5小时。将混合物蒸发，在水相与乙酸乙酯相之间分配，用水、盐水洗涤有机相，用硫酸钠干燥，蒸发并在二氧化硅(EtOAc Rf 0.35)上纯化，得到82mg标题化合物。对于两个步骤而言，产量为82mg(62％)。

参考例6

另一种P3结构单元

i.AcOH，溴，RT，2h，产率55％；ii.KF，乙腈，18-冠-6，90℃，16h；产率31％；iii.AcOH，溴，45℃，4h，产率100％；iv.4-甲基-哌嗪-1-硫代甲酰胺，加热，2h，产率74％；LiOH，RT，16h，产率100％。

原料的可得性-

4-乙酰基苯甲酸甲酯可从Aldrich获得；4-甲基-哌嗪-1-硫代甲酰胺-在SciFinder中找到的11个供应商(也许Chem Pur ProductsLtd在德国最方便)。

步骤a)4-(2-溴-乙酰基)-苯甲酸甲酯

向4-乙酰基-苯甲酸甲酯(8.4mmol)的乙酸(20mL)溶液中加入溴(8.4mmol)。将反应物在室温搅拌2小时，在这段时间内红色消失并形成灰白色沉淀。产物经过滤收集并用冷甲醇/水(200mL 1∶1)洗涤，得到白色粉末(55％)。1H NMR(400MHz，CDCl₃)3.98(3H，s)，4.20(2H，s)，8.02(2H，d，J＝8Hz)，8.18(2H，d，J＝8Hz)。

步骤b)4-(2-氟-乙酰基)-苯甲酸甲酯

向氟化钾(3.11mmol)的乙腈(1mL)混悬液中加入18-冠-6(0.1mmol)并将反应物于90℃加热30分钟。加入4-(2-溴-乙酰基)-苯甲酸(1.56mmol)并将反应物于90℃加热16小时。反应物用水(10mL)稀释并用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。产物在二氧化硅上纯化，用溶于异己烷的5-15％乙酸乙酯洗脱，在真空中浓缩所需组分，得到标题化合物，为白色固体(31％)。1H NMR(400MHz，CDCl₃)3.98(3H，s)，5.55(2H，d，J＝50Hz)，7.95(2H，d，J＝8Hz)，8.18(2H，d，J＝8Hz).

步骤c)4-(2-溴-2-氟-乙酰基)-苯甲酸甲酯

向4-(2-氟-乙酰基)-苯甲酸(1.19mmol)的乙酸(5mL)混悬液中加入溴(1.19mmol)。将反应物于45℃加热4小时，在这段时间内形成绿色溶液。将反应物在真空中浓缩并两次与甲苯共沸产生标题化合物，为绿色固体(100％)。在下一步骤中使用该粗产物。1H NMR(400MHz，CDCl₃)3.98(3H，s)，7.04(1H，s)，8.05-8.10(4H，m).

步骤d)4-[5-氟-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸甲酯

将4-(2-溴-2-氟-乙酰基)-苯甲酸甲酯(1.18mmol)与4-甲基-哌嗪-1-硫代甲酰胺(1.18mmol)溶解于乙醇(10mL)中。使反应物在回流下加热2小时。将反应物冷却至室温，导致产物沉淀。经过滤收集产物并用冷乙醇洗涤。给予产物含水碳酸氢钠后处理，产生标题化合物，为无色油状物(74％).MS(ES+)337(M+H，100％).

步骤f)

4-[5-氟-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸二盐酸盐

向4-[5-氟-2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-噻唑-4-基]-苯甲酸甲酯(0.43mmol)的四氢呋喃/水(2.5mL，4∶1)溶液中加入氢氧化锂(0.5mmol)。将反应物在室温搅拌16小时。反应物在真空中浓缩并加入盐酸(2N，3mL)导致产物沉淀，为白色固体。经过滤收集产物得到标题化合物，为白色固体(79％)。MS(ES+)322(M+H，100％).

实施例1

N-[1-(6-氰基-3-氧代-六氢-呋喃并[3，2-b]吡咯-4-羰基)-3-甲基-丁基]-4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)噻唑-4-基]-苯甲酰胺

步骤a)

将参考例5的P1/P2结构单元(60mg，0.147mmol)溶解于3ml甲醇中，冷却至0℃并逐滴加入0.4mL乙酰氯。于室温搅拌产生的混合物4小时，然后蒸发。将残余物溶于2.5mL DMF中，加入52mg(0.147mmol)P3结构单元(按WO0566180中制备)的酸，接着加入0.5mL二异丙基乙胺。将产生的混合物冷却直到0℃并加入70mg(0.184mmol)HATU(六氟磷酸O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲)。让反应混合物温热直到室温并搅拌1.5小时。将混合物蒸发，在水相和乙酸乙酯相之间分配，并用水、盐水洗涤有机相，用硫酸钠干燥，蒸发并在二氧化硅(5％MeOH的EtOAc溶液)上纯化。合并所需组分并在真空中浓缩得到所需材料，产量为56mg(64％)，LC/MS 597(M+1)

步骤b)

用3mL TFA-水混合物(2.5％水溶于TFA)处理步骤a)的缩酮(56mg，0.094mmol)4小时。反应由LC/MS监测。将反应混合物蒸发，溶解于乙腈(5mL)中，与固体碳酸钠一起搅拌1小时，然后将固体过滤出，母液在真空中浓缩，并经制备型HPLC(NH₄OAc缓冲液，30-80***(MeCN-水))纯化得到25mg所需产物(产率45％)。LC/MS M+1551，M+19569(水合物形式)

实施例2

将被保护的参考例5的P1-P2结构单元(1)(33mg，0.08mmol)溶解于3ml甲醇中冷却至0℃，并逐滴加入0.4ml乙酰氯加入酸。于室温搅拌所得混合物4小时，然后蒸发。将残余物溶解于2.5mlDMF中，加入29mg(0.08mmol)参考例2的P3酸(为盐酸盐)，接着加入0.5ml二异丙基乙胺。将产生的混合物冷却直到0℃并加入39mg(0.101mmol)HATU(六氟磷酸O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲

)。让反应混合物温热直到室温并搅拌1.5小时。使混合物蒸发，在水相和乙酸乙酯相之间分配，有机相用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥，蒸发并在二氧化硅(5％MeOH溶于EtOAc中)上纯化。(3)的产量为32mg(67％)，LC/MS 615(M+1)

用3ml TFA-水混合物(2.5％水溶于TFA)处理缩酮(3)(32mg，0.054mmol)4小时。反应由LC/MS监测。将反应混合物蒸发，溶解于乙腈(5ml)中，与固体碳酸钠一起搅拌1小时，然后将固体过滤出，母液在真空中浓缩，并在制备型LC/MS上纯化，由制备型HPLC(NH₄OAc缓冲液，30_80***(MeCN-水))纯化，得到13mg产物(产率42％)。LC/MS M+1 569，M+19 587(水合物形式)

实施例3

将被保护的参考例5的P1P2结构单元(1)(33mg，0.08mmol)溶解于3ml甲醇中冷却至0℃并逐滴加入0.4ml乙酰氯，加入酸。于室温搅拌产生的混合物4小时，然后蒸发。将残余物溶于2.5mlDMF中，加入29mg(0.08mmol)参考例6的P3酸(为盐酸盐)，接着加入0.5ml二异丙基乙胺。将产生的混合物冷却直到0℃并加入39mg(0.101mmol)HATU(六氟磷酸O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲

)。让反应混合物温热直到室温并搅拌1.5小时。混合物蒸发，在水相与乙酸乙酯相之间分配，有机相用水、盐水洗涤，用硫酸钠干燥，蒸发并在二氧化硅(5％MeOH溶于EtOAc)上纯化。(5)的产量为30mg(63％)，LC/MS 615(M+1)

用3ml TFA-水混合物(2.5％水溶于TFA中)处理缩酮(5)(30mg，0.051mmol)4小时。反应由LC/MS监测。将反应混合物蒸发，溶解于乙腈(5ml)中，与固体碳酸钠一起搅拌1小时，然后将固体过滤出，母液在真空中浓缩，在制备型LC/MS上纯化，由制备型HPLC(NH₄OAc缓冲液，30_80***(MeCN-水))纯化，得到11mg产物(产率38％)。LC/MS M+1 569，M+19 587(水合物形式)

生物实施例

组织蛋白酶K蛋白水解催化活性的测定

组织蛋白酶K的合宜分析使用例如PDB中描述的人类重组酶进行。

ID BC016058标准；mRNA；HUM；1699BP.

DE 人类组织蛋白酶K(致密性成骨不全症)，mRNA(cDNA克隆MGC：23107

RX MEDLINE；.RX PUBMED；12477932.

DR RZPD；IRALp962G1234.

DR SWISS-PROT；P43235；

重组组织蛋白酶K可在各种商业上可获得的表达***包括大肠杆菌、毕赤酵母(Pichia)及杆状病毒***中表达。纯化酶通过常规方法经去除而前导序列而活化。

测定动力学常数的标准分析条件使用荧光底物，通常为H-D-Ala-Leu-Lys-AMC，且在含有1mM EDTA和10mM 2-巯基乙醇的100mM Mes/Tris，pH 7.0，或100mM磷酸钠、1mM EDTA、0.1％PEG4000 pH 6.5，或含有5mM EDTA和20mM半胱氨酸的100mM乙酸钠，pH 5.5中测定，在各种情况下任选用1M DTT作为稳定剂。所使用的酶浓度为5nM。底物贮液于DMSO中以10mM制备。筛选在固定底物浓度60μM下进行，详细动力学研究用从250μM起的底物二倍稀释液进行。分析中的总DMSO浓度保持低于3％。所有分析皆在环境温度下进行。产物荧光(在390nm激发，于460nm发射)用Labsystems Fluoroskan Ascent荧光读板仪来监测。在产生AMC产物之后，在15分钟内产生产物进度曲线。

组织蛋白酶SKi测定

该分析使用杆状病毒表达的人类组织蛋白酶S与384孔板中的从Bachem获得的boc-Val-Leu-Lys-AMC荧光底物，在孔板中可对7种试验化合物与包含已知组织蛋白酶S抑制剂对照物的阳性对照进行平行试验。

底物稀释

向96深孔聚丙烯板的两列的行B-H加入280μl/孔的12.5％DMSO。向行A加入70μl/孔的底物。向行A加入2x250μl/孔的分析缓冲液(100mM磷酸钠，100mM NaCl，pH 6.5)，混合，并沿板向下双倍稀释到行H。

抑制剂稀释

向96孔V底聚丙烯板4行中的列2-5与列7-12加入100μl/孔的分析缓冲液。向列1与列6加入200μl/孔的分析缓冲液。

向首行的列1加入于DMSO中制备的第一试验化合物，通常其容量提供最初测定的粗略K_i的10到30倍之间。粗略K_i根据预试运转计算出，其中10μl/孔的1mM boc-VLK-AMC(10mM的DMSO贮液在分析缓冲液中稀释的1/10稀释液)分配至96孔Microfluor^TM板的行B至H，将20μl/孔分配至行A。向行A的列1-10上的单独孔中加入每10mM试验化合物2μl。向行B-H的每个孔加入90μl含有1mM DTT和2nM组织蛋白酶S的分析缓冲液并向行A加入180μl。使用多道移液管混合行A并双倍稀释至行G。混合行H并在荧光分光光度计中读数。读数为Prism数据，其拟合了竞争性抑制方程，设定S＝100μM且K_M＝100μM以获得K_i的估计值，最大多达100μM。

向第一行的列6加入第二种试验化合物，向第二行的列1加入第三种试验化合物等。向最底行的列6加入1μl对照物。混合列1并双倍稀释至列5。混合列6并双倍稀释至列10。

使用设置为5x10μl的8道多级移液管，将10μl/孔的底物分配至384孔分析板上。将底物稀释板的第一列分配至分析板上起始于行A的所有列上。多道移液管的吸头(tip)间距将正确跳过交错行。将第二列分配至开始于行B的所有列。

使用设置为4x10μl的12道多级移液管，将10μl/孔的抑制剂分配至384孔分析板上。将抑制剂稀释板的第一行分配至分析板上开始于A1的交错行。多道移液管的吸头间距将正确跳过交错列。相似地，将第二行、第三行及第四行分配至分别开始于A2、B1及B2的交错行与列。

混合20ml分析缓冲液与20μl 1M DTT。加入足量的组织蛋白酶S以得到2nM的最终浓度。

使用分配器例如Multidrop 384，向分析板的所有孔加入30μl/孔并用荧光分光光度计例如Ascent读数。

荧光读数(激发波长与发射波长分别为390nm和460nm，使用带通滤波器设置)反映荧光底物的酶切程度，尽管抑制剂是拟合后的每个孔的线性速率。

使用SigmaPlot 2000，将每种抑制剂所有孔的拟合速率拟合竞争性抑制方程，来测定V、Km及Ki值。

组织蛋白酶L Ki

使用上文的程序并作出以下修订，测定了组织蛋白酶L的Ki。

所述酶是商业上可获得的人类组织蛋白酶L(例如Calbiochem)。底物是从Bahcem获得的H-D-Val-Leu-Lys-AMC。分析缓冲液为100mM乙酸钠1mM EDTA，pH5.5)。DMSO贮液(10mM，于100％DMSO中)在分析缓冲液中稀释至10％。临用前，酶在分析缓冲液中制备为5nM浓度加上1mM二硫苏糖醇。将100％DMSO中制备的2ul 10mM抑制剂分配至行A。10μl 50μM底物(＝10mM DMSO贮液在分析缓冲液中稀释的1/200稀释液，)

抑制研究

使用上文的分析和可变浓度的试验化合物，筛选潜在抑制剂。反应通过向底物和抑制剂的缓冲溶液加入酶而启动。K_i值根据方程式1计算。

v_{0} = \frac{VS}{K_{M} (1 + \frac{I}{K_{i}}) + S} - - - (1)

其中v₀是反应速度，V是最大速度，S是具有米氏常数K_M的底物浓度，且I为抑制剂的浓度。

结果如下表示

A 低于50nM

B 50-500nM

C 501-1000nM

D 1001-5000nM

E 5001-10000nM

F 超过10000nM

表1

实施例	试验编号	Ki组织蛋白酶K	Ki组织蛋白酶S	Ki组织蛋白酶L
					1	试验1	A	D	B
1	试验2	3.0nM	3300nM	530nM

因此式II化合物是组织蛋白酶K的有效抑制剂并仍然对密切相关的组织蛋白酶S和L有选择性。

代谢稳定性

在胞液分析中对本发明化合物和所示的对比例进行了代谢稳定性试验，其中所述化合物与商业上可获得的人类肝脏胞液部分一起孵育，且化合物的消失由HPLC或LC/MS监测。与来自单独个体的血液相比，合并的人类肝脏胞液部分不太可能代表离群个体，且可冷冻保存，不像全血。因此胞液分析提供一致的分析试验台作为对化合物在体内环境，例如当暴露于全血中时稳定性的指引。

简而言之，于37℃将试验化合物(2μM)在合并的人类肝脏胞液(Xenotech LLC Lenexa US，1mg/mL蛋白质，于0.1M磷酸缓冲液中中，pH 7.4)中孵育1小时。通过加入1mM NADPH辅因子启动孵育。在0、20、40及60分钟时取出定时的亚样品并通过加入3倍容量的冰冷乙腈将其″碰撞沉淀″。样品在降低的温度下离心，将上清液分离并用LC-MS-MS分析。

或者，在人或猴全血和/或商业上可获得的肝微粒体中进行类似稳定性分析。

表2

对比例代表在上文所述的WO2008/007107的范围内在6位有碳-碳键的化合物。它以容易的方式从化合物1d(流程1)来制备。因此使用可得到的环外烯烃1d，在氢环境下烯烃用Adams催化剂(二氧化铂)于乙酸乙酯中，通过顺式加氢进行烯烃的立体选择性氢化。该氢化基本上产生一种产物，即具有R-立体化学的C-6甲基异构体(LCMS[M+H]＝288可见)，其产率高。对于氢化步骤而言，此处可见的面选择性与文献之前报道的紧密相关的双环结构的选择性相似(Srinivas等人，Synlett，1999，555-556)。对如此制备的结构单元进行脱保护、延长并氧化成关于上文例示的本发明化合物的活性酮式。

体内稳定性提高可容许化合物全天在体内有更好分布，不论是QD还是BID给药。这对于其中昼夜变化显著的病症例如骨质疏松症特别重要。

渗透性

该实验测定抑制剂通过人类胃肠道细胞的转运。分析使用熟知的传代数在40和60之间的Caco-2细胞。

顶端至基侧转运

通常每种化合物用2-4孔试验。基侧和顶端的孔将分别含有1.5mL和0.4mL转运缓冲液(TB)，试验物质的标准浓度为10μM。此外，所有的试验溶液和缓冲液将含有1％DMSO。在实验之前，将转运板用含有10％血清的培养基预包被30分钟以避免与塑料材料的非特异性结合。在滤膜支持物上培养21至28天之后，细胞准备用于渗透性实验。

转运板1号含有各有4孔的3行。行1表示洗涤，行2表示“30分钟”，而行3表示“60分钟”。转运板2号含有各有4孔的3行，行4表示“90分钟”，行5表示“120分钟”，而其余一行未指定。

除去来自顶端孔的培养基并将***物转移至无***物的2块板之中的在转运板(1号板)的洗涤行(1号)，所述2块板在行1至5中已经用1.5mL转运缓冲液(HBSS，25mM HEPES，pH 7.4)制备。在A→B筛选中，基侧孔中的TB还含有1％牛血清白蛋白。

将0.5mL转运缓冲液(HBSS，25mM MES，pH 6.5)加入到***物中，并使细胞单层在polymix振荡器中于37℃在转运缓冲***中平衡30分钟。在平衡至缓冲***之后，通过EVOM chop stick仪器测定每孔的经上皮电阻值(Transepithelial electrical resistance，TEER)。TEER值通常在每孔400至1000Ω之间(取决于使用的传代数)。

从顶端侧除去转运缓冲液(TB，pH 6.5)，将***物转移至30分钟行(2号)，将包括试验物质的新鲜425μL TB(pH 6.5)加入至顶端(供体)孔内。将板于37℃在polymix振荡器中孵育，其低振动速率大约为150至300rpm。

在行2孵育30分钟之后，每30分钟将***物移动到新的预热基侧(接受者)孔；行3(60分钟)，4(90分钟)及5(120分钟)。

约2分钟后和实验结束时，从顶端的溶液中取出25μL样品。这些样品代表来自实验开始与结束的供体样品。

在每个预定的时间点从基侧(接受者)孔取出300μL，并在实验结束时测定实验后TEER值(post value)。向收集的所有样品加入乙腈，样品中最终浓度为50％。将收集的样品于-20℃储存直到HPLC或LC-MS分析。

基侧至顶端的转运

通常每种化合物会用2-4孔试验。基侧孔和顶端孔将分别含有1.55mL和0.4mL TB，试验物质的标准浓度为10μM。此外，所有的试验溶液和缓冲液将含有1％DMSO。在实验之前用含有10％血清的培养基预包被转运板30分钟，以避免与塑料材料的非特异性结合。

滤膜支持物上培养21至28天之后，细胞准备用于渗透性实验。从顶端孔除去培养基并将***物转移到在无***物的新板(转运板)上的洗涤行(1号)。

转运板包含各有4孔的3行。行1表示“洗涤”，而行3为“实验行”。转运板之前已经在洗涤行1号用1.5mL TB(pH 7.4)制备，在实验行3号(供体侧)用包括试验物质的1.55mL TB(pH 7.4)制备。

将0.5mL转运缓冲液(HBSS，25mM MES，pH 6.5)加入1号行的***物中，并将细胞单层于polymix振荡器中于37℃在转运缓冲***中平衡30分钟。平衡至缓冲***之后，通过EVOM chop stick仪器测定各孔的TEER值。

将转运缓冲液(TB，pH 6.5)从顶端侧除去并将***物转移至行3，将400μL新鲜TB，pH 6.5加入到***物中。30分钟之后从顶端的(接受者)孔中取出250μL并用新鲜转运缓冲液替换。此后每30分钟取出250μL样品并用新鲜转运缓冲液代替直到120分钟时实验结束，在实验结束时测定实验后TEER值。大约2分钟后和在实验结束时从基侧(供体)室取出25μL样品。这些样品代表来自实验开始与结束的供体样品。

向所有收集的样品中加入乙腈，样品中最终浓度为50％。将收集的样品在-20℃储存直到HPLC或LC-MS分析。

计算

相对于时间的累积吸收组分FA_cum的测定。FA_cum根据下式计算

{FA}_{cum} = Σ \frac{C_{RI}}{C_{DI}}

其中C_Ri是间隔i结束时的接受者浓度，而C_Di是间隔i开始时的供体浓度。应该获得线性关系。

渗透系数(P_app，cm/s)的测定结果根据下式计算：

P_{app} = \frac{(k \cdot V_{R})}{(A \cdot 60)}

其中k为转运速率(min^-1)，如通过累积吸收组分(FA_cum)以时间函数(min)的线性回归获得的斜率所定义，V_R为接受室中的体积(mL)，且A为滤膜的面积(cm²)。

参考化合物

通过胃肠组织的渗透性更强是有利的，因为它允许使用较小剂量来达到与以更高剂量给药的渗透性较弱化合物的相似水平。低剂量是有利的，因为减少了商品的日剂量成本，后者在延长的时间周期内摄取的药物中是至关重要的参数。

诱变性

化合物的诱变潜力可方便地在埃姆斯(Ames)试验中测试，通常在各种各样的细菌菌株例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)TA100、TA102、TA 1535、TA 1537中、在有和没有肝脏S9组分活化下，例如在浓度30、300和3000ug/板下进行。

埃姆斯试验可容易在世界各地许多CRO处获得。

缩写

该申请涉及的所有参考，包括专利和专利申请，在此最大限度地引入作为参考。

贯穿整个说明书和所附的权利要求书中，除非上下文需要另有所指，否则词语‘包含(comprise)’和其变化例如‘包含(comprises)’与‘含有’，应理解为暗示包含所述的整数、步骤、整数组或步骤组，但不排除任何其他整数、步骤、整数组或步骤组。

Claims

1.式II化合物：

其中

R⁴为甲基或氟；m为0、1或2；

E为化学键、或任选被甲基或氟取代的噻唑基；

A₁为CH或N，

A₂为CR⁶R⁷或NR⁶，条件是至少A₁与A₂之一含有N；

n为0或1，使得含有A₁和A₂的环为5或6个环原子的饱和含氮环；

R⁶为H、C₁-C₄烷基、C₁-C₄卤代烷基、C₁-C₃烷基-O-C₁-C₃烷基，或当A₂为C时，R⁶还可以为C₁-C₄烷氧基或F；

R⁷为H、C₁-C₄烷基或F；

或其药学上可接受的盐、N-氧化物或水合物。

2.按照权利要求1的化合物，具有下式IIa：

其中

R³为支链的C₂-C₆烷基或C₃-C₆环烷基，两者中任一个任选被一个或两个氟或被三氟甲基取代；

R⁴为甲基或氟，m为0、1或2；

R⁵为H、甲基或氟；

R⁶为C₁-C₆烷基；或其药学上可接受的盐、N-氧化物或水合物。

3.按照任一前述权利要求的化合物，其中R³为亮氨酸的侧链。

4.按照任一前述权利要求的化合物，其中m表示0，而R⁵表示F。

5.按照权利要求1至4中任一项的化合物，其中n表示1，R⁴为F，而R⁵为H。

6.按照权利要求5的化合物，其中R⁴的位置如以下部分结构所示：

7.按照权利要求2-6中任一项的化合物，其中R⁶为CH₃。

8.按照权利要求1的化合物，其选自：

或其药学上可接受的盐、水合物或N-氧化物。

9.药物组合物，其包含任一前述权利要求所定义的化合物和其药学上可接受的载体或稀释剂。

10.权利要求1至8中任一项所定义的化合物在制备用于预防或治疗选自以下疾病的药物中的应用：

骨质疏松症、

牙龈病(例如齿龈炎和牙周炎)、

佩吉特氏病、

恶性肿瘤的高钙血症、

代谢性骨病、

骨癌，包括瘤形成、

疼痛(特别是慢性疼痛)。

11.按照权利要求1至8中任一项的化合物，其用于治疗或预防以下疾病：

骨质疏松症、

牙龈病(例如齿龈炎和牙周炎)、

佩吉特氏病、

恶性肿瘤的高钙血症、

代谢性骨病、

骨癌，包括瘤形成、

疼痛(特别是慢性疼痛)。

12.用于治疗由组织蛋白酶K介导疾病的方法，包括向需要治疗的受治疗者施用安全和有效量的按照权利要求1至8中任一项的化合物。

13.权利要求12的方法，其中所述疾病选自：

骨质疏松症、

牙龈病(例如齿龈炎和牙周炎)、

佩吉特氏病、

恶性肿瘤的高钙血症、

代谢性骨病、

骨癌，包括瘤形成、

疼痛(特别是慢性疼痛)。

14.下式化合物：

其中Rb基团定义缩酮，例如二甲基缩酮，或所述Rb基团一起定义环状缩酮例如1，3-二氧戊环、或其N被保护的衍生物。

15.按照权利要求14的化合物，其为：