CN102206674A - 一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法，适用于水稻防治水稻条纹叶枯病，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。本发明通过构建含有水稻条纹叶枯病病毒CP和SP基因的RNAi表达载体，将植物表达载体利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过G-418抗性基因筛选、分化、生根壮苗，获得再生转基因株系。该方法利用RNAi技术，可培育出优良的抗条纹叶枯病的水稻转基因株系，从根本上解决水稻条纹叶枯病问题，显著增强水稻抗性，提高其经济价值，为绿色农业提供有力的技术支持。
Description
技术领域
本发明属于转基因植物的培育技术领域，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。
背景技术
水稻条纹叶枯病是由水稻条纹病毒引起的病毒性病害，由灰飞虱传播。近几年，水稻条纹叶枯病在我省及周边地区的水稻上连年猖獗，给江苏省的水稻生产和农民的经济利益造成了灾难性影响。该病最早于1897年在日本的关东发现，后在朝鲜、乌克兰、中国等地均有发生。目前它已分布于我国的16个省（市），给我国的水稻生产造成了严重损失。该病于上世纪60年代前后始见于江苏省，70年代在苏南、苏中少数地区曾一度流行，以后几乎是销声匿迹。但自80年代末期以来，水稻条纹叶枯病在我省的发生有所加重。进入21世纪，该病的发生度和发生范围逐年扩大，已成为长江淮河流域稻区水稻生产上最主要的病害，缺乏抗病品种也是水稻条纹叶枯病暴发的主要原因之一。
对待灰飞虱及其传播的条纹叶枯病，一般贯彻“预防为主，综合治理”的植保方针，采用治虫防病结合生态调控等一系列措施，国内外抗病育种的经验表明，选育抗病品种是控制水稻病害最经济有效的方法。选育抗病品种首先要筛选或创制抗源，以往鉴定出的高抗品种多具籼稻血缘，与现有品种杂交后后代品系很难育成优质米品种。到目前为止，粳稻中还未找到1个对条纹叶枯病高度免疫的基因。也就是说，由于品种的限制，现有的抗源材料较难作为优良亲本组配杂交组合用于后代选育。
RNA干扰（RNAi，RNA interference）是指在进化过程中高度保守的、有双链RNA（double-stranded
RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制。由dsRNA介导的干扰现象作为细胞的一种防御机制可针对性地降解细胞内与之具有同源性的核酸(如病毒的核酸)，达到对病毒的抵抗，同时还调节细胞内编码基因的表达，为利用RNA介导的病毒抗性进行抗病毒基因工程的研究奠定了基础。目前，RNAi已经广泛用于基因的功能分析、疾病治疗和抗病虫抗源创制。
目前还未见利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的报道。
发明内容
本发明的主要目的就是针对上述水稻条纹叶枯病的研究现状，提供一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法：
以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列作为抗水稻条纹叶枯病的目的基因序列，分别以下述两对引物F1/R1和F2/R2进行PCR扩增，扩增得到CP和SP基因片段序列，设计上下游引物5’端引入限制性内切酶位点Bgl II和Xho I，酶切位点外侧添加2个保护碱基以保证酶切完全，两对引物分别如下：
F1: CGCTCGAGGTTCAGTCTAGTCATCTGCAC; （SEQ
ID NO.3）
R1: CGAGATCTTAGAATGGGTACCAACAAGCC; （SEQ
ID NO.4）
F2: CGCTCGAGAGAATCGAAGATGCAAGAGGTA; （SEQ
ID NO.5）
R2: CGAGATCTGCTATGTTTTGTGTAGAAGAGG; （SEQ
ID NO.6）
将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pUCCRNAi，于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入pUCCRNAi载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2；
用限制性内切酶分别酶切中间载体pUCCRNAi-CP和pUCCRNAi-SP，以及植物表达载体pCam23A，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pCam23A载体中，即为构建成功的植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP；
将植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP，利用农杆菌介导法分别转入优良水稻品种的胚性愈伤组织，通过G-418筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。
本发明所说的方法，具体步骤如下：
(1)水稻条纹叶枯病毒CP和SP基因RNAi载体的构建
1) 分别以下述F1/R1和F2/R2为引物，水稻条纹叶枯病病毒总RNA为模板，进行PCR扩增获得序列如SEQ ID NO.1和SEQ
ID NO.2所示的述的CP和SP基因序列，再将CP和SP基因序列分别克隆到pMD18-T，得pMD-CP和pMD-SP；
2) 构建含反向重复序列的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2
① 构建含正向序列的中间载体pUCCRNAi-CP1和pUCCRNAi-SP1
将pMD-CP、pMD-SP和pUCCRNAi经Bgl II和Xho I酶切获得的片段进行连接，分别得到pUCCRNAi-CP1和pUCCRNAi-SP1；
② 构建含反向重复序列的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2
将①中得到的含正向序列的中间载体pUCCRNAi-CP1和pUCCRNAi-SP1用限制性内切酶酶BamH I和Sal I进行酶切，回收酶切的目的条带，将其与Bgl II和Xho I酶切pMD-CP和pMD-SP获得的CP和SP基因序列进行连接，得到含反向重复目的片段的中间载体，命名为pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2；
③ 构建含反向重复序列的表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP
Pst I单酶切含反向重复目的片段的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2，Pst I单酶切植物表达载体pCam23A，分别回收反向重复序列和植物表达载体片段， T4
DNA连接酶连接，得到的阳性克隆分别为pCam23A-CP和pCam23A-SP；
(2)将植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP，利用农杆菌介导法分别转入水稻胚性愈伤组织，通过G-418筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。
经过多代自交、分子检测和抗性鉴定，表明所获得的转基因株系对水稻条纹叶枯病具有较好抗性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明方法利用RNAi技术，可培育出具有优良抗条纹叶枯病的转基因水稻株系，从根本上解决水稻条纹叶枯病问题，显著增强水稻对条纹叶枯病的抗性，提高其产量和经济价值。
附图说明
图1 为中间载体pUCCRNAi，其多克隆位点区***了一段内含子。
图2 为植物表达载体pCam23A。MCS为多克隆位点区，酶切位点依次为Sma I，Xba I，Sal I，和Pst I。
图3 为PCR扩增目的基因CP电泳检测结果图： 1，分子量标记；2，未感病植株；3-6，感病水稻植株。
图4 为PCR扩增目的基因SP电泳检测结果图：1，分子量标记；2，未感病植株；3-7，感病水稻植株。
图5 为含CP正向序列中间载体pUCCRNAi-CP1用Bgl
II和Xho I双酶切鉴定电泳检测结果图：1，分子量标记；2-3，pUCCRNAi-CP1用Bgl
II和Xho I双酶切。
图6 为含SP正向序列中间载体pUCCRNAi-SP1用Bgl
II和Xho I双酶切鉴定电泳检测结果图：1-3，pUCCRNAi-SP1用Bgl II和Xho I双酶切；4，分子量标记。
图7 为含CP反向重复序列中间载体pUCCRNAi-CP2用Pst I单酶切鉴定电泳检测结果图：1，分子量标记；2-6，pUCCRNAi-CP2用Pst I单酶切。
图8 为含SP反向重复序列中间载体pUCCRNAi-SP2用Pst I单酶切鉴定电泳检测结果图：1，分子量标记；2-5，pUCCRNAi-SP2用Pst I单酶切。
图9 为含CP反向重复序列表达载体pCam23A-CP用Pst I单酶切鉴定电泳检测结果图：1，分子量标记；2-5，pCam23A-CP用Pst I单酶切。
图10 为含SP反向重复序列表达载体ppCam23A-SP用Pst I单酶切鉴定电泳检测结果图：1，分子量标记；2-5，pCam23A-SP用Pst I单酶切。
图11 为实施例2中，部分转化植株CP基因检测结果：1，阴性对照；2，阳性对照；3-7，转基因植株。
图12 为实施例2中，部分转化植株SP基因检测结果：1，阴性对照；2，阳性对照；3-7，转基因植株。
图13 为实施例4中，半定量RT-PCR 检测接毒鉴定的转基因植株及对照中CP基因表达量：1，未接种植株；2，接种对照；3-8，分别为TG1，TG2，TG3，TG13，TG14和TG15转基因植株。
图14 为实施例4中，半定量RT-PCR 检测接毒鉴定的转基因植株及对照中SP基因表达量：1，未接种植株；2，接种对照；3-8，分别为TG5，TG7，TG8，TG18，TG19和TG20转基因植株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例1
本实施例利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法，包括下述主要步骤：
(1)、水稻条纹叶枯病毒CP和SP基因RNAi载体的构建
1) 利用PCR扩增获得如SEQ
ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的目的基因序列
根据NCBI数据库中的水稻条纹叶枯病毒基因组序列信息，选取条纹病毒CP基因980bp和SP基因548bp碱基序列作为水稻抗条纹叶枯病的目的基因序列，分别命名为CP-980和SP-548，其核苷酸序列从左至右从5’端至3’端碱基组成分别如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所述。
具体步骤如下：
① 病毒总RNA的提取
选取水稻条纹叶枯病病株的叶片约250mg剪成碎片放入研钵中，在液氮冷却条件下研磨至细粉，转入1.5ml离心管，加入0.5ml预冷的Trizol提取液震荡摇匀，5 min后加入0.5ml氯仿，再剧烈震荡离心管5min，在8℃，12,000g条件下，离心15min，离心后的溶液分为两层，将上层液体转移入1.5ml的干净离心管，加入0.5ml异丙醇摇匀，沉淀10min，然后在8℃，12,000g条件下离心10min。
② 利用PCR分别扩增CP和SP基因片段
扩增体系为，每50μL中含有：
| 2×RT-PCR mix | 25 μL； |
| AMV/Taq | 1.5 μL； |
| RNase抑制剂(40u/μL) | 0.5μL； |
| 1μg RNA | 2 μL； |
| F1/F2 | 1 μL； |
| R1/R2 | 1 μL； |
| 无核酸酶的双蒸水至总体积 | 50 μL。 |
扩增程序为：
50℃，30min；
94℃，2min；
94℃，30sec；52℃，30sec；72℃，2min；30个循环；
72℃，10min。
扩增得到目的基因序列；
将扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离(图3、4)、回收和纯化，得到纯化的回收产物。
③ 连接转化
A. 回收产物连接到pMD18-T
反应体系如下：pMD18-T（Takara，大连） 载体1μL，10×连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶350U，回收PCR产物加至终反应体积10μL；
16℃连接12小时，得到连接产物；
B. 转化大肠杆菌DH5α
大肠杆菌感受态细胞的制备：
a. 挑取无抗生素平板上的大肠杆菌单菌落接种于2ml
LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；
b. 按1%的接种量接种于10ml新鲜LB培养液中，37℃剧烈振荡培养至OD600=0.4-0.6；
c. 将菌株移到无菌的50ml离心管中，置冰上10min，4℃下4,000g离心10min，倒出培养液，
用无菌滤纸尽量吸干；
d. 加入10ml预冷的无菌0.1mol/L CaCl2悬浮沉淀，置冰上30min。同法离心，弃尽上清；
e. 沉淀以1ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬，分装成小份，4℃保存备用。
转化步骤如下：
a. 在50μL感受态细胞中加入上述步骤A中获得的连接产物2μL，轻轻旋转以混匀内溶物，冰浴30 min;
b. 将离心管放至42℃的水浴中90
sec。快速将管转移到冰浴中;
c. 每管加800μL LB液体培养基，37℃培养箱中45 min;
d. 取200μL转化的感受态细胞，转移到含对应选择抗生素的LB固体培养基上，将菌液涂满整个平板表面;
e. 封好培养皿倒置于37℃培养12~16h。
④阳性克隆筛选
以前述步骤③中获得的克隆为模板，以下述引物扩增目的基因序列：
D1F: GTTCAGTCTAGTCATCTGCAC; （SEQ
ID NO.7）
D1R: TAGAATGGGTACCAACAAGCC; （SEQ
ID NO.8）
D2F: AGAATCGAAGATGCAAGAGGTA; （SEQ
ID NO.9）
D2R: GCTATGTTTTGTGTAGAAGAGG; （SEQ
ID NO.10）
A. 挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中37℃、
220r/min 振荡培养12小时；
B. 以菌液为模板进行PCR 扩增，反应体系如下：
扩增体系为，每25μL 中含有：
| 10×PCR buffer | 25 μL； |
| dNTPs | 2 μL； |
| Mg2+ | 2 μL； |
| 模板DNA | 2 μL； |
| F1/F2 | 1 μL； |
| R1/R2 | 1 μL； |
| 双蒸水至总体积 | 25 μL。 |
C. PCR 反应扩增程序为：
94℃，5min ；
94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s；30个循环；
72℃，5min；10℃保温；
将得到的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，观察条带有无，若没有目的条带，则为阴性克隆，反之则为阳性，阳性克隆分别命名为pMD-CP和pMD-SP；
D. 测序：通过测序确定扩增得到的序列与目的基因序列相一致。
2) 构建含反向重复序列的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2
① 构建含正向序列的中间载体pUCCRNAi-CP1和pUCCRNAi-SP1
以上述步骤1)中获得的阳性克隆pMD-CP、pMD-SP及中间载体pUCCRNAi（图1）（颜培强, 李丽杰, 康宏, 万秀清, 白先权, 郭兆奎, 储成才. (2007). 应用RNA
i技术培育抗2种病毒病的转基因烟草. 中国生物工程杂志 27,
27-31。刘丹, 郭兆奎, 万秀清, 颜培强, 乔婵, 刘磊. (2009). TMV和PVY外壳蛋白双基因融合干涉及烟草转化.
基因组学与应用生物学 28, 450-454 。Gan, D.F., Zhang, J.A., Jiang, H.B.,
Jiang, T., Zhu, S.W., Cheng, B.J. (2010). Bacterially
expressed dsRNA protects maize against SCMV infection. Plant Cell Reports 29,
1261-1268.由中国科学院储成才研究员提供）为模板，以限制性内切酶Bgl II和Xho I进行酶切，酶切体系为：
| 质粒DNA | 10 μL； |
| 10×Buffer | 3 μL； |
| Bgl II | 2.5 U/1μL； |
| Xho I | 2.5 U/1μL； |
| 双蒸水至总体积 | 3μL。 |
37℃反应4小时。
将pMD-CP和pMD-SP经Bgl II和Xho I酶切获得目的基因序列（指SEQ ID NO.1 和SEQ
ID NO.2），再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pUCCRNAi，于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带。进行连接反应，反应体系如下：
pUCCRNAi中间载体1μL，10×连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶350U，回收CP和SP产物7μL，加至终反应体积10μL；16℃连接12小时，得到连接产物，转化大肠杆菌DH5α。
阳性克隆筛选：
挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中37℃、220r/min 振荡培养12小时；抽取质粒进行酶切鉴定(图5、6)，酶切反应体系如下：
| 质粒DNA | 10 μL； |
| 10×Buffer | 3 μL； |
| Bgl II | 2.5 U/1μL； |
| Xho I | 2.5 U/1μL； |
| 双蒸水至总体积 | 30μL。 |
37℃反应4小时。
将得到的酶切产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，观察条带有无，若有目的条带，则为阳性克隆，分别命名为pUCCRNAi-CP1和pUCCRNAi-SP1；
② 构建含反向重复序列的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2
将①中得到的含正向序列的中间载体pUCCRNAi-CP1和pUCCRNAi-SP1用限制性内切酶酶BamH I和Sal I进行酶切，酶切反应体系如下：
| 质粒DNA | 10 μL； |
| 10×Buffer | 3 μL； |
| BamH I | 2.5 U/1μL； |
| Sal I | 2.5 U/1μL； |
| 双蒸水至总体积 | 30μL。 |
37℃反应4小时。
于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，将其与Bgl II和Xho I酶切pMD-CP和pMD-SP获得的CP和SP基因序列（指SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2）进行连接。产物的回收、纯化、连接和转化与pMD-CP和pMD-SP过程相同。
阳性克隆筛选：
挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中37℃、220r/min 振荡培养12小时；抽取质粒进行酶切鉴定，酶切反应体系如下：
| 质粒DNA | 10 μL； |
| 10×Buffer | 3 μL； |
| Pst I | 2.5 U/1μL； |
| 双蒸水至总体积 | 30μL。 |
37℃反应4小时。
对酶切鉴定为阳性的克隆进行测序，完全正确的即为含反向重复目的片段的中间载体，命名为pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2(图7、8)。
③ 构建含反向重复序列的表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP
Pst I单酶切含反向重复目的片段的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2，30μL 酶切体系为：
| 质粒DNA | 15 μL； |
| 10×Buffer | 3 μL； |
| Pst I | 2.5 U/1μL； |
| 双蒸水至总体积 | 30μL。 |
37℃温育3小时。
Pst I单酶切植物表达载体pCam23A（图2）（王歆, 于恒秀, 唐丁, 裔传灯, 程祝宽. (2008). RNA干涉水稻端粒酶再生植株的初步研究.
扬州大学学报(农业与生命科学版) 29,
54-58.由中国科学院储成才研究员提供），30μL 酶切体系如下：
| 质粒DNA | 10 μL； |
| 10×Buffer | 3 μL； |
| Pst I | 2.5 U/1μL； |
| 双蒸水至总体积 | 30μL。 |
37℃温育3小时。
酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体片段，所有操作按说明书进行；T4
DNA连接酶连接，10μL 连接体系为：10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，正反向重复序列5μL，植物表达载体的大片段2μL，T4 DNA连接酶350U，ddH2O加至终反应体积10μL；16℃连接12h。
阳性克隆筛选：
挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中37℃、220r/min 振荡培养12小时；抽取质粒进行酶切鉴定(图9、10)，酶切反应体系如下：
| 质粒DNA | 15 μL； |
| 10×Buffer | 3 μL； |
| Pst I | 2.5 U/1μL； |
| 双蒸水至总体积 | 30μL。 |
37℃温育3小时。
经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即为构建成功的植物表达载体，在本发明中命名为pCam23A-CP和pCam23A-SP。
(2)、农杆菌介导法转化水稻胚性愈伤组织及植株的再生
1）植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP转化农杆菌：
① 农杆菌感受态的制备
A. 接种农杆菌EHA105（He, X.L., Miyasaka, S.C., Fitch, M.M.M., Moore, P.H.,
Zhu, Y.J. (2008). Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation of taro (Colocasia esculenta (L.) Schott) with a rice chitinase gene for improved tolerance to a
fungal pathogen Sclerotium rolfsii. Plant Cell Reports 27, 903-909。刘巧泉, 姚泉洪, 王红梅, 顾铭洪. (2004). 转基因水稻胚乳中表达铁结合蛋白提高稻米铁含量.
遗传学报 31, 518-524. 农杆菌EHA105由申请人保存）单菌落于50ml液体YEB培养基中，28℃，220-250rpm震荡培养至OD600为0.5左右，冰浴30min，5,000rpm离心5min，收集菌体并用10ml 0.5mol/L CaCl2悬浮；
B. 再次离心（同上），菌体悬浮于1ml 20mmol/L CaCl2溶液；
C. 取50ul菌液分装到1.5ml离心管中，用液氮迅速冷冻，并保存于-70℃冰箱中备用。
② 植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP转化农杆菌：
A.取0.5-1.0ug的DNA加入到50ul冰上解冻的菌液中，轻轻混合冰浴30min，并在液氮中迅速冷冻1min；
B. 在37℃水浴中融化，加1mlYEB液体培养基，28℃轻轻摇动培养2-4h；
C. 6,000rpm离心，倒去大部分上清液，剩50ul左右，悬浮菌体；
D. 涂布在含有50 ug/ml卡那酶素（kan）的YEB培养基上，28℃培养到形成菌落。
③ 阳性克隆的鉴定：
挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB 液体培养基中37℃、220r/min 振荡培养12小时，以菌液为模板进行PCR 扩增，反应体系及扩增程序同上述实施例1中（1）1）⑷。
2）水稻胚性愈伤组织的诱导
选取饱满无虫害的水稻（苏御糯和广陵香粳）成熟种子去壳后，用70%乙醇处理1min，蒸馏水冲洗3次，再用1.5%NaClO浸泡20min，重复一次，蒸馏水冲洗多次，取出放在滤纸的培养皿上凉干。将成熟种子接种于诱导培养基诱导愈伤组织。25℃黑暗条件下培养2周，取盾片来源的愈伤组织接种在继代培养基上，在经几次继代后，选取1-2mm致密的颗粒性好颜色鲜艳的愈伤组织作为农杆菌的转化材料。
3）农杆菌侵染
将含有目标载体pCam23A-CP和pCam23A-SP的农杆菌接种到含50mg/L卡那霉素的YEB培养基，于28℃培养2天；挑取单个菌落于含相应抗生素的1mL YEB培养基中，28℃、225r/min 振荡培养12h，再将其加入含相应抗生素的50mL培养基扩大培养至OD600＝0.5；4℃、4000r/min 离心5min收集菌体，用等体积的液体浸染培养基悬浮；将待转化水稻的愈伤组织分别浸入含AS的浸染培养基，浸染20min；
4）共培养：
取出愈伤组织，铺于放有无菌纸的培养皿上吸干菌液后转移到共培养培养基上（培养基表面铺一张无菌滤纸），适当风干后于25℃，暗培养2-3天。
5）抗性愈伤组织的筛选
将共培养后的愈伤组织取出放在滤纸上干燥20min，经干燥处理过的愈伤组织转移到含有50mg/L G-418和400mg/L头孢霉素的培养基上，进行选择培养。10天后挑选出幼胚盾片处新长出的愈伤组织，转到新鲜筛选培养基上继续筛选10天。
6）转基因植株的再生
MS盐分和维生素，0.3g/L酪蛋白水解物，30g/L蔗糖，2mg/L 6-BA，0.2mg/L
NAA，0.2mg/L玉米素(Zeatin)，0.5mg/L KT，2.5g/L植物胶，pH5.8，50mg/L G-418，200mg/L头孢霉素，25℃光照培养16小时/d，即得到T0代转基因植株。
经分子检测和田间接种鉴定，确定将CP和SP基因转入到水稻品种苏御糯和广陵香粳中。
实施例2
本实施例为转基因植株的分子检测
(1)、水稻基因组DNA的提取
取T0代转化植株幼嫩叶片，用2×CTAB法提取水稻基因组DNA，试剂和配方见表1。.
将约0.1g的水稻叶片放置于2 mL的小离心管中，液氮冷冻后用竹签捣成粉末；加入700μL经65℃预热的2×CTAB提取缓冲溶液，充分混匀后置于65℃水浴30min，每隔5 min混匀一次；水浴完毕后，在每个离心管中加入700μL氯仿，上下颠倒充分混匀，抽提5 min；10000
rpm，离心8 min，取上清液500μL转移入1.5 mL的小离心管中；加入500μL预先冷冻的异丙醇，混匀后冰上静置30 min；12000
rpm，离心5 min；弃尽上清，DNA沉淀用70%的酒精洗涤2次；弃尽洗涤液，DNA沉淀风干后溶于50μL的灭菌双蒸水中，于-20℃保存备用。
(2)、目的基因片段的PCR检测
利用CP和SP目的基因的特异性引物，对T0代植株DNA进行PCR扩增。引物序列如下：
D1F: GTTCAGTCTAGTCATCTGCAC; （SEQ
ID NO.7）
D1R: TAGAATGGGTACCAACAAGCC; （SEQ
ID NO.8）
D2F: AGAATCGAAGATGCAAGAGGTA; （SEQ
ID NO.9）
D2R: GCTATGTTTTGTGTAGAAGAGG; （SEQ ID NO.10）
扩增体系为，每25μL 中含有：
| 10×PCR buffer | 25 μL； |
| dNTPs | 2 μL； |
| Mg2+ | 2 μL； |
| 模板DNA | 2 μL； |
| F1/F2 | 1 μL； |
| R1/R2 | 1 μL； |
| 双蒸水至总体积 | 25 μL。 |
PCR 反应扩增程序为：
94℃，5min ；
94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s ；30 个循环；
72℃，5min ；10℃保温；
将得到的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果，见图11和图12。PCR检测结果表明，外源基因CP和SP已成功导入水稻中。
实施例3
本实施例为阳性株系抗病性鉴定
具体步骤为：
(1)、传毒介体昆虫灰飞虱的采集和饲养
在秧池中播种感病品种广陵香粳，并罩上白色纱网。4月下旬从小麦、大麦试验田及田埂杂草丛中收集灰飞虱成虫放至秧池纱网中喂养。每天赶虫3次，以增加灰飞虱后代的带毒率。
(2)、转基因及对照株系的种植与接种
经过5代自交，获得T5代转基因纯合系。将转基因株系与未转基因对照种子点播于秧板上，并用纱网隔离，随机区组设计，株距为3cm，三次重复。三叶期时接入带毒灰飞虱，同时设不接虫对照。期间，注意水肥管理，杜绝喷洒任何杀虫剂，每天赶虫3次，使尽可能多的秧苗得到感染机会。
(3)、转基因及对照株系发病情况调查
连续赶虫10天后喷洒杀虫剂，20天后观察发病情况，本发明采用了两个抗病性鉴定标准：一是株系发病率(Infection Rate, IR)，即发生病症的株数与总株数之比；二是病级指数（Disease Rating Index, DRI）。表2中发病率和病级指数为三次重复的平均值。不同平均数后的星号表示差异显著水平，NS表示0.05水平差异不显著，**表示0.01水平差异显著。R 抗病，S 感病。
表2. T5代转基因株系和对照发病情况
| 编号 | 发病率 | 显著性 | 病级指数 | 显著性 | 抗性水平 | 载体 | 受体 |
| TG1 | 3.45±2.51% | ** | 2.4±0.8 | ** | R | pCam23A-CP | 苏御糯 |
| TG2 | 3.25±1.19% | ** | 2.5±0.9 | ** | R | pCam23A-CP | 苏御糯 |
| TG3 | 3.54±1.44% | ** | 3.2±1.1 | ** | R | pCam23A-CP | 苏御糯 |
| TG5 | 5.76±1.56% | ** | 4.7±1.0 | ** | R | pCam23A-SP | 苏御糯 |
| TG7 | 4.93±1.72% | ** | 4.1±1.1 | ** | R | pCam23A-SP | 苏御糯 |
| TG8 | 9.56±3.81% | ** | 7.2±1.9 | ** | R | pCam23A-SP | 苏御糯 |
| 苏御糯 | 49.20±10.10% | --- | 31.4±6.8 | -- | S | -- | -- |
| TG13 | 1.93±0.72% | ** | 1.4±0.7 | ** | R | pCam23A-CP | 广陵香粳 |
| TG14 | 3.18±2.18% | ** | 2.2±0.7 | ** | R | pCam23A-CP | 广陵香粳 |
| TG15 | 3.79±1.54% | ** | 2.3±0.8 | ** | R | pCam23A-CP | 广陵香粳 |
| TG18 | 4.77±3.37% | ** | 3.4±1.2 | ** | R | pCam23A-SP | 广陵香粳 |
| TG19 | 6.16±1.66% | ** | 5.2±1.3 | ** | R | pCam23A-SP | 广陵香粳 |
| TG20 | 5.09±2.74% | ** | 3.8±1.0 | ** | R | pCam23A-SP | 广陵香粳 |
| 广陵香粳 | 29.54±7.97% | --- | 23.5±5.1 | -- | S | -- | -- |
实施例4
本实施例为半定量RT-PCR检测接病毒转基因株系及对照CP和SP基因表达水平
(1)、引物设计
以水稻条纹叶枯病毒CP和SP基因为模板，Actin为内参基因设计引物，引物序列见表3。
(2)、叶片总RNA的提取和反转录
选取转基因和对照植株的叶片约250mg剪成碎片放入研钵中，在液氮冷却条件下研磨至细粉，转入1.5ml离心管，加入0.5ml预冷的Trizol提取液震荡摇匀，5 min后加入0.5ml氯仿，再剧烈震荡离心管5min，在8℃，12,000g条件下，离心15min，离心后的溶液分为两层，将上层液体转移入1.5ml的干净离心管，加入0.5ml异丙醇摇匀，沉淀10min，然后在8℃，12,000g条件下离心10min。
反转录体系为，每20μL 中含有：
| 5×PrimeScript buffer | 4 μL； |
| PrimeScript® RT Enzyme Mix I | 1 μL； |
| Oligo dT Primer（50 μM） | 1 μL； |
| Random 6 mers（100 μM） | 1μL； |
| Total RNA | 1 μL； |
| RNase Free水至总体积 | 20 μL。 |
反转录反应条件如下：
37℃ 15 min；85℃ 5 sec。
(3)、接毒鉴定的转基因株系和对照CP和SP目的基因表达量
半定量RT-PCR 检测接毒鉴定的转基因植株及对照CP和SP目的基因表达量的结果见图13、图14。结果表明，在接种后5天，无论是对照植株还是转基因植株，都没有检测到病毒的RNA积累，10天后，在对照植株中检测出病毒RNA，说明病毒RNA已经在对照植株中复制积累，但在转SP基因植株和转CP基因植株依然没有检测到病毒RNA的积累。说明转基因株系能够通过RNAi的作用抵抗病毒的入侵，从而减轻条纹叶枯病毒对水稻的危害。
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 980
<212> DNA
<213> 水稻条纹叶枯病病毒
<400> 1
tagaatgggt accaacaagc cagccactct agctgatttg cagaaggcaa
tcaatgacat 60
ctccaaagat gcgttgtctt acctgactgc tcataaagct gatgttgtga
cctttgctgg 120
tcagatagag tatgcaggct acgatgctgc aactctgatt ggcatattga
aggacaaagg 180
tggtgacaca ctggccaagg atatgactat gtgcatcact atgagatatg
tgagaggcac 240
tggctttgtg agagatgtca ctaagaaagt gaaggtggcg gctggaagca
cagaggcttc 300
gaccttggtg tcgaggtatg ggatagtgtc ctcggtggga acaaatgcca
atgctatcac 360
acttggaaga ttggctcagc tattcccaaa tgtctcacat gaagttgtga
gacaaatttc 420
tggtgttaag atggctgtgg actcttctga cctggggctg acaggatgtg
acaacttact 480
gtgggactat gttccacaat atatcaaact ggagagtgaa acagctcctt
actgctcaac 540
tcactcccta agtcacattt tgtttgttgt gcacatcatt cactccttcc
aaataactaa 600
aaagaccatg ccagagggta agaagaagga gcgtggtctg acgaaggaca
tagacatgat 660
gaagtacaca actggtctcc tggtcatcac atgcaagtca aagaacctgt
ctgacaagaa 720
gaaggaagaa ggcaggaaga aggtcttaga tgaattcatc accaatggga
aagtgaagac 780
tactatcttc gatgcgctgg ctggtatgtc tgtcaatacg atcagcactt
atgggaacca 840
gacaaggctg tacttggctc aacagagcaa gctgatgaag atccttgctg
agaacacttc 900
aaagacagca acagaagtca gcgggctggt gaaggagttc ttcgaggatg
aggcagaagg 960
tgcagatgac
tagactgaac
980
<210> 2
<211> 548
<212> DNA
<213> 水稻条纹叶枯病病毒
<400> 2
agaatcgaag atgcaagacg tacaaaggac aatagaagtt tctgttggtc
ctattgtagg 60
cctagattac actctattgt atgacactct gcccgagact gttagcgaca
acattactct 120
acctgatttg aaagatccag agagagtcac ggaagatact aagaagctaa
tactcaaggg 180
ctgtgtttac atagcatatc atcacccctt ggagactgat acccttttca
tcaaagttca 240
caaacatata ccagagtttt gtcactcatt cctatcacac cttttaggag
gtgaagatga 300
tgacaatgct cttatagaca ttggtctgtt tttcaacatg ctgcaaccct
ctttgggtgg 360
ttggataacc aagaattttc ttagacaccc taataggatg tctaaggacc aaattaaaat
420
gctcctggat cagattatca agatggctaa ggctgagagc tcagacacag
aagaatatga 480
gaaagtgtgg aagaagatgc caacttactt tgaatcaatt attcaacctc
ttctacacaa 540
aacatagc
548
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgctcgaggt tcagtctagt
catctgcac
29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgagatctta gaatgggtac
caacaagcc
29
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgctcgagag aatcgaagat
gcaagaggta
30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgagatctgc tatgttttgt
gtagaagagg
30
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gttcagtcta gtcatctgca
c
21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tagaatgggt accaacaagc
c
21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agaatcgaag atgcaagagg
ta
22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gctatgtttt gtgtagaaga
gg
22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gatgacccag
atcatgtttg
20
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gggcgatgta
ggaaagc
17
Claims (2)
1.一种利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法，其特征在于：
分别以下述两对引物F1/R1和F2/R2进行PCR扩增，从水稻基因中扩增得到CP和SP基因片段序列，CP和SP基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
F1: CGCTCGAGGTTCAGTCTAGTCATCTGCAC;
R1: CGAGATCTTAGAATGGGTACCAACAAGCC;
F2: CGCTCGAGAGAATCGAAGATGCAAGAGGTA;
R2: CGAGATCTGCTATGTTTTGTGTAGAAGAGG;
将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pUCCRNAi，于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入pUCCRNAi载体中，形成含反向重复目的片段的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2；
用限制性内切酶分别酶切中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2，以及植物表达载体pCam23A，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pCam23A载体中，即为构建成功的植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP；
将植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP，利用农杆菌介导法分别转入水稻的胚性愈伤组织，通过G-418筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。
2.根据权利要求1所述的利用RNAi技术培育抗条纹叶枯病水稻的方法，其特征在于其步骤如下：
(1)水稻条纹叶枯病毒CP和SP基因RNAi载体的构建
1) 分别以下述F1/R1和F2/R2为引物，水稻条纹叶枯病病毒总RNA为模板，进行PCR扩增获得序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的述的CP和SP基因序列，再将CP和SP基因序列分别克隆到pMD18-T，得pMD-CP和pMD-SP；
2) 构建含反向重复序列的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2
① 构建含正向序列的中间载体pUCCRNAi-CP1和pUCCRNAi-SP1
将pMD-CP、pMD-SP和pUCCRNAi经Bgl II和Xho I酶切获得的片段进行连接，分别得到pUCCRNAi-CP1和pUCCRNAi-SP1；
② 构建含反向重复序列的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2
将①中得到的含正向序列的中间载体pUCCRNAi-CP1和pUCCRNAi-SP1用限制性内切酶酶BamH I和Sal
I进行酶切，回收酶切的目的条带，将其与BglII和Xho I酶切pMD-CP和pMD-SP获得的CP和SP基因序列进行连接，得到含反向重复目的片段的中间载体，命名为pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2；
③ 构建含反向重复序列的表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP
Pst I单酶切含反向重复目的片段的中间载体pUCCRNAi-CP2和pUCCRNAi-SP2，PstI单酶切植物表达载体pCam23A，分别回收反向重复序列和植物表达载体片段， T4 DNA连接酶连接，得到的阳性克隆分别为pCam23A-CP和pCam23A-SP；
(2)将植物表达载体pCam23A-CP和pCam23A-SP，利用农杆菌介导法分别转入水稻胚性愈伤组织，通过G-418筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN113801887A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-12-17 | 华南农业大学 | 一种水稻纹枯病菌脂肪基因沉默片段RslipA及其应用 |
-
2011
- 2011-04-08 CN CN2011100872251A patent/CN102206674A/zh active Pending
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| CN113801887A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-12-17 | 华南农业大学 | 一种水稻纹枯病菌脂肪基因沉默片段RslipA及其应用 |
| CN113801887B (zh) * | 2021-08-20 | 2023-06-16 | 华南农业大学 | 一种水稻纹枯病菌脂肪基因沉默片段RslipA及其应用 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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