CN101880673B - 利用根特异启动子与抗病基因培育烟草抗青枯病品系方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用根特异启动子与抗病RIP基因培育烟草抗青枯病品系的方法，包括根特异启动子的克隆，抗病基因RIP的克隆，抗烟草青枯病表达载体的构建，培育抗青枯病转基因烟草，以及接种转基因烟草青枯菌进行材料的筛选鉴定。将烟草根特异启动子运用于烟草分子育种上，提高了转基因安全性，由根特异启动子携带光谱抗病基因在烟草根和茎部表达，对烟草青枯病有较强的抵抗能力甚至达到免疫功能。通过对转基因烟草进行RT-PCR鉴定，表明了RIP基因不在烟草叶片表达，通过对转基因烟草进行接种青枯菌进行抗性鉴定，得到了高抗烟草青枯病的转基因新材料，为培养高抗烟草青枯病的转基因植株奠定了有利的基础。

Description

利用根特异启动子与抗病基因培育烟草抗青枯病品系方法

技术领域   

本发明涉及一种运用基因工程技术培育烟草安全抗青枯病种质材料的方法，属于植物基因工程技术领域。

背景技术   

烟草青枯病是我国南方烟草种植过程中的重要病害，利用传统的防治手段，长期以来未能得到有效的解决，给烟草的产量和烟叶的品质带来了严重的影响。烟草青枯病导致烟株死亡的原因很多，近年来的生物化学和基因研究表明，胞外多糖（EPS，由eps基因编码）以及降解植物细胞壁的纤维素酶（主要为内切葡萄糖酶EG，由egl基因编码）和果胶酶（主要是内聚半乳糖醛酸酶PG，由pglA基因编码）是病菌在维管束中群居、蔓延以及植物细胞坏死和溶菌作用所必须的因子（Seal S E，et al.1999）。研究还表明，青枯病菌在导管中生长时可产生大量的胞外多糖，影响和阻塞植物体内水分运输，特别是易于对叶柄和小叶处较小孔径的导管孔板造成堵塞而引起植株萎蔫；同时，青枯病菌还分泌细胞外多种细胞壁降解酶（如纤维素酶类和果胶酶类），其可能也在破坏导管组织，引起植株枯萎死亡方面起重要作用（何礼远和康耀卫，1995）

烟草青枯病是一种细菌性侵染病，是典型的维管束病害，根、茎、叶都可受害。烟草青枯病最典型的症状是枯萎：发病初期，在晴天中午可见烟株的一侧1至2片叶片凋萎下垂，而夜间可以恢复，萎蔫一侧的茎上有褪绿条斑，萎蔫叶片仍为青色，故称“青枯”。发病中前期，烟株一直表现为一侧叶片枯萎，另一侧叶片比较正常，这时拔出根部，可见发病一侧的许多侧根变黑腐烂，但另一侧比较正常。随着病情的进一步加重，褪绿条斑变为黑色条斑，可达到烟株顶部，发病中期枯萎的叶片由绿色变浅绿，然后逐渐变黄，大部分叶片萎蔫。有条斑的茎和根部全部变黑。到发病后期，全部烟叶萎蔫变黄，根部全部变黑腐烂，直至整株死亡。挤压横切茎部有黄白色的乳状粘液即菌脓溢出。

    烟草是四倍体，遗传背景及其复杂，主要栽培品种大多数是已经种植十几年了，因此容易受到青枯病的危害，且目前尚未特效药剂能够防治，因此只能通过选育出新品种才能有效的抵制青枯病，而传统育种的育种年很长，且烟草是一种特殊的产品，因此不能满足烟草生产的需要。自从1986年，美国Powel-Abel最先报道了将TWV-CP基因转入烟草获得了对TMV既有抗性的转CP基因烟草植株以来，转基因技术已经成功运用于烟草的分子育种与功能基因鉴定方面。国内科研工作者已成功将TMV、CMV、马铃薯X病毒与Y病毒（PVX与PVY）等病毒的的CP基因、复制酶基因导入烟草，获得相应的抗植物病毒的转基因植株（方荣祥等，1990；1993；周汝鸿等，1994；吴中心等，1994；王振东等，1995；项瑜等，1995；吴元华等，1997；朱小平等，1998；魏振承和Foster G，2000）。RIP具有广谱的抗病毒活性，已成为抗病毒病的研究热点。分子量约为30kDa的商陆抗病毒蛋白（Pokeweed activiral protein，PAP）属I型碱性核糖体失活蛋白，对TMV、CMV、AMV、PVX、PVY等病毒都具有一定的抑制作用（Irvin J D，1975）。1993年成功导入烟草即表现出对植物病毒的抗性，对机械传播和蚜虫传播的多种病毒均有效。这是第一次RIP基因在植物抗病毒基因工程中发挥作用，但RIP基因在抗烟草细菌性病害上尚无报导，PAP在烟草中适当的表达可保护其不受病毒的侵害，但高水平表达对烟草本身也产生毒害（Lodge J K，et al.1993）。特异启动子能够定时定量让基因表达，因此用特异启动子携带抗病基因在植物里面表达能在一定程度上解决基因本身给植物带来的影响。  

本发明就是针对以上背景技术，通过分离克隆RIP基因，与烟草根特异启动子，将启动子、目的基因连接在载体上，构建植物表达载体，建立以抗生素为筛选剂的转基因遗传体系，以及快速、高效的转基因检测技术和接种抗病鉴定，大幅度的提高烟草抗青枯病能力，为解决烟草安全抗青枯病品种的培养奠定了良好的技术基础。

发明内容   

本发明的目的是提供一种利用烟草根特异启动子、抗病基因RIP培育抗青枯病烟草新品系的方法。所解决的技术问题是一种利用转基因技术安全有效的解决烟草青枯病的方法。

本发明利用烟草根特异启动子、抗病基因RIP培育抗青枯病烟草新品系的方法，包括包括根特异启动子的克隆，抗病基因RIP的克隆，抗烟草青枯病表达载体的构建，培育抗青枯病转基因烟草，以及接种转基因烟草青枯菌进行材料的筛选鉴定。具体地说在成熟苦瓜种子中分离克隆得到核糖体失活蛋白(RIP)基因，以及从烟草DNA组中扩增得到烟草NRT12根特异启动子，构建植物表达载体，利用农杆菌介导叶盘法转化烟草翠碧一号，培育抗青枯病烟草转基因植株，对烟草转基因植株进行青枯菌的接种鉴定，筛选出抗青枯病转基因烟草的新材料。

其中：

1.      烟草NRT12根特异启动子核苷酸序列为SEQ ID No.3所显示的碱基序列；

2.      RIP基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所显示的碱基序列，以及RIP核苷酸序列所推演的氨基酸序列为SEQ ID No.2；

3.      构建含有特异启动子驱动抗病基因表达的植物载体pSC1300-NRT12-RIP，构建过程如图1所示；其中载体指的是pCAMBIA1300，启动子是NRT12，基因是RIP核糖体失活蛋白基因；

4.      利用农杆菌介导叶盘法转化烟草获得抗青枯病转基因烟草植株。

根据上述培育获得烟草特异启动子驱动抗病基因RIP的转基因材料，通过对转基因烟草进行青枯菌接种鉴定，已获得一批高抗烟草青枯病的转RIP基因烟草的新材料。培育出来的转RIP基因新材料，其在抗烟草青枯病表现出较强的优势，远优于对照品种和非转基因的组培后代。

获得的转RIP基因烟草品系，其抗性明显高于受体品种翠碧一号及非转基因后代。目前对转RIP基因烟草进行根、茎接种鉴定，表明了转基因烟草具有高抗烟草青枯病的能力。将烟草根特异启动子NtR12与抗病基因RIP结合在一起构建的植物表达载体，遗传转化得到的转基因烟草，RIP基因不在烟草叶片表达，符合分子安全育种的有效基因工程手段。

本发明的载体是将已经报道的RIP基因与克隆的烟草根特异启动子相结合构建植物表达载体，运用于烟草分子育种上，提高分子育种的安全性。其中所克隆得到的RIP基因全长为861bp，编码286个氨基酸，蛋白质分子量为32.03 KDa，等电点为9.41。融合GST标签后蛋白分子量为59.01 KDa。同源克隆得到的烟草NRT12根特异启动子全长956bp，NtR12启动子AT占64.6%，GC占35.8%。AT丰富序列的低复杂度有利于DNA双链结构的解螺旋，提高基因的转录效率。启动子存在GC盒，因为GC盒一般位于TATA-box和CAAT-box的上游，所以猜测这个基因启动子序列是完整的启动子。

本发明转基因烟草新材料具有以下优点：将烟草根特异启动子运用于烟草分子育种上，提高了转基因安全性，由根特异启动子携带光谱抗病基因在烟草根和茎部表达，对烟草青枯病有较强的抵抗能力甚至达到免疫功能。通过对转基因烟草进行RT-PCR鉴定，表明了RIP基因不在烟草叶片表达，通过对转基因烟草进行接种青枯菌进行抗性鉴定，得到了高抗烟草青枯病的转基因新材料，为培养高抗烟草青枯病的转基因植株奠定了有利的基础。

说明书附图

图1为Psc1300- NRT12-RIP 的构建；

图2为转基因烟草PCR分子检测；

图3为不同转基因烟草及对照RIP基因表达的TR-PCR检测；其中泳道1-6分别为转基因烟草植株RIP10和RIP-14的根、茎、叶片组织RT-PCR结果。泳道7-12分别为转基因阴性植株和非转基因翠碧一号植株的根、茎、叶片组织RT-PCR结果；

图4为转基因植株青枯菌的接种鉴定；其中a表示转基因烟草，b表示对照品种。

具体实施方式  

为了进一步更详细地阐明本发明，以下结合实施例加以说明。

【实施例1】成熟苦瓜种子RNA与烟草基因组DNA的提取

取2.5g成熟苦瓜种子置于研钵中加液氮研磨，取 0.1g倒入预冷的0.5ml异硫氰酸胍变性匀浆液中，充分混匀1min。加入0.1ml 2mol/L NaAc (pH4.0)混匀1min；加入0.5ml水饱和酚，振荡30秒，冰浴5min。加入0.2ml氯仿：异戊醇（24：1），剧烈振荡2次3min，冰上放置10min。4℃，12000g离心15min。小心移取上层水相，弃去中间和下层有机相。加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），振荡2次3min，冰上放置5min。4℃，12000g离心10-15min，移取上层水相，弃去中间和下层有机相。加入等体积异丙醇，放置-20℃ 30 分种以沉淀RNA。4℃，12000g离心15min收集RNA沉淀，用75%乙醇洗涤沉淀；将RNA沉淀在空气中干燥。用30ul RNase-free ddH2O或去离子甲酰胺溶解RNA沉淀；

取烟草叶片取0.3g左右的冻存组织，液氮研成粉末。加入500μl裂解缓冲液（10mmol Tris-Cl pH8.0；0.1mol EDTA pH8.0；0.5% SDS；20μg/ml RNase A），50℃水浴3-5hr。加入500μl平衡酚，振荡混匀后，于4℃ 12000g离心15min，取上层水相。反复抽提一次。加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），振荡混匀后，于4℃ 12000g离心10min；取上层水相，加入2倍体积的冰预冷的无水乙醇，置-20℃ 20min。以吸头小心挑取云絮状物转入另一Ep管中，以70%乙醇洗涤1-2次。待沉淀风干后，加入100μlTE溶液溶解，置-20℃保存。

【实施例2】苦瓜核糖体失活蛋白基因(RIP)的克隆

通过GENBANK已经公布的RIP基因序列，对其所编码的多聚蛋白氨基酸序列进行分析，设计引物MCRIP-BamHⅠ-F:5’-CGGCGGATCCGTCACCA TGGTGAAATGCTTACTACT-3’和MCRIP-SacⅠ-R: 5’ –CGGCGAGCTCTCAATT

CACAACAGATTCC-3’，将上述实施例1中所得的RNA进行逆转录，利用上面两对引物进行RT-PCR，获得一个条带为861bp的片度，胶回收目的片度，将其连接到pMD 18-T Vector载体上，利用T4连接酶16℃过夜连接，大肠杆菌DH5α转化涂板，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取阳性克隆进行摇菌，提质粒，送出去测序。将测序结果与GenBank中已报道的序列进行序列相似性检索。检索结果表明其与Leelamanit,W.等人已发表的AY817142.序列相比，不存在核苷酸的差异，核苷酸序列的同源性为100％。结果表明我们得到了核糖体失活蛋白基因片段。

【实施例3】 烟草NRT12根特异启动子的克隆

利用同源克隆法，合成两条引物P12-BamHⅠ-F:5’-GCAAGCTTCAAGATC

AAAATTTTGA-3；P1-HindⅢ’-R: 5’-GTGGATCCAGTAGTACAATTCATTGTGC

TTTATATTT-3’，同时在引物上设计限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ的识别序列，通过扩增PCR，从烟草基因组中扩增克隆到根特异启动子NRT12。

【实施例4】烟草NRT12根特异启动子携带抗病基因RIP的载体构建

用限制性内切酶PSTⅠ、EcoRⅠ双酶切载体PSPROK和载体PCAMBIA1300，并将回收到的目的片段进行纯化，用T4连接酶过夜连接，转化到大肠杆菌DH5α菌株，涂板后，倒置放在37℃过夜培养后挑起单菌落，用试剂盒提取质粒，用PSTⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定，获得的重组的载体命名为Psc1300。

利用BamHⅠ、HindⅢ双酶切载体Psc1300以及NRT12启动子，回收目的片段，用T4连接酶16℃过夜连接，用大肠杆菌DH5α菌株转化，涂板后，倒置放在37℃过夜培养后挑起单菌落，用试剂盒提取质粒，用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，获得的重组的载体命名为pSC1300-NRT12。

分别用BamHⅠ、SacⅠ单酶切载体pSC1300-NRT12和胶回收目的基因RIP，并同时回收酶切产物，用T4连接酶16℃过夜连接，转化到大肠杆菌DH5α菌株，涂板后，倒置放在37℃过夜培养后挑起单菌落，进行PCR鉴定，挑单个阳性重组菌于Kan含量为50mg.L-1的LB培养基中37℃振荡过夜培养，用试剂盒提取质粒，命名为pSC1300-NRT12-RIP。

【实施例5】烟草的遗传转化

1.      烟草无菌苗的获得以及根瘤农杆菌侵染液的制备

往1.5毫升的离心管中放入大概200粒左右的CB—1烟草种子，用70%的酒精进行消毒1分钟，在超净工作台上用事先准备好的无菌水清洗三次用0.1%的砷汞进行消毒10-15分钟无菌水再次清洗5次，将处理好的无菌种子种植在1/2MS培养基上。

从YEB固体平板上挑取含有重组质粒的单菌落，接种到含有Rif 和Km的液体培养基中，28℃ 250rpm 培养过夜；取1ml过夜培养的菌液接种到30ml含有相应抗生素（或无任何抗生素）的YEB液体培养基中继续振荡培养，至O.D.600 =0.6-0.8，4000rpm， 4℃离心10min，弃上清；沉淀用20ml MS液体培养基（MS大量+ MS微量+20 g/l蔗糖，pH=5.8）重新悬浮备用。分光光度计测得此时菌液的O.D.600 在0.3-0.6左右。

2.      根瘤农杆菌介导的烟草遗传转化 

外植体制备：取事先培养的无菌苗嫩叶，剪切成0.5×0.5cm大小。叶盘法转化：将处理好的外植体投入制备好的菌液中，浸泡侵染5min后，用含有Cef 500mg/L的无菌水冲洗3-5次后，接种于共培养基中于28℃暗培养；2天后转入含有Cef 500mg/L,Hyg 10mg/L的叶片芽诱导培养基上筛选培养，控制温度为25-28℃、光强为2000lex、每天光照时间为12-14hr。等叶芽长至1cm大hr，转入生根培养基。待基部伸出大量根系、上部生长至3～4cm的幼苗转至盛有无菌沙土的培养盒内，炼苗后转入温室培养。诱导培养基：培养基+0.1mg/L NAA+ 1mg/L 6-BA，共培养培养基：MS培养基+0.1mg/L NAA+ 1mg/L 6-BA，诱导筛选培养基：MS培养基+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+10mg/L Hyg +500mg/L Cef，生根培养基：MS培养基5mg/L Hyg +500mg/L Cef。

【实施例6】转基因烟草的PCR、RT-PCR、抗性检测

1.采用CTAB法快速提取转烟草基因组DNA，叶片粉末取0.1g，加入600-700ul CTAB（100 mM Tris·Cl, pH 8.0 ，20 mM EDTA, pH 8.0，1.4 M NaCl），65℃水浴15min-30min，加入相同体积的氯仿：异戊醇，剧烈震动1min，10,000rpm.离心10min，取上清液到新的离心管中，加入相同体积的异丙醇（预冷）10,000rpm.离心10min，用70%酒精清洗两次。并烘干用30-50ul H2O溶解，并加入小量的RNAase，取1-3ul用于PCR检测，检测的结果如图2所示，图中阳性转基因植株的根和茎显示较深的PCR带。表明转基因植株中含有目的启动子、抗病基因及终止子的整个表达单元元件，目的条带刚好符合引物所扩增的条带。结果表明了已经成功的将整个载体Psc1300- NRT12-RIP转入烟草翠碧一号品种中，获得了转Psc1300- NRT12-RIP的转基因烟草阳性植株。

2.采用Trizol方法提取转基因烟草叶片总RNA，取5ul总RNA样品（约2ug），加入1ul 0.5ug/ul的Oligo(dT)_15,于70℃水浴锅温浴3min，置于冰上2min，分别加入下列成分：5ul的5*RNAM-MLV缓冲液，9.5ul的无水RNase的水，2ul的dNTPs，0.5ul的RNase抑制剂以及2ul的M-MLV反转录酶。混匀，瞬间离心，42℃温浴60min。然后将反应物加热至75℃，温浴8min终止反应，冰上冷却并离心后于-20℃保存。然后利用上述基因引物对烟草根茎叶进行RT-PCR，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察基因的表达情况如图3所示，结果表明转基因烟草阳性植株，在特异启动子NRT12驱使下，抗病基因只在烟草根、茎部表达，而在烟草的叶片不表达。而对照品种翠碧一号与及阴性转基因植株，在烟草的各个部位都没有表达。从而证明了利用NRT12启动子可以驱使抗病基因的特异性表达。

3. 将实验室保存的青枯菌种划板，挑取单克隆于SPA培养基过夜培养，取1ml菌液于新的SPA培养基培养，5个小时后，检测浓度，OD=0.5的时候，取出菌液离心，收集菌体，用等量的无菌水悬浮。用一毫升容量的注射器吸取重悬的菌液接种于转基因植株上，以同期生长的CB-1作为对照。转基因烟草植株对青枯菌有一定的抵抗能力，个别转RIP基因烟草植株达到免疫能力如图4所示，结果表明了，在接种同样量的青枯菌菌液后，转基因烟草表现出较强的免疫能力，对青枯菌有一定的抑制作用，而对照品种在接种青枯菌过程后，马上出现致病的表现，出现叶片凋萎，茎部发黑等青枯病明显症状。这说明转基因植株在受青枯菌诱导的情况下，对青枯菌有较强的免疫能力，能起到抑制青枯菌的能力，同时证实了RIP基因能对细菌性病害有一定的抑制能力，证实了RIP基因并非只对真菌性病害抑制作用。

<110> 福建农林大学

<120> 利用根特异启动子与抗病基因培育烟草抗青枯病品系方法

<160> 3

<210> 1

<211> 861

<212> DNA

<213> 苦瓜（Momordica charantia L.）

<220>

<223> 核糖体失活蛋白(RIP)基因

<400> 1

atggtgaaat gcttactact ttctttttta attatcgcca tcttcattgg tgttcctact 60

gccaaaggcg atgttaactt cgatttgtcg actgccactg caaaaaccta cacaaaattt 120

atcgaagatt tcagggcgac tcttccattt agccataaag tgtatgatat acctctactg 180

tattccacta tttccgactc cagacgtttc atactcctca atctcacaag ttatgcatat 240

gaaaccatct cggtggccat agatgtgacg aacgtttatg ttgtggccta tcgcacccgc 300

gatgtatcct acttttttaa agaatctcct cctgaagctt ataacatcct attcaaaggt 360

acgcggaaaa ttacactgcc atataccggt aattatgaaa atcttcaaac tgctgcacac 420

aaaataagag agaatattga tcttggactc cctgccttga gtagtgccat taccacattg 480

ttttattaca atgcccaatc tgctccttct gcattgcttg tactaatcca gacgactgca 540

gaagctgcaa gatttaagta tatcgagcga cacgttgcta agtatgttgc cactaacttt 600

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tttttggcgc agaatcaagg aggaaaattt agaaatcctg tcgaccttat aaaacctacc 720

ggggaacggt ttcaagtaac caatgttgat tcagatgttg taaaaggtaa tatcaaactc 780

ctgctgaact ccagagctag cactgctgat gaaaacttta tcacaaccat gactctactt 840

ggggaatctg ttgtgaattg a 861

 

 

 

 

<210> 2

<211> 286

<212> PRT

<213> 苦瓜（Momordica charantia L.）

<400> 2

Met Val Lys Cys Leu Leu Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ala Ile Phe Ile

1               5                   10                  15     

Gly Val Pro Thr Ala Lys Gly Asp Val Asn Phe Asp Leu Ser Thr Ala

            20                  25                  30         

Thr Ala Lys Thr Tyr Thr Lys Phe Ile Glu Asp Phe Arg Ala Thr Leu

        35                  40                  45             

Pro Phe Ser His Lys Val Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Tyr Ser Thr Ile

    50                  55                  60                 

Ser Asp Ser Arg Arg Phe Ile Leu Leu Asn Leu Thr Ser Tyr Ala Tyr

65                  70                  75                  80 

Glu Thr Ile Ser Val Ala Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Val Val Ala

                85                  90                  95     

Tyr Arg Thr Arg Asp Val Ser Tyr Phe Phe Lys Glu Ser Pro Pro Glu

            100                 105                 110        

Ala Tyr Asn Ile Leu Phe Lys Gly Thr Arg Lys Ile Thr Leu Pro Tyr

        115                 120                 125            

Thr Gly Asn Tyr Glu Asn Leu Gln Thr Ala Ala His Lys Ile Arg Glu

    130                 135                 140                

Asn Ile Asp Leu Gly Leu Pro Ala Leu Ser Ser Ala Ile Thr Thr Leu

145                 150                 155                 160

Phe Tyr Tyr Asn Ala Gln Ser Ala Pro Ser Ala Leu Leu Val Leu Ile

                165                 170                 175    

Gln Thr Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Arg His Val

            180                 185                 190        

Ala Lys Tyr Val Ala Thr Asn Phe Lys Pro Asn Leu Ala Ile Ile Ser

        195                 200                 205            

Leu Glu Asn Gln Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Phe Leu Ala Gln

    210                 215                 220                

Asn Gln Gly Gly Lys Phe Arg Asn Pro Val Asp Leu Ile Lys Pro Thr

225                 230                 235                 240

Gly Glu Arg Phe Gln Val Thr Asn Val Asp Ser Asp Val Val Lys Gly

                245                 250                 255    

Asn Ile Lys Leu Leu Leu Asn Ser Arg Ala Ser Thr Ala Asp Glu Asn

            260                 265                 270        

Phe Ile Thr Thr Met Thr Leu Leu Gly Glu Ser Val Val Asn  

        275                 280                 285             <210> 3

<211> 956

<212> DNA

<213> 烟草（Nicotiana tabacum）

<220>

<223> 根特异启动子

<400> 3

tcttttgctg tcgagatttg gtcgacggcc cgggctgcaa ttccagtata atataccggt 60

ccagcataaa atactgtcca atctccagta tattgtactg aaactttccg cgtgttggag 120

ttccagcata atatgctgga agttcttacg catgtgcacc gatctccagt atattatgtt 180

ggaactttcc gtgttgcagc aaaatagtgg ctatttttca atgacttcgc aaacgctgac 240

tatttttgat aaatccgaaa actgattagc ccgtgctatt tttaagaaac aaaagtgaat 300

taaattggaa ttataggtgc tggcccaatg gtctaagctc tccccacacc cgcttgctgc 360

atttttagag tgatatcaaa cacaaatcgt aagatgagga tatgttttgc ctttgggtat 420

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Claims (2)

1.一种利用根特异启动子与抗病RIP基因培育烟草抗青枯病品系的方法，其特征在于：包括根特异启动子的克隆，抗病基因RIP的克隆，抗烟草青枯病表达载体的构建，培育抗青枯病转基因烟草，以及接种转基因烟草青枯菌进行材料的筛选鉴定；所述表达载体为pSC1300- NtR12-RIP，其中所用的载体是pCAMBIA1300，启动子是NtR12, 基因是RIP核糖体失活蛋白基因；烟草NtR12根特异启动子携带抗病基因RIP的载体构建如下：

用限制性内切酶PSTⅠ、EcoRⅠ双酶切载体PSPROK和载体PCAMBIA1300，并将回收到的目的片段进行纯化，用T4连接酶过夜连接，转化到大肠杆菌DH5α菌株，涂板后，倒置放在37℃过夜培养后挑起单菌落，用试剂盒提取质粒，用PSTⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定，获得的重组的载体命名为Psc1300；

利用BamHⅠ、HindⅢ双酶切载体Psc1300以及NtR12启动子，回收目的片段，用T4连接酶16℃过夜连接，用大肠杆菌DH5α菌株转化，涂板后，倒置放在37℃过夜培养后挑起单菌落，用试剂盒提取质粒，用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，获得的重组的载体命名为pSC1300- NtR12；

分别用BamHⅠ、SacⅠ单酶切载体pSC1300- NtR12和胶回收目的基因RIP，并同时回收酶切产物，用T4连接酶16℃过夜连接，转化到大肠杆菌DH5α菌株，涂板后，倒置放在37℃过夜培养后挑起单菌落，进行PCR鉴定，挑单个阳性重组菌于Kan含量为50mg.L-1的LB培养基中37℃振荡过夜培养，用试剂盒提取质粒，命名为pSC1300- NtR12-RIP；

所述RIP基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列；所述RIP核苷酸序列对应的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

所述根特异启动子为烟草根特异启动子NtR12，所述启动子具有如SEQ ID No.3所示的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的利用根特异启动子与抗病RIP基因培育烟草抗青枯病品系的方法，其特征在于：利用农杆菌介导法获得抗青枯病转基因烟草。

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