CN102192848B - 一种用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，首先制备凝集素芯片和制备生物样本；然后将生物样本加载到凝集素芯片上来检测甲型流感病毒中的糖蛋白糖链，来快速判定甲型流感病毒的亚型以及其致病性强弱。解决常规检测流感病毒方法不能快速同时检测甲型流感病毒亚型及其毒力的技术问题。具有快速、简便、效率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种分析糖蛋白的方法，具体是涉及一种用凝集素芯片分析甲型流感病毒亚型及其毒力方法。
背景技术
凝集素是一类具有糖专一性、可促使细胞凝集的糖蛋白，它能与糖专一性、非共价、可逆结合。按照所结合糖的类型，可把自然界中的凝集素分成若干类型，即能与某糖分子特异性结合，就叫该糖凝集素，这样一般可把凝集素分为六大类：D-甘露糖或D-葡萄糖凝集素(如伴刀豆素A)；N-乙酰氨基葡萄糖凝集素(如麦芽的凝集素)；N-乙酰氨基半乳糖凝集素(如大豆的凝集素)；D-半乳糖凝集素(如蓖麻的凝集素)；L-岩藻糖凝集素(如荆豆的凝集素)；N-乙酰神经氨酸(唾液酸)凝集素(如麦胚凝集素)。凝集素有各种应用：凝集素可用于恶性肿瘤等疾病的诊断；利用凝集素来设计抗菌、抗病毒药物；利用凝集素设计“生物导弹”；利用凝集素进行糖链结构的识别和分析。糖蛋白的研究技术主要有：凝胶中糖蛋白技术，生物质谱技术，凝集素亲和技术。
凝集素芯片是将各种不同来源的凝集素固定于醛基化、环氧化或经其它方式修饰后的玻璃片基上，再与标记后的糖蛋白、菌体、细胞等待检测样品反应，经后续处理后，以检测待检测样品的糖结构。凝集素芯片能简便、快速、高通量的检测分析蛋白质的糖基化修饰，在短时间内给出待检测样品的糖结构指纹图谱，它的出现必将加速蛋白质糖基化修饰的研究。
甲型流感病毒是国际兽疫局(OIE)规定的A类传染病，中国相应称之为一类传染病。分类上属正黏病毒科、甲型流感病毒属，一般呈球形，初代分离毒常见有丝状或其它形状，有囊膜，直径80～120nm，是单股负链RNA，完整病毒包含内、中、外3层结构，其中外层为双层脂质囊膜，其表面主要有两种糖蛋白纤突，即血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)。目前HA有16种，NA有10种，根据每种甲型流感病毒的HA和NA种类，将甲型流感病毒病毒分为不同的血清亚型，例如H5N1和H9N2。由甲型流感病毒引起的禽流感，其病理变化因感染病毒毒株致病性的强弱和禽种的不同而不同。其临床症状因感染禽的种类、日龄和并发感染情况及所感染毒株的致病性和其他环境等不同而表现出的症状很不一致。长期以来，甲型流感病毒的诊断一直依赖于病原的分离和鉴定。近年来，国内外已相继建立了甲型流感病毒琼脂扩散(AGP)、血凝抑制试验(HI)神经氨酸酶抑制试验(NI)、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学诊断技术及分子诊断技术(如RT-PCR)和基因芯片，满足了我国甲型流感病毒流行病学监测及现地诊断与防制的迫切需要。病毒分离培养和血凝抑制试验经常作为评价新的检测甲型流感病毒方法的对照，但病毒分离培养耗时长，至少需7天，不利于快速诊断，病毒分离的实验条件要求较高，同时有致病性的危险，对毒株的检测及管理上要严格考虑生物安全措施。甲型流感病毒在鸡胚培养过程中还可能发生变异。血凝及血凝抑制试验特异性好，但其操作相对繁琐。血清学检查对最后确诊有回顾性诊断价值，一般只能在发病2-3周甚至更长时间才能有抗体阳性出现。由于甲型流感病毒血清型众多，新的变异株不断出现，制备血清型特异性单克隆抗体相对困难，且在各种免疫接种的情况下，血凝抑制试验等血清学诊断方法也会失去作用。核酸扩增技术(NAT)检测甲型流感病毒，选择好靶基因和引物及优化反应参数，均可获得高灵敏度和特异性。对于血清型众多的甲型流感病毒，不同亚型致病性不同，其宿主分布也不同，故快速、特异地分型在甲型流感病毒诊断中显得尤为重要。RT-PCR方法能够获得所有甲型流感病毒的已知HA亚型。上述流感病毒的检测方法中无论是哪一种检测方法，都无法同时对流感病毒进行精确的分型和对其毒力快速评估。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用凝集素芯片分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，解决常规检测流感病毒方法不能快速同时检测甲型流感病毒亚型及其毒力的技术问题。具有快速、简便、效率高等优点。
本发明的技术方案如下：
一种用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，该方法包括以下步骤：
1)制备凝集素芯片；
2)制备生物样本；
3)将生物样本加载到凝集素芯片上以获得甲型流感病毒亚型及其毒力的结果。
上述步骤1)中制备凝集素芯片包括以下步骤：
1)取环氧化片基备用；
2)将凝集素配制成浓度为1mg/ml的点样液；
3)将配制的点样液加到384孔板内；再用晶芯48点样***在环氧化片基上点样；
4)将点制好的芯片在湿度为55％-65％的环境中孵育2.5-3.5小时；
5)对孵育好的芯片在37℃的环境中抽真空3小时，使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；
6)将固定好的凝集素芯片放置在干燥器中以备用。
上述步骤2)中制备生物样本包括以下步骤：
1)准备所需样本；
2)用有机试剂***对样本病毒裂解；
3)对裂解后的病毒进行浓缩，形成浓缩样本；
4)用荧光试剂对浓缩样本进行标记，用G-25柱去除多余荧光；
5)将标记好的样本分装冻存于-20℃以下的环境中。
上述步骤3)包括以下步骤：
1)将1-2％牛血清白蛋白溶解到磷酸盐缓冲液-吐温20中配制成封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液中1小时；
2)将封闭后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次3分钟，再经甩干后备用；
3)对甩干后的凝集素芯片加入3-5μg标记好的样本和750-800μL的孵育缓冲液，并在室温孵育3小时；
4)将孵育后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次3分钟，再甩干；
5)对甩干后的凝集素芯片用GenePix4000B芯片扫描仪扫描，得到凝集素与标记后糖蛋白血凝素结合的荧光图像；
6)通过GenePix3.0软件对荧光图像进行中值分析，对图像中的凝集素所对应的糖链结构反复核对后得出甲型流感病毒亚型及其毒力结果。
上述样本为高致病性样本或低致病性样本。
上述高致病性样本包括H5N1(DK/GD/17/08)、H5N1(CK/GX/4/09)、H5N2(Mallard/JX/16/05)、H7N1(KP)。
上述低致病性样本包括H5N2(Ostrich/Denmark/96-72420/96)、N7N2(HB7)、H9N2(CK/FJ/S-1-521/08)、H9N2(DK/GD/S-7-134/04)。
上述将点制好的芯片在湿度为60％的环境中孵育3小时为最佳。
上述对甩干后的凝集素芯片加入4μg标记好的样本和780μL的孵育缓冲液，并在室温孵育3小时为最佳。
上述凝集素为2种以上。
本发明中：
磷酸盐缓冲液pH7.4(1L)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g。
磷酸盐缓冲液-吐温20：10mmol/L磷酸盐缓冲液中含质量分数0.05-0.5％吐温20。
孵育缓冲液：磷酸盐缓冲液-吐温20中含质量分数1％牛血清白蛋白和质量分数10-20％羟胺。
其中荧光试剂：Cy3，Cy5等。
实施本发明具有以下优点：
通过用凝集素芯片分析甲型流感病毒亚型及其毒力测定糖蛋白的精确化学结构灵敏度提高。
附图说明
图1为本发明高致病性样本H5N1(DK/GD/17/08)的效果图；
图2为发明高致病性性样本H5N1(CK/GX/4/09)的效果图；
图3为本发明高致病性样本H5N2(Mallard/JX/16/05)的效果图；
图4为本发明低致病性样本H5N2(Ostrich/Denmark/96-72420/96)的效果图；
图5为本发明高致病性样本H7N1(KP)的效果图；
图6为本发明高致病性样本H7N2(HB7)的效果图；
图7为本发明低致病性样本H9N2(CK/FJ/S-1-521/08)的效果图；
图8为本发明低致病性样本H9N2(DK/GD/S-7-134/04)的效果图；
图9为凝集素芯片的点样矩阵设计。
具体实施方式：
一种用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，该方法包括以下步骤：
1)制备凝集素芯片；
1.1)取环氧化片基备用；
1.2)将凝集素配制成浓度为1mg/ml的点样液；
1.3)将配制的点样液加到384孔板内；再用晶芯48点样***在环氧化片基上点样；
1.4)将点制好的芯片在湿度为60％的环境中孵育3小时；
1.5)对孵育好的芯片在37℃的环境中抽真空3小时，使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；
1.6)将固定好的凝集素芯片放置在干燥器中以备用。
2)制备生物样本；
2.1)准备所需的高致病性样本或低致病性样本；
高致病性样本包括H5N1(DK/GD/17/08)、H5N1(CK/GX/4/09)、H5N2(Mallard/JX/16/05)、H7N1(KP)。
低致病性样本包括H5N2(Ostri ch/Denmark/96-72420/96)、N7N2(HB7)、H9N2(CK/FJ/S-1-521/08)、H9N2(DK/GD/S-7-134/04)。
2.2)用有机试剂***对样本病毒裂解；
2.3)对裂解后的病毒进行浓缩，形成浓缩样本；
2.4)用荧光试剂对浓缩样本进行标记，用G-25柱去除多余荧光；
2.5)将标记好的样本分装冻存于-20℃以下的环境中。
3)将生物样本加载到凝集素芯片上以获得甲型流感病毒亚型及其毒力结果。
3.1)将2％牛血清白蛋白溶解到磷酸盐缓冲液-吐温20中配制成封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液1小时；
3.2)将封闭后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次3分钟，再经甩干后备用；
3.3)对甩干后的凝集素芯片加入4μg标记好的样本和780μL的孵育缓冲液，并在室温孵育3小时；
3.4)将孵育后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次3分钟，再甩干；
3.5)对甩干后的凝集素芯片用GenePix4000B芯片扫描仪扫描，得到凝集素与标记后糖蛋白结合的荧光图像；
3.6)通过GenePix3.0软件对荧光图像进行中值分析，对图像中2种以上的凝集素所对应的糖链结构反复核对后得出甲型流感病毒亚型及其毒力结果。
具体实施例子：以样本H5N1(DK/GD/17/08)为例
该方法包括以下步骤：
1)制备凝集素芯片；
1.1)取环氧化片基备用；
1.2)将凝集素配制成浓度为1mg/ml的点样液；
1.3)将配制的点样液加到384孔板内；再用晶芯48点样***在环氧化片基上点样；
1.4)将点制好的芯片在湿度为60％的环境中孵育3小时；
1.5)对孵育好的芯片在37℃的环境中抽真空3小时，使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；
1.6)将固定好的凝集素芯片放置在4℃干燥器中以备用。
2)制备生物样本；
2.1)准备所需样本H5N1(DK/GD/17/08)；
2.2)用有机试剂***对样本病毒裂解；
2.3)对裂解后的病毒进行浓缩，形成浓缩样本；
2.4)用荧光试剂对浓缩样本进行标记，去除多余荧光；
2.5)将标记好的样本分装冻存于-20℃的环境中。
3)将生物样本加载到凝集素芯片上以获得不同样本中糖蛋白上糖链结构差异
3.1)将2％牛血清白蛋白溶解到磷酸盐缓冲液-吐温20中配制成封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液1小时；
3.2)将封闭后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次3分钟，再经甩干后备用；
3.3)对甩干后的凝集素芯片加入4μg标记好的样本和780μL的孵育缓冲液，并在室温孵育3小时；
3.4)将孵育后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次3分钟，再甩干；
3.5)对甩干后的凝集素芯片用GenePix4000B芯片扫描仪扫描，得到凝集素与标记后糖蛋白结合的荧光图像；参见图1。
3.6)通过GenePix3.0软件对荧光图像进行中值分析，对图像中2种以上的凝集素所对应的糖链结构反复核对后得出样本高致病性甲型流感毒株H5N1(DK/GD/17/08)上糖蛋白的糖链结构。糖链结构分析结果如下表所示，通过这些糖链分析显示此毒株为H5高致病性。
表一
| Lectin | Specificity | H5N1(高)DK |
| STL | GlcNAc | + |
| BPL | Galβ1-3GalNAc | ++ |
| PWM | GlcNAc | + |
| ACA | Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr(Tn) | + |
| SNA | Sia2-6Galβ1-4Glc(NAc) | + |
| PHA-E | Bisecting GlcNAc and biantennary N-glycans | + |
| RCA120 | β-gal | +++ |
| Con A | branched and terminalmannose，terminal GlcNAc | + |
表二为本发明样本中血凝素为H5的糖蛋白上的糖谱差异。根据下表中凝集素对应的糖谱结果可以判断出亚型类型以及毒株毒力。
表二
| Lectin | Specificity | H5N1(高)DK | H5N1(高)CK | H5N2(高)Ma | H5N2(低)Os/ |
| STL | GlcNAc | + | ++ | + | |
| BPL | Galβ1-3GalNAc | ++ | + | ||
| DSA | GlcNAc | ++ | + | ||
| PWM | GlcNAc | + | + | ||
| PHA-E+L | Bisecting GlcNAc andbiantennary N-glycans andtetraantennary complex-typeN-glycan | + | |||
| ACA | Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr(Tn) | + | + | + | |
| SNA | Sia2-6Galβ1-4Glc(NAc) | + | + | ||
| PHA-E | Bisecting GlcNAc andbiantennary N-glycans | + | ++ | + | + |
| RCA120 | β-gal | +++ | +++ | +++ | ++ |
| Con A | branched and terminalmannose，terminal GlcNAc | + | + | ++ | +++ |
| GNA | Terminalα-1，3mannose | ++ |
表三为本发明样本中血凝素为H7的糖蛋白对应的糖谱差异；
根据下表中凝集素对应的糖谱结果可以判断出亚型类型以及毒株毒力。
表三
| Lectin | Specificity | H7N1(高)KP | H7N2(低)HB7 |
| STL | GlcNAc | + | |
| JaCalin | Galβ1-3GalNAc-Ser/Thr(T)andGalNAc-Ser/Thr(T) | + | |
| DSA | GlcNAc | +++ | + |
| PWM | GlcNAc | ++ | |
| PHA-E+L | Bisecting GlcNAc and biantennaryN-glycans and tetraantennarycomplex-type N-glycan | + | |
| MAL-II | Sia2-3Galβ1-4Glc(NAc) | + | |
| SBA | Terminal GalNAc(especiallyGalNAcα1-3Gal) | + | |
| SNA | Sia2-6Galβ1-4Glc(NAc) | + | + |
| PHA-E | Bisecting GlcNAc and biantennaryN-glycans | + | ++ |
| LEL | Poly-LacNAc and(GlcNAc)n | + | |
| RCA120 | β-gal | ++ | +++ |
| Con A | branched and terminal mannose，terminalGlcNAc | ++ |
| GNA | Terminalα-1，3mannose | +++ |
表四为本发明样本中血凝素为H9的糖蛋白对应的糖谱差异根据下表中凝集素对应的糖谱结果可以判断出亚型类型以及毒株毒力。
表四
| Lectin | Specificity | H9N2(低)CK | H9N2(低)DK |
| WFA | GalNAcβ-1，4GlcNAc | + | + |
| PTL-I | αGalNAc and Gal | + | + |
| AAL | Fucose | ++ | + |
| GSL-I | αGalNAc，GalNAcα-Ser/Thr(Tn)andαGal | ++ | |
| STL | GlcNAc | +++ | +++ |
| PTL-II | Gal | + | |
| BPL | Galβ1-3GalNAc | + | |
| DSA | GlcNAc | + | |
| PWM | GlcNAc | + | |
| LCA | Fucoseα-1，6GlcNAc(core fucose) | + | |
| LEL | Poly-LacNAc and(GlcNAc)n | ++ | ++ |
| RCA120 | β-gal | ++ | + |
| Con A | branched and terminalmannose，terminal GlcNAc | + |
本发明涉及的8种亚型禽流感病毒详细信息如下表：
| 亚型 | 致病性 | 名称 |
| H5N1 | 高 | DK/GD/17/08 |
| H5N1 | 高 | CK/GX/4/09 |
| H5N2 | 高 | Mallard/JX/16/05 |
| H5N2 | 低 | Ostrich/Denmark/96-72420/96 |
| H7N1 | 高 | KP |
| H7N2 | 低 | HB7 |
| H9N2 | 低 | CK/FJ/S-1-521/08 |
| H9N2 | 低 | DK/GD/S-7-134/04 |
Claims (9)
1.一种用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，该方法包括以下步骤：
1)制备凝集素芯片；
2)制备生物样本；
3)将生物样本加载到凝集素芯片上以获得甲型流感病毒亚型及其毒力的结果，具体包括以下步骤：
3.1)将质量分数为1-2％牛血清白蛋白溶解到磷酸盐缓冲液-吐温20中配制成封闭液，将制备好的凝集素芯片置于封闭液中1小时；
3.2)将封闭后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次3分钟，再经甩干后备用；
3.3)对甩干后的凝集素芯片加入3-5μg标记好的样本和750-850μL的孵育缓冲液，并在室温孵育3小时；
3.4)将孵育后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次3分钟，再甩干；
3.5)对甩干后的凝集素芯片用芯片扫描仪扫描，得到凝集素与标记后糖蛋白结合的荧光图像；
3.6)通过芯片分析软件对荧光图像进行中值读取，对图像中的凝集素所对应的糖链结构分析后得出甲型流感病毒亚型及其毒力的结果。
2.根据权利要求1所述的用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，其特征在于：
所述步骤1中制备凝集素芯片包括以下步骤：
1)取环氧化片基备用；
2)将凝集素配制成浓度为1mg/ml的点样液；
3)将配制的点样液加到384孔板内；再用芯片点样仪在环氧化片基上点样；
4)将点制好的芯片在湿度为55％-65％的环境中孵育2.5-3.5小时；
5)对孵育好的芯片在37℃的环境中抽真空3小时，使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；
6)将固定好的凝集素芯片放置在干燥器中以备用。
3.根据权利要求1所述的用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，其特征在于：所述步骤2中制备生物样本包括以下步骤：
1)准备所需样本；
2)用分析纯***对样本病毒充***解；
3)对裂解后的病毒进行浓缩至含病毒蛋白至少0.1mg/mL，形成浓缩样本；
4)用荧光试剂对浓缩样本进行标记，去除未反应的荧光试剂；
5)将标记好的样本分装冻存于-20℃以下的环境中。
4.根据权利要求3所述的用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，其特征在于：所述步骤1中的样本为高致病性样本或低致病性样本。
5.根据权利要求4所述的用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，其特征在于：所述高致病性样本包括H5N1代表性的毒株DK/GD/17/08、H5N1代表性的毒株CK/GX/4/09、H5N2代表性的毒株Mallard/JX/16/05、H7N1代表性的毒株KP。
6.根据权利要求4所述的用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，其特征在于：
所述低致病性样本包括H5N2代表性的毒Ostrich/Denmark/96-72420/96、N7N2代表性的毒株HB7、H9N2代表性的毒株CK/FJ/S-1-521/08、H9N2代表性的毒株DK/GD/S-7-134/04。
7.根据权利要求2所述的用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，其特征在于：
所述步骤4)中将点制好的芯片在湿度为60％的环境中孵育3小时。
8.根据权利要求1所述的用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，其特征在于：
所述步骤3)中对甩干后的凝集素芯片加入4μg标记好的样本和780μL的孵育缓冲液，并在室温孵育3小时。
9.根据权利要求1所述的用凝集素芯片同时分析甲型流感病毒亚型及其毒力的方法，其特征在于：所述步骤3.6)中的凝集素为2种以上。
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