ES2312349T3 - Toxinas de escorpion de buthotus judaicus. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la SEC ID Nº: 2; (c) una secuencia de nucleótidos que comprende el complemento de (a) o (b); y (d) una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 21-86 de la SEC ID Nº:2.
Description
Toxinas de escorpión de Buthotus
judaicus.
Esta solicitud reivindica el beneficio de la
Solicitud Provisional de EE.UU. Nº 60/140.410, presentada el 22 de
junio de 1999.
Esta invención se encuentra en el campo de la
biología molecular. Más específicamente, esta invención pertenece a
fragmentos de ácido nucleico que codifican toxinas de escorpión que
son modificadores del canal de sodio.
Las neurotoxinas alfa son polipéptidos cortos de
cadena sencilla responsables del envenenamiento de insectos y
mamíferos. Estas neurotoxinas muestran una variabilidad en su
toxicidad aparente, en sus estructuras primarias y en sus
propiedades de unión a preparaciones de membrana neuronal (Dufton y
Rochat (1984) J. Mol. Evol. 20: 120-127). A pesar
de las diferencias en sus estructuras primarias y en la selectividad
filogenética, las neurotoxinas de escorpión que afectan a los
canales de sodio (Na) están estrechamente relacionadas con sus
disposiciones espaciales y forman una estructura globular compacta
que se mantiene rígida gracias a cuatro puentes disulfuro (Miranda
y col. (1970) Eur. J. Biochem. 16: 514-523; y
Fontecilla-Camps (1989) J. Mol. Evol. 29:
63-67).
Zilbergberg y colaboradores determinaron que
algunos residuos de aminoácido sencillos eran importantes en la
unión de receptor y en la actividad biológica de las toxinas de
canal de Na de escorpión (Zilbergberg y col. (1997) J. Biol. Chem.
272: 14810-14816). A modo de ejemplo, se demostró
que la lisina de la posición 8 de LqhlT era necesaria para la
actividad de unión y de toxicidad sin un cambio en la estructura
glotal. Se descubrió una caída sustancial de la actividad biológica
sin un cambio significativo de la estructura cuando el aminoácido
aromático fenilalanina, en la posición 17, era sustituido por una
glicina. Por el contrario, los cambios en la estructura no están
asociados necesariamente a diferencias en la toxicidad, tal como
demostró cuando se cambió la tirosina de la posición 49 por una
leucina.
Aunque se ha demostrado que los canales de
potasio (K) son básicos en la función cardíaca, el papel de los
canales de cloro (Cl) y Na en dicha actividad está menos claro
(Johnson y col. (1998) J. Neurogent. 12: 1-24). La
entrada de sodio hiperpolariza la célula, produciendo cambios
indirectos dependientes de Na en el transporte de calcio (Friedman
(1998) Annu. Rev. Physiol. 60: 179-197). Se cree que
un influjo anormal de calcio es muy importante en la patogénesis de
varios trastornos del sistema nervioso central en vertebrados, que
incluyen el daño por apoplejía, la epilepsia y la muerte neuronal
asociada a la epilepsia crónica.
Los aminoácidos excitadores, más notablemente el
glutamato y el aspartato, son los neurotransmisores excitadores
predominantes en el sistema nervioso central de los vertebrados
(incluyendo los humanos). Estos aminoácidos son liberados de los
terminales presinápticos nerviosos, para después difundir a través
de la fisura sináptica y entrar en contacto con moléculas
receptoras especiales de la membrana celular postsináptica. Estos
receptores influyen indirectamente en el flujo de varios iones a
través de la membrana celular y contribuyen de este modo a la
producción de una respuesta eléctrica al mensaje químico entregado
por las moléculas de neurotransmisor. Una serie de problemas
neurológicos comunes y muy graves implican un funcionamiento anormal
de la sinapsis de aminoácidos excitadores. Éstos incluyen
epilepsia, varios trastornos degenerativos tales como la enfermedad
de Huntington, y la muerte neuronal tras una apoplejía.
Desafortunadamente, existen muy pocos agentes químicos que sean
bloqueadores potentes y selectivos de los receptores de aminoácidos
excitadores. Los modificadores del canal de Na pueden usarse para
estos propósitos.
Es de esperar que un fármaco con una elevada
afinidad por el receptor produzca un bloqueo irreversible de la
transmisión sináptica. Cuando se marca con alguna molécula
trazadora, dicho fármaco proporcionaría un modo fiable de marcado
de receptores para permitir la medida de su número y su distribución
en las células y tejidos. Estas propiedades tendrían consecuencias
muy valiosas para la investigación de la neurotransmisión de
aminoácidos excitadores y para el desarrollo de agentes
terapéuticos para tratar disfunciones del sistema nervioso central
en humanos y en animales. En bibliografía se han descrito métodos
para tratar enfermedades cardíacas y neurológicas aplicando toxinas
derivadas de arañas (Patente de EE.UU. Nº 4.925.664).
Los animales artrópodos, que incluyen a los
insectos, y determinados gusanos parasitarios usan aminoácidos
excitadores como neurotransmisor principal en su unión neuromuscular
y en su sistema nervioso central. Debido al daño provocado por las
plagas de insectos y a la prevalencia de infecciones de gusanos
parasitarios en animales y humanos en muchos países, existe una
constante necesidad de obtener nuevos pesticidas potentes y
específicos y nuevos fármacos antihelmínticos que no sean tóxicos
para humanos, mascotas y animales de granja.
Los insecticidas químicos son un componente
integral de la agricultura moderna y constituyen un medio eficaz de
reducir el daño a los cultivos mediante el control de plagas de
insectos. Sin embargo, los agentes químicos se encuentran bajo una
continua vigilancia debido a su potencial de contaminación
ambiental, a la selección de poblaciones resistentes a las plagas
agronómicas y a la toxicidad con respecto a organismos no
implicados, tales como insectos beneficiosos, organismos acuáticos,
animales y humanos. Como resultado, se están estudiando estrategias
alternativas para el control de insectos que sean eficaces a la vez
que benignas para las poblaciones no afectadas y para el entorno.
Una de dichas estrategias es el uso de microorganismos que son
patógenos naturales de las poblaciones de insecto objetivo. La
expresión de toxinas de escorpión usando vectores de baculovirus
constituirá una ventaja, ya que se ha demostrado previamente que
dichas toxinas son altamente tóxicas y muy específicas (Zlotkin y
col. (1995) American Chemical Society, Symposium on
Agrochemicals).
Debido a una combinación de problemas asociados
a algunos insecticidas sintéticos, que incluyen toxicidad, peligros
medioambientales y pérdida de eficacia debido a resistencia, existe
una continua necesidad de desarrollar nuevos medios para el control
de invertebrados, que incluyen el desarrollo de baculovirus
recombinantes diseñados genéticamente que expresen toxinas
proteicas capaces de incapacitar al anfitrión más rápidamente que la
propia infección por baculovirus.
Los venenos de escorpión han sido identificados
como posibles fuentes de compuestos que proporcionan propiedades
insecticidas. Previamente se han publicado dos toxinas selectivas de
insectos aisladas a partir de veneno del escorpión Leiurus
quinquestriatus y que afectan a la conductancia de sodio
(Zlotkin y col. (1985) Arch. Biochem. Biophys. 240:
877-87). Una toxina, AaIT, indujo una parálisis
contractiva excitadora rápida en larvas de mosca y la otra, LqhlT2,
indujo una parálisis flácida depresiva lenta, lo que sugiere que
estas dos toxinas tienen diferentes propiedades químicas y
farmacológicas (Zlotkin y col. (1971) Biochimie (París), 53:
1073-1078). Por tanto, otras toxinas derivadas de
veneno de escorpión también presentarán diferentes propiedades
químicas y farmacológicas.
La presente invención se refiere a un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 1, (b) una secuencia de nucleótidos de
la SEC ID Nº: 2, y (c) una secuencia de nucleótidos que comprende el
complemento de (a) ó (b).
En una realización adicional, esta invención se
refiere a un gen quimérico que comprende un polinucleótido aislado
de la presente invención ligado operativamente a al menos una
secuencia reguladora adecuada.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a una célula anfitriona que comprende un gen
quimérico de la presente invención. La célula anfitrión puede ser
eucariótica, tal como una célula de levadura o una célula vegetal,
una célula de insecto o una célula de mamífero, o procariótica, tal
como una célula bacteriana. La presente invención también se
refiere a un virus, preferiblemente un baculovirus, que comprende
un polinucleótido aislado de la presente invención.
También se describe un proceso para producir una
célula anfitriona que comprende un gen quimérico de la presente
invención o un polinucleótido aislado de la presente invención,
proceso que comprende la transformación o la transfección de una
célula anfitriona compatible con un gen quimérico o un
polinucleótido aislado de la presente invención.
También se describe un polipéptido agonista de
canal de Na de escorpión de al menos 60 aminoácidos que comprende
al menos un 80% de identidad basándose en el método Clustal de
alineamiento en comparación con un polipéptido seleccionado del
grupo que consiste en las SEC ID Nºs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,
18, 20, 29, 31, 33, 35 y 37.
También se describe un método para obtener un
fragmento de ácido nucleico que codifica una porción sustancial de
un polipéptido agonista de canal de Na de escorpión, que comprende
las etapas de: sintetizar un oligonucleótido cebador que comprende
una secuencia de nucleótidos de al menos uno de 60 (preferiblemente
al menos uno de 40, más preferiblemente al menos uno de 30)
nucleótidos contiguos derivados de una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nºs: 1, 3, 5, 7,
9, 11, 13, 15, 17, 19, 28, 30, 32, 34 y 36, y el complemento de
dichas secuencias de nucleótidos; y amplificar un fragmento de ácido
nucleico (preferiblemente un ADNc insertado en un vector de
clonación) usando el cebador de oligonucleótido. El fragmento de
ácido nucleico amplificado codificará preferiblemente una porción
sustancial de una secuencia de aminoácidos agonista de canal de Na
de
escorpión.
escorpión.
También se describe un método para obtener un
fragmento de ácido nucleico que codifica toda, o una porción
sustancial, la secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido
agonista de canal de Na de escorpión que comprende las etapas de:
sondear un librería genómica o de ADNc con un polinucleótido aislado
de la presente invención; identificar un clon de ADN que se hibride
con un polinucleótido aislado de la presente invención; aislar el
clon de ADN identificado; y secuenciar un fragmento genómico o de
ADNc que comprende el clon de ADN aislado.
En una realización adicional, esta invención se
refiere a una composición, tal como una mezcla de hibridación, que
comprende un polinucleótido aislado o un polipéptido aislado de la
presente invención.
También se describe un método para expresar un
gen que codifica agonista de canal de Na en el genoma de un
baculovirus recombinante en un cultivo de célula de insecto o en
insectos viables en donde dichas células de insecto o dichos
insectos han sido modificados genéticamente para expresar un AAH
IT4, un precursor LqhlT2, un precursor IT-2, un
TsnTxp, una toxina insecticida, un precursor BmK M1, una neurotoxina
V-5 o una neurotoxina AS. El vector de expresión de
baculovirus recombinante comprende una secuencia de ADN que codifica
un polipéptido de al menos 60 aminoácidos que comprende una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las
SEC ID Nºs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 29, 31, 33, 35 y
37.
La invención puede comprenderse mejor a partir
de la siguiente descripción detallada, de las figuras anexas y del
Listado de Secuencias, que forman parte de esta solicitud.
La Figura 1 muestra el alineamiento entre la
secuencia de aminoácidos AAH IT4 procedente de Androctonus
australis hector (Identificador NCBI General Nº 134360; SEC ID
Nº: 21) y la secuencia de aminoácido derivada del presente clon de
Buthotus judaicus ibj1c.pk008.19 (SEC ID Nº: 2). La fila
superior indica mediante asteriscos (*) los aminoácidos conservados
en ambas secuencias. Los residuos de cisteína conservados que
probablemente están implicados en los puentes de disulfuro
intracadena están recuadrados.
La Figura 2 muestra el alineamiento entre la
secuencia de aminoácidos de precursor LqhlT2 de Leiurus
quinquestriatus hebraeus (Identificador NCBI General Nº
1078960, SEC ID Nº: 22) y la secuencia de aminoácidos derivada del
presente clon de Buthotus judaicus ibj1c.pk007.h18 (SEC ID
Nº: 4). La fila superior indica mediante asteriscos (*) los
aminoácidos conservados en ambas secuencias. Los residuos de
cisteína conservados que probablemente están implicados en los
puentes de disulfuro intracadena están recuadrados.
La Figura 3 muestra el alineamiento entre la
secuencia de aminoácidos de precursor IT-2 de
Hottentotta judaica (Identificador NCBI General Nº 134344,
SEC ID Nº: 23) y la secuencia de aminoácidos derivada del presente
clon de Buthotus judaicus ibj 1 c.pk008.c4 (SEC ID Nº: 6). La
fila superior indica mediante asteriscos (*) los aminoácidos
conservados en ambas secuencias. Los residuos de cisteína
conservados que probablemente están implicados en los puentes de
disulfuro intracadena están recuadrados.
La Figura 4 muestra el alineamiento entre la
secuencia de aminoácidos de TsnTxp de Tityus serrulatus
(Identificador NCBI General Nº 3293263, SEC ID Nº: 24) y las
secuencias de aminoácidos derivadas de los presentes clones de
Buthotus judaicus ibj1c.pk006.o21 (SEC ID Nº: 8) e
ibj1c.pk007.c5 (SEC ID Nº: 10). La fila superior indica mediante
asteriscos (*) los aminoácidos conservados en las tres secuencias.
Los residuos de cisteína conservados que probablemente están
implicados en los puentes de disulfuro intracadena están
recuadrados.
La Figura 5 muestra el alineamiento entre la
secuencia de aminoácidos de toxina insecticida Osl-1
de Orthochirus scrobiculosus (Identificador NCBI General Nº
3273105, SEC ID Nº: 25) y la secuencia de aminoácidos derivada del
presente clon de Buthotus judaicus ibj1c.pk008.k24 (SEC ID
Nº: 12). La fila superior indica mediante asteriscos (*) los
aminoácidos conservados en ambas secuencias. Los residuos de
cisteína conservados que probablemente están implicados en los
puentes de disulfuro intracadena están recuadrados.
La Figura 6 muestra el alineamiento entre la
secuencia de aminoácidos de precursor BmK M1 de Mesobuthus
martensii (Identificador NCBI General Nº 3047323, SEC ID Nº: 26)
y las secuencias de aminoácidos derivadas de los presentes clones
de Buthotus judaicus ibj 1c.pk007.f5 (SEC ID Nº: 14),
ibj1c.pk007.h1 (SEC ID Nº: 16), e ibj1c.pk007.p23 (SEC ID Nº: 18).
La fila superior indica mediante asteriscos (*) los aminoácidos
conservados en todas las secuencias. Los residuos de cisteína
conservados que probablemente están implicados en los puentes de
disulfuro intracadena están recuadrados.
La Figura 7 muestra el alineamiento entre la
secuencia de aminoácidos de neurotoxina V-5 de
Centruroides exilicauda (Identificador NCBI General Nº
102790, SEC ID Nº: 27) y la secuencia de aminoácidos deducida del
presente clon de Buthotus judaicus ibj1c.pk005.k22 (SEC ID
Nº: 20). La fila superior indica mediante asteriscos (*) los
aminoácidos conservados en ambas secuencias. Los residuos de
cisteína conservados que probablemente están implicados en los
puentes de disulfuro intracadena están recuadrados.
La Figura 8 muestra el alineamiento entre la
secuencia de aminoácidos de neurotoxina AS de Burthus
martensii (Identificador NCBI General Nº 5712121, SEC ID Nº:
38) y la secuencia de aminoácidos derivada del presente clon de
Buthotus judaicus ibj 1c.pk006.f4 (SEC ID Nº: 29). La fila
superior indica mediante asteriscos (*) los aminoácidos conservados
en ambas secuencias. Los residuos de cisteína conservados que
probablemente están implicados en los puentes de disulfuro
intracadena están recuadrados.
La Figura 9 muestra el alineamiento entre la
secuencia de aminoácidos de toxina insecticida de Orthochirus
scrobiculosus (Identificador NCBI General Nº 3273105, SEC ID Nº:
25) y las secuencias de aminoácidos derivadas de los presentes
clones de Buthotus judaicus ibj1c.pk0004.h3 (SEC ID Nº: 31),
ibj1c.pk006.p4 (SEC ID Nº: 33), ibj1c.pk008.f14 (SEC ID Nº: 35) e
ibj1c.pk008.119 (SEC ID Nº: 37). La fila superior indica mediante
asteriscos (*) los aminoácidos conservados en todas las secuencias,
y con signos positivos (+) que los aminoácidos están conservados
únicamente entre las secuencias de Buthotus judaicus. Los
residuos de cisteína conservados que probablemente están implicados
en los puentes de disulfuro intracadena están recuadrados.
\newpage
Las siguientes descripciones de secuencias y el
Listado de Secuencias anexo cumplen las reglas que gobiernan las
descripciones de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos en
solicitudes de patente, tal como se establece en 37 C.F.R.
\NAK1.821-1.825.
La SEC ID Nº: 1 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc en el clon
ibj1c.pk008.19 que codifica un AAH IT4 de Buthotus judaicus
completo con su secuencia de señal entera.
La SEC ID Nº: 2 es la secuencia de aminoácidos
deducida para un AAH IT4 de Buthotus judaicus completo, con
su secuencia de señal completa derivada de la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 1. La toxina madura sin su señal de
secuencia consiste en los aminoácidos 21 a 86.
La SEC ID Nº: 3 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj 1c.pk007.h18 que codifica un precursor LqhlT2 de escorpión
entero con su secuencia señal completa.
La SEC ID Nº: 4 es la secuencia de aminoácidos
deducida de un precursor LqhlT2 entero de escorpión con su
secuencia señal completa derivada de la secuencia de nucleótidos de
la SEC ID Nº: 3. La toxina madura sin su secuencia señal consiste
en los aminoácidos 22 a 84.
La SEC ID Nº: 5 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj 1c.pk008.c4 que codifica un precursor IT-2
entero de Buthotus judaicus con su secuencia señal
completa.
La SEC ID Nº:6 es la secuencia de aminoácidos
deducida de un precursor IT-2 entero de Buthotus
judaicus con su secuencia señal completa derivada de la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 5. La toxina madura sin
su secuencia señal consiste en los aminoácidos 20 a 82.
La SEC ID Nº: 7 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk006.o21 que codifica un Tsn Txp entero de Buthotus
judaicus con su secuencia señal completa.
La SEC ID Nº: 8 es la secuencia de aminoácidos
deducida de un TsnTxp entero de Buthotus judaicus con su
secuencia señal completa derivada de la secuencia de nucleótidos que
consiste en los aminoácidos 19 a 82.
La SEC ID Nº: 9 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk007.c5 que codifica un TsnTxp de Buthotus judaicus
con su secuencia señal completa.
La SEC ID Nº: 10 es la secuencia de aminoácidos
deducida de un TsnTxp entero de Buthotus judaicus con su
secuencia señal completa derivada de una secuencia de nucleótidos de
la SEC ID Nº: 9. La toxina madura sin su secuencia señal consiste
en los aminoácidos 22 a 83.
La SEC ID Nº: 11 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk008.k24 que codifica un Osl-1 casi completo
de Buthotus judaicus con una porción de su secuencia
señal.
señal.
La SEC ID Nº: 12 es la secuencia de aminoácidos
deducida de un Osl-1 casi entero de Buthotus
judaicus con una porción de su secuencia señal derivada de la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 11. La toxina madura sin
su secuencia señal consiste en los aminoácidos 19 a 80.
La SEC ID Nº: 13 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk007.f5 que codifica un precursor BmK M1 entero de
Buthotus judaicus con su secuencia señal completa.
La SEC ID Nº: 14 es la secuencia de aminoácidos
deducida de un precursor BmK M1 entero de Buthotus judaicus
con su secuencia señal completa derivada de la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 13. La toxina madura sin su secuencia
señal consiste en los aminoácidos 20 a 82.
La SEC ID Nº: 15 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk007.h1 que codifica un precursor BmK M1 entero de
Buthotus judaicus con su secuencia señal completa.
La SEC ID Nº: 16 es la secuencia de aminoácidos
deducida de un precursor BmK M1 entero de Butholus judaicus
con su secuencia señal completa derivada de la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 15. La toxina madura sin su secuencia
señal consiste en los aminoácidos 24 a 84.
La SEC ID Nº: 17 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk007.p23 que codifica un precursor BmK M1 entero de
Buthotus judaicus con su secuencia de señal completa.
La SEC ID Nº: 18 es la secuencia de aminoácidos
deducida de un precursor BmK M1 entero de Buthotus judaicus
con su secuencia señal completa derivada de la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 17. La toxina madura sin su secuencia
señal consiste en los aminoácidos 20 a 83.
La SEC ID Nº: 19 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk005.k22 que codifica una neurotoxina V-5
entera de Buthotus judaicus con una porción de su secuencia
señal.
La SEC ID Nº: 20 es la secuencia de aminoácidos
deducida de una neurotoxina V-5 entera de
Buthotus judaicus con una porción sustancial de su secuencia
señal derivada de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 19.
La toxina madura sin su secuencia señal consiste en los aminoácidos
21 a 94.
La SEC ID Nº: 21 es la secuencia de aminoácidos
del AAH IT4 de Androctonus australis hector que tiene el
Identificador NCBI General Nº: 1078960.
La SEC ID Nº: 22 es la secuencia de aminoácidos
del precursor LqhlT2 de Leiurus quinquestriatus hebraeus que
tiene el Identificador NCBI General Nº 1078960.
La SEC ID Nº: 23 es la secuencia de aminoácidos
del precursor IT-2 de Hottentotta judaica que
tiene el Identificador NCBI General Nº: 134344.
La SEC ID Nº: 24 es la secuencia de aminoácidos
del TsnTxp de Tityus serrulatus que tiene el Identificador
NCBI General Nº 3293263.
La SEC ID Nº: 25 es la secuencia de aminoácidos
de la toxina insecticida Osl-1 de Orthochirus
scrobiculosus que tiene el Identificador NCBI General Nº
3273105.
La SEC ID Nº: 26 es la secuencia de aminoácidos
del precursor BmK M1 de Mesobuthus martensii que tiene el
Identificador NCBI General Nº 3047323.
La SEC ID Nº: 27 es la secuencia de aminoácidos
de la neurotoxina V-5 de Centruroides
exilicauda que tiene el Identificador NCBI General Nº
102790.
La SEC ID Nº: 28 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk006.f4 que codifica una neurotoxina AS entera con su
secuencia señal completa.
La SEC ID Nº: 29 es la secuencia de aminoácidos
deducida de una neurotoxina AS entera de Buthotus judaicus
con su secuencia señal completa derivada de la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 28. La toxina madura sin su secuencia
señal consiste en los aminoácidos 22 a 82.
La SEC ID Nº: 30 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk0004.h3 que codifica una toxina insecticida entera con su
secuencia señal completa.
La SEC ID Nº: 31 es la secuencia de aminoácidos
de una toxina insecticida entera de Buthotus judaicus con su
secuencia señal completa derivada de la secuencia de nucleótidos de
la SEC ID Nº: 30. La toxina madura sin su secuencia señal consiste
en los aminoácidos 22 a 89.
La SEC ID Nº: 32 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk006.p4 que codifica una toxina insecticida completa con su
secuencia señal completa.
La SEC ID Nº: 33 es la secuencia de aminoácidos
deducida de una toxina insecticida entera de Buthotus
judaicus con su secuencia señal completa derivada de la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 32. La toxina madura sin
su secuencia señal consiste en los aminoácidos 22 a 89.
La SEC ID Nº: 34 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj 1c.pk008.f14 que codifica una toxina insecticida completa con su
secuencia señal completa.
La SEC ID Nº: 35 es la secuencia de aminoácidos
deducida de una toxina insecticida entera de Buthotus
judaicus con su secuencia señal completa derivada de la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 34. La toxina madura sin
su secuencia señal consiste en los aminoácidos 22 a 89.
La SEC ID Nº: 36 es la secuencia de nucleótidos
que comprende una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk008.119 que codifica una toxina insecticida entera con su
secuencia señal completa.
La SEC ID Nº: 37 es la secuencia de aminoácidos
deducida de una toxina insecticida entera de Buthotus
judaicus con su secuencia señal completa derivada de la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 36. La toxina madura sin
su secuencia señal consiste en los aminoácidos 22 a 89.
La SEC ID Nº: 38 es la secuencia de aminoácidos
de la neurotoxina AS de Buthus martensii que tiene el
Identificador NCBI General Nº 5712121.
\newpage
El Listado de Secuencias contiene el código de
una letra para caracteres de secuencia de nucleótidos y los códigos
de tres letras para aminoácidos, tal como se define de conformidad
con los estándares de la IUPAC-IUBMB descritos en
Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985) y en
Biochemical Journal 219 (Nº 2): 345-373 (1984). Los
símbolos y el formato usado para los datos de secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos se ciñen a las normas establecidas en
37 C.F.R. \NAK1.822.
En el contexto de esta descripción se utilizan
una serie de expresiones. Las expresiones "polinucleótido",
"secuencia de polinucleótido", "secuencia de ácido
nucleico" y "fragmento de ácido nucleico"/"fragmento de
ácido nucleico aislado" se usan indistintamente en la presente
memoria. Dichos términos abarcan secuencias de nucleótidos y
similares. Un polinucleótidos puede ser un polímero de ARN o ADN de
cadena sencilla o doble, que contiene opcionalmente bases de
nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un polinucleótido
en la forma de un polímero de ADN puede estar compuesto por uno o
más segmentos de ADNc, ADN genómico, ADN sintético, o mezclas de
los
mismos.
mismos.
"NPV" significa virus de polihedrosis
nuclear, un baculovirus. "Polihedrosis" se refiere a cualquiera
de las diversas enfermedades de larvas de insectos que se
caracterizan por la disolución de tejidos y la acumulación de
gránulos polihedrales en el fluido resultante. "PIBs" son
cuerpos de inclusión polihedrales. "AcNPV" significa virus de
polihedrosis nuclear de Autographa californica natural.
Las expresiones "modificador del canal de
Na", "agonista del canal de Na", "modificador del canal de
sodio" y "agonista del canal de sodio" se usan
indistintamente en la presente memoria.
La expresión "polinucleótido aislado" se
refiere a un polinucleótido que está sustancialmente libre de otras
secuencias de ácido nucleico tales como, aunque sin limitación,
otros ADN y ARN cromosomales y extracromosomales. Los
polinucleótidos aislados pueden purificarse a partir de una célula
anfitriona en la que existen de forma natural. Se pueden usar los
métodos convencionales de purificación de ácidos nucleicos conocidos
por los especialistas en la técnica para obtener polinucleótidos
aislados. La expresión también abarca polinucleótidos recombinantes
y polinucleótidos sintetizados químicamente.
La expresión "recombinante" significa, por
ejemplo, que una secuencia de ácido nucleico se obtiene mediante
una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados,
por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación
de ácidos nucleicos aislados a través de técnicas de ingeniería
genética.
Tal como se usa en la presente memoria, la
expresión "sustancialmente similar" se refiere a fragmentos de
ácido nucleico en los que cambios en una o más bases de nucleótido
dan como resultado la sustitución de uno o más aminoácidos, pero no
afectan a las propiedades funcionales del polipéptido codificado por
la secuencia de nucleótidos. Las expresiones "sustancialmente
similar" y "sustancialmente correspondiente" se usan en la
presente memoria de forma indistinta.
Por ejemplo, las alteraciones en un gen que dan
como resultado la producción de un aminoácido químicamente
equivalente en una posición dada, pero que no afectan a las
propiedades funcionales de la proteína codificada, son bien
conocidas en la técnica. Así, un codón para el aminoácido alanina,
un aminoácido hidrofóbico, puede ser sustituido por un codón que
codifique otro residuo menos hidrofóbico, tal como glicina, u otro
residuo más hidrofóbico, tal como valina, leucina o isoleucina. De
forma similar, los cambios que dan como resultado la sustitución de
un residuo cargado negativamente por otro, tal como ácido aspártico
por ácido glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro,
tal como lisina por arginina, también es de esperar que puedan
producir un producto funcionalmente equivalente. Todas las
modificaciones propuestas son rutinarias en la técnica, como
también lo es la determinación de la retención de la actividad
biológica de los productos codificados.
Además, fragmentos de ácido nucleico
sustancialmente similares también pueden caracterizarse por su
capacidad para hibridarse. Las estimaciones para dicha homología
vienen dadas por la hibridación ADN-ADN ó
ADN-ARN en condiciones severas, como es bien sabido
por los especialistas en la técnica (Hames y Higgins, Eds. (1985)
Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, R.U.). Las
condiciones de severidad pueden ajustarse para escrutar un
fragmento moderadamente similar, tal como secuencias homólogas de
organismos lejanamente relacionados, hasta fragmentos altamente
similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales a
partir de organismos estrechamente relacionados. Los lavados de
post-hibridación determinan las condiciones de
severidad. Un conjunto de condiciones preferidas usa una serie de
lavados que comienzan con 6X SSC, SDS al 0,5% a temperatura ambiente
durante 15 minutos, a continuación se repite con 2X SSC, SDS al
0,5% a 45ºC durante 30 minutos, y después se repite dos veces con
0,2X SSC, SDS al 0,5% a 50ºC durante 30 minutos. Un conjunto de
condiciones de severidad más preferido emplea mayores temperaturas
y los lavados son idénticos a los descritos antes excepto por la
temperatura de los últimos dos lavados de 30 minutos con 0,2X SSC,
SDS al 0,5%, que se aumentó a 60ºC. Otro conjunto preferido de
condiciones altamente severas utiliza dos lavados finales con 0,1X
SSC, SDS al 0,1% a 65ºC.
También se pueden caracterizar fragmentos de
ácido nucleico sustancialmente similares mediante el porcentaje de
identidad de las secuencias de aminoácido que codifican a las
secuencias de aminoácido descritas en la presente memoria,
determinado a través de algoritmos empleados comúnmente por los
especialistas en esta técnica. Los fragmentos de ácido nucleico
adecuados codifican polipéptidos que son idénticos en al menos
aproximadamente un 70%, preferiblemente en al menos aproximadamente
un 80%, a las secuencias de aminoácidos presentadas en la presente
memoria. Los fragmentos de ácido nucleico preferidos codifican
secuencias de aminoácidos que son idénticas en aproximadamente un
85% a las secuencias de aminoácidos presentadas en la presente
memoria. Los fragmentos de ácido nucleico más preferidos codifican
secuencias de aminoácidos que son idénticas en al menos
aproximadamente un 90% a las secuencias de aminoácidos presentadas
en la presente memoria. Los fragmentos de ácidos nucleicos aún más
preferidos que codifican secuencias de aminoácidos que son idénticas
en al menos aproximadamente un 95% a las secuencias de aminoácidos
presentadas en la presente memoria. Los fragmentos de ácido
nucleico adecuados no sólo presentan las anteriores identidades sino
que típicamente codifican un polipéptido que tiene al menos 50
aminoácidos, preferiblemente al menos 100 aminoácidos, más
preferiblemente al menos 150 aminoácidos, aún más preferiblemente
al menos 200 aminoácidos, y aún más preferiblemente al menos 250
aminoácidos. Los alineamientos de secuencia y los cálculos de
porcentaje de identidad se llevaron a cabo usando el programa
Megalign de la sala de computación bioinformática LASERGENE (DNASTAR
Inc., Madison, WI). El alineamiento múltiple de las secuencias se
llevó a cabo usando el método Clustal de alineamiento (Higgins y
Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153) con los parámetros
fijados por defecto (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10).
Los parámetros por defecto para los alineamientos por pares usando
el método Clustal fueron KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 y
DIAGONALS SAVED = 5.
Una "porción sustancial" de una secuencia
de aminoácidos o nucleótidos comprende una secuencia de aminoácidos
o nucleótidos que es suficiente para permitir una identificación
putativa de la proteína o gen que comprende la secuencia de
aminoácidos o nucleótidos. Las secuencias de aminoácidos y de
nucleótidos pueden ser evaluadas manualmente por un especialista en
la técnica o usando herramientas de comparación e identificación de
secuencias basadas en ordenadores que emplean algoritmos tal como
el BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul y col. (1993)
J. Mol. Biol. 215: 403-410; véase también
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). En general, se necesita una
secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o de treinta o más
nucleótidos contiguos a fin de identificar putativamente una
secuencia de polipéptido o de ácido nucleico como homóloga a una
proteína o gen conocidos. Además, con respecto a las secuencias de
nucleótidos, se pueden usar sondas de oligonucleótidos específicas
de genes que comprendan 30 o más nucleótidos contiguos en métodos
dependientes de la secuencia para la identificación de genes (por
ejemplo, hibridación Southern) y para el aislamiento de los mismos
(por ejemplo, la hibridación in situ de colonias bacterianas
o de placas bacteriófagas). Adicionalmente, se pueden usar
oligonucleótidos cortos de 12 o más nucleótidos como cebadores para
amplificación PCR a fin de obtener un fragmento de ácido nucleico
particular que comprenda los cebadores. Por consiguiente, una
"porción sustancial" de una secuencia de nucleótidos comprende
una secuencia de nucleótidos que permita la identificación y/o
aislamiento específicos de un fragmento de ácido nucleico que
comprenda la secuencia. La presente especificación muestra
secuencias de aminoácidos y de nucleótidos que codifican
polipéptidos que comprenden una o más proteínas de artrópodo
particulares. El especialista en la técnica, aprovechando las
secuencias presentadas en la presente memoria, puede usar las
secuencias descritas, enteras o una parte sustancial, para
propósitos conocidos por los especialistas en esta técnica.
"Degeneración de codón" se refiere a una
divergencia en el código genético que permite una variación de la
secuencia de nucleótidos sin afectar a la secuencia de aminoácidos
de un polipéptido codificado. El especialista en la técnica será
consciente del "comportamiento de codón" mostrado por una
célula anfitriona específica en el uso de codones de nucleótido
para especificar un aminoácido dado. Por tanto, cuando se sintetiza
un fragmento de ácido nucleico para obtener una mejor expresión en
una célula anfitriona, es deseable diseñar el fragmento de ácido
nucleico de tal modo que su frecuencia de uso de codón se aproxime a
la frecuencia de uso de codón preferida de la célula
anfitriona.
Los "fragmentos de ácido nucleico
sintéticos" pueden montarse a partir de bloques de construcción
de oligonucleótidos que son sintetizados químicamente usando
procedimientos conocidos por el especialista en la técnica. Estos
bloques de construcción son ligados y madurados para formar
fragmentos de ácido nucleico de mayor tamaño, que a continuación
pueden ser ensamblados enzimáticamente para construir el fragmento
de ácido nucleico deseado completo. "Sintetizados
químicamente", en referencia a un fragmento de ácido nucleico,
significa que los nucleótidos que lo componen fueron ensamblados
in vitro. La síntesis química manual de fragmentos de ácido
nucleico puede llevarse a cabo usando procedimientos bien
establecidos, o se puede llevar a cabo una síntesis química
automatizada usando una entre varias máquinas disponibles
comercialmente. Por consiguiente, los fragmentos de ácido nucleico
pueden diseñarse para una expresión génica óptima en base a la
optimización de la secuencia de nucleótidos para reflejar el tipo
de codón de la célula anfitriona. El especialista apreciará la
probabilidad de una expresión génica exitosa si el uso del codón
tiende hacia los codones favorecidos por el anfitrión. La
determinación de los codones preferidos puede basarse en un
escrutinio de genes derivados de la célula anfitriona cuando se
dispone de la información.
"Gen" se refiere a un fragmento de ácido
nucleico que expresa una proteína específica, que incluye secuencias
reguladoras que preceden (secuencias 5' no codificadoras) y que
siguen (secuencias 3' no codificadoras) a la secuencia
codificadora. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como se
encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras.
"Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen
nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificadoras que no
se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen
quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias
codificadoras derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de un
modo diferente al encontrado en la naturaleza. "Gen endógeno"
se refiere a un gen nativo en su localización natural dentro del
genoma de un organismo. Un "gen extraño" se refiere a un gen
que normalmente no se encuentra en el organismo anfitrión, sino que
se introduce en el organismo anfitrión mediante transferencia
génica. Los genes extraños pueden comprender genes nativos
insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un
"transgén" es un gen que ha sido introducido en el genoma
mediante un procedimiento de transformación.
"Secuencia codificadora" se refiere a una
secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de
aminoácidos específica. "Secuencias reguladoras" se refiere a
secuencias de nucleótidos localizadas por encima (secuencias 5' no
codificadoras), en medio o por debajo (secuencias 3' no
codificadoras) de una secuencia codificadora, y que influyen en la
transcripción, el procesado de ARN o la estabilidad, o la traducción
de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras
pueden incluir promotores, secuencias directoras de la traducción,
intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.
"Promotor" se refiere a una secuencia de
nucleótidos capaz de controlar la expresión de una secuencia
codificadora o de un ARN funcional. En general, una secuencia
codificadora se localiza 3' respecto a una secuencia promotora. La
secuencia promotora consta de elementos por encima proximales y más
distales, referidos estos últimos como potenciadores. Por
consiguiente, un "potenciador" es una secuencia de nucleótidos
que puede estimular la actividad de promotor y puede ser un
elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para
potenciar el nivel o la especificidad de tejido de un promotor. Los
promotores pueden derivar en su totalidad de un gen nativo, o
pueden estar compuestos por diferentes elementos derivados que se
encuentran en la naturaleza, o incluso pueden comprender segmentos
de nucleótidos sintéticos. Los especialistas entenderán que
diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en
diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes estadios de
desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los
promotores que hacen que un fragmento de ácido nucleico se exprese
en la mayoría de tipos celulares la mayor parte del tiempo, son
denominados comúnmente "promotores constitutivos".
Continuamente se están descubriendo nuevos promotores de diversos
tipos útiles en una serie de células; pueden encontrarse numerosos
ejemplos en la recopilación realizada por Okamuro y Goldberg (1989)
Biochemistry of Plants 15: 1-82. También se
reconoce que, ya que en la mayoría de los casos las fronteras
exactas de las secuencias reguladoras no han sido definidas
completamente, fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden
presentar idénticas actividades de promotor.
"Secuencia directora de la traducción" se
refiere a una secuencia de nucleótidos localizada entre la secuencia
promotora de un gen y la secuencia codificadora. La secuencia
directora de la traducción está presente en ARNm totalmente
procesado por encima de la secuencia de inicio de la traducción. La
secuencia directora de la traducción puede afectar al procesado del
tránscrito primario a ARNm, a la estabilidad del ARNm o a la
eficacia de la traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias
directoras de la traducción (Turner y Foster (1995) Mol.
Biotechnol. 3: 225-236).
"Secuencias 3' no codificadoras" se refiere
a secuencias de nucleótidos localizadas por debajo de una secuencia
codificadora e incluyen secuencias de reconocimiento de
poliadenilación y otras secuencias que codifican señales
reguladoras capaces de afectar al procesado de ARNm o a la expresión
génica. La señal de poliadenilación se caracteriza normalmente por
afectar a la adición de extensiones de ácido poliadenílico en el
extremo 3' del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias
3' no codificadoras se presenta, por ejemplo, en Ingelbrecht y col.
(1989) Plant Cell 1: 671-680.
"Tránscrito de ARN" se refiere al producto
que resulta de la transcripción catalizada por polimerasa de ARN de
una secuencia de ADN. Cuando el tránscrito de ARN es una copia
perfectamente complementaria de la secuencia de ADN, se denomina
tránscrito primario, o puede ser una secuencia de ARN derivada a
partir del procesado post-transcripcional del
tránscrito primario y se denomina ARN maduro. "ARN mensajero
(ARNm)" se refiere al ARN que está sin intrones y que puede ser
traducido en polipéptidos por la célula. "ADNc" se refiere a
ADN que es complementario y que deriva de una plantilla de ARNm. El
ADNc puede ser de cadena sencilla o puede convertirse a la forma de
cadena doble usando, por ejemplo, el fragmento Klenow de polimerasa
I de ADN. "ARN sentido" se refiere a un tránscrito de ARN que
incluye el ARNm y que puede ser traducido en un polipéptido por la
célula. "ARN funcional" se refiere a ARN sentido, ARN
antisentido, ARN de ribozima u otro ARN que puede no estar
traducido pero que aún así tiene un efecto sobre los procesos
celulares.
El término "ligado operativamente" se
refiere a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico de
tal modo que la función de uno se ve afectada por el otro. Por
ejemplo, un promotor está ligado operativamente con una secuencia
codificadora cuando es capaz de afectar a la expresión de dicha
secuencia codificadora (es decir, que la secuencia codificadora
está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias
codificadoras pueden estar ligadas operativamente a secuencias
reguladoras en orientación sentido o antisentido.
El término "expresión", tal como se usa en
la presente memoria, se refiere a la transcripción y a la
acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o antisentido derivado
del fragmento de ácido nucleico de la invención. "Expresión"
también puede referirse a la traducción de ARNm en un polipéptido.
"Sobreexpresión" se refiere a la producción de un producto
génico en organismos transgénicos que excede los niveles de
producción en organismos normales o no transformados.
Una "proteína" o "polipéptido" es una
cadena de aminoácidos dispuestos en un orden específico determinado
por la secuencia codificadora en un polinucleótido que codifica el
polipéptido. Cada proteína o polipéptido tiene una función
única.
"Niveles alterados" o "expresión
alterada" se refieren a la producción de producto(s)
génico(s) en organismos transgénicos en cantidades o
proporciones que difieren de los organismos normales o no
transformados.
Una "secuencia señal" es una secuencia de
aminoácidos que está ligada covalentemente a una secuencia de
aminoácidos que representa una proteína madura. La secuencia señal
dirige la proteína al sistema secretor (Chrispeels (1991) Ann. Rev.
Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42: 21-53). "Proteína
madura" se refiere a un polipéptido procesado
post-traducción, es decir, uno al que se le ha
eliminado cualquier pre- o propéptido, incluyendo las secuencias
señal, presentes en el producto de traducción primaria. "Proteína
precursora" se refiere al producto primario de traducción de
ARNm, es decir, con pre- y propéptidos aún presentes. Los pre- y
propéptidos pueden ser, aunque sin limitación, señales de
localización intracelular.
"Transformación" se refiere a la
transferencia de un fragmento de ácido nucleico al genoma de un
organismo anfitrión, lo que da como resultado una herencia
genéticamente estable. Los organismos anfitriones que contienen los
fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos
"transgénicos". Los ejemplos de métodos de transformación de
plantas incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (De
Blaere y col. (1987) Meth. Enzymol. 143: 277) y la tecnología de
transformación acelerada por partículas o "pistola de genes"
(Klenin y col. (1987) Nature (Londres) 327: 70-73;
Patente de EE.UU. Nº 4.945.050, incorporadas a la presente memoria
a modo de referencia). Así, los polinucleótidos aislados de la
presente invención se pueden incorporar a construcciones
recombinantes, típicamente construcciones de ADN, capaces de
introducirse y replicarse en una célula anfitriona. Dicha
construcción puede ser un vector que incluya un sistema de réplica y
secuencias que sean capaces de transcripción y traducción de una
secuencia codificadora de polipéptido en una célula anfitriona. Se
ha descrito una serie de vectores adecuados para la transfección
estable de células vegetales o para la obtención de plantas
transgénicas en, por ejemplo, Powels y col., Cloning Vectors: A
Laboratory Manual, 1985, sup. 1987; Weissbach y Weissbach, Methods
for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; y Flevin y col.,
Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990.
Normalmente los vectores de expresión vegetales incluyen, por
ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control
transcripcional de secuencias reguladoras 3' y 5' y un marcador
seleccionable dominante. Dichos vectores de expresión vegetales
también pueden contener una región reguladora de promotor (por
ejemplo, una región reguladora que controla la expresión inducible o
constitutiva, regulada ambientalmente o en desarrollo, o la
expresión específica de célula o de tejido), una posición de inicio
de la transcripción, una posición de unión de ribosoma, una señal de
procesado de ARN, una posición de finalización de la transcripción
y/o una señal de poliadenilación.
Debe entenderse que "una célula de insecto"
se refiere a una o más células de insecto mantenidas in
vitro, así como a una o más células que se encuentran en un
insecto intacto vivo.
Las técnicas de clonación molecular y de ADN
recombinante estándares usadas en la presente memoria son bien
conocidas en la técnica y se describen con más detalle en Sambrook y
col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989 (a partir de aquí
"Maniatis").
La "PCR" o "reacción en cadena de
polimerasa" es bien conocida por los especialistas en la técnica
como una técnica usada para la amplificación de segmentos de ADN
específicos (Patentes de EE.UU. Nº 4.683.195 y 4.800.159).
Los fragmentos de ácido nucleico que codifican
al menos una porción sustancial de varios agonistas de canal de Na
de escorpión han sido aislados e identificados mediante comparación
de secuencias de ADNc de artrópodo aleatorias con bases de datos
públicas que contienen secuencias de nucleótidos y proteínas usando
los algoritmos BLAST, bien conocidos por los especialistas en la
técnica. La Tabla 1 enumera las proteínas que se describen en la
presente memoria, y la designación de los clones de ADNc que
comprenden los fragmentos de ácido nucleico que codifican dichas
proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos de ácido nucleico de la presente
invención pueden usarse para aislar ADNc y genes que codifican
proteínas homólogas a partir de la misma especie de artrópodo o de
otra. El aislamiento de genes homólogos usando protocolos
dependientes de secuencia es bien conocido en la técnica. Los
ejemplos de protocolos dependientes de secuencia incluyen, aunque
sin limitación, métodos de hibridación de ácido nucleico y métodos
de amplificación de ADN y ARN tal como queda patente a través de
diversos usos de tecnologías de amplificación de ácido nucleico
(por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa, reacción en cadena
de ligasa).
Por ejemplo, los genes que codifican otros AAH
IT4s, precursores LqhlT2, precursores IT-2, TsnTxps,
toxinas insecticidas, precursores BmK M1, neurotoxinas
V-5s, o neurotoxinas AS, tanto como ADNcs o ADNs,
podrían ser aislados directamente usando los fragmentos de ácido
nucleico presentes enteros, o una porción sustancial, como sondas
de hibridación de ADN para escrutar bibliotecas de cualquier
artrópodo de interés empleando una metodología bien conocida por
los especialistas en la técnica. Las sondas de oligonucléotidos
específicas basadas en las presentes secuencias de ácido nucleico
pueden diseñarse y sintetizarse empleando métodos conocidos en la
técnica (Maniatis). Además, la(s) secuencia(s)
entera(s) puede(n) usarse directamente para sintetizar
sondas de ADN empleando métodos conocidos por el especialista tales
como el marcado aleatorio de ADN con cebador, la traducción de
sobrenombre, técnicas de marcado en los extremos o sondas de ARN
usando sistemas de transcripción in vitro disponibles.
Además, se pueden diseñar y usar cebadores específicos para
amplificar las presentes secuencias enteras, o una parte. Los
productos resultantes de la amplificación pueden ser marcados
directamente durante las reacciones de amplificación o pueden
marcarse después de las reacciones de amplificación, y pueden
usarse como sondas para aislar fragmentos de genómicos o ADNc de
longitud completa en las condiciones de severidad apropiadas.
Adicionalmente, se pueden usar dos segmentos
cortos de los presentes fragmentos de ácido nucleico en los
protocolos de reacción en cadena de polimerasa para amplificar
fragmentos de ácido nucleico mayores que codifican genes homólogos
a partir de ADN o ARN. La reacción en cadena de polimerasa también
puede llevarse a cabo sobre una biblioteca de fragmentos de ácido
nucleico clonados en la que la secuencia de un cebador es derivada a
partir de los fragmentos de ácido nucleico presentes, y la
secuencia del otro cebador aprovecha la presencia de extensiones de
ácido poliadenílico en el extremo 3' del precursor de ARNm que
codifica genes de artrópodo. Alternativamente, la segunda secuencia
de cebador puede basarse en las secuencias derivadas del vector de
clonación. Por ejemplo, el especialista en la técnica puede seguir
el protocolo RACE (Frohman y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85: 8998-9002) para generar ADNc usando PCR para
amplificar copias de la región entre un punto individual del
tránscrito y el extremo 3' ó 5'. Se pueden diseñar cebadores
orientados en las direcciones 3' ó 5' a partir de las presentes
secuencias. Usando sistemas 3' RACE ó 5' RACE disponibles
comercialmente (BRL), se pueden aislar fragmentos de ADNc 3' ó 5'
específicos (Ohara y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
5673-5677; Loh y col. (1989) Science 243:
217-220). Los productos generados mediante los
procedimientos 3' y 5' RACE se pueden combinar para generar ADNc de
longitud completa (Frohman y Martin (1989) Techniques 1: 165). Por
consiguiente, se puede usar un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos de al menos 60 (preferiblemente una de al
menos 40, más preferiblemente una de al menos 30) nucleótidos
contiguos derivados de una secuencia de nucleótidos seleccionada
del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,
17, 19, 28, 30, 32, 34 y 36, y el complemento de dichas secuencias
de nucleótidos puede usarse en dichos métodos para obtener un
fragmento de ácido nucleico que codifica una porción sustancial de
una secuencia de aminoácidos de un polipéptido.
La presente solicitud describe un método para
obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica una porción
sustancial de un polipéptido de agonista de canal de Na,
preferiblemente una porción sustancial de un AAH IT4, precursor
LqhlT2, precursor IT-2, TsnTxp, toxina insecticida,
precursor BmK M1, neurotoxina V-5 o polipéptido de
neurotoxina AS de artrópodo, que comprende las etapas de: sintetizar
un cebador de oligonucleótido que comprende una secuencia de
nucleótidos de al menos 60 (preferiblemente una de al menos 40, más
preferiblemente una de al menos 30) nucleótidos contiguos derivados
de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste
en las SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 28, 30, 32, 34
y 36, y el complemento de dichas secuencias de nucleótidos; y
amplificar un fragmento de ácido nucleico (preferiblemente un ADNc
insertado en un vector de clonación) usando el cebador de
oligonucleótido. El fragmento de ácido nucleico amplificado
codificará preferiblemente una porción sustancial de un AAH IT4, de
un precursor LqhlT2, de un precursor IT-2, de un
Tsn Txp, de una toxina insecticida, de un precursor BmK M1, de una
neurotoxina V-5 o de una neurotoxina AS.
La disponibilidad del presente nucleótido y de
las presentes secuencias de aminoácidos deducidas facilita el
escrutinio inmunológico de bibliotecas de expresión de ADNc. Se
pueden sintetizar péptidos sintéticos que representen porciones
sustanciales de las presentes secuencias de aminoácidos. Dichos
péptidos pueden usarse para inmunizar animales para producir
anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidad por
péptidos o proteínas que comprenden las secuencias de aminoácido.
Dichos anticuerpos pueden usarse entonces para escrutar bibliotecas
de expresión de ADNc para aislar clones de ADNc de longitud completa
de interés (Learner (1984) Adv. Immunol. 36: 1-34;
Maniatis).
En otra realización, esta invención se refiere a
células anfitrionas que comprenden los genes quiméricos de la
invención tal como se describen en la presente memoria y a virus.
Los ejemplos de células anfitrionas que pueden usarse para llevar a
la práctica la invención incluyen, aunque sin limitación, levaduras,
bacterias, plantas, mamíferos e insectos.
Los fragmentos de ácido nucleico de la presente
invención pueden usarse para crear plantas transgénicas en las que
se expresan los agonistas de canal de Na descritos. Esto sería útil
como medio para controlar plagas de insectos mediante la producción
de plantas que sean más tolerantes a insectos que las variedades
naturales.
La expresión en plantas de las proteínas de la
presente invención puede llevarse a cabo construyendo en primer
lugar un gen quimérico en el que la región codificadora está ligada
operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión de un
gen en los tejidos deseados en el estadio de desarrollo deseado. Por
razones de comodidad, el gen quimérico puede comprender secuencias
promotoras y secuencias directoras de la traducción derivadas de
los mismos genes. También se pueden proporcionar secuencias 3' no
codificadoras que codifiquen las señales de finalización de la
transcripción. El presente gen quimérico también puede comprender
uno o más intrones a fin de facilitar la expresión génica.
A continuación se pueden construir los vectores
de plásmido que comprenden el presente gen quimérico. La elección
de vector de plásmido depende del método que vaya a usarse para
transformar plantas anfitrionas. El especialista en la técnica es
consciente de los elementos genéticos que puede haber presentes en
el vector de plásmido con el objetivo de transformar, seleccionar y
propagar con éxito las células anfitrionas que contienen el gen
quimérico. El especialista también reconocerá que diferentes eventos
de transformación independientes darán como resultado diferentes
niveles y modelos de expresión (Jones y col. (1985) EMBO J. 4:
2411-2418; De Almeida y col. (1989) Mol. Gen.
Genetics 218: 78-86), y por tanto que deben
escrutarse múltiples eventos con el objetivo de obtener líneas que
presenten el nivel y el modelo de expresión deseado. Dicho
escrutinio puede llevarse a cabo mediante análisis Southern de ADN,
análisis Northern de expresión de ARNm, análisis Western de
expresión de proteína, LC-MS, o análisis
fenotípicos.
Los presentes polipéptidos (o porciones
sustanciales de los mismos) pueden producirse en células anfitrionas
heterólogas, particularmente en las células de anfitriones
microbianos, y pueden usarse para preparar anticuerpos a estas
proteínas mediante métodos bien conocidos por los especialistas en
la técnica. Los anticuerpos son útiles para detectar los
polipéptidos de la presente invención in situ en células o
in vitro en extractos celulares. Las células anfitrionas
heterólogas preferidas para la producción de los polipéptidos
presentes son anfitriones microbianos. Los sistemas de expresión y
los vectores de expresión microbianos que contienen secuencias
reguladoras que dirigen una expresión de alto nivel de proteínas
extrañas son bien conocidos por los especialistas en la técnica.
Cualquier de ellos podría ser usado para construir un gen quimérico
para la producción de los presente polipéptidos. Dicho gen
quimérico podría ser introducido entonces en microorganismos
apropiados a través de una transformación para proporcionar un
elevado nivel de expresión del agonista de canal de Na de escorpión
codificado. Se proporciona un ejemplo de un vector para expresión de
alto nivel de los presentes polipéptidos en un anfitrión bacteriano
(Ejemplo 8).
Los baculovirus insecticidas tienen un gran
potencial para proporcionar un método medioambientalmente benigno
para el control de plagas de insectos en agricultura. Sin embargo,
se requieren mejoras en la eficacia a fin de hacer que estos
agentes sean competitivos con los actuales agentes químicos de
control de plagas. Una estrategia para lograr dichas mejoras es a
través de la alteración genética del virus. Por ejemplo, puede ser
posible modificar el genoma vírico con el objetivo de mejorar el
rango de anfitriones del virus, para aumentar la estabilidad
medioambiental y la persistencia del virus, o para mejorar la
capacidad de infección y de transmisión del virus. Adicionalmente,
la mejora de la velocidad de actuación del virus para comprometer al
insecto infectado aumentaría significativamente el atractivo de los
baculovirus insecticidas como adyuvantes o sustitutos de los
agentes químicos de control de plagas. Un método para aumentar la
velocidad con que el virus afecta a su insecto anfitrión consiste
en introducir en el baculovirus genes extraños que codifiquen
proteínas que son tóxicas para el insecto, en donde la muerte o la
incapacitación del insecto ya no depende únicamente del curso de la
infección vírica, sino que también se ve ayudada por la acumulación
de niveles tóxicos de la proteína extraña. El resultado son
baculovirus insecticidas recombinantes.
Se pueden preparar baculovirus recombinantes que
expresen los presentes agonistas de canal de Na de escorpión (o
porciones sustanciales de los mismos) empleando protocolos conocidos
hoy día por los especialistas en la técnica (por ejemplo, Tomalski
y col., Patente de EE.UU. Nº 5.266.317, que muestra neurotoxinas
procedentes de ácaros parasitarios; McCutchen y col. (1991)
Bio/Technology 9: 848-852; Maeda y col. (1991)
Virology 184: 777-780, que ilustra la construcción
de un baculovirus recombinante que expresa AaIT, véase también
O'Reilly y col. (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory
Manual, W. H. Freeman y Compañía, Nueva York; King y Possee (1992)
The Baculovirus Expression System, Chapman y Hall, Londres, Patente
de EE.UU. Nº 4.745.051). Estos métodos de expresión génica
proporcionan preparaciones económicas de proteínas extrañas en un
sistema de vector de expresión eucariótico, en muchos casos dando
lugar a proteínas que han alcanzado su conformación terciaria
apropiada y que han formado los puentes de disulfuro apropiados
necesarios para su actividad.
Comúnmente, la introducción de genes heterólogas
en el genoma del baculovirus se produce mediante recombinación
homóloga entre el ADN genómico y un "vector de transferencia"
adecuado que contiene el gen heterólogo de interés. Dichos vectores
de transferencia son generalmente ADN de plásmido que es capaz de
una replicación autónoma en anfitriones bacterianos, permitiendo
una fácil manipulación genética. Los vectores de transferencia de
baculovirus también contienen una construcción genética que
comprende una región del genoma vírico que ha sido modificada para
incluir las siguientes características (enumeradas en la dirección
5' a 3'): 1) ADN vírico que comprende la región 5' de una región
genómica no esencial; 2) un promotor vírico; 3) una o más secuencias
de ADN que codifican posiciones de restricción de enzimas que
facilitan la inserción de secuencias de ADN heterólogas; 4) una
secuencia de finalización transcripcional; y 5) ADN vírico que
comprende la región 3' de una región genómica no esencial. Se
inserta un gen heterólogo de interés en el vector de transferencia
en la posición de restricción por debajo del promotor vírico. La
construcción resultante comprende un gen quimérico en el que el gen
heterólogo se encuentra bajo el control transcripcional del promotor
vírico y de las secuencias de finalización de la transcripción
presentes en el vector de transferencia. Además, este gen quimérico
está flanqueado por secuencias de ADN vírico que facilitan la
recombinación homóloga en una región no esencial del genoma vírico.
Los virus recombinantes son creados co-transfectando
células de insecto que son capaces de soportar una replicación
vírica con ADN genómico vírico y el vector de transferencia
recombinante. Se produce la recombinación homóloga entre las
secuencias flanqueantes de ADN vírico presentes en el vector de
transferencia y las secuencias homólogas del ADN genómico vírico y
da lugar a la inserción del gen quimérico en una región del genoma
vírico que no interrumpe la función vírica esencial. El virión
recombinante infeccioso consiste en el ADN genómico recombinado,
denominado vector de expresión de baculovirus, rodeado de una
cobertura de proteína.
En una realización preferida, la región no
esencial del genoma vírico que está presente en el vector de
transferencia comprende la región del ADN vírico responsable de la
producción de polihedrina. Lo más preferible es un vector de
transferencia que contiene el gen de polihedrina completo entre las
secuencias flanqueantes que están implicadas en la recombinación
homóloga. La recombinación con ADN genómico de virus que son
defectuosos en producción de polihedrina (debido a un defecto en la
copia genómica del gen de polihedrina) dará como resultado la
restauración del fenotipo positivo en polihedrina. Esta estrategia
facilita la identificación y la selección de virus
recombinantes.
En otra realización, el ADN genómico
baculovírico puede modificarse directamente mediante la introducción
de una única secuencia de reconocimiento de enzima de restricción
en una región no esencial del genoma vírico. Se puede construir un
gen quimérico que comprende el gen heterólogo que va a ser expresado
por el virus recombinante y que está ligado operativamente a
secuencias reguladoras capaces de dirigir la expresión génica en
células de insecto infectadas por baculovirus, y se puede insertar
directamente en el genoma vírico en la posición de restricción
única. Esta estrategia elimina tanto la necesidad de construcción de
vectores de transferencia como la dependencia de la recombinación
homóloga para la generación de virus recombinantes. Esta tecnología
es descrita por Ernst y col. (Ernst y col. (1994) Nuc. Acid Res. 22:
2855-2856), y en el documento WO 94/28114.
Los vectores de expresión de baculovirus
recombinantes adecuados para la entrega de neurotoxinas codificadas
genéticamente específicas de insecto requieren una expresión génica
de toxina óptima para obtener una máxima eficacia. El especialista
en la técnica puede usar una serie de estrategias para diseñar y
preparar baculovirus recombinantes en donde la expresión génica de
toxina da lugar a cantidades suficientes de toxina producida en el
tiempo apropiado durante la infección en una forma funcional y
disponible para unirse a las células diana del interior del insecto
anfitrión.
El fragmento génico de toxina aislado puede ser
digerido con enzimas apropiadas y puede insertarse en el plásmido
pTZ-18R (Pharmacia, Piscataway, NJ) en la posición
de clonación múltiple usando técnicas de clonación molecular
estándares. Tras la transformación de DH5\alphaMCR de E.
coli, se pueden elegir colonias aisladas y se puede preparar el
plásmido. Los clones positivos se identifican y se secuencian con
cebadores directos e inversos disponibles comercialmente.
Las células de Spodoptera frugiperda
(Sf-9) pueden propagarse en medio ExCell® 401 (JRH
Biosciences, Lenexa, KS) suplementado con suero fetal bovino al
3,0%. Se puede añadir Lipofectin® (50 \muL a 0,1 mg/mL, Gibco/BRL)
a una alícuota de 50 \muL del vector de transferencia que
contiene el gen de toxina de interés (500 ng) y se puede
co-transfectar AcNPV linealizado negativo en
polihedrina (2,5 \mug, ADN vírico Baculogold®, Pharmigen, San
Diego, CA). Las células Sf-9 (aproximadamente
monocapa del 50%) pueden co-transfectarse con la
disolución de ADN vírico/vector de transferencia. El fluido
sobrenadante procedente del experimento de
co-transfección puede recogerse a los 5 días de la
transfección y se pueden aislar los virus recombinantes empleando
protocolos estándar de purificación de placas, en donde sólo se
seleccionarán las placas positivas en polihedrina (Granados, R. R.,
Lawler, K. A., Virology (1981), 108, 297-308).
Para propagar el virus recombinante de interés,
las placas aisladas pueden seleccionarse y suspenderse en 500
\muL de medio ExCell® suplementado con un 2,5% de suero fetal
bovino. Se pueden inocular células Sf-9 en placas
petri de 35 mm (monocapa del 50%) con 100 \muL de la suspensión
vírica, y los fluidos sobrenadantes se recolectan a los 5 días de
la infección. Estos fluidos sobrenadantes se usarán para inocular
cultivos para la propagación a gran escala de virus
recombinante.
La expresión del gen de toxina codificado por el
baculovirus recombinante será confirmada usando un bioensayo, LCMS
o anticuerpos. La presencia de actividad de toxina en los virus
recombinantes se seguirá in vivo. Estos ensayos implican la
comparación de la actividad biológica de los virus recombinantes con
la de los virus naturales. Se infectan oralmente larvas de tercera
etapa de H. Virescens mediante consumo de una dieta que
contiene virus de ensayo y de control, y las larvas son controladas
para estudiar los cambios de comportamiento y la mortalidad.
Se inoculan bolos aislados de una dieta de
insecto estándar con aproximadamente 5000 PIBs de cada virus. Se
permite que las larvas individuales que no se han alimentado durante
las 12 h previas al inicio del bioensayos consuman la dieta durante
24 h. Las larvas son transferidas a pocillos individuales en una
bandeja de dieta y son monitorizadas para estudiar los síntomas y
la mortalidad diariamente (Zlotkin y col. (1991) Biochimie (París)
53: 1073-1078).
La presente invención queda definida
adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos, en los que las
partes y porcentajes se definen en peso y los grados son Celsius, a
menos que se indique lo contrario. Cabe destacar que estos
Ejemplos, aunque indican las realizaciones preferidas de la
invención, se proporcionan únicamente a modo de ilustración.
Se prepararon bibliotecas de ADNc que
representan ARNm de telsones de Buthotus judaicus. Las
bibliotecas de ADNc pueden prepararse mediante uno cualquiera de
los muchos métodos disponibles. Por ejemplo, los ADNc pueden
introducirse en vectores de plásmido preparando primero las
bibliotecas de ADNc en vectores UniZAP^{TM} XR de acuerdo con el
protocolo del fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA).
Las bibliotecas Uni-ZAP^{TM} XR se convierten en
bibliotecas de plásmidos según el protocolo proporcionado por
Stratagene. En la conversión, los injertos de ADNc quedarán
contenidos en el vector de plásmido pBluescript. Adicionalmente,
los ADNc pueden introducirse directamente en vectores precortados
Bluescript II SK(+) (Stratagene) usando ligasa T4 de ADN (New
England Biolabs), seguido de transfección en células DH10B según el
protocolo del fabricante (GIBCO BRL Products). Una vez que los
injertos de ADNc están en vectores de plásmido, se preparan los ADNs
de plásmido a partir de colonias bacterianas seleccionadas
aleatoriamente que contienen los plásmidos pBluescript
recombinantes, o se amplifican las secuencias de ADNc mediante
reacción en cadena de polimerasa usando cebadores específicos para
las secuencias de vector que flanquean a las secuencias de ADNc
insertadas. Los ADNs insertados amplificados o los ADNs de plásmido
son secuenciados en reacciones de colorante-cebador
para generar secuencias de ADNc parciales (etiquetas de secuencias
expresadas o "ESTs", véase Adams y col., (1991) Science 252:
1651-1656). Las ESTs resultantes son analizadas
usando un secuenciador fluorescente Perkin Elmer Modelo 377.
\vskip1.000000\baselineskip
Los agonistas de canal de Na que codifican ESTs
fueron identificados llevando a cabo búsquedas BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool; Altschul y col. (1993) J. Mol. Biol. 215:
403-410; véase también
www.ncbi.nlm.nih.
gov/BLAST/) para determinar la similitud con secuencias contenidas en la base de datos BLAST "nr" (que comprende todas las traducciones no redundantes de CDS del GenBank, las secuencias derivadas del Brookhaven Protein Data Bank de estructuras 3-dimensionales, la última liberación principal de la base de datos de secuencias de proteínas de SWISS-PROT, EMBL, y bases de datos DDBJ). Las secuencias de ADNc obtenidas en el Ejemplo 1 fueron analizadas para determinar la similitud con todas las secuencias de ADN disponibles públicamente contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTN proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI). Las secuencias de ADN fueron traducidas en todos los marcos de lectura y fueron comparadas para determinar la similitud con todas las secuencias de proteínas disponibles públicamente contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTX (Gish y States (1993) Nat. Genet. 3: 266-272) proporcionado por el NCBI. Para mayor comodidad, el valor-P (probabilidad) de la observación de una coincidencia de secuencia de ADNc con una secuencia contenida en las bases de datos analizadas meramente por probabilidad calculado mediante BLAST se presenta en la presente memoria como valores "pLog", que representan el negativo del logaritmo del valor-P reportado. Por consiguiente, cuanto mayor es el valor pLog, mayor es la probabilidad de que la secuencia de ADNc y la "coincidencia" de BLAST representen proteínas homólogas.
gov/BLAST/) para determinar la similitud con secuencias contenidas en la base de datos BLAST "nr" (que comprende todas las traducciones no redundantes de CDS del GenBank, las secuencias derivadas del Brookhaven Protein Data Bank de estructuras 3-dimensionales, la última liberación principal de la base de datos de secuencias de proteínas de SWISS-PROT, EMBL, y bases de datos DDBJ). Las secuencias de ADNc obtenidas en el Ejemplo 1 fueron analizadas para determinar la similitud con todas las secuencias de ADN disponibles públicamente contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTN proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI). Las secuencias de ADN fueron traducidas en todos los marcos de lectura y fueron comparadas para determinar la similitud con todas las secuencias de proteínas disponibles públicamente contenidas en la base de datos "nr" usando el algoritmo BLASTX (Gish y States (1993) Nat. Genet. 3: 266-272) proporcionado por el NCBI. Para mayor comodidad, el valor-P (probabilidad) de la observación de una coincidencia de secuencia de ADNc con una secuencia contenida en las bases de datos analizadas meramente por probabilidad calculado mediante BLAST se presenta en la presente memoria como valores "pLog", que representan el negativo del logaritmo del valor-P reportado. Por consiguiente, cuanto mayor es el valor pLog, mayor es la probabilidad de que la secuencia de ADNc y la "coincidencia" de BLAST representen proteínas homólogas.
\vskip1.000000\baselineskip
La búsqueda BLASTX usando la secuencia EST del
clon ibj1c.pk008.I9 reveló una similitud de la proteína codificada
por el ADNc con AAH IT4 de Androctonus australis hector
(Identificador NCBI General Nº 134360; pLog = 23,52). La secuencia
de una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk008.I9 se muestra en la SEC ID Nº: 1; la secuencia de
aminoácidos deducida de este ADNc se muestra en la SEC ID Nº: 2.
Esta secuencia de aminoácidos contiene una secuencia señal
(aminoácidos 1-20) y una proteína madura
(aminoácidos 21-86). La secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID Nº: 2 se evaluó mediante BLASTP, dando lugar a
un valor pLog de 23,52 frente a la secuencia de Androctonus
australis hector. La Figura 1 presenta un alineamiento de las
secuencias de aminoácidos fijadas en la SEC ID Nº: 2 y la secuencia
de Androctonus australis hector (SEC ID Nº: 21). La
secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 2 es idéntica
en un 64,6% a la secuencia de Androctonus australis
hector.
La búsqueda BLASTX usando la secuencia EST del
clon ibj1c.pk007.h18 reveló similitud de la proteína codificada por
el ADNc con el precursor LqhIT2 de Leiurus quinquestriatus
hebraeus (Identificador NCBI General Nº 1078960; pLog = 10,70).
La secuencia de una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk007.h18 se muestra en la SEC ID Nº: 3; la secuencia de
aminoácidos deducida de este ADNc se muestra en la SEC ID Nº: 4.
Esta secuencia de aminoácidos contiene una secuencia señal
(aminoácidos 1-21) y una proteína madura
(aminoácidos 22-84). La secuencia de aminoácidos
fijada en la SEC ID Nº: 4 se evaluó mediante BLASTP, dando lugar a
un valor de pLog de 10,70 frente a la secuencia de Leiurus
quinquestriatus hebraeus. La Figura 2 presenta un alineamiento
de las secuencias de aminoácidos fijadas en la SEC ID Nº: 4 y la
secuencia de Leiurus quinquestriatus hebraeus (SEC ID Nº:
22). La secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 4 es
idéntica en un 28,6% a la secuencia de Leiurus quinquestriatus
hebraeus.
La búsqueda BLASTX usando la secuencia EST del
clon ibj1c.pk008.c4 reveló similitud de la proteína codificada por
el ADNc con el precursor IT-2 de Hottentotta
judaica (Identificador NCBI General Nº 134344; pLog = 13,44).
La secuencia de una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk008.c4 se muestra en la SEC ID Nº: 5; la secuencia de
aminoácidos deducida de este ADNc se muestra en la SEC ID Nº: 6.
Esta secuencia de aminoácidos contiene una secuencia señal
(aminoácidos 1-19) y una proteína madura
(aminoácidos 20-82). La secuencia de aminoácidos
fijada en la SEC ID Nº: 6 se evaluó mediante BLASTP, dando lugar a
un valor de pLog de 13,44 frente a la secuencia de Hottentotta
judaica. La Figura 3 presenta un alineamiento de las secuencias
de aminoácidos fijadas en la SEC ID Nº: 6 y la secuencia de
Hottentotta judaica (SEC ID Nº: 23). La secuencia de
aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 6 es idéntica en un 31,7% a
la secuencia de Hottentotta judaica.
La búsqueda BLASTX usando la secuencia EST del
clon ibj1c.pk006.o21 e ibj1c.pk007.c5 reveló similitud de la
proteína codificada por el ADNc con TsnTxp de Tityus
serrulatus (Identificador NCBI General Nº 3293263; pLog = 10,40
y 13,52; respectivamente). La secuencia de una porción sustancial
del injerto de ADNc del clon ibj1c.pk006.o21 se muestra en la SEC
ID Nº: 7; la secuencia de aminoácidos deducida de este ADNc se
muestra en la SEC ID Nº: 8. Esta secuencia de aminoácidos contiene
una secuencia señal (aminoácidos 1-18) y una
proteína madura (aminoácidos 19-82). La secuencia
de aminoácidos fijada en la SEC ID Nº: 8 se evaluó mediante BLASTP,
dando lugar a un valor de pLog de 10,40 frente a la secuencia de
Tityus serrulatus. La secuencia de una porción sustancial
del injerto de ADNc del clon ibj1c.pk007.c5 se muestra en la SEC ID
Nº: 9; la secuencia de aminoácidos deducida de este ADNc se muestra
en la SEC ID Nº: 10. Esta secuencia de aminoácidos contiene una
secuencia señal (aminoácidos 1-21) y una proteína
madura (aminoácidos 22-83). La secuencia de
aminoácidos fijada en la SEC ID Nº: 10 se evaluó mediante BLASTP,
dando lugar a un valor de pLog de 13,52 frente a la secuencia de
Tityus serrulatus La Figura 4 presenta un alineamiento de las
secuencias de aminoácidos fijadas en la SEC ID Nº: 8, la SEC ID Nº:
10 y la secuencia de Tityus serrulatus (SEC ID Nº: 24). La
secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 8 es idéntica
en un 30,5% a la secuencia de Tityus serrulatus mientras que
la secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 10 es
idéntica en un 37,3% a la secuencia de Tityus
serrulatus.
La búsqueda BLASTX usando la secuencia EST del
clon ibj1c.pk008.k24 reveló similitud de la proteína codificada por
el ADNc con la toxina insecticida Osl-1 de
Orthochirus scrobiculosus (Identificador NCBI General Nº
3273105; pLog = 19,00). La secuencia de una porción sustancial del
injerto de ADNc del clon ibj1c.pk008.k24 se muestra en la SEC ID
Nº: 11; la secuencia de aminoácidos deducida de este ADNc se muestra
en la SEC ID Nº: 12. Esta secuencia de aminoácidos contiene una
secuencia señal (aminoácidos 1-18) y una proteína
madura (aminoácidos 19-80). La secuencia de
aminoácidos fijada en la SEC ID Nº: 12 se evaluó mediante BLASTP,
dando lugar a un valor de pLog de 19,00 frente a la secuencia de
Orthochirus scrobiculosus. La Figura 5 presenta un
alineamiento de las secuencias de aminoácidos fijadas en la SEC ID
Nº: 12 y la secuencia de Orthochirus scrobiculosus (SEC ID
Nº: 25). La secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 12
es idéntica en un 50,0% a la secuencia de Orthochirus
scrobiculosus.
scrobiculosus.
La búsqueda BLASTX usando la secuencia EST del
clon ibj1c.pk007.f5, ibj1c.pk007.h1 e ibj1c.pk007.p23 reveló
similitud de la proteína codificada por el ADNc con el precursor BmK
M1 de Mesobuthus martensii (Identificador NCBI General Nº
30473233; pLog = 32,30, 24,00 y 22,15, respectivamente). La
secuencia de una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk007.f5 se muestra en la SEC ID Nº: 13; la secuencia de
aminoácidos deducida de este ADNc se muestra en la SEC ID Nº: 14.
Esta secuencia de aminoácidos contiene una secuencia señal
(aminoácidos 1-19) y una proteína madura
(aminoácidos 20-82). La secuencia de aminoácidos
fijada en la SEC ID Nº: 14 se evaluó mediante BLASTP, dando lugar a
un valor de pLog de 32,22 frente a la secuencia de Mesobuthus
martensii. La secuencia de una porción sustancial del injerto
de ADNc del clon ibj1c.pk007.h1 se muestra en la SEC ID Nº: 15; la
secuencia de aminoácidos deducida de este ADNc se muestra en la SEC
ID Nº: 16. Esta secuencia de aminoácidos contiene una secuencia
señal (aminoácidos 1-23) y una proteína madura
(aminoácidos 24-84). La secuencia de aminoácidos
fijada en la SEC ID Nº: 16 se evaluó mediante BLASTP, dando lugar a
un valor de pLog de 24,0 frente a la secuencia de Mesobuthus
martensii. La secuencia de una porción sustancial del injerto
de ADNc del clon ibj1c.pk007.p23 se muestra en la SEC ID Nº: 17; la
secuencia de aminoácidos deducida de este ADNc se muestra en la SEC
ID Nº: 18. Esta secuencia de aminoácidos contiene una secuencia
señal (aminoácidos 1-19) y una proteína madura
(aminoácidos 20-83). La secuencia de aminoácidos
fijada en la SEC ID Nº: 18 se evaluó mediante BLASTP, dando lugar a
un valor de pLog de 22,05 frente a la secuencia de Mesobuthus
martensii. La Figura 6 presenta un alineamiento de las
secuencias de aminoácidos fijadas en la SEC ID Nº: 14, la SEC ID
Nº: 16, la SEC ID Nº: 18 y la secuencia de Mesobuthus
martensii (SEC ID Nº: 26). La secuencia de aminoácidos
presentada en la SEC ID Nº: 14 es idéntica en un 72,6% a la
secuencia de Mesobuthus martensii, la secuencia de
aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 16 es idéntica en un 56,0% a
la secuencia de Mesobuthus martensii y la secuencia de
aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 18 es idéntica en un 47,0% a
la secuencia de Mesobuthus martensii.
La búsqueda BLASTX usando la secuencia EST del
clon ibj1c.pk005.k22 reveló similitud de la proteína codificada por
el ADNc con la neurotoxina V-5 de Centruroides
exilicauda (Identificador NCBI General Nº 102790; pLog = 5,30).
La secuencia de una porción sustancial del injerto de ADNc del clon
ibj1c.pk005.k22 se muestra en la SEC ID Nº: 19; la secuencia de
aminoácidos deducida de este ADNc se muestra en la SEC ID Nº: 20.
Esta secuencia de aminoácidos contiene una secuencia señal
(aminoácidos 1-20) y una proteína madura
(aminoácidos 21-99). La secuencia de aminoácidos
fijada en la SEC ID Nº: 20 se evaluó mediante BLASTP, dando lugar a
un valor de pLog de 5,30 frente a la secuencia de Centruroides
exilicauda. La Figura 7 presenta un alineamiento de las
secuencias de aminoácidos fijadas en la SEC ID Nº: 20 y la secuencia
de Centruroides exilicauda (SEC ID Nº: 27). La secuencia de
aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 20 es idéntica en un 28,8% a
la secuencia de Centruroides exilicauda.
Los datos de la Tabla 2 presentan los cálculos
del porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos
fijadas en las SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20, y las
secuencias de la base de datos NCBI (SEC ID Nº: 21, 22, 23, 24, 25,
26 y 27).
\vskip1.000000\baselineskip
Las alineaciones de secuencia y los cálculos de
porcentajes de identidad se llevaron a cabo usando el programa
Megalign de la sala de computación de bioinformática LASARGENE
(DNASTAR Inc., Madison, WI). La alineación por pares de las
secuencias se llevó a cabo usando el método Clustal de alineamiento
(Higgins, G. G. y Sharp, P. M. (1989) CABIOS. 5:
151-153) usando los parámetros por defecto (ktuple =
1, gap penalty = 3, window = 5, diagonals saved = 5). Los
parámetros por defecto para la alineación múltiple de las secuencias
usando el método Clustal fueron: gap penalty = 10, gap length
penalty = 10. Las alineaciones de secuencia, las puntuaciones y las
probabilidades BLAST indican que los presentes fragmentos de ácido
nucleico codifican diez modificadores canal de sodio de escorpión
distintos y de longitud completa, con secuencias señal completas o
casi completas: un AAH IT4, un precursor LqhlT2, un precursor
IT-2, dos TsnTxp, un Osl-1, dos
precursores BmK M1 y una neurotoxina V-5.
Un análisis más profundo de la base de datos de
propiedad DuPont permitió la identificación de otros agonistas de
canal de Na. La búsqueda BLASTX usando la secuencia EST del clon
ibj1c.pk006.f4 reveló una similitud de la proteína codificada por
el ADNc con neurotoxina AS de Buthus martensii (Identificador
NCBI General Nº 5712121; pLog = 6,72). La secuencia de una porción
sustancial del injerto de ADNc del clon ibj1c.pk006.f4 se muestra
en la SEC ID Nº: 28; la secuencia de aminoácidos deducida de este
ADNc se muestra en la SEC ID Nº: 29. Esta secuencia de aminoácidos
contiene una secuencia señal (aminoácidos 1-21) y
una proteína madura (aminoácidos 22-82). La
secuencia de aminoácidos fijada en la SEC ID Nº: 29 se evaluó
mediante BLASTP, dando lugar a un valor pLog de 11,00 frente a la
secuencia de Buthus martensii. La Figura 8 presenta un
alineamiento de las secuencias de aminoácidos fijadas en la SEC ID
Nº: 29 y en la secuencia de Buthus martensii (SEC ID Nº:
38). La secuencia de aminoácidos presentada en la SEC ID Nº: 29
tiene una identidad del 36,6% con respecto a la secuencia de
Buthus martensii.
Las alineaciones de secuencia y los cálculos de
porcentaje de identidad se realizaron usando el programa Megalign
de la sala de computación de bioinformática LASARGENE (DNASTAR Inc.,
Madison, WI). La alineación por pares de las secuencias se llevó a
cabo usando el método Clustal de alineamiento (Higgins, D. G. y
Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5: 151-153) usando los
parámetros por defecto (ktuple = 1, gap penalty = 3, window = 5,
diagonals saved = 5). Las alineaciones de secuencia, las
puntuaciones y las probabilidades BLAST indican que el presente
fragmento de ácido nucleico codifica una neurotoxina AS de escorpión
de longitud completa con su secuencia señal completa.
La búsqueda BLASTX usando la secuencia EST del
clon ibj1c.pk0004.h3, ibj1c.pk006.p4, ibj1c.pk008.f14 e
ibj1c.pk008.l19 reveló similitud de la proteína codificada por el
ADNc con toxina insecticida de Orthochirus scrobiculosus
(Identificador NCBI General Nº 3273105; pLog = 5,54, 4,27, 4,28 y
4,31, respectivamente). La secuencia de una porción sustancial del
injerto de ADNc del clon ibj1c.pk0004.h3 se muestra en la SEC ID Nº:
30; la secuencia de aminoácidos deducida de este ADNc se muestra en
la SEC ID Nº: 31. Esta secuencia de aminoácidos contiene una
secuencia señal (aminoácidos 1-21) y una proteína
madura (aminoácidos 22-89). La secuencia de
aminoácidos fijada en la SEC ID Nº: 31 se evaluó mediante BLASTP,
dando lugar a un valor de pLog de 6,05 frente a la secuencia de
Orthochirus scrobiculosus. La secuencia de una porción
sustancial del injerto de ADNc del clon ibj1c.pk006.p4 se muestra
en la SEC ID Nº: 32; la secuencia de aminoácidos deducida de este
ADNc se muestra en la SEC ID Nº: 33. Esta secuencia de aminoácidos
contiene una secuencia señal (aminoácidos 1-21) y
una proteína madura (aminoácidos 22-89). La
secuencia de aminoácidos fijada en la SEC ID Nº: 33 se evaluó
mediante BLASTP, dando lugar a un valor de pLog de 5,00 frente a la
secuencia de Orthochirus scrobiculosus. La secuencia de una
porción sustancial del injerto de ADNc del clon ibj1c.pk008.f14 se
muestra en la SEC ID Nº: 34; la secuencia de aminoácidos deducida
de este ADNc se muestra en la SEC ID Nº: 35. Esta secuencia de
aminoácidos contiene una secuencia señal (aminoácidos
1-21) y una proteína madura (aminoácidos
22-89). La secuencia de aminoácidos fijada en la
SEC ID Nº: 35 se evaluó mediante BLASTP, dando lugar a un valor de
pLog de 5,00 frente a la secuencia de Orthochirus
scrobiculosus. La secuencia de una porción sustancial del
injerto de ADNc del clon ibj1c.pk008.l19 se muestra en la SEC ID
Nº: 36; la secuencia de aminoácidos deducida de este ADNc se muestra
en la SEC ID Nº: 37. Esta secuencia de aminoácidos contiene una
secuencia señal (aminoácidos 1-21) y una proteína
madura (aminoácidos 22-89). La secuencia de
aminoácidos fijada en la SEC ID Nº: 37 se evaluó mediante BLASTP,
dando lugar a un valor de pLog de 5,00 frente a la secuencia de
Orthochirus scrobiculosus. La Figura 8 presenta un
alineamiento de las secuencias de aminoácidos fijadas en la SEC ID
Nº: 31, 33, 35 y 37 y la secuencia de Orthochirus
scrobiculosus (SEC ID Nº: 25). No hay más de 10 diferencias de
aminoácidos entre las secuencias de la presente invención. Fue
sorprendente descubrir que incluso aunque dichas secuencias sólo
tienen 7 residuos Cys, lo que las hace incapaces de formar 4
puentes de disulfuro como hacen normalmente los agonistas de canal
de Na, en los bioensayos mostraron actividad contra
lepidópteros.
Los datos de la Tabla 3 presentan los cálculos
de porcentajes de identidad de las secuencias de aminoácidos
fijadas en las SEC ID Nº: 31, 33, 35 y 37 con la secuencia de
Orthochirus scrobiculosus de Identificador NCBI General Nº
3273105 (SEC ID Nº: 25).
Las alineaciones de secuencia y los cálculos de
porcentaje de similitud se llevaron a cabo usando la sala de
computación de bioinformática LASARGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI).
La alineación múltiple de las secuencias se realizó usando el
método Clustal de alineamiento (Higgins, D. G. y Sharp, P. M. (1989)
CABIOS 5: 151-153) usando los parámetros por
defecto (gap penalty = 10, gap length penalty = 10). Las
alineaciones de secuencias, las puntuaciones BLAST y las
probabilidades indican que los presentes fragmentos de ácido
nucleico codifican cuatro toxinas insecticidas de escorpión
distintas y de longitud completa, con secuencias señal
completas.
Se puede construir un gen quimérico que
comprende un ADNc que codifica los presentes polipéptidos en
orientación sentido con respecto al promotor zein de 27 kD de maíz
que está localizado 5' respecto al fragmento de ADNc, y el extremo
3' de 10 kD de zein que está localizado 3' respecto al fragmento
ADNc. El fragmento de ADNc de este gen puede generarse mediante
reacción en cadena de polimerasa (PCR) del clon de ADNc usando los
cebadores de oligonucleótidos apropiados. Las posiciones de
clonación (Nco I ó Sma I) pueden incorporarse a los oligonucleótidos
para proporcionar una orientación apropiada al fragmento de ADN
cuando se inserta en el vector digerido pML103 tal como se indica a
continuación. A continuación se lleva a cabo la amplificación con
una PCR estándar. El ADN amplificado es digerido entonces con
enzimas de restricción Nco I y Sma I y es fraccionado sobre gel de
agarosa. La banda apropiada puede ser aislada a partir del gel y
combinarse con un fragmento Nco I-Sma I de 4,9 kb
del plásmido pML103. El plásmido pML103 ha sido depositado bajo los
términos del Tratado de Budapest en la ATCC (American Type Culture
Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA
20110-2209), y tiene el número de acceso ATCC
97366. El segmento de ADN de pML103 contiene un fragmento Sal
I-Nco I de promotor de 1,05 kb del gen zein de 27
kD de maíz y un fragmento Sma I-Sal I de 0,96 kb del
extremo 3' del gen zein de 10 kD de maíz en el vector pGem9Zf(+)
(Promega). El vector y el injerto de ADN pueden ligarse a 15ºC
durante una noche, esencialmente como se ha descrito anteriormente
(Maniatis). A continuación el ADN ligado puede usarse para
transformar XL1-Blue de E. coli (Epicurian
Coli XL-1 Blue^{TM}, Stratagene). Se pueden
escrutar los transformantes bacterianos mediante digestión con
enzimas de restricción del ADN de plásmido y mediante análisis
limitado de secuencia de nucleótidos usando el método de
finalización de cadena dideoxi (Sequenase^{TM} DNA Sequencing
Kit, U.S. Biochemical). La construcción de plásmido resultante
comprende un gen quimérico que codifica, en la dirección 5' a 3',
el promotor zein de 27 kD de maíz, un fragmento de ADNc que codifica
los presentes polipéptidos, y la región 3' de zein de 10 kD.
El gen quimérico descrito antes puede
introducirse entonces en células de maíz mediante el siguiente
procedimiento. Se pueden diseccionar embriones de maíz inmaduros a
partir de cariopsis en desarrollo derivadas de los cruces de las
líneas de maíz cultivadas H99 y LH132. Los embriones se aíslan 10 a
11 días después de la polinización cuando tienen una longitud de
1,0 a 1,5 mm. A continuación los embriones son colocados con el lado
del eje orientado hacia abajo y se ponen en contacto con medio N6
de agarosa solidificado (Chu y col., (1975) Sci. Sin. Peking 18:
659-668). Los embriones se mantienen a oscuras a
27ºC. Callos embriogénicos desmenuzables que consisten en masas no
diferenciadas de células con proembriodes somáticos y embriodes
sujetos en estructuras suspensoras proliferan a partir del escutelo
de dichos embriones inmaduros. Los callos embriogénicos aislados a
partir del explante primario pueden cultivarse en medio N6 y pueden
sub-cultivarse en este medio cada 2 a 3
semanas.
El plásmido p35S/Ac (obtenido por el Dr. Peter
Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Alemania) puede usarse en los
experimentos de transformación con el objetivo de proporcionar un
marcador seleccionable. Este plásmido contiene el gen Pat
(véase la Publicación de Patente Europea 0 242 236) que codifica
fosfinotricina acetil transferasa (PAT). La enzima PAT confiere
resistencia frente a inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas
tales como la fosfinotricina. El gen pat del p35S/Ac está
bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la
coliflor (Odell y col. (1985) Nature 313: 810-812) y
la región 3' del gen de nopalina sintasa del ADN-T
del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens.
El método del bombardeo de partículas (Klein y
col. (1987) Nature 327: 70-73) puede usarse para
transferir genes a las células de cultivo de callos. Según dicho
método, se recubren partículas de oro (de un diámetro de 1 \mum)
con ADN usando la siguiente técnica. Se añaden diez \mug de ADNs
de plásmido a 50 \muL de una suspensión de partículas de oro (60
mg por mL). Se añade cloruro cálcico (50 \muL de una disolución
2,5 M) y base libre de espermidina (20 \muL de una disolución 1,0
M) a las partículas. La suspensión se somete a vórtice durante la
adición de dichas disoluciones. Después de 10 minutos, los tubos de
centrifugan brevemente (5 segundos a 15.000 rpm) y se retira el
sobrenadante. Se vuelve a suspender las partículas en 200 \muL de
etanol absoluto, se centrifuga de nuevo y se vuelve a retirar el
sobrenadante. Se lleva a cabo un nuevo lavado con etanol y las
partículas se vuelven a suspender en un volumen final de 30 \muL
de etanol. Se puede colocar una alícuota (5 \muL) de partículas
de oro recubiertas de ADN en el centro de un disco volante
Kapton^{TM} (Bio-Rad Labs). A continuación las
partículas se aceleran al interior del tejido de maíz con un
Biolistic^{TM} PDS-1000/He
(Bio-Rad Instruments, Hercules CA), usando una
presión de helio aproximada de 69 bar (1.000 psi), una distancia de
huevo de 0,5 cm y una distancia de vuelo de 1,0 cm.
Para el bombardeo, el tejido embriogénico se
coloca sobre papel de filtro encima de medio N6 solidificado de
agarosa. El tejido se dispone en forma de una capa fina y cubriendo
un área circular de aproximadamente 5 cm de diámetro. La placa
petri que contiene el tejido puede colocarse en la cámara del
PDS-1000/He aproximadamente a 8 cm de la pantalla
de detención. Entonces de evacua el aire de la cámara hasta un vacío
de 71,12 cm (28 pulgadas) de mercurio (Hg). El macroportador es
acelerado con una onda de choque de helio usando una membrana de
rotura que cede cuando la presión de He en el tubo de choque alcanza
los 69 bares (1.000 psi).
Siete días después del bombardeo, el tejido
puede transferirse a medio N6 que contiene glufosinato (2 mg por
litro) y que carece de caseína o prolina. El tejido continúa
creciendo lentamente en este medio. Tras otras 2 semanas el tejido
puede ser transferido a medio N6 fresco que contiene glufosinato.
Después de 6 semanas, se pueden identificar áreas de
aproximadamente 1 cm de diámetro de callos en crecimiento activo en
algunas de las placas que contienen el medio suplementado con
glufosinato. Estos callos pueden continuar creciendo cuando son
sub-cultivados en el medio selectivo.
Las plantas pueden regenerarse a partir de
callos transgénicos transfiriendo en primer lugar las agrupaciones
de tejidos a medio N6 suplementado con 0,2 mg por litro de
2,4-D. Tras dos semanas el tejido puede ser
transferido a medio de regeneración (Fromm y col. (1990)
Bio/Technology 8: 833-839).
Se puede usar una construcción específica de
siembra compuesta por el promotor y el terminador de transcripción
del gen que codifica la subunidad \beta de la proteína de
almacenamiento de siembra faseolina procedente de alubia
Phaseolus vulgaris (Doyle y col. (1986) J. Biol. Chem. 261:
9228-9238) para la expresión de los presentes
polipéptidos en semilla de soja transformada. La construcción de
faseolina incluye aproximadamente 500 nucleótidos por encima (5')
del codón de inicio de la traducción y aproximadamente 1650
nucleótidos por debajo (3') del codón de parada de la traducción de
la faseolina. Entre las regiones 5' y 3' están las posiciones
únicas de restricción de endonucleasa Nco I (que incluye el codón de
inicio de la traducción ATG), Sma I, Kpn I y Xba I. La construcción
completa está flanqueada por las posiciones Hind III.
El fragmento de ADNc de este gen puede generarse
mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) del clon de ADNc
usando los cebadores de oligonucleótidos apropiados. Las posiciones
de clonación pueden incorporarse a los oligonucleótidos para
proporcionar una orientación apropiada del fragmento de ADN cuando
se inserta en el vector de expresión. A continuación se lleva a
cabo la amplificación como se ha descrito anteriormente, y el
fragmento aislado se inserta en un vector pUC 18 que porta la
construcción de semilla.
A continuación los embriones de semilla de soja
pueden ser transformados con el vector de expresión que comprende
secuencias que codifican los presentes polipéptidos. Para inducir
embriones somáticos, cotiledones, de 3-5 mm de
longitud separados de las semillas inmaduras esterilizadas
superficiales del cultivo de semilla de soja A2872, se puede
cultivar en luz u oscuridad a 26ºC en un medio de agar apropiado
durante 6-10 semanas. Los embriones somáticos que
producen embriones secundarios son escindidos a continuación y
colocados en un medio líquido adecuado. Tras una selección repetida
de agrupaciones de embriones somáticos que se multiplican como
embriones en etapa globular temprana, las suspensiones se mantienen
como se describe a continuación.
Los cultivos de suspensión embriogénica de
semilla de soja pueden mantenerse en 35 mL de medio líquido en un
agitador rotatorio, a 150 rpm, a 26ºC con luces fluorescentes en un
programa de 16:8 horas día/noche. Los cultivos son subcultivados
cada dos semanas mediante la inoculación de aproximadamente 35 mg de
tejido en 35 mL de medio líquido.
A continuación los cultivos de suspensión
embriogénica de semilla de soja pueden ser transformados por el
método del bombardeo de partículas (Klein y col. (1987) Nature
(Londres) 327: 70, Patente de EE.UU. Nº 4.945.050). Se puede usar
un instrumento Du Pont Biolistic^{TM} PDS1000/HE (actualización de
helio) para dichas transformaciones.
Un gen marcador seleccionable que puede usarse
para facilitar la transformación de las semillas de soja es un gen
quimérico compuesto por el promotor 35S del virus del mosaico de la
coliflor (Odell y col. (1985) Nature 313: 810-812),
el gen de higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E.
coli; Gritz y col. (1983) Gene 25: 179-188) y
la región 3' del gen de nopalina sintasa del ADN-T
del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. La
construcción de semilla que comprende la región 5' de faseolina, el
fragmento que codifica los presentes polipéptidos y la región 3' de
faseolina puede aislarse como un fragmento de restricción. Este
fragmento puede insertarse a continuación en una única posición de
restricción del vector que porta el gen marcador.
A 50 \muL de una suspensión de 60 mg/mL de
partículas de oro de 1 \mum se añade (por orden): 5 \muL de ADN
(1 \mug/\muL), 20 \muL de espermidina (0,1 M) y 50 \muL de
CaCl_{2} (2,5 M). La preparación de partículas se agita entonces
durante tres minutos, se gira en una micrófuga durante 10 segundos y
se retira el sobrenadante. A continuación las partículas
recubiertas con ADN se lavan una vez en 400 \muL de etanol al 70%
y se vuelven a suspender en 40 \muL de etanol anhidro. La
suspensión de partículas/ADN puede sonicarse tres veces durante un
segundo cada vez. Entonces de cargan cinco \muL de partículas de
oro recubiertas de ADN en cada disco del macroportador.
Se colocan aproximadamente
300-400 mg de un cultivo de suspensión de dos
semanas de edad en una placa petri vacía de 60x15 mm y el líquido
residual se retira del tejido con una pipeta. Para cada experimento
de transformación se bombardean aproximadamente
5-10 placas de tejido. La presión de rotura de
membrana se fija en 75,8 bares (1100 psi) y la cámara es evacuada
hasta un vacío de 71,12 cm (28 pulgadas) de mercurio (Hg). El tejido
se coloca aproximadamente a 8,89 cm (3,5 pulgadas) de la pantalla
de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el
tejido puede dividirse por la mitad y colocarse de nuevo en líquido
y cultivarse tal como se ha descrito antes.
De cinco a siete días después del bombardeo, el
medio líquido puede intercambiarse con medio fresco, y de once a
doce días después del bombardeo con medio fresco que contiene 50
mg/mL de higromicina. Este medio selectivo puede ser renovado
semanalmente. De siete a ocho semanas después del bombardeo, puede
observarse tejido transformado verde que crece a partir de
agrupaciones embriogénicas necróticas no transformadas. El tejido
verde aislado es retirado e inoculado en matraces individuales para
generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos transformados,
propagados por clonación. Cada nueva línea puede tratarse como un
evento de transformación independiente. Estas suspensiones pueden
subcultivarse a continuación y mantenerse como agrupaciones de
embriones inmaduros o pueden regenerarse para formar plantas
completas mediante maduración y germinación de embriones somáticos
individuales.
Los ADNc que codifican los presentes
polipéptidos pueden insertarse en el vector de expresión pBT430 de
E. coli T7. Este vector es un derivado de
pET-3a (Rosenberg y col. (1987) Gene 56:
125-135) que emplea el sistema promotor
T7/polimerasa de ARN de bacteriófago T7. El plásmido pBT430 se
construyó destruyendo en primer lugar las posiciones EcoR I e Hind
III de pET-3a en sus localizaciones originales. Se
insertó un oligonucleótido adaptador que contiene posiciones EcoR I
e Hind III en la posición BamH I de pET-3a. Esto
creó pET-3aM, con posiciones de clonación únicas
para la inserción de genes en el vector de expresión. A
continuación, la posición Nde I de la posición de inicio de la
traducción se convirtió en una posición Nco I usando mutagénesis
dirigida por oligonucleótidos. La secuencia de ADN de
pET-3aM de esta región, 5'-CATATGG,
se convirtió en 5'-CCCATGG en pBT430.
El ADN de plásmido que contiene ADNc puede ser
digerido apropiadamente para liberar un fragmento de ácido nucleico
que codifica la proteína. Este fragmento puede ser purificado a
continuación en un gel de agarosa de bajo punto de fusión NuSieve
GTG^{TM} al 1% (FMC, Filadelfia, PA). El tampón y la agarosa
contienen 10 \mug/mL de bromuro de etidio para la visualización
del fragmento de ADN. Entonces el fragmento puede ser purificado a
partir del gel de agarosa mediante digestión con GELase^{TM}
(Epicentre Technologies) según las instrucciones del fabricante,
puede precipitarse en etanol, secarse y volver a suspenderse en 20
\muL de agua. Se pueden ligar adaptadores de oligonucleótido
adecuados al fragmento usando ligasa T4 de ADN (New England
Biolabs, Beverly, MA). El fragmento que contiene los adaptadores
ligados puede purificarse del exceso de adaptadores usando agarosa
de bajo punto de fusión como se ha descrito anteriormente. El vector
pBT430 es digerido, desfosforilado con fosfatasa alcalina (NEB) y
desproteinizado con fenol/cloroformo como se ha descrito
anteriormente. El vector preparado pBT430 y el fragmento pueden ser
ligados entonces a 16ºC durante 15 horas, seguido de la
transformación en células electrocompetentes DH5 (GIBCO BRL). Los
transformantes pueden seleccionarse sobre placas de agar que
contienen medio LB y 100 \mug/mL de ampicilina. Los transformantes
que contienen el gen que codifica los presentes polipéptidos son
escrutados a continuación para determinar la orientación correcta
con respecto al promotor T7 mediante análisis de enzima de
restricción.
Para la expresión de alto nivel, se puede
transformar un clon plásmido con un injerto de ADNc en la
orientación correcta relativa al promotor T7 en la cepa
BL21(DE3) de E. coli (Studier y col. (1986) J. Mol.
Biol. 189: 113-130). Los cultivos se realizan en
medio LB que contiene ampicilina (100 mg/L) a 25ºC. Con una densidad
óptica a 600 nm de aproximadamente 1, se puede añadir IPTG
(isopropiltio-\beta-galactósido,
el inductor) hasta una concentración final de 0,4 mM, y se puede
continuar con la incubación durante 3 h a 25ºC. Entonces se recogen
las células mediante centrifugación y se resuspenden en 50 \muL de
Tris-HCl 50 mM a pH 8,0 que contiene DTT 0,1 mM y
fluoruro de fenil metilsulfonilo 0,2 mM. Se puede añadir una pequeña
cantidad de bolitas de vidrio de 1 mm y la mezcla se somete a
ultrasonidos 3 veces durante aproximadamente 5 segundos cada vez,
con un sonicador de microsondas. La mezcla se centrifuga y se
determina la concentración de proteína del sobrenadante. Se puede
separar un \mug de proteína de la fracción soluble del cultivo
mediante electroforesis de gel SDS-poliacrilamida.
Los geles pueden ser observados para determinar las bandas de
proteína que migran en los pesos moleculares esperados.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADNc que codifican los presentes
polipéptidos pueden introducirse en el propio genoma del
baculovirus. Para este propósito los ADNc pueden colocarse bajo el
control del promotor polihedron, el promotor IE1 o cualquier otro
promotor de baculovirus. El ADNc, junto con las secuencias
directoras apropiadas, es insertado a continuación en un vector de
transferencia de baculovirus usando técnicas de clonación molecular
estándares. Tras la transformación de DH5\alpha de E.
coli, se seleccionan colonias aisladas y se prepara y analiza
ADN de plásmido mediante análisis de enzimas de restricción. Las
colonias que contienen el fragmento apropiado son aisladas,
propagadas, y el ADN de plásmido se prepara para
cotransfección.
Se propagan células de Spodoptera
frugiperda (Sf-9) en medio ExCell® 401 (JRH
Biosciences, Lenexa, KS) complementado con suero fetal bovino al
3,0%. Se añade lipofectin® (50 \muL a 1 mg/mL, Gibco/BRL) a una
alícuota de 50 \muL del vector de transferencia que contiene el
gen de toxina (500 ng) y se linealiza con AcNPV negativo en
polihedrina (2,5 \mug, ADN vírico Baculogold®, Pharmigen, San
Diego, CA). Las células Sf-9 (aproximadamente en
monocapa del 50%) son co-transfectadas con la
disolución de ADN vírico/vector de transferencia. El fluido
sobrenadante del experimento de co-transfección es
recogido a los 5 días de la transfección y se aíslan los virus
recombinantes empleando protocolos de purificación de placas
estándares, en donde sólo se seleccionan las placas pasivitas en
polihedrina (O'Reilly y col., (1992), Baculovirus Expression
Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman y Compañía, Nueva
York). Las células Sf-9 en placas petri 35 mM
(monocapa del 50%) son inoculadas con 100 \muL de una disolución
en serie de la suspensión vírica, y los fluidos sobrenadantes son
recogidos a los 5 días de la infección. Con el fin de preparar
cantidades mayores de virus para su caracterización, dichos fluidos
de sobrenadante se usan para inocular grandes cultivos de tejido
para la propagación a gran escala de virus recombinantes. La
expresión de los presentes polipéptidos codificada por los
baculovirus recombinantes se confirma mediante bioensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha demostrado que los residuos de aminoácido
individuales son importantes para la unión de receptor y para la
actividad biológica de las toxinas de canal de Na de escorpión
(Zilbergberg y col., (1997) J. Biol. Chem. 272:
14810-14816). Algunos ADNc descritos en la presente
memoria fueron clonados en baculovirus y se usaron para evaluar su
actividad contra Lepidopteran. Los clones fueron ensayados en uno o
dos bioensayos independientes contra Heliothis
virescens.
El ADN que codifica los péptidos fue ensayado
para determinar la presencia de posiciones de restricción BgI II
y/o Eco RI internas. Las posiciones de restricción útiles para
insertar fragmentos de ADN en el vector se añadieron al mismo
tiempo que el ADN se amplificó usando PCR. Se añadió una posición
Bgl II en el extremo 5' del ADN y se añadió una posición Eco RI o
una posición Asc I (en los clones que contienen posiciones de
restricción Eco RI internas) en el extremo 3'. El ADN amplificado se
insertó en el vector de transferencia de baculovirus pAcUW21 (BD
Biosciences-PharMingen, San Diego, CA). Tras
amplificación en E. coli, se confirmó la presencia de los
fragmentos apropiados mediante análisis con enzimas de restricción.
Las colonias que contenían los fragmentos apropiados fueron
aisladas, propagadas y el ADN de plásmido se preparó para la
co-transfección mediada por lipofectina en células
de insecto con AcNPV negativo en polihedrina. Las
co-transfecciones se llevaron a cabo esencialmente
como se describe en el Ejemplo 9. Los virus recombinantes positivos
en polihedrina fueron aislados empleando protocoles estándares de
purificación de placas y se mezclaron con un bolo de dieta HV
(www.Bio-Serv.com), para dárselo como
alimento a larvas de Heliothis virescens.
En la Tabla 4 se muestran los resultados de dos
experimentos independientes en los que cuatro larvas de 5 días de
edad fueron alimentadas con 200 mg de dieta contaminada con el
virus. Se dejó que las larvas comieran durante 2 días o hasta que
la dieta contaminada con virus se consumiera, entonces de añadieron
bolos de dieta frescos de 1 g para permitir la continuación de la
dieta. Las larvas fueron examinadas en busca de síntomas a los 4,
5, 6 y 7 días después de que se añadiese la dieta fresca, y ésta fue
puntuada como extremadamente activa si la mayoría de las larvas
mostraba síntomas tóxicos (parálisis) y morían en menos de 4 días,
como muy activa si la muerte se producía a los 5 días, como activa
si la muerte se producía a los 6 días, y como moderadamente activa
si la mayoría de las larvas presentaban síntomas tóxicos a los 7
días, como activa si las larvas se volvían irritadas y presentaban
contracciones y morían, y como ligeramente activa si las larvas
presentaban un bajo consumo de dieta y un retraso en el crecimiento.
Estos ensayos se compararon con los resultados obtenidos
alimentando insectos con una dieta que contenía AcNPV natural, en
donde las larvas mueren por colapso a los 7 días, y alimentando
insectos con una dieta de control (añadiendo agua en lugar del
virus), en donde todas las larvas sobreviven.
\vskip1.000000\baselineskip
En resumen, los péptidos codificados por las
secuencias de escorpión mostradas en las SEC ID Nº: 2, 6, 14, 16,
18, 20, 29, 31, 33, 35 y 37 mostraron diferentes niveles de
actividad tóxica frente a lepidopteran de Heliothis
virescens.
Un resultado inesperado fue el descubrimiento de
que los péptidos mostrados en las SEC ID Nº: 31, 33, 35 y 37
mostraron actividad contra lepidocteran a pesar de tener sólo 7
residuos de cisteína. Los péptidos pueden mantener su estructura
tridimensional mediante una serie de interacciones diferentes.
<110> E. I. du Pont de Nemours and
Company
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> TOXINAS DE ESCORPIÓN
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> BB1375
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\vskip0.400000\baselineskip
<140>
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<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/140.410
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
22-06-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 38
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> Microsoft Office 97
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 261
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<212> ADN
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 86
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<212> PRT
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 255
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<212> ADN
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 84
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<212> PRT
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 249
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<212> ADN
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 82
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<212> PRT
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 249
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<212> ADN
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 82
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<212> PRT
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 83
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<212> PRT
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 243
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<212> ADN
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 80
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<212> PRT
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 258
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 85
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<212> PRT
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 264
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<212> ADN
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 87
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<212> PRT
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 16
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Hottentotta judaica
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<400> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Hottentotta judaica
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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<210> 19
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<211> 300
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hottentotta judaica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hottentotta judaica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Androctonus australis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Leiurus quinquestriatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hottentotta judaica
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tityus serrulatus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
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<212> PRT
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<213> Orthochirus scrobiculosus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mesobuthus martensi
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Centruroides exilicauda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hottentotta judiaca
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 29
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<211> 82
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<212> PRT
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<213> Hottentotta judiaca
\newpage
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<400> 29
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<210> 30
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<211> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Hottentotta judiaca
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
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<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Hottentotta judiaca
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<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 32
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<211> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Hottentotta judiaca
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Hottentotta judiaca
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hottentotta judiaca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Hottentotta judiaca
\newpage
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<400> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hottentotta judiaca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hottentotta judiaca
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Buthus martensii
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
Claims (11)
1. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº:
1;
(b) una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido de la SEC ID Nº: 2;
(c) una secuencia de nucleótidos que comprende
el complemento de (a) o (b); y
(d) una secuencia de nucleótidos que codifica
los aminoácidos 21-86 de la SEC ID Nº:2.
2. El polinucleótido aislado de la
Reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos es ADN.
3. El polinucleótido aislado de la
Reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos es ARN.
4. Un gen quimérico que comprende el
polinucleótido aislado de la Reivindicación 1 ligado operativamente
al menos a una secuencia reguladora adecuada.
5. Una célula anfitriona que comprende el gen
quimérico de la Reivindicación 4.
6. La célula anfitriona de la Reivindicación 5,
en la que la célula anfitriona se selecciona del grupo que consiste
en levadura, bacterias, plantas, mamíferos e insectos.
7. Un virus que comprende el polinucleótido
aislado de la Reivindicación 1.
8. Un polipéptido de la SEC ID Nº: 2.
9. Una composición que comprende el
polinucleótido aislado de la Reivindicación 1.
10. Una composición que comprende el polipéptido
aislado de la Reivindicación 8.
11. Un vector de expresión de baculovirus
recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 2.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14041099P | 1999-06-22 | 1999-06-22 | |
| US140410P | 1999-06-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2312349T3 true ES2312349T3 (es) | 2009-03-01 |
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ID=22491107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00943005T Expired - Lifetime ES2312349T3 (es) | 1999-06-22 | 2000-06-21 | Toxinas de escorpion de buthotus judaicus. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1185653B1 (es) |
| AR (1) | AR024435A1 (es) |
| AT (1) | ATE406442T1 (es) |
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