CN102183601A

CN102183601A - 去氢***多克隆抗体免疫亲和柱的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102183601A
Application number: CN2011100009356A
Authority: CN
Inventors: 王云; 徐燕; 董英; 张勋
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2011-01-05
Filing date: 2011-01-05
Publication date: 2011-09-14

Abstract

本发明一种去氢***多克隆抗体免疫亲和柱的制备方法及其应用，属于免疫亲和层析及兽药残留检测技术领域。公开了去氢***多抗免疫亲和柱的制备方法及应用。通过将免疫动物得到的多克隆抗体纯化以后与CNBr-Sepharose4B偶联得到的免疫亲和吸附剂填充于固相萃取管中制得了对去氢***具有特异性吸附的免疫亲和柱。本发明制备的免疫亲和柱能够与去氢***特异性结合，其最大结合容量约为160ngDMT；采用的洗脱液为80%的甲醇-水溶液时，平均加标回收率为97.87%；；重复使用3次，回收率不低于90%。本发明可以应用于去氢***的快速检测。

Description

去氢***多克隆抗体免疫亲和柱的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于免疫亲和层析及兽药残留检测技术领域，涉及去氢***多克隆抗体免疫亲和柱的制备方法及其应用。

背景技术

去氢***（1-dehydro-17-methyltestosterone, DMT），是一种蛋白质同化雄性类固醇激素。由于其具有强烈的促进蛋白合成、增强食欲、提高饲料转化率等作用，常被非法用于畜牧生产领域。DMT被人体吸收后，会干扰人体自身的激素平衡，产生严重的毒副作用。

目前，DMT常用的检测方法多为仪器检测方法，如高效液相色谱（HPLC）、液质联用（LC-MS）和气质联用（GC-MS）等。这些仪器检测方法对样品纯度要求较高，需经过一定的前处理，而传统的样品前处理技术，如液-液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、固相微量萃取（SPME）等，步骤繁琐、缺乏选择性、容易受其他成分的干扰、准确度低。因此，建立快捷有效的样品前处理技术已成为DMT检测分析中需解决的首要问题。

免疫亲和色谱(IAC)是一种新型高效的样品前处理技术。它的原理是利用抗原抗体间特异性的可逆结合来实现对复杂样品中的目标物质的提取和净化处理。近年来，免疫亲和色谱技术结合常规仪器分析已成为兽药残留检测的一个主要发展方向。但目前尚未见DMT多克隆抗体免疫亲和柱的制备及其使用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DMT免疫亲和柱的制备与使用方法，所研制的亲和柱是将DMT多克隆抗体与溴化氰活化的琼脂糖4B（CNBr-Sepharose 4B）偶联填充于固相萃取管中，用于纯化含有DMT的待测样品。

本发明所述的DMT多克隆抗体免疫亲和柱的制备方法，按照下述步骤进行制备：

（1）偶联：取免疫动物并经纯化的DMT多克隆抗体与溶胀后的CNBr-Sepharose 4B湿凝胶置于偶联缓冲液中在室温下振荡偶联；

（2）封闭：将偶联凝胶产物转入其5-10倍体积的封闭缓冲液中，室温下振荡反应2 h；

（3）洗涤：先分别用5-10倍封闭后凝胶体积的醋酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液交替洗涤3次，然后用5-10倍封闭后凝胶体积的PBS缓冲液洗涤2次，制备得到免疫亲和吸附剂；

（4）装柱：将得到的免疫亲和吸附剂填充入固相萃取管中，加入PBS缓冲液后自然沉降，制成DMT多克隆抗体免疫亲和柱，于4 ℃保存待用；

其中步骤（1）中所述的DMT多克隆抗体与CNBr-Sepharose 4B干胶的质量比为1:100；所述的偶联缓冲液为pH 8.3、含0.5 mol/L NaCl 的0.1 mol/L NaHCO₃偶联缓冲液；所述的溶胀CNBr-Sepharose 4B的溶液为1 mmol/L HCl溶液；

其中步骤（2）中所述的封闭缓冲液为pH 8.0、含0.5 mol/L NaCl 的0.1 mol/L Tris-HCl封闭缓冲液；

其中步骤（3）中所述的醋酸盐缓冲液为pH 4.0、含0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L 醋酸盐缓冲液；所述的Tris-HCl缓冲液为pH 8.0、含0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液；所述的PBS缓冲液为pH 7.4、0.01 mol/L的PBS缓冲液；

本发明去氢***多抗免疫亲和柱的应用，可以应用于去氢***的快速检测。

本发明的有益效果：（1）本发明制备的免疫亲和柱能够与DMT特异性结合，一次净化能除去绝大部分干扰物，能得到纯度较高的DMT。（2）制备的免疫亲和柱最大结合容量约为160 ng DMT；(3) 采用的洗脱液为80 %的甲醇-水溶液时，平均加标回收率为97.87 %；（4）制备的免疫亲和柱重复使用3次，回收率不低于90 %。

附图说明

其中图1. 本发明IAC柱外观图；

图2. 本发明IAC柱洗脱条件选择优化图；

图3. 本发明IAC柱最大结合容量图；

图4. 本发明IAC柱icELISA评价方法标准曲线图；

图5. 本发明IAC柱HPLC评价方法标准曲线图。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 DMT多抗免疫亲和柱的制备

（1）偶联

将免疫动物、纯化后所得的DMT多克隆抗体置于pH 8.3、含0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L NaHCO₃偶联缓冲液中透析过夜，并稀释到0.5 mg/mL后备用；

称取CNBr-Sepharose 4B干胶，于5-10 mL的1 mmol/L HCl溶液中充分溶胀得到一定体积的湿胶。用10倍以上湿胶体积的偶联缓冲液快速洗涤2次，4000 r/min 离心1 min；

将洗涤后的湿胶定容至2 mL，迅速加入0.5 mg/mL的抗体溶液，使CNBr-Sepharose 4B干胶与抗体的质量比为100:1，于室温下振荡反应2.5 h以上；

偶联反应结束后，用10倍以上偶联凝胶体积的偶联缓冲液洗涤除去未偶联的抗体，收集洗涤液，运用公式C_protein(mg/mL)=1.45 A_280 nm-0.74 A_260 nm计算未偶联的抗体量，得到的偶联率在90 %以上；

（2）封闭

将CNBr-Sepharose 4B与抗体的偶联凝胶产物转入其5-10倍体积的pH 8.0、含0.5 mol/L NaCl 的0.1 mol/L Tris-HCl封闭缓冲液中，室温下振荡反应2 h封闭活性基团；

（3）洗涤

先后用5-10倍偶联凝胶体积的pH 4.0、含0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L 醋酸盐缓冲液、pH 8.0、含0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L Tris-HCl交替洗涤3次，然后用5-10倍偶联凝胶体积的pH 7.4、0.01 mol/L的PBS 洗涤2次；

（4）装柱

将得到的亲和吸附剂填充入与其体积比为4:1的固相萃取管中，制成DMT多克隆抗体免疫亲和柱，于4 ℃冰箱保存待用。所制备的免疫亲和柱外观图见说明书附图1。图中显示的是装填了以上亲和吸附剂的IAC柱，柱子由两部分组成：柱身和套管。其中的液体是PBS。

试验一、本发明所述DMT多抗免疫亲和柱的条件优化方法：

1、实施例1所制备得到的DMT多抗免疫亲和柱最佳洗脱条件的确定：按上述方法制备5支IAC柱，每柱上样100 ng的DMT溶液，PBS充分洗涤后，分别用60 %、70 %、80 %、90 %、100 %甲醇-水溶液洗脱，收集洗脱液于50 ℃的旋转蒸发仪上旋干，用1 mL的甲醇复溶后用HPLC法测定洗脱液中标准品含量，计算回收率，当甲醇浓度大于80 %时，回收率均在95 %以上，因此选择有机溶剂浓度较小的80 %的甲醇-水溶液为最佳的洗脱条件。洗脱条件选择优化图见说明书附图2；

2、实施例1所制备得到的DMT多抗免疫亲和柱最大结合容量的测定：制备两个IAC柱，分别用6 mL 50 ng/mL(300 ng)的DMT过柱，上样液每mL收集一管，用间接竞争ELISA（icELISA）测定每组份中DMT含量。根据下式计算：最大结合容量（即被吸附的DMT总量）=DMT上样总量－洗下的DMT总量。结果发现1-3 mL上样液中只有少量DMT，上样第4 mL时则有大于30 ng被洗下，5 mL开始无吸附。因此，偶联1.0 mg多抗的IAC柱的最大结合容量约为160 ng。结合容量确定如说明书附图3所示；

3、实施例3所制备得到的DMT多抗免疫亲和柱加标回收率的测定：分别上样2.5 mL 的20 ng/mL、40 ng/mL、60 ng/mL三种不同浓度的DMT，每种浓度作两组平行。收集洗涤液后用HPLC测定回收率。结果见表1。用合适的洗脱液洗脱后，经测定回收率均达到90 %以上，平均回收率为97.87 %；

表1. IAC柱的加标回收率

标品浓度（ng/mL）	标品加入量（ng）	回收率（%）
			20	50	105.83
40	100	95.50
			60	150	92.28

4、实施例4所制备得到的DMT多抗免疫亲和柱重复使用次数的确定：制备两个IAC柱，分别重复上样、洗涤、洗脱、再生操作，隔1-2天重复试验，再用icELISA和HPLC分别测定IAC柱的柱容量和回收率。结果如表2所示，该柱重复使用3次，此时柱容量下降25 %左右，回收率仍高于90 %。

表2. IAC柱的重复使用性的测定

上样次数	1	2	3	4	5
						柱容量（ng）	167.01	143.76	126.95	83.50	54.25
回收率（%）	101.70	96.64	92.55	89.07	53.52

试验二、本发明所述DMT多抗免疫亲和柱的性能评价方法：

（1） icELISA评价方法的建立

包被封闭后，先加入50 μL系列浓度（0.001、0.01、0.1、1.0、2.5、5.0、10.、25、50、100、500 ng/mL）的标准品溶液，每种浓度2个平行，再加入50 μL最佳稀释倍数的一抗，显色封闭后用酶标检测仪测定各个浓度在450 nm的吸光度A_i和对照（即浓度为0 ng/mL时）的吸光度A₀，以A_i /A₀为纵坐标，标准溶液浓度的对数值为横坐标作图。后经Origin软件拟合，得到标准曲线的线性范围为1-100 ng/mL。该方法标准曲线图见说明书附图4；

（2）HPLC评价方法的建立

HPLC的色谱条件：Shim-pack VP-ODS 色谱柱(250 × 4.6 mm)；流动相：V（乙腈）:V（水）= 80:20；UV检测器检测波长：λ= 250 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL；流速：0.8 mL/min。

取标准工作液（1 mg/mL），配制成系列浓度（5、10、50、100、200、300 ng/mL），用HPLC测定，以各浓度和其对应的峰面积进行线性拟合。该标准曲线线性关系较好，其线性回归方程为：y=1443.3x-1207.2 (R²=0.9999)，线性范围为5-300 ng/mL。该方法标准曲线图见说明书附图5。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims

1.本发明所述的DMT多克隆抗体免疫亲和柱的制备方法，按照下述步骤进行制备：

（4）装柱：将得到的免疫亲和吸附剂填充入固相萃取管中，加入PBS缓冲液后自然沉降，制成DMT多克隆抗体免疫亲和柱，于4 ℃保存待用。

2.根据权利要求1所述的一种去氢***多克隆抗体免疫亲和柱，其特征在于其中步骤（1）中所述的DMT多克隆抗体与CNBr-Sepharose 4B干胶的质量比为1:100；所述的偶联缓冲液为pH 8.3、含0.5 mol/L NaCl 的0.1 mol/L NaHCO₃偶联缓冲液；所述的溶胀CNBr-Sepharose 4B的溶液为1 mmol/L HCl溶液。

3.根据权利要求1所述的一种去氢***多克隆抗体免疫亲和柱，其特征在于其中步骤（2）中所述的封闭缓冲液为pH 8.0、含0.5 mol/L NaCl 的0.1 mol/L Tris-HCl封闭缓冲液。

4.根据权利要求1所述的一种去氢***多克隆抗体免疫亲和柱，其特征在于其中步骤（3）中所述的醋酸盐缓冲液为pH 4.0、含0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L 醋酸盐缓冲液；所述的Tris-HCl缓冲液为pH 8.0、含0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液；所述的PBS缓冲液为pH 7.4、0.01 mol/L的PBS缓冲液。

5.去氢***多克隆抗体免疫亲和柱的应用，可以应用于去氢***的快速检测。