CN102181410A

CN102181410A - 一种发酵生产漆酶的方法

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Publication number: CN102181410A
Application number: CN 201110121926
Authority: CN
Inventors: 林娟; 胡佑彪; 叶秀云; 杨捷; 李仁宽; 严芬
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2011-05-12
Filing date: 2011-05-12
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2031-05-12
Also published as: CN102181410B

Abstract

本发明提供了一种发酵生产漆酶的方法，该方法包括真菌分泌漆酶培养基的配制和产酶发酵，所述真菌分泌漆酶培养基为：每100mL的液体培养基中含有葡萄糖1-4g，酒石酸铵1-2.5g，ABTS0.05-0.25mmol/L，VB₁0.6mg/L，大量元素，微量元素，余量为水，用NaOH或HCl调节初始pH=5.0-6.0。随着研究的不断深入，漆酶的应用已经渗透到工业、农业和医疗等领域，然而在漆酶的大规模工业化生产方面，以及探索适宜的发酵条件等方面报道较少，仍然是今后研究的热点。本发明建立了发酵生产漆酶的工艺条件，为实现漆酶的工业化生产打下基础。该方法可提高漆酶的产量和质量。

Description

一种发酵生产漆酶的方法

技术领域

本发明属于生物制造领域，更具体涉及一种利用一色齿毛菌发酵生产漆酶的方法。

背景技术

木质素、纤维素和半纤维素为自然界中最丰富的三大可再生资源，分别占植物干重的20%~35%，45%和20%。木质素是一种天然高分子化合物，广泛存在于高等植物细胞壁中，是储量仅次于纤维素的生物多聚体，而且每年以50亿吨以上的速度再生。自然界中木质素的完全降解主要是通过白腐真菌的分解作用来完成的。其机理是通过白腐菌分泌的胞外氧化酶——木质素降解酶来实现的，其中漆酶(Laccase)、锰过氧化物酶(MnP)和木素过氧化物酶(LiP)是白腐菌木质素降解酶系的主要组成部分，其中漆酶在木质素降解过程中扮演着重要角色，对木质素的氧化、脱甲基和解聚等发挥着重要作用。

漆酶不仅存在于高等植物中，而且一些多孔菌和腐生菌以及昆虫和细菌等也能产漆酶，且大多数由真菌分泌。在大多数真菌中，白腐菌是目前公认的最强、最主要的木质素降解者，能使木质素最终矿化为CO₂和H₂O。漆酶能催化氧化多种有机物，包括苯酚、甲氧基酚、氨基酚等难以降解的芳香族化合物，同时分子氧被还原成水。最近研究表明，漆酶在造纸工业中有着重要作用，可以降解木浆中的木质素，并能够脱除造纸工业污水中的大量污染物。由于漆酶在催化木质素、木质素前体物质分子及其结构相似物等许多环境污染物的降解中具有特殊的作用，近年来，有关漆酶的研究受到国内外的广泛关注，显示出了较大的研究价值和应用潜力。

尽管漆酶具有如此重要的用途，但其在生产实践中的应用仍十分有限，主要原因是多数生产菌株合成漆酶的效率低，造成漆酶产量不足。因此，高产漆酶菌株的获得对生态农业、环境和生物质资源转化等方面有着非常重要的经济和生态效益，在提高农副产品利用效率方面具有广阔的应用前景，特别是在农作物废弃物的利用、环境保护、我国生态农业的可持续发展上具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种发酵生产漆酶的方法，该方法可提高漆酶的产量和质量。

本发明的一种发酵生产漆酶的方法，包括真菌分泌漆酶培养基的配制和产酶发酵，所述真菌分泌漆酶培养基为：每100mL的液体培养基中含有葡萄糖1-4g，酒石酸铵1-2.5g，ABTS 0.05-0.25mmol/L，VB₁0.6mg/L，大量元素，微量元素，余量为水，用NaOH或HCl调节初始pH=5.0-6.0。

所述真菌分泌漆酶培养基为：每100mL的液体培养基中含有葡萄糖2g，酒石酸铵1.5g，ABTS 0.05mmol/L，VB₁0.6mg/L，大量元素，微量元素，余量为水，调节初始pH=5.0；其中大量元素包括：KH₂PO₄ 20.0g/L，MgSO₄ ^。7H₂O 13.8g/L，CaCl₂1.0g/L和NaCl 0.6g/L；微量元素包括：MnSO₄ ^。H₂O 0.35g/L，FeSO₄ ^。7H₂O 60mg/L，CoCl₂ ^。6H₂O 110mg/L，ZnSO₄ ^。7H₂O 60mg/L，CuSO₄ ^。5H₂O 95 mg/L，AlK(SO₄)₂ ^。12H₂O 6mg/L，H₃BO₃6mg/L和NaMoO₄ ^。2H₂O 6mg/L。

所述真菌为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)。

发酵工艺条件为：接种量8-12%，发酵温度20-30℃，转速150-250r/min，装液量50-70mL/250mL。

发酵工艺条件为：接种量8%，发酵温度25℃，转速200r/min，装液量60mL/250mL。

接种的种子液的制备方法为：将在PDA平板上活化好的菌种用打孔器制成10-12mm菌块，将得到的菌块接入PDA液体培养基中，所述PDA液体培养基的配制为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL（先将马铃薯洗净去皮，切成小块，称取200g，加水1000mL煮沸约20min，纱布过滤去渣，再加入葡萄糖20g和琼脂15-20g，加热使之全部溶解，补充蒸馏水至1000mL， 121℃灭菌30min）；PDA液体培养基装液量为100mL/250mL三角瓶，每瓶接种3个菌块，然后在转速200r/min，温度30℃摇床中恒温振荡培养4d，制成种子液。

本发明的发酵生产漆酶的方法，最高漆酶活力可达58888.59U/L，约为优化前的10.8倍；经过5L发酵罐试验，最高漆酶活力可达79733U/L，约为实验室摇瓶条件下的1.35倍。

本发明的显著优点：

随着研究的不断深入，漆酶的应用已经渗透到工业、农业和医疗等领域，然而在漆酶的大规模工业化生产方面，以及探索适宜的发酵条件等方面报道较少，仍然是今后研究的热点。本发明建立了发酵生产漆酶的工艺条件，为实现漆酶的工业化生产打下基础。

具体实施方式

1 漆酶活力的测定方法

漆酶活力测定方法采用ABTS法。4.0mL反应体系中含1.95mL 0.1mol/L NaAc-HAc缓冲液（pH3.0）、2.00mL 0.5mmol/L 2,2’-连氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）溶液和50μL稀释好的酶液，30℃启动反应并测定反应前5min内反应液在420nm处吸光度的增加值△OD₄₂₀，以灭活的酶液作为空白。定义该条件下，每min催化1μmol ABTS氧化所需酶量为1个酶活力单位（U），并按下式计算漆酶活力：

酶活力U(/L)=N×△OD₄₂₀×l0⁶/(36000×t)

其中，N为稀释倍数；△OD₄₂₀为5min内反应液在420nm处吸光度的增加值；36000为ABTS氧化态的摩尔吸光系数(Lmol^-1cm^-1)，t为反应时间5min。

2 产酶培养基的优化

2.1 碳源及其添加量对产酶的影响

分别以麸皮、玉米淀粉、葡萄糖、酒糟、桔皮、可溶性淀粉、稻草、蔗渣为碳源，添加量均为1%（w/v），考察它们对产漆酶的影响，结果见表1。以葡萄糖为碳源时，产酶效果最好，酶活力最高，且漆酶产率也最高。在发酵第6d，酶活力达到最高56355.56U/L，产酶效率达到9392.59 U/L·d^-1。

表1 碳源对一色齿毛菌产漆酶的影响

Figure 2011101219262100002DEST_PATH_IMAGE002

对产酶效果最好的葡萄糖进一步进行添加量的优化，从表2可以看出，当葡萄糖添加量为2%（w/v）时，产酶效果最佳；与葡萄糖含量为1%时比较，酶活力增加了约70%。在一定的碳源添加量范围内，随着葡萄糖添加量的增加，酶活力有所上升，例如添加量由1%上升到2%时；但当葡萄糖含量超过某一个值以后，酶活力则呈现出递减的趋势，例如当葡萄糖添加量从2%增加到6%以后，相对酶活力从171%逐步下降至43.68%。

表2 葡萄糖添加量对产酶的影响

Figure 2011101219262100002DEST_PATH_IMAGE004

2.2 氮源及其添加量对产酶的影响

在确定最佳碳源及其添加量的基础上，分别以酒石酸铵、蛋白胨、硫酸铵、酵母浸出物、豆粕和硝酸铵为氮源，添加量均为0.44%（w/v），进一步考察氮源及其添加量对产酶的影响（表3、表4）。

表3显示，当以酒石酸铵为氮源的时候，产酶效果最好，以酶活力最高的酒石酸铵为相对酶活力100%，则有机氮源蛋白胨为62.55%，酵母膏为29.55%，大豆粕为21.26%；而无机氮源硫酸铵和硝酸铵则分别为2.23%和0.36%；可见有机氮更有利于漆酶的合成。

表3 氮源对产酶的影响

Figure 2011101219262100002DEST_PATH_IMAGE006

进一步考察酒石酸铵添加量对产酶的影响。表4显示，当酒石酸铵浓度较高时，产酶效果较好，如当浓度分别为1.5%、2%和2.5%时，相对酶活力均处于100%以上，这说明较高的氮含量对产酶有利。其中，以添加量为1.5%时，酶活力最高，相对酶活力达到153.22%。

表4 酒石酸铵添加量对产酶的影响

Figure 2011101219262100002DEST_PATH_IMAGE008

2.3 诱导物对产酶的影响

在碳源、氮源及碳氮比优化的基础上，分别在接种后第4d向产酶液体培养基中添加0.05mmol/L 的ABTS、愈创木酚、单宁酸和RB亮蓝，以不添加任何诱导物的初始培养基为参照，考察不同诱导物对该菌株漆酶分泌的影响（表5）。

表5 不同诱导物对产酶的影响

Figure 2011101219262100002DEST_PATH_IMAGE010

从表5可以看出，只有ABTS显示出了较明显的促进漆酶合成的作用，增加了16.87%的酶活力，单宁酸显示出的促进作用不是很明显；而能够被用作酶解底物的愈创木酚和RB亮蓝反而出现了低强度的抑制作用。

进一步考察ABTS浓度对产酶的影响，结果如表6所示。由表6可见，从总体趋势来看，随着ABTS浓度的不断加大，漆酶的合成反而呈现出不同程度的抑制作用，添加量越大，抑制效果越明显。因此确定ABTS的添加量为0.05mmol/L。

表6 ABTS添加量对产酶的影响

Figure 2011101219262100002DEST_PATH_IMAGE012

2.4 金属离子对产酶的影响

主要考察金属离子Cu²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺和Zn²⁺对产酶的影响（表7）。实验方法为，在配制液体产酶培养基时，微量元素溶液中分别去除这几种金属离子，以没有做任何处理的微量元素溶液产酶培养基作对照，分别考察这几种金属离子对产酶的影响。

表7 金属离子对产酶的影响

Figure 2011101219262100002DEST_PATH_IMAGE014

表7显示，铜离子对漆酶的合成影响最大，当产酶培养基中缺少Cu²⁺时，漆酶的合成量非常低，只有正常水平的12.36%，可见铜离子为漆酶合成必不可少的金属离子；其次是Mn²⁺，当培养基中缺乏Mn²⁺时，相对酶活力只有30.73%。

2.5 不同培养基初始pH对产酶的影响

分别将产酶液体培养基的初始pH调至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以产酶液体培养基的自然pH（pH5.8）为对照，考察不同培养基初始pH对产酶的影响（表8）。

表8 不同培养基初始pH对产酶的影响

当产酶培养基的初始pH值控制在5.0~6.0时，酶活力相对较高，初始pH为5.0时，漆酶活力达到最大，与对照组相比酶活力提高了15%；但随着pH值的进一步增加，酶活力又逐渐下降，这可能是过酸或者过碱影响营养物质的吸收以及菌体的生长，进而影响漆酶的合成。因此在一色齿毛菌发酵过程中控制产酶培养基初始pH5.0左右为宜。

3 产酶发酵条件优化

3.1 不同接种量对产酶的影响

将在PDA平板上活化好的菌种用打孔器制成10-12mm菌块，将得到的菌块接入PDA液体培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL；先将马铃薯洗净去皮，切成小块，称取200g，加水1000mL煮沸约20min，纱布过滤去渣，再加入葡萄糖20g和琼脂15-20g，加热使之全部溶解，补充蒸馏水至1000mL， 121℃灭菌30min）中，装液量为100mL/250mL三角瓶，每瓶接种3个菌块。在转速200r/min，温度30℃摇床中恒温振荡培养4d，制成种子液。

在装液量为50mL/250mL的液体产酶培养基中，以一色齿毛菌（Cerrena unicolor)（参考文献：张蓓蓓；一色齿毛菌胞外漆酶的纯化及部分酶学性质的研究[D].东北林业大学，2009. 6-10）为例，分别按照2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的接种量（v/v）接入PDA种子液，以最初的接种量10%为对照，考察接种量对漆酶合成的影响（表9）。

表9 不同接种量对产酶的影响

Figure 2011101219262100002DEST_PATH_IMAGE018

随着接种量的增大，漆酶的合成量也不断增大，当接种量为8%时，产酶效果最好；但随着接种量的进一步加大，酶活力则呈现出递减的趋势。因此确定接种量为8%（v/v）。

3.2 不同转速对产酶的影响

分别将接种后的培养液置于100r/min、150r/min、200r/min、250r/min、300r/min五个不同转速下培养（30℃），比较其产酶效果（表10）。

表10 不同转速对产酶的影响

Figure 2011101219262100002DEST_PATH_IMAGE020

在一定范围内，随着转速的提高，酶的分泌量明显增加；当转速为200r/min时，酶产量最高；但当转速进一步增加到250~300r/min时，酶活力明显降低。因此确定转速为200r/min。

3.3 不同装液量对产酶的影响

于250mL三角瓶中分别加入30mL、40mL、50mL、60mL、70mL和80mL的发酵培养基，在30℃、200r/min下进行发酵，确定最佳装液量（表11）。

表11 不同装液量对产酶的影响

Figure 2011101219262100002DEST_PATH_IMAGE022

当装液量为60mL/250mL时，产酶效果最好；低于60mL/250mL时，随着装液量的不断增加，酶活力逐渐上升；当装液量高于60mL/250mL时，随着装液量的增加，酶活力呈现下降的趋势。因此选择装液量为60mL/250mL。

3.4 不同发酵温度对产酶的影响

将接种好的培养液分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃摇床中（200r/min）进行发酵，确定最适发酵温度（表12）。

表12 不同发酵温度对产酶的影响

当温度低于30℃时，总体产酶效果较好，在20℃和25℃时酶活力均在40000U/L以上；最适产酶温度为25℃，在该温度下酶活力达到51911.11U/L；但当温度超过30℃时，产酶量迅速下降，35℃时，酶活力下降到18822.23U/L， 40℃时，酶活力只剩下70.22U/L。因此确定最佳发酵温度为25℃。

实施1：优化试验

采用优化后的培养基配方和发酵条件进行发酵产酶，最高漆酶活力可达58888.59U/L，约为优化前的10.8倍。

实施2：5L发酵罐试验

采用自动控制5L发酵罐，装液量3.2L，接种量8%，发酵温度25℃，每天取发酵液8000r/min、4℃离心10min，取上清液测定漆酶活力（表13）。

表13 一色齿毛菌发酵过程漆酶活力的变化

Figure 2011101219262100002DEST_PATH_IMAGE026

随着发酵时间的延长，漆酶活力也逐渐提高，当发酵进行到第6d的时候，酶活力达到最大，为79733U/L，最高酶活力约为实验室摇瓶条件下的1.35倍；随着发酵时间的进一步增加，酶活力开始下降。

Claims

1.一种发酵生产漆酶的方法，包括真菌分泌漆酶培养基的配制和产酶发酵，其特征在于：所述真菌分泌漆酶培养基为：每100mL的液体培养基中含有葡萄糖1-4g，酒石酸铵1-2.5g，ABTS 0.05-0.25mmol/L，VB₁0.6mg/L，大量元素，微量元素，余量为水，用NaOH或HCl调节初始pH=5.0-6.0。

2.根据权利要求1所述的发酵生产漆酶的方法，其特征在于：所述真菌分泌漆酶培养基为：每100mL的液体培养基中含有葡萄糖2g，酒石酸铵1.5g，ABTS 0.05mmol/L，VB₁0.6mg/L，大量元素，微量元素，余量为水，调节初始pH=5.0；其中大量元素包括：KH₂PO₄ 20.0g/L，MgSO₄ ^。7H₂O 13.8g/L，CaCl₂1.0g/L和NaCl 0.6g/L；微量元素包括：MnSO₄ ^。H₂O 0.35g/L，FeSO₄ ^。7H₂O 60mg/L，CoCl₂ ^。6H₂O 110mg/L，ZnSO₄ ^。7H₂O 60mg/L，CuSO₄ ^。5H₂O 95 mg/L，AlK(SO₄)₂ ^。12H₂O 6mg/L，H₃BO₃6mg/L和NaMoO₄ ^。2H₂O 6mg/L。

3.根据权利要求1所述的发酵生产漆酶的方法，其特征在于：所述真菌为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)。

4.根据权利要求1所述的发酵生产漆酶的方法，其特征在于：发酵工艺条件为：接种量8-12%，发酵温度20-30℃，转速150-250r/min，装液量50-70mL/250mL。

5.根据权利要求3所述的发酵生产漆酶的方法，其特征在于：发酵工艺条件为：接种量8%，发酵温度25℃，转速200r/min，装液量60mL/250mL。

6.根据权利要求3所述的发酵生产漆酶的方法，其特征在于：接种的种子液的制备方法为：将在PDA平板上活化好的菌种用打孔器制成10-12mm菌块，将得到的菌块接入PDA液体培养基中，所述PDA液体培养基的配制为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL；PDA液体培养基装液量为100mL/250mL三角瓶，每瓶接种3个菌块，然后在转速200r/min，温度30℃摇床中恒温振荡培养4d，制成种子液。