CN102180970A - 一种抗hiv融合多肽cp32m的固液混合策略规模制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种抗HIV融合多肽CP32M的固液混合策略规模制备方法。本发明提供一种抗HIV融合多肽CP32M(Ac-VEWNEMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-NH2)的制备方法(合成路线见附图)。将目标肽划分为a(Ac-1-9-OH)、b(Fmoc-10-21-OH)、c(H-22-32-NH2)三个片段。按照多肽固相偶联方法合成三个肽片段。b、c片段经液相缩合后脱除Fmoc基团得到中间肽片段,然后再与片段a进行液相缩合得到侧链保护的目标肽,脱除侧链保护基团得到目标粗品。粗品经DEAE弱阴离子交换色谱及规模C18反相HPLC两步纯化得到纯品。
Description
技术领域:
本发明涉及抗HIV融合多肽CP32M的制备方法,尤其涉及固-液相混合策略合成CP32M的制备方法。
背景技术:
据世界卫生组织和***艾滋病规划署(http://www.unaids.org)的估计,全世界已有六千多万人感染HIV病毒,超过2500万人死于艾滋病,研制其治疗药物具有重要意义。
目前治疗爱滋病药物主要是逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂,但耐药性及副作用是其突出问题。近年来病毒融合抑制剂及整合酶抑制剂进入临床,降低了毒性。2003年上市的唯一基于HIV表面融合蛋白gp41靶点的抑制剂Fuzeon对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂耐药及不耐药病人均具有很好的治疗效果,且副作用低(Tom Matthews et al.Nature reviews,2004,3:215-25.)。然而Fuzeon存在用量偏大,耐药性产生快等不足(Yuxian He,Jianwei Chen,Qiuyun Dai.PNAS,2008,105(42):16332-7.)。
CP32M是申请人设计的新型抗gp41融合多肽(Ac-VEWNEMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-NH2)(Yuxian He.Jianwei Chen,Qiuyun Dai.PNAS,2008,105(42):16332-7.)。该肽具有如下突出特征:(1)作用活性比Fuzeon高得多;(2)对T-20、C34病毒耐株非常有效;(3)对O型HIV-1BCF02有特效(IC50为11.6nm);(4)耐药性低;(5)CP32M的氨基酸序列与Fuzeon、C34及国内的扶素肽Fuserox的同源性仅28%、47%、63%,且只含32个氨基酸,合成相对容易,成本降低。CP32M及相关肽已获得国家发明专利(ZL200610087074.9)
目前多肽合成主要采用逐步合成法,即保护氨基酸逐个连接于树脂,然后通过肽树脂的切割、脱保护而得到目标肽。常用的多肽合成方法主要有Fmoc保护和Boc保护策略。目前绝大部分多肽合成采用Fmoc保护策略,即脱保护采用哌啶,树脂切割采用三氟乙酸(TFA)混合体系,该法比Boc法优越,因为Boc法中每步脱除Boc均需用TFA,肽树脂切割采用刺激强烈、剧毒的氟化氢。
长肽的规模合成主要有两种方法,即单一的逐步合成法,适用于肽链少于30个氨基酸的多肽。而更长的多肽需采用采用固-液相混合策略(Brian L.Bray.Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis.Nature,2003,2:587-93.),该法先合成带侧链保护的多个肽片段,片段再进行液相缩合得到目标肽,此法可以大大提高长肽的合成效率,减少保护氨基酸的用量。固-液相混合策略规模合成长肽的关键是片段的选择,要防止片段缩合时出现消旋及耦合效率低的问题。肽片段的长度一般为数个至十几个氨基酸,不宜过长。缩合片段应尽量符合以下要求:①尽量选用非光活性或消旋风险最小氨基酸;②全保护肽片段在有机溶剂中如DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、NMP(N-甲基吡咯烷酮)中具有很好的溶解性;③片段纯度高(王德心.固相有机合成:原理及应用指南.北京:化学工业出版社,2004:114-115.)。最佳片段的选择还应根据具体序列,通过试验确定各片段的合成效率及液相缩合效率来确定。
多肽的纯化方法一般有离子交换色谱、反相高效液相色谱。离子交换色谱有分辨率高、分辨容量大、易于放大等特点,根据多肽杂质的电荷差异加以分离。反相高效液相色谱根据多肽的疏水性差异加以分离。
发明内容:
本发明的目的是提供一种含32个氨基酸的抗HIV融合多肽CP32M的固液相规模制备方法。
在片段划分选择中,主要考察了两片段法和三片段法的合成效果及缩合效率,典型的片段划分及序列见表1。按方式1将目标肽划分为二个肽片段α和β,但片段的纯度和收率均很低。将目标肽按方式2划分为三个片段(1)、(2)、(3)时,(2)、(3)两个片段合成效果较好,而片段(1)纯度较差,HPLC分析有多个杂峰出现。为减小片段(1)合成难度,将划分点的选择更靠近肽链N端,得到第3种划分方式。少量合成中甲、乙、丙三个片段的合成效果均较好,但片段乙与丙液相缩合很困难,且片段丙的合成纯度不高。经过进一步的优化,发现按方式4划分,各片段a、b、c合成效率高(附图2、3、4)较好,收率达到80%,液相缩合得到目标粗肽CP32M且收率较高(附图5)。
表1 片段划分方式的选择
按照片段策略4的合成路线见附图1。在片段合成中,Fmoc保护的氨基酸与树脂的投料比为2.5∶1,氨基酸逐步偶合到酸敏感树脂上,目的片段合成后经温和裂解得到带侧链保护的多肽片段,各片段纯度高不需色谱纯化即可用于固液相缩合。CP32M的合成及纯化步骤如下:片段a(表1中示)以2-Cl-Resin为起始树脂,采用Fmoc保护策略的线性固相合成方法合成并经1%TFA温和裂解而得,其N端乙酰化修饰,产率60%(纯度分析见附图2);片段b采用同法进行合成,同时N端保留Fmoc保护基,产率达75%(纯度分析见附图3);片段c以Sieber树脂为起始原料,产率达85%(纯度分析见附图4)。侧链保护片段b与片段c以HOBt/HBTU/DIEA(1-羟基苯并三氮唑/2-(1H-苯并***)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐/二异丙基乙二胺)为缩合剂进行缩合,用20%哌啶脱除Fmoc基团得到中间体肽片段H-10-32-NH2,然后与片段a进行缩合得到全保护目标肽,用TFA/EDT(1,2-二巯基乙醇)/H2O/TIS(三异丙基硅烷)混合液脱除侧链保护基得到CP32M粗品。
粗品选择离子交换色谱进行第一步纯化,填料为DEAE弱阴离子交换剂,采用流动相10mmol/L Na2B4O7缓冲液(pH=7.8)(A)及10mmol/L Na2B4O7缓冲液加1mol/L NaCl(pH=7.8)(B)梯度洗脱,收集目标峰。然后再用反相HPLC纯化(规模柱(C18 Kromasil,50mm×400mm)),含0.1%TFA的乙腈梯度洗脱,收目标肽CP32M,浓缩后冻干得到纯品。
附图说明:
附图1 CP32M合成路线图
附图2片段a HPLC分析图
附图3片段b HPLC分析图
附图4片段c HPLC分析图
附图5 CP32M粗品HPLC分析图
附图6粗品阴离子交换色谱纯化后HPLC分析图
附图7样品反相高效液相色谱纯化后HPLC分析图
具体实施方式:
实施例1:Fmoc-Leu-CTC Resin的合成
2-Cl-CTC-Resin 14g及Fmoc-Leu-OH 11.9g(33.3mmol)溶于40ml NMP(N-甲基吡咯烷酮),加入DIEA(6.6ml,40mmol),偶合2小时,抽干,树脂依次用60ml DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、MeOH(无水甲醇)、DCM、DMF、DMF洗涤。未反应的树脂用MeOH(63ml,1.54mol)与DIEA(7ml,42.34mmol)封闭1小时,抽干,用60ml DCM、DMF、DCM、DCM分别洗涤。
实施例2:Fmoc-Met-CTC Resin的合成
2-Cl-CTC-Resin 16.75g及Fmoc-Met-OH 15.1g(40mmol)溶于40ml NMP,加入DIEA(8ml,48mmol),偶合2小时,抽干,树脂依次用60ml DMF、MeOH、DCM、DMF、DMF洗涤。未反应的树脂用MeOH(81ml,1.98mol)与DIEA(9ml,54.43mmol)封闭1小时,抽干,依次用60ml DCM、DMF、DCM、DCM洗涤。
实施例3:多肽片段a(Ac-1-9-OH)的固相合成
Fmoc-Met-CTC Resin(21.1g,15mmol)用20%哌啶/NMP溶液(100ml)分别脱保护5分钟和30分钟,然后依次用DMF、DCM、MeOH、DCM(3次)、NMP(3次)洗涤。抽干后,加入活化的Fmoc-Trp(Boc)-OH(37.5mmol,23.78g)/HOBt(39.375mmol,1.05eq)/lDIEA(78.75mmo,2.1eq)/HBTU(40.125mmol,1.07eq)NMP溶液,震荡3小时,茚三酮检测呈阴性,抽干树脂,再用DMF、MeOH、DCM、DMF、DMF洗涤(100ml)。按上述方法依次连接剩余氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH。最后一个氨基酸Val连接完毕后,脱除Fmoc基团(方法同前),然后用乙酸酐(7ml,75mmol)与DIEA(25ml,150mmol)混合液修饰N端(反应2小时),抽干肽树脂,依次用100ml DMF、MeOH、DCM、DMF、DCM(2次)洗涤。
肽树脂用1%TFA的DCM溶液洗涤4次(200ml),每次3min,再用DCM洗涤3次(100ml),收集洗涤液,旋蒸,用无水乙醇除去残余DCM,加入500ml冷水析出沉淀,静置2小时,抽滤,晾干得15g片段a(Ac-1-9-OH)。取少量,用TFA/DTT/H2O/TIS(1ml/50mg/50μl/20μl)脱去侧链保护基,HPLC分析(附图2)。
实施例4:多肽片段b(Fmoc-10-21-OH)的固相合成
Fmoc-Leu-CTC Resin(18.14g,15mmol)用20%哌啶/NMP溶液(100ml)分别脱保护5分钟和30分钟,然后依次用DMF、DCM、MeOH、DCM(3次)、NMP(3次)洗涤。抽干后,加入活化的Fmoc-Lys(Boc)-OH(17.6g,37.5mmol)/HOBt(39.375mmol,1.05eq)/DIEA(78.75mmol,2.1eq)/HBTU(40.125mmol,1.07eq)NMP溶液,震荡反应3小时,茚三酮检测呈阴性,抽干树脂,再用DMF、MeOH、DCM、DMF、DMF洗涤(100ml)。按上述方法依次连接剩余氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH。
肽树脂用1%TFA的DCM溶液洗涤4次(200ml),每次3min,再用DCM洗涤3次(100ml),收集洗涤液,旋蒸,用无水乙醇除去残余DCM,加入500ml冷水析出沉淀,静置2小时,抽滤,晾干得32g片段b(Fmoc-10-21-OH)。取少量,用TFA/DTT/H2O/TIS(1ml/50mg/50μl/20μl)脱去侧链保护基,HPLC分析(附图3)。
实施例5:多肽片段c(H-22-32-NH2)的固相合成
21.74g(15mmol,0.69mmol/g)Sieber Resin用20%哌啶/NMP溶液(100ml)分别脱保护5分钟和30分钟,然后依次用DMF、DCM、MeOH、DCM(3次)、NMP(3次)洗涤。抽干后,加入活化的Fmoc-Gln(Trt)-OH(23.02g,37.5mmol)/HOBt(39.375mmol,1.05eq)/DIEA(78.75mmol,2.1eq)/HBTU(40.125mmol,1.07eq)NMP溶液,震荡3小时,茚三酮检测呈阴性,抽干树脂,再用DMF、MeOH、DCM、DMF、DMF洗涤(100ml)。按上述方法依次连接剩余氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH。最后一个氨基酸I连接完毕后,脱除Fmoc基团(方法同前)。
肽树脂用1%TFA的DCM溶液洗涤8次(200ml),每次3min,再用DCM洗涤3次(100ml),收集洗涤液,旋蒸,用无水乙醇除去残余DCM,加入500ml冷水析出沉淀,静置2小时,抽滤,晾干得29g片段c(H-22-32-NH2)。取少量,用TFA/DTT/H2O/TIS(1ml/50mg/50μl/20μl)脱去侧链保护基,HPLC分析(附图4)。
实施例6:中间肽片段H-10-32-NH2的合成
Fmoc-10-21-OH(侧链保护)(5mmol,13.76g)/H-22-32-NH2(侧链保护)(8mmol,18.3g)溶解于60ml NMP中,加入HOBt(6mmol,1.2eq)、DIEA(12mmol,2.4eq)及HBTU(6mmol,1.2eq),室温搅拌2小时,TLC法检测反应完全,搅拌中加500ml冷水析出沉淀,静置2小时,抽滤,固体晾干后用60ml 20%哌啶/NMP脱保护1h,搅拌加入500ml冷水析出沉淀,静置2小时,抽滤后固体分别用饱和碳酸氢钠溶液、蒸馏水、正己烷洗涤。固体冻干后得26.5g中间肽片段H-10-32-NH2。
实施例7:带侧链保护目标肽CP32M的合成
侧链保护片段Ac-1-9-OH(4.8mmol,8.05g)及侧链保护片段H-10-32-NH2(4.8mmol,22.9g)溶解于80ml NMP中,加入HOBt(5.76mmol,1.2eq)、DIEA(11.52mmol,2.4eq)、(5.76mmol,1.2eq)HBTU,室温搅拌2小时,TLC法检测反应完全,搅拌中加600ml冷水析出沉淀,静置2小时,抽滤后固体分别用饱和碳酸氢钠溶液、蒸馏水洗涤,晾干得30g带侧链保护的CP32M。
实施例8:全保护目标肽脱除侧链保护基得到CP32M
带保护基的CP32M 40g用TFA(200ml)/EDT(20ml)/H2O(20ml)/TIS(8ml)脱保护3小时,减压蒸除TFA等裂解剂,倒入1L冷无水***,搅拌,静置1小时。抽滤,无水***洗涤3次,晾干后称重约26g,HPLC分析(附图5)。
实施例9:CP32M粗品进行阴离子交换色谱纯化
色谱柱选用Protein-Pak DEAE 40HR(5cm×30cm),上样量为15g(2g/次)。流动相采用10mmol/L Na2B4O7缓冲液(pH=7.8)(A)及10mmol/L Na2B4O7缓冲液加1mol/LNaCl(pH=7.8)(B),洗脱梯度为0-4L/0-30%B,4L-6L/100%B,流速14ml/min。检测波长280nm。收集目标峰,得到纯度大于80%的样品5克,HPLC分析见附图6。
实施例10:反相HPLC纯化样品
反相HPLC纯化选用规模柱(C18 Kromasil10μm(5cm×40cm)),用含0.1%TFA的乙腈进行梯度洗脱,洗脱梯度为1min-5min/20%B-40%B;5min-25min/40%B-70%B;检测波长214nm。上样量5g(0.8克/次),收集目标肽CP32M,浓缩后冻干,得到纯度大于98%的纯品3克,HPLC分析见附图7。
Claims (2)
1.一种抗HIV融合多肽CP32M(Ac-VEWNEMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-NH2)的固液混合策略规模制备方法,其特征在于,采用固液相混合策略将目标肽划分为三个优选片段,即片段a(Ac-1-9-OH)、片段b(Fmoc-10-21-OH)、片段c(H-22-32-NH2)。片段a与片段b以2-Cl-树脂为起始原料,片段c以Sieber树脂为起始原料,三个肽片段-树脂按照逐步多肽固相偶联方法合成,经温和裂解得到全保护肽片段。b、c片段进行液相缩合后脱除Fmoc保护基团得到中间体肽片段,然后再与片段a进行液相缩合从而得到侧链保护的目标肽,脱除侧链保护基团得到CP32M粗品。
2.CP32M粗品通过DEAE弱阴离子交换色谱进行第一步纯化,然后使用规模C18反相柱进行HPLC纯化,收集样品,经浓缩后冻干得到纯品。
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