CN102177871A

CN102177871A - 功能性消化不良肝脾气滞证动物模型的建立方法

Info

Publication number: CN102177871A
Application number: CN2011100350641A
Authority: CN
Inventors: 蔡光先; 刘柏炎; 易健
Original assignee: Hunan University of Chinese Medicine
Current assignee: Hunan University of Chinese Medicine
Priority date: 2011-02-09
Filing date: 2011-02-09
Publication date: 2011-09-14

Abstract

本发明涉及一种动物模型的建立方法，具体是一种功能性消化不良动物模型的建立方法。它是采用不可预知的慢性应激模型的建立手段与饥饱失常法的手段同时处理动物，从而获得功能性消化不良肝脾气滞证动物模型；所谓不可预知的慢性应激模型，是指选取多种刺激因素对动物进行不可预知的刺激。病证结合模型为功能性消化不良相关生物学研发奠定基础，为新型治疗药物提供理想的动物模型。

Description

功能性消化不良肝脾气滞证动物模型的建立方法

技术领域

本发明涉及一种动物模型的建立方法，具体是一种功能性消化不良动物模型的建立方法。

背景技术

公认的疾病模型的建立方法有慢性应激模型和饥饱失常法。现有技术文献中(例如“慢性应激模型研究进展”<四川精神卫生>2010年第23卷第2期)公开了慢性应激模型。

而饥饱失常法是一种熟知的造模方法，被广泛单独使用或与其他手段联合使用进行造模。

功能性胃肠病是指不伴有器质性改变、具有胃肠功能紊乱表现的一类疾病，是临床常见的疾病。功能性消化不良发病率高且呈上升趋势。中医学据其临床表现应属“痞满””等范畴。本病多由情志不遂、饮食伤胃、劳倦伤脾、寒温失调等因素导致脾胃气机升降失常，临床多以七情内伤，致肝失疏泄，木郁土壅，运化功能减退，中焦痞塞不通，内生痞满所致，病位在脾胃，但与肝等多个脏腑有密切的关系。

证候是中医临床辨证论治的核心，它以中医基础理论特别是藏象理论为基础，又指导着方剂的临床应用.因此中医证候的研究，与中医藏象理论和中药复方作用机理紧密相关，是关系到中医理论发展的关键问题，探索并建立符合中医证候特点的动物模型对学科发展有着重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种功能性消化不良肝脾气滞证动物模型的建立方法。

本发明提供的功能性消化不良肝脾气滞证动物模型的建立方法是：采用不可预知的慢性应激模型的建立手段与饥饱失常法的手段同时处理动物，从而获得功能性消化不良肝脾气滞证动物模型。

所谓不可预知的慢性应激模型，与传统的慢性应激模型不同，是指选取多种刺激因素对动物进行不可预知的刺激，而传统的慢性应激模型是采用单一的刺激手段对动物进行刺激。传统的慢性应激模型使得动物对单一刺激不敏感。

具体地，本发明的方法是：采用不可预知的慢性应激模型：选取多种刺激因素对动物进行不可预知的刺激：①食物剥夺24小时；②饮水剥夺合并空瓶刺激12小时；③明暗颠倒24小时；④湿笼饲养24小时；⑤强迫游泳45℃，5分钟；⑥倒悬30分钟；⑦行为束缚30分钟；⑧超声刺激2小时；⑨夹尾1小时。每天随机选取一种，相邻两天的刺激不重复，在上述造模同时，动物禁食24小时，仅给予蒸馏水，然后给予富脂食物喂养2天，重复上述方法造模14天。

病证结合动物模型和疾病模型的最大区别就是除了功能性消化不良的应有病理变化外，同时还出现有肝郁证的表现，不同于普通疾病模型的病理生理表现，会有神经递质和激素水平的变化。

病证结合模型为功能性消化不良相关生物学研发奠定基础，为新型治疗药物提供理想的动物模型。中医证候动物模型研究在研究探索中医证的涵义和生理、病理、病因的实质及为中医临床诊疗提供客观依据方面取得了一定进展。其作为中医基础研究的重要组成部分，定将与中医临床研究相互促进，共同提高中医现代化水平。通过本研究，可以扩大方剂学的研究领域，推进方剂配伍规律的物质基础研究，为中医证型的现代研究提供思路与方法学上的参考，为临床合理用药提供保障及依据。本研究不仅丰富了中医动物模型，还为中药新药开发和机理研究提供，具有较高的理论价值和较大现实意义。

附图说明

图1是模型动物肠道组织病理切片图，其中：A疾病模型组，B病证模型组，C阳性药物组；

图2各组小鼠脑内DRD1阳性细胞表达(×400)，其中：A正常组，B病证模型组，C疾病模型组，D阳性药物组；

图3各组小鼠脑内DRD2阳性细胞表达(×400)，其中：A正常组，B 病证模型组，C疾病模型组，D阳性药物组；

图4各组小鼠十二指肠DRD1阳性纤维表达(×200)，其中：A正常组，B病证模型组，C疾病模型组，D阳性药物组；

图5各组小鼠十二指肠DRD2阳性纤维表达(×200)，其中：A正常组，B病证模型组，C疾病模型组，D阳性药物组。

具体实施方式

实施例1

1.目的

运用慢性不可预测应激和饥饱失常法复制功能性消化不良肝脾气滞证动物模型，从行为学、功能评价、病理学、胃肠激素和相关神经递质检测评价动物模型，并运用药物进行反证，探讨肝脾气滞证的病理基础，建立一种国际公认的动物模型。

2.材料

2.1动物来源

Km小鼠，2月龄，清洁级，20-30g，雌雄各半，湖南斯莱克景达实验动物公司提供，实验动物许可证号SCXK(湘)2009-0004。

2.2试剂与药物

四磨汤口服液(湖南汉森制药股份有限公司)，批号：091002183，规格：10ml/支。兔抗小鼠多巴胺受体1单抗(DRD1)、兔抗小鼠多巴胺受体2单抗(DRD2)，由武汉博上德生物工程有限公司提供；SP-9000免疫组化染色试剂盒(批号724944A)和液体AEC酶底物试剂盒(批号K96914D)，由北京中杉金桥生物技有限公司提供；水溶性封片剂，由武汉博上德生物工程有限公司提供。小鼠NE ELISA试剂盒(美国ADL公司)，小鼠5-HTELISA试剂盒(美国RD公司)，胃泌素试剂盒由(北京北方生物技术研究所)。

2.3仪器

英国Thermo公司E60冰冻切片机；日本Olympus公司BX-51光学显微镜及Image-ProPlus 5.1(IPP5.1)图像分析***；上海医疗器械七厂电热恒温水浴箱，GL20A高速冷冻离心机(湖南仪器仪表总厂离心机厂)；MK3型酶标仪(芬兰LABSYSTEMS集团)。

3.方法

3.1动物分组与给药

120只小鼠随机分为正常组、疾病模型组、病证模型组、阳性对照药组(病证模型)，阳性对照药组于造模开始时给予四磨汤，剂量7.56ml/kg(临床等效剂量)。

3.2动物造模方法：

病证模型：采用不可预知的慢性应激模型：选取多种刺激因素对大鼠进行不可预知的刺激：①食物剥夺(24h)；②饮水剥夺合并空瓶刺激(12h)；③明暗颠倒(24h)；④湿笼饲养(24h)；⑤强迫游泳(45℃，5min)；⑥倒悬(30min)；⑦行为束缚(30min)；⑧超声刺激(2h)；⑨夹尾(1h)。每天随机选取一种，相邻两天的刺激不重复，造模14天。饥饱失常法：在上述造模同时，动物禁食24小时，仅给予蒸馏水，然后给予富脂食物喂养2天，重复上述方法。

疾病动物模型：单纯采用饥饱失常法造模，同上。

3.3制备营养性半固体糊

取羧甲基纤维素纳10g溶于250mL蒸馏水中，分别加入奶粉16g、糖8g、淀粉8g、活性炭末2g，搅拌均匀，配制成300mL的黑色半固体糊状物，冰箱冷藏，用时恢复至室温。

3.4组织处理

于动物造模模前和造模后处死动物。动物麻醉后经心脏灌注多聚甲醛固定后取血清，或相应组织冰冻切片。

3.5指标检测

3.5.1外观观察：观察并记录造模中各组小鼠的情绪、体重、毛发色泽、饮食、大小便等外观行为方面的变化；

3.5.2行为学评价：分别于第0、7、14d进行open-field-test试验，观察各组大鼠的5min内水平爬行格数和直立次数。

3.5.3胃肠运动观察：各选取10只动物做胃排空和肠道推进实验。造模第13d，小鼠禁食(自由饮水)8h后末次给药，给药后1h，每只小鼠灌胃给予半固体糊0.8mL，20min后10％水合氯醛麻醉。打开腹腔，结扎幽门和贲门，取出胃，用滤纸擦干后称全重，然后沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后擦干，称净重，以胃全重和胃净重之差为胃内残留物质量，计算胃内残留物占所灌半固体糊质量百分比为胃内残留率。同时迅速取出小肠，测量黑色半固体糊前沿至幽门距离(小肠推进长度)和幽门至回盲部距离(小肠总长度)，按下列公式计算推进百分率。推进率(％)＝黑色半固体糊推进长度/小肠总长度×100％。

3.5.4病理学观察：观察胃肠组织的病理形态学，判别是否有器质性病变。

3.5.5血清学检测：麻醉后心脏取血1mL直接置于预冷的试管内，4℃离心(3000r/min)15min，取血清置-34℃冰箱保存。测定按胃泌素放免试剂盒说明进行。Elisa法检测胃动素表达。

3.5.6激素水平的检测：ELISA法检测血清NE和5-HT的表达。

3.5.7神经递质的检测：免疫组织化学法检测小鼠Dopamine1、Dopamine2的水平。

3.6数据处理：

所有数据以均数±标准差表示，应用SPSS16.0统计软件包对数据进行统计分析，多组比较用方差分析和q检验。

4.结果与分析

4.1动物一般情况观察

实验期间，正常组小鼠的外观等未见异常。与正常组小鼠相比，随着造模天数的增加，疾病模型组小鼠毛发变得不光泽，情绪无明显变化，饮食减少，体重增长减慢；病证模型组小鼠毛发由顺整变为不泽、枯乱；行为状态由活泼变为少动、扎堆、不活跃；情绪由稳定变为易怒继而低落；饮食逐渐减少；睡眠由良好变为易醒、倦卧；大便由正常变为稍干。药物组小鼠情况较病证模型组好，但比正常组稍差。结果提示符合造模可导致小鼠性情烦躁，进食减少，体重下降，而单纯疾病模型未出现肝郁表现，阳性药物可对抗符合造模这一过程，结果见表1。

表1小鼠体重情况比较

注：与正常组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与疾病模型组比较#P＜0.05；与病证模型组比较▲P＜0.05。

4.2动物的行为学观察

病证模型组动物自发活动次数明显减少，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，疾病模型跟正常组比较差异无统计学意义，与病证模型比有统计学意义(P＜0.05)，病证模型经治疗后活动次数恢复较快，药物组比模型组自发活动显著。详见表2。

表2动物自主活动情况比较(

times/5min)

注：与正常组比较*P＜0.01；与疾病模型组比较#P＜0.01；与病证模型组比较▲P＜0.05。

4.3造模对动物胃肠运动的影响

病证模型组和疾病模型小鼠胃排空和小肠推进功能降低，与正常组比较差异有显著性统计学意义(P＜0.01)。给药后，四磨汤组胃内残留率降低，小肠推进率升高，与模型组比较有统计学差异(P＜0.05)。见表2。

表3慢性应激对小鼠胃排空和小肠推进的影响

注：与正常组比较*P＜0.01；与疾病模型组比较#P＜0.05；与病证模型组比较▲P＜0.05。

4.4肠道组织病理改变

病证模型组小鼠HE染色后，普通光学显微镜下观察发现，模型组动物胃肠组织粘膜无缺损，粘膜层没有发现充血水肿，无炎症细胞散在分布。疾病模型组和阳性药物组动物也无明显病理变化。具体见图1

4.5血清胃动素和胃泌素的表达

疾病模型建成后血清胃泌素含量降低，病证模型组MOT也下降明显，两组比较差异无统计学意义，药物组胃泌素含量下降不明显，与病证模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。疾病模型动物胃动素含量升高，病证模型组GAS也升高，组建比较差异无统计学意义，药物组升高不明显，与病证模型组差异无统计学意义。见表4。

表4慢性应激对小鼠血清胃动素和胃泌素的表达的影响

注：与正常组比较*P＜0.05；与疾病模型组比较#P＜0.05；与病证模型组比较▲P＜0.05。

4.6激素水平的变化

疾病模型组动物血清去甲肾上腺素(NE)、五羟色胺(5-HT)不升高，与正常组比较差异无统计学意义；病证模型组动物血清去甲肾上腺素(NE)、五羟色胺(5-HT)升高，与疾病模型组比较有统计学意义(P＜0.05)，与正常组比较有统计学意义(P＜0.05)。阳性药物组去甲肾上腺素(NE)、五羟色胺(5-HT)水平升高不明显，与正常组比较差异无统计学意义，与病证模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。提示病证模型组激素水平出现变化，符合目前中医关于肝郁证的表现，药物能对抗这一变化。具体见表5。

表5慢性应激对小鼠血清NE和5-HT的表达的影响

4.7神经递质的表达

4.7.1复合造模对小鼠脑组织DRD1、DRD2的影响

DRD1在正常脑组织有一定量的表达，阳性细胞呈现红褐色，在脑内表达广泛，脑皮层、Calleja岛、下丘脑和杏仁核均有表达，主要分布于脑皮层，以星状、条索状形态多见。造模后，疾病模型组小鼠DRD1阳性细胞数与正常组比较，无明显变化，无统计学意义；病证模型组小鼠DRD1阳性细胞染色较深，数量较多，与正常组和疾病模型组分别比较差异均有显著性统计学意义(P＜0.05)；四磨汤组DRD1表达下降，与病证模型组比较有统计学差异(P＜0.05)，与正常组比较差异无统计学意义。见图2，表5。

DRD2在正常脑组织的阳性表达呈胞质红褐色染色，不同部位的DRD2表达形态多样，以大脑皮层的梭形、多角形多见。造模后，疾病模型组小鼠DRD2阳性细胞数与正常组比较，无统计学意义；模型组DRD2阳性细胞染色深，数量增多，与正常组和疾病模型组分别比较差异均有显著性(P＜0.01)；四磨汤组DRD2表达下降，与病证模型组比较有统计学差异(P＜0.05)，与正常组比较差异无统计学意义。见图3，表6。

表6造模对小鼠脑内DRD1、DRD2阳性细胞数的影响

注：与正常组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与疾病模型组比较#P＜0.05；与模型组比较▲P＜0.05。

4.7.2造模对小鼠十二指肠DRD1、DRD2的影响

DRD1在正常十二指肠组织有一定量的表达，阳性纤维呈现红褐色，较弥散地分布于整个粘膜层，而在固有层顶部绒毛间质内呈集中趋势，腺体与腺体、上皮细胞与上皮细胞之间亦有。疾病模型组小鼠十二指肠DRD1表达和正常组比较差异无统计学意义，病证模型组小鼠DRD1阳性纤维染色较深，分布较广，与正常组和疾病模型组比较差异有显著性统计学意义(P＜0.01)；四磨汤组DRD1表达下降，与模型组比较有显著性统计学差异(P＜0.01)。见图4，表6。

DRD2在正常十二指肠组织的阳性表达呈胞质红褐色染色，以固有膜靠近黏膜肌层为主，不同部位的DRD2表达形态多样。疾病模型组无明显变化，病证模型组DRD2阳性纤维染色深，数量增多，与正常组及疾病模型在比较差异有显著性(P＜0.01)；四磨汤组DRD2表达下降，与模型组比较有统计学差异(P＜0.05)。见图5，表7。

表7造模对慢性应激小鼠十二指肠DRD1、DRD2平均OD值的变化

注：与正常组比较

与疾病模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与病证模型组比较

Claims

1.功能性消化不良肝脾气滞证动物模型的建立方法，其特征在于是采用不可预知的慢性应激模型的建立手段与饥饱失常法的手段同时处理动物，从而获得功能性消化不良肝脾气滞证动物模型；所谓不可预知的慢性应激模型，是指选取多种刺激因素对动物进行不可预知的刺激。

2.根据权利要求1所述的功能性消化不良肝脾气滞证动物模型的建立方法，其特征在于所述的不可预知的慢性应激模型的建立手段是选取下列多种刺激因素之一对动物进行不可预知的刺激：①食物剥夺24小时；②饮水剥夺合并空瓶刺激12小时；③明暗颠倒24小时；④湿笼饲养24小时；⑤强迫游泳45℃，5分钟；⑥倒悬30分钟；⑦行为束缚30分钟；⑧超声刺激2小时；⑨夹尾1小时。每天随机选取一种，相邻两天的刺激不重复，在上述造模同时，动物禁食24小时，仅给予蒸馏水，然后给予富脂食物喂养2天，重复上述方法造模14天。