CN102172409A - 一种用于乌头类中药毒性效价检测的生物检定方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乌头类中药毒性效价检测的生物检定方法。本发明提供的毒性效价检测的生物检定法可以准确、快捷地检测乌头类中药的整体毒性，对药材进行统一的毒性效价标示。本发明还涉及一种用于乌头类中药毒性效价检测的生物检定方法的装置。

Description

一种用于乌头类中药毒性效价检测的生物检定方法及装置

技术领域

本发明涉及一种乌头类中药毒性效价检测的生物检定方法及装置。

背景技术

附子、川乌、草乌等乌头类中药在临床上应用十分广泛，特别是附子在危重症的抢救和久治不愈的疑难病例的治疗中发挥了突出的作用，自古为中药回阳救逆之第一品。乌头类中药有一个共同的特点，即均有剧毒，治疗量和致死量接近，安全窗较窄，这给临床安全用药带来巨大挑战，如附子被称为“最有用亦最难用”的中药。双酯型生物碱是乌头类中药的主要毒性成分，主要包括乌头碱、新乌头碱与次乌头碱三种，其毒性极强，主要是对神经和心血管***造成严重伤害，人口服乌头碱0.2mg即可引起中毒，致死量为2～5mg。由于乌头类中药药性剧烈，作用时间短，且治疗剂量与中毒剂量、致死剂量接近，因用药不慎而中毒甚至死亡的情况在临床上屡见不鲜。因此，评价药物的安全性是乌头类中药质量控制的重中之重。

现在控制乌头类中药毒性的方法主要是用高效液相色谱等分析手段测定乌头碱、新乌头碱与次乌头碱三种双酯型生物碱的含量。但是，现行的乌头类药材安全性控制方法和标准存在诸多局限性，无法满足生产和临床的需要。中药本身是一个具有多成分、多作用靶点特性的复杂体系，不同成分之间在活性上一般存在着协同、拮抗等诸多相互作用，简单的测定几个特定成分往往难以表征药物的整体药效或毒性。例如，乌头类药材中毒性物质种类较多，除了双酯型生物碱外，其他生物碱也有毒，三种双酯型生物碱的含量并不能准确的表征药材的整体毒性。已进行的药理实验也表明药材总提物的毒性远远大于三种双酯型生物碱毒性的总和，不同批次药材之间甚至出现三种双酯型生物碱含量较低但总毒性高的现象，这样会给临床用药带来很大风险。其次，三种双酯型生物碱含量的测定无法直观地说明药材毒性的大小，不利于不同药材毒性大小的比较和安全性控制。

因此，需要一种能够直观、客观地标示出乌头类药材的总毒性大小，保障临床用药安全性的乌头类中药毒性检测方法。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种乌头类中药毒性效价检测的生物检定方法。

本发明的另一个目的是提供一种用于乌头类中药毒性效价检测的生物检定方法的装置。

本发明的乌头类中药毒性效价检测的生物检定方法包括下述步骤：

a.标准品溶液和标准品稀释液的配制：用无水乙醇将标准品配制成1mg/ml的标准品溶液，在4℃下贮存；测定时，用0.9％的氯化钠溶液稀释得标准品稀释液，标准品稀释液的注射体积不得大于动物单次静脉注射最大承受体积；

b.供试品溶液和供试品稀释液的配制：称取过10～100目筛的供试品粉末，置于锥形瓶中，加入其重量(g)5～15倍体积(ml)的50％～95％的乙醇，浸泡30分钟，超声处理15～60分钟；用孔径0.2μm的微孔滤膜过滤提取液，滤液减压浓缩至原来体积的十分之一得供试品溶液。测定时，估计供试品效价，用0.9％氯化钠溶液对供试品溶液进行稀释得供试品稀释液。调节供试品稀释液浓度使其注射体积与标准品稀释液注射体积相近；

c.测定：取健康合格的动物，试验前24小时移去饲料，但仍给予饮水，临试验前准确称重，每次试验所用动物的体重相差不得超过体重均值的20％；将动物平均分为两组，每组至少6只，一组注入所述标准品稀释液，另一组注入所述供试品稀释液；将动物用固定器固定，于静脉中***注射针头，用匀速注射仪以每分钟0.2～1.0ml的速度匀速连续注入药液，至动物中毒死亡立即停止注入；以动物瞳孔迅速放大、呼吸停止为注入终点；分别记录所注入的以ml计的标准品稀释液和供试品稀释液的总量；

d.按中国药典2010版二部附录XI V生物检定统计法中的直接测定法计算毒性效价及实验误差，可信限率FL％不得超过15％；

直接测定法的计算公式如下：

x_S和x_T为标准品(S)和供试品(T)组各只动物的对数最小致死量，它们的均值

和

为S和T的对数等反应剂量；

M是S和T对数等反应剂量之差，即

R是S和T等反应剂量的比值，即

n_S和n_T为S和T组的动物数；

P_T是T的测得效价，A_T为T的估计效价，P_T＝A_T·R  (3)；

方差

M的标准误

自由度f＝n_S+n_T-2，用此自由度查t值表得t值(P＝0.95)；

P_T的可信限FL＝A_T·antilg(M±t·S_M)(6)；

P_T的可信限率

优选地，所使用的动物可以是大鼠、小鼠、豚鼠、鸽子、青蛙中的一种。

所采用的标准品可为乌头碱、新乌头碱和次乌头碱中的一种。当选用同一标准品，所使用动物不同时，药材毒性效价(即标准品当量)不变。

本发明的用于乌头类中药毒性效价检测的生物检定方法的装置包括固定器、带导管的针头和匀速注射仪，其特征在于所述带导管的针头的针头端***固定在固定器中的动物静脉中，另一端固定在匀速注射仪的注射器上。

本发明装置中的固定器可以为本领域中任何合适的容器，只要动物置于其中不能移动即可，如可以采用圆柱形的筒。

本发明装置中的匀速注射仪可以为本领域中任何合适的匀速注射仪，如可以采用包括注射器、机箱、推进机构、微电脑芯片和控制电路五部分的匀速注射仪。推进机构在微电脑芯片和控制电路的控制下可带动注射器活塞左右平行匀速移动。通过微电脑芯片可以设置注射速度和注射体积。

本发明的乌头类中药毒性效价检测的生物检定方法与现有的乌头类中药安全性评价方法相比，具有如下优点：

1)本发明的毒性效价生物检定方法可以评价药物的整体毒性；

2)以最小致死量作为评价指标使药物毒性大小更加直观明了，同时该评价指标由药理实验得到，与临床相关性更强；

3)将药材总毒性以标准品当量表示，可以对药材毒性大小进行统一标示，便于不同药材间毒性大小的比较及毒性限量的设定；

4)本发明的毒性效价生物检定方法结果准确，精密度高，同时操作简便，用时较短，经济成本低；

5)本发明的装置采用动物固定器和匀速注射仪的合理组合，成本较低，其中动物固定器简单实用，可使注射过程方便快捷；匀速注射仪可以方便地控制生物检定方法中的关键影响因素——注射速度，因而极大地提高了该生物检定方法的效率和结果的准确性。

本发明提供的毒性效价生物检定法可以准确、快捷地检测乌头类中药的整体毒性，对药材进行统一的毒性效价标示。在乌头类药材生产、加工、销售等环节，毒性效价检测可以作为药材质量控制的手段之一；在临床上，医生可以根据药材的标示毒性效价调整用药剂量，从而保证用药安全。

附图说明

图1为本发明的用于乌头类中药毒性效价检测的生物检定方法的装置的示意图。

具体实施方式

以下实施例中采用的物质，除了注明的之外，其余均为市售。

实施例：

供试品：由生附子炮制得到的两个批次的白附片1和2

标准品：乌头碱，赋值1mg＝1000u，u为单位数

动物：SD大鼠，雄性，0.2±0.02kg

步骤如下：

a.精密称取乌头碱10mg置于10ml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，密塞，振摇使完全溶解，在4℃下贮存。测定时，精密量取乌头碱溶液0.5ml置于100ml的容量瓶中，用0.9％氯化钠溶液稀释至刻度得乌头碱稀释液。

b.精密称取白附片1和白附片2的粉末(过100目筛)各10g，置于两个磨口锥形瓶中，分别加入100ml的70％乙醇，浸泡30分钟，超声处理30分钟。提取液用0.2μm微孔滤膜过滤，滤液浓缩至10ml得到两份供试品溶液。测定时，精密量取白附片1或白附片2的溶液5ml置于50ml容量瓶中，用0.9％氯化钠溶液稀释至刻度得供试品稀释液。

c.取18只健康合格的SD大鼠。试验前24小时移去饲料，但仍给予饮水，临试验前准确称重。将动物平均分为三组，分别用于乌头碱、白附片1和白附片2最小致死量的测定。测定时，将动物置于固定器1内，于尾静脉中***带导管的针头2的针头，用匀速注射仪3以每分钟0.5ml的速度匀速连续注入乌头碱稀释液或白附片稀释液，至动物中毒死亡立即停止注入。以瞳孔迅速放大、呼吸停止为注入终点。记录所注入的乌头碱稀释液的总量(ml)或白附片稀释液的总量(ml)，计算最小致死量，结果见表1。

d.按中国药典2010版二部附录XI V生物检定统计法中的直接测定法计算毒性效价及实验误差。计算结果如下：

表1乌头碱、白附片1和白附片2最小致死量测定结果

其中，乌头碱稀释液的浓度为5u/ml，白附片1和白附片2稀释液浓度均为0.1g/ml，估计效价A_T均为50u/g。以白附片1为例，具体计算过程如下：

按(1)～(7)式：

$M={\stackrel{\‾}{x}}_S-{\stackrel{\‾}{x}}_T=2.024-2.032=-0.008;$

R＝antilgM＝antilg(-0.008)＝-0.9816；

P_T＝A_T·R＝50×0.9816＝49.08u/g；

n_S＝n_T＝6；

$s^2=\frac{\mathrm{\Σ}{x_S}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}{x}_S\right)}^2}{n_S}+\mathrm{\Σ}{x_T}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}{x}_T\right)}^2}{n_T}}{n_S+n_T-2}$

$=({0.052}^2+{2.039}^2+...+{2.040}^2-{12.146}^2/6+{2.023}^2+{2.045}^2+...+$

${2.022}^2-{12.194}^2/6)/(6+6-2)$

$=0.0004512;$

$S_M=\sqrt{s^2\·\frac{n_S+n_T}{n_S\·n_T}}=\sqrt{0.0004512\×\frac{6+6}{6\×6}}=0.01226;$

f＝n_S+n_T-2＝6+6-2＝10，用此自由度查t值表得t＝2.23；

P_T的可信限FL＝A_T·antilg(M±t·S_M)

＝50×antilg(-0.008±2.23×0.01226)

＝46.086～52.267u/g；

P_T的可信限率 $\mathrm{FL}\%=\frac{A_T\mathrm{antilg}(M+{\mathrm{tS}}_M)-A_T\mathrm{antilg}(M-t{S}_M)}{2P_T}$

$=\frac{52.267-46.086}{2\×49.08}$

$=6.30\%;$

同理，白附片2的测得效价P_T＝58.39u/g，P_T的可信限FL＝55.176～61.798u/g，P_T的可信限率FL％＝5.67％；

对照：

按中国药典2010版一部附子项下双酯型生物碱含量测定的高效液相色谱法测定白附片1和白附片2中乌头碱的含量，结果为：白附片1和2中乌头碱的含量分别为0.0031mg/g(3.1u/g)，0.0025mg/g(2.5u/g)。

由以上测定结果可以看出，供试品中有毒物质的乌头碱当量远远大于其所含的乌头碱绝对量(约为20倍)。同时，白附片2的毒性效价大于白附片1，但白附片2的乌头碱含量却小于白附片1，这说明单纯测定药材中双酯型生物碱的含量不能准确地表征药材的毒性大小，甚至会得到相反的结果，这会给附子等有毒中药的临床应用带来风险。而本发明提供的毒性效价生物检定法可以准确、快捷地检测药物的整体毒性，有效地避免这种风险。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，并非对本发明作出任何形式上和实质上的限制。本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更改、修饰与演变的等同变化均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更改、修饰与演变等均在本发明的由权利要求界定的范围内。

Claims (4)

1.一种用于乌头类中药毒性效价检测的生物检定方法，其特征在于所述生物检定方法包括下述步骤：

a.标准品溶液和标准品稀释液的配制：

用无水乙醇将所述标准品配制成1mg/ml的标准品溶液，在4℃下贮存；测定时，用0.9％的氯化钠溶液稀释得所述标准品稀释液；

b.供试品溶液和供试品稀释液的配制：

称取过10～100目筛的供试品粉末，置于锥形瓶中，加入其重量(g)5～15倍体积(ml)的50％～95％的乙醇，浸泡30分钟，超声处理15～60分钟；用孔径0.2μm的微孔滤膜过滤提取液，滤液减压浓缩至原来体积的十分之一得供试品溶液。测定时，估计供试品效价，用0.9％氯化钠溶液对供试品溶液进行稀释得供试品稀释液。调节供试品稀释液浓度使其注射体积与标准品稀释液注射体积相近；

c.测定：

取健康合格的动物，试验前24小时移去饲料，但仍给予饮水，临试验前准确称重，每次试验所用动物的体重相差不得超过体重均值的20％；将动物平均分为两组，每组至少6只，一组注入所述标准品稀释液，另一组注入所述供试品稀释液；将动物用固定器固定，于静脉中***注射针头，用匀速注射仪以每分钟0.2～1.0ml的速度匀速连续注入药液，至动物中毒死亡立即停止注入；以动物瞳孔迅速放大、呼吸停止为注入终点；分别记录所注入的以ml计的标准品稀释液和供试品稀释液的总量；

d.按中国药典2010版二部附录XIV生物检定统计法中的直接测定法计算毒性效价及实验误差，可信限率FL％不得超过15％。

2.如权利要求1所述的生物检定方法，其特征在于所述标准品为乌头碱、新乌头碱和次乌头碱中的一种。

3.如权利要求1所述的生物检定方法，其特征在于所述动物为大鼠、小鼠、豚鼠、鸽子、青蛙中的一种。

4.一种用于权利要求1所述的生物检定方法的装置，其特征在于所述装置包括固定器、带导管的针头和匀速注射仪，所述带导管的针头的针头端***固定在所述固定器中的动物静脉中，另一端固定在所述匀速注射仪的注射器上。

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