CN102161699A - 一种文蛤多肽及其制备方法 - Google Patents
一种文蛤多肽及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102161699A CN102161699A CN2011100365454A CN201110036545A CN102161699A CN 102161699 A CN102161699 A CN 102161699A CN 2011100365454 A CN2011100365454 A CN 2011100365454A CN 201110036545 A CN201110036545 A CN 201110036545A CN 102161699 A CN102161699 A CN 102161699A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- liquid
- clam
- centrifugal
- damping fluid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 41
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 45
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 48
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 37
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 33
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 30
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 30
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 24
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 10
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 claims description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 6
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 5
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- -1 centrifugal Substances 0.000 claims description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 20
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 abstract description 5
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 abstract description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract 2
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 abstract 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 abstract 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OFDNQWIFNXBECV-UHFFFAOYSA-N Dolastatin 10 Natural products CC(C)C(N(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)N(C)C(C(C)CC)C(OC)CC(=O)N1CCCC1C(OC)C(C)C(=O)NC(C=1SC=CN=1)CC1=CC=CC=C1 OFDNQWIFNXBECV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 108010045524 dolastatin 10 Proteins 0.000 description 3
- OFDNQWIFNXBECV-VFSYNPLYSA-N dolastatin 10 Chemical compound CC(C)[C@H](N(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C=1SC=CN=1)CC1=CC=CC=C1 OFDNQWIFNXBECV-VFSYNPLYSA-N 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 229930188854 dolastatin Natural products 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Chemical group 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- KYHUYMLIVQFXRI-SJPGYWQQSA-N Didemnin B Chemical compound CN([C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@@H]([C@H](CC(=O)O[C@H](C(=O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N(C)[C@@H](CC=2C=CC(OC)=CC=2)C(=O)O[C@@H]1C)C(C)C)O)[C@@H](C)CC)C(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)O KYHUYMLIVQFXRI-SJPGYWQQSA-N 0.000 description 1
- 241000237378 Dolabella auricularia Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000804473 Trididemnum solidum Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000069 breast epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- KYHUYMLIVQFXRI-UHFFFAOYSA-N didemnin B Natural products CC1OC(=O)C(CC=2C=CC(OC)=CC=2)N(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)C(=O)C(C(C)C)OC(=O)CC(O)C(C(C)CC)NC(=O)C1NC(=O)C(CC(C)C)N(C)C(=O)C1CCCN1C(=O)C(C)O KYHUYMLIVQFXRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010061297 didemnins Proteins 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000029115 microtubule polymerization Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种文蛤多肽及其制备方法，所述文蛤多肽N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa。制备将文蛤体液经过硫酸铵分级沉淀、超滤、离子交换层析、疏水层析、反相层析后获得一种分子量为15KDa的多肽。本发明还涉及该多肽在预防和/或治疗恶性肿瘤的用途。本发明从文蛤中提取多肽，其对多种肿瘤细胞具有很高抑制活性。通过不断优化其为一分子量大小为15KDa的多肽类物质。用MTT比色法检测其抗肿瘤活性，发现该化合物能显著抑制多种肿瘤细胞的生长，但对正常细胞没有抑制作用。该多肽能够选择性抑制肿瘤细胞增殖的特点使其很有潜力成为新的抗癌药物。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种文蛤多肽及其制备方法。
背景技术
海洋生物的多样性、海洋环境的独特性以及海洋生物活性物质结构的新颖性使海洋成为创新药物与功能性/保健食品的资源宝库。自上世纪70年代以来，人们已经从海洋生物中分离出数万种新型活性物质，包括肽类、蛋白质类、多糖类、生物碱类、萜类、大环聚酯类等多种类型。其中，肽类是数量最庞大的一类化合物。现已证明，多种海洋肽类具有抗肿瘤、抗艾滋病、抗真菌、抗病毒及免疫调节等生理活性。
恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病。目前，肿瘤化疗技术已经有所进步，肿瘤患者生存时间明显延长，特别是对白血病、恶性淋巴瘤等的治疗有了突破，但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤90％以上的实体瘤的治疗还未能达到满意的效果，普遍存在着治疗有效率低、选择性差、毒副作用大、易产生肿瘤细胞耐药等问题。因此，寻找高效、低毒、特异性强的抗肿瘤药物仍是药物治疗的当务之急。
多肽类药物因其分子量小、活性高、毒性低等优点，日益引起国内外学者的广泛关注。Didemnin B是Rinehart小组于1981年从海鞘Trididemnum solidum中分离获得的具有抗病毒和细胞毒活性的环肽化合物，于1984年进入I期临床实验阶段，是第一个进入临床研究的海洋药物。药理研究结果表明，该化合物具有强烈的抗肿瘤活性，对L1210白血病细胞的IC50达到2ng/mL，同时其还具有显著的抗P388白血病和B16黑色素瘤活性。Dolastatin 10是Pettit小组从软体动物海兔Dolabellaauricularia中分离获得的线性五肽，目前已开发了多种Dolastatins衍生物。Dolastatins类化合物能够抑制微管聚合，促进其解聚，进而干扰肿瘤细胞的有丝***，是一类新型的海洋生物来源的肿瘤细胞生长抑制剂。体外实验发现，Dolastatin 10能诱导多株细胞发生凋亡。更令人感兴趣的是，近来发现作用于微管的药物能明显降低肿瘤血管的血流量，其中Dolastatin 10能降低肿瘤血管90％的血流量。其具体机制尚不明了，可能与其影响肿瘤血管的微管功能有关，这无疑为实体瘤的治疗提供了新手段和新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种文蛤多肽及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种文蛤多肽：所述文蛤多肽N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa，等电点为8.85。
所述文蛤多肽按如下步骤制备：
1)取新鲜文蛤体液，离心，上清进行硫酸铵分级沉淀，每次在4℃静置沉淀12小时；
2)将步骤1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分别用50KDa和5KDa超滤膜过滤，待用；
3)取步骤2)中分子量在5-50KDa之间的活性部分过CM-Sepharosefast flow阳离子交换柱，用分别含浓度为0M、0.1M、0.5M或2M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为0.1M NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0.05M NaAc，pH5.5缓冲液；
4)将步骤3)所得活性组分过Phenyl Sepharose 6fast flow疏水柱，用分别含浓度为2.5M、2M、1M或0M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为1M NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0.05M NaAc，pH5.5的缓冲液；
5)将步骤4)所得洗脱组分用快速蛋白液相色谱(FPLC)的Resource15Q阴离子交换柱进行分离，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的100％，B液以每分钟1.5％的速率上升，流速为1ml/min，当B液占总洗脱液体积的5.5％时出现活性组分，即为N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa的单一组分文蛤多肽，其中A液为0.02M Tris，pH9.0，B液为1M NaCl，0.02M Tris，pH9.0。
所述步骤1)中上清进行硫酸铵分级沉淀，即为将新鲜文蛤体液离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至30％饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至70％饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至95％饱和度，离心收集沉淀。所述步骤1)中离心条件为10000×g，离心20分钟。
文蛤多肽的制备方法：
1)取新鲜文蛤体液，离心，上清进行硫酸铵分级沉淀，每次在4℃静置沉淀12小时；
2)将步骤1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分别用50KDa和5KDa超滤膜过滤，待用；
3)取步骤2)中分子量在5-50KDa之间的活性部分过CM-Sepharosefast flow阳离子交换柱，用分别含浓度为0M、0.1M、0.5M或2M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为0.1M NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0.05M NaAc，pH5.5缓冲液；
4)将步骤3)所得活性组分过Phenyl Sepharose 6fast flow疏水柱，用分别含浓度为2.5M、2M、1M或0M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为1M NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0.05M NaAc，pH5.5的缓冲液；
5)将步骤4)所得洗脱组分用快速蛋白液相色谱(FPLC)的Resource15Q阴离子交换柱进行分离，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的100％，B液以每分钟1.5％的速率上升，流速为1ml/min，当B液占总洗脱液体积的5.5％时出现活性组分，即为N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa的单一组分文蛤多肽，其中A液为0.02M Tris，pH9.0，B液为1M NaCl，0.02M Tris，pH9.0。
所述步骤1)中上清进行硫酸铵分级沉淀，即为将新鲜文蛤体液离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至30％饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至70％饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至95％饱和度，离心收集沉淀。所述步骤1)中离心条件为10000×g，离心20分钟。
本发明所具有的优点：
1、多肽类药物具有分子量小、无免疫原性、结构简单、活性高、毒性低等优点，因此在临床方面有很好的应用前景。
2、本发明从文蛤中提取多肽，其对多种肿瘤细胞具有很高抑制活性的物质。通过不断优化其为一分子量大小为15KDa的多肽类物质。用MTT比色法检测其抗肿瘤活性，发现该化合物能显著抑制多种肿瘤细胞的生长，但对正常细胞没有抑制作用。该多肽能够选择性抑制肿瘤细胞增殖的特点使其很有潜力成为新的抗癌药物。
附图说明
图1为本发明实施例提供的文蛤多肽的SDS-PAGE电泳分析图。
具体实施方式
实施例1
文蛤体液抗肿瘤多肽的制备
(1)取新鲜文蛤，开壳收集其体液，经10000×g离心20分钟，去除沉淀。按照硫酸铵沉淀剂用量表向上清中缓慢加入已研磨成细粉末状的硫酸铵至30％饱和度，4℃静置12小时，10000×g离心20分钟，分别收集沉淀和上清，再次向上清中加入硫酸铵至70％饱和度，4℃静置12小时，10000×g离心20分钟，收集沉淀和上清，按上述方法再次向上清中加入硫酸铵至95％饱和度，4℃静置12小时，10000×g离心20分钟，收集沉淀。
(2)将活性组分所在的沉淀用纯水溶解，微滤以去除不溶物，然后过5KDa和50KDa超滤膜将其按分子量划分成三部分。
(3)取分子量在5-50KDa之间的活性部分对纯水透析，然后对缓冲液充分透析，将透析好的样品过CM-Sepharose fast flow阳离子交换柱，分别用含不同浓度0M、0.1M、0.5M、2M的NaCl的缓冲液洗脱。所用缓冲液为0.05M NaAc，pH5.5缓冲液。将各洗脱峰对纯水透析，冷冻干燥，各取少量用适量纯水溶解，用BCA法测定蛋白浓度后，用MTT比色法检测各组份活性，发现活性组分位于含有0.1M NaCl的洗脱液中，将活性组份置于-20℃保存。
(4)将步骤(3)中活性组分用含有2.5M NaCl的缓冲液充分透析，将透析好的样品过Phenyl Sepharose 6fast flow疏水柱，分别用含不同浓度2M、1M、0M的NaCl的缓冲液洗脱。所用缓冲液为0.05M NaAc，pH5.5缓冲液。将各洗脱峰对纯水透析，冷冻干燥，各取少量用适量纯水溶解，用BCA法测定蛋白浓度后，用MTT比色法检测各组份活性，发现活性组分位于含有1M NaCl的洗脱液中，将活性组份置于-20℃保存。
(5)将步骤(4)中活性组分用A液溶解后，用快速蛋白液相色谱(FPLC)的Resource 15Q阴离子交换柱进行分离，采用梯度洗脱方法进行活性组分洗脱。洗脱液为A液和B液，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的100％，B液以每分钟1.5％的速率上升，流速为1ml/min。将各洗脱峰对纯水透析，冷冻干燥，各取少量用适量纯水溶解，用BCA法测定蛋白浓度后，MTT比色法检测各组份活性，发现当B液占总洗脱液体积的5.5％时出现活性组分，将活性组分置于-20℃保存。所用A液为0.02M Tris，pH9.0，B液为1MNaCl，0.02M Tris，pH9.0。
(6)将步骤(5)中活性组分用A液溶解，经高效液相色谱(HPLC)C-18反相柱检测纯度。洗脱液为：A液为0.1％TFA+99.9％超纯水，B液为0.1％TFA+99.9％乙腈，进行梯度洗脱。起始浓度为A液90％，B液10％，B液浓度每分钟上升1％，流速为0.5ml/min，当B液占总洗脱液体积的43.5％时出现洗脱峰。洗脱峰为单一峰，说明该组分为单一组分。此组分N-末端序列测定为IDEIQNTGGGTNFR，等电点由等电聚焦电泳测定为PI＝8.85。
(7)将此单一组分进行SDS-PAGE鉴定。取此单一组分进行电泳，用分子量范围在14.4-116KDa的蛋白Marker作为对照。5％的浓缩胶采用80V电压，15％的分离胶采用120V电压。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液进行染色。6小时后，用脱色液脱色直至蛋白质条带清晰可见。结果发现在15KDa左右有单一的蛋白条带(参见图1)。
实施例2：文蛤多肽体外抑制肿瘤细胞活性
抗肿瘤活性实验：
人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人***上皮细胞(Hela)、人结肠癌细胞(HCT-116)、人乳腺癌细胞(MCF-15)、人胰腺癌细胞(ASPC-1)可用来评价抗肿瘤药物的活性强弱，操作简便，重现性好。实验方法(MTT法)：
四氮唑盐(MTT)是一种能接受氢原子的染料。活细胞的线粒体中与NADH有关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲臜(formazan)，而死细胞则没有此功能。Formazan结晶的生成量与活细胞数成正比，该结晶的DMSO溶液在570纳米处有最大吸收峰，所以，可通过检测formazan结晶的量来评价药物对细胞增殖的影响。
各种细胞株按照常规方法传代培养。取对数生长期的细胞，调节细胞密度至5×104个细胞/毫升，按每孔180微升接种于96孔细胞培养板中，于37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养24h。样品为上述实施例制备所得的文蛤多肽，其设定5个浓度梯度，即为15，30，45，60，75μg/ml，每个浓度设四个平行孔。阳性对照组为5-FU，阴性对照组为不含样品的培养基。每孔各加样品或对照20微升。培养48小时后，每孔各加入浓度为5mg/ml的MTT 50微升，继续培养4小时，除去上清液。每孔各加入DMSO 150微升，在微量震荡器上震荡15分钟，至结晶完全溶解后，用酶标仪测定各孔在570纳米处的吸光值(OD值)。取四个平行孔的平均OD值按公式IR％＝(OD阴性对照-OD样品)/OD阴性对照×100％计算样品对细胞增殖的抑制率(IR％)。实验结果显示，活性组分在45ug/ml浓度时能够强烈抑制人肺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人***上皮细胞(Hela)、人结肠癌细胞(HCT-116)、人乳腺癌细胞(MCF-15)、人胰腺癌细胞(ASPC-1)的增殖，抑制率达到40％-80％，但是对人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)、鼠成纤维细胞(NIH/3T3)都没有抑制作用，说明该物质能够选择性的抑制肿瘤细胞的增殖。
Claims (7)
1.一种文蛤多肽，其特征在于：所述文蛤多肽N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa，等电点为8.85。
2.按权利要求1所述的文蛤多肽，其特征在于：所述文蛤多肽按如下步骤制备：
1)取新鲜文蛤体液，离心，上清进行硫酸铵分级沉淀，每次在4℃静置沉淀12小时；
2)将步骤1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分别用50KDa和5KDa超滤膜过滤，待用；
3)取步骤2)中分子量在5-50KDa之间的活性部分过CM-Sepharosefast flow阳离子交换柱，用分别含浓度为0M、0.1M、0.5M或2M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为0.1M NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0.05M NaAc，pH5.5缓冲液；
4)将步骤3)所得活性组分过Phenyl Sepharose 6fast flow疏水柱，用分别含浓度为2.5M、2M、1M或0M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为1M NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0.05M NaAc，pH5.5的缓冲液；
5)将步骤4)所得洗脱组分用快速蛋白液相色谱(FPLC)的Resource15Q阴离子交换柱进行分离，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的100％，B液以每分钟1.5％的速率上升，流速为1ml/min，当B液占总洗脱液体积的5.5％时出现活性组分，即为N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa的单一组分文蛤多肽，其中A液为0.02M Tris，pH9.0，B液为1M NaCl，0.02M Tris，pH9.0。
3.按权利要求2所述的文蛤多肽，其特征在于：所述步骤1)中上清进行硫酸铵分级沉淀，即为将新鲜文蛤体液离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至30％饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至70％饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至95％饱和度，离心收集沉淀。
4.按权利要求2或3所述的文蛤多肽，其特征在于：所述步骤1)中离心条件为10000×g，离心20分钟。
5.一种权利要求1所述的文蛤多肽的制备方法，其特征在于：文蛤多肽按如下步骤制备：
1)取新鲜文蛤体液，离心，上清进行硫酸铵分级沉淀，每次在4℃静置沉淀12小时；
2)将步骤1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分别用50KDa和5KDa超滤膜过滤，待用；
3)取步骤2)中分子量在5-50KDa之间的活性部分过CM-Sepharosefast flow阳离子交换柱，用分别含浓度为0M、0.1M、0.5M或2M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为0.1M NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0.05M NaAc，pH5.5缓冲液；
4)将步骤3)所得活性组分过Phenyl Sepharose 6fast flow疏水柱，用分别含浓度为2.5M、2M、1M或0M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为1MNaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0.05M NaAc，pH5.5的缓冲液；
5)将步骤4)所得洗脱组分用快速蛋白液相色谱(FPLC)的Resource15Q阴离子交换柱进行分离，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的100％，B液以每分钟1.5％的速率上升，流速为1ml/min，当B液占总洗脱液体积的5.5％时出现活性组分，即为N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa的单一组分文蛤多肽，其中A液为0.02M Tris，pH9.0，B液为1M NaCl，0.02M Tris，pH9.0。
6.按权利要求5所述的文蛤多肽，其特征在于：所述步骤1)中上清进行硫酸铵分级沉淀，即为将新鲜文蛤体液离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至30％饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至70％饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至95％饱和度，离心收集沉淀。
7.按权利要求5或6所述的文蛤多肽，其特征在于：所述步骤1)中离心条件为10000×g，离心20分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110036545 CN102161699B (zh) | 2011-01-31 | 2011-01-31 | 一种文蛤多肽及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110036545 CN102161699B (zh) | 2011-01-31 | 2011-01-31 | 一种文蛤多肽及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102161699A true CN102161699A (zh) | 2011-08-24 |
| CN102161699B CN102161699B (zh) | 2013-07-24 |
Family
ID=44463184
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110036545 Expired - Fee Related CN102161699B (zh) | 2011-01-31 | 2011-01-31 | 一种文蛤多肽及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102161699B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102870954A (zh) * | 2012-10-25 | 2013-01-16 | 浙江万里学院 | 一种抗氧化肽的制备方法 |
| CN102977184A (zh) * | 2012-11-13 | 2013-03-20 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法 |
| CN106916206A (zh) * | 2015-12-25 | 2017-07-04 | 无限极（中国）有限公司 | 文蛤多肽及其制备方法与应用 |
| CN106916868A (zh) * | 2015-12-25 | 2017-07-04 | 无限极（中国）有限公司 | 一种具有体内抗氧化和神经保护功能的白蛤多肽及其制备方法与应用 |
| CN107522770A (zh) * | 2017-10-25 | 2017-12-29 | 贵州大学 | 九香虫药用成分分离纯化方法 |
| CN113817792A (zh) * | 2021-11-25 | 2021-12-21 | 山东方明药业集团股份有限公司 | 一种海洋生物多肽在制备治疗骨质疏松症药物中的应用 |
| CN114134191A (zh) * | 2020-09-04 | 2022-03-04 | 琛蓝(美国)营养制品股份有限公司 | 一种抗炎护肾的蛤蜊肽的制备方法和应用 |
-
2011
- 2011-01-31 CN CN 201110036545 patent/CN102161699B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张玉艳: "文蛤抗肿瘤多肽的分离纯化及其作用机理的研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 * |
| 王翠翠: "文蛤多肽的分离纯化及抗肿瘤机制研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102870954A (zh) * | 2012-10-25 | 2013-01-16 | 浙江万里学院 | 一种抗氧化肽的制备方法 |
| CN102977184A (zh) * | 2012-11-13 | 2013-03-20 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法 |
| WO2014075443A1 (zh) * | 2012-11-13 | 2014-05-22 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法 |
| CN102977184B (zh) * | 2012-11-13 | 2014-07-09 | 天津耀宇生物技术有限公司 | 家蚕蚕蛹中30kD蛋白群的纯化方法 |
| CN106916206A (zh) * | 2015-12-25 | 2017-07-04 | 无限极（中国）有限公司 | 文蛤多肽及其制备方法与应用 |
| CN106916868A (zh) * | 2015-12-25 | 2017-07-04 | 无限极（中国）有限公司 | 一种具有体内抗氧化和神经保护功能的白蛤多肽及其制备方法与应用 |
| CN107522770A (zh) * | 2017-10-25 | 2017-12-29 | 贵州大学 | 九香虫药用成分分离纯化方法 |
| CN114134191A (zh) * | 2020-09-04 | 2022-03-04 | 琛蓝(美国)营养制品股份有限公司 | 一种抗炎护肾的蛤蜊肽的制备方法和应用 |
| CN114134191B (zh) * | 2020-09-04 | 2023-12-12 | 琛蓝(美国)营养制品股份有限公司 | 一种抗炎护肾的蛤蜊肽的制备方法和应用 |
| CN113817792A (zh) * | 2021-11-25 | 2021-12-21 | 山东方明药业集团股份有限公司 | 一种海洋生物多肽在制备治疗骨质疏松症药物中的应用 |
| CN113817792B (zh) * | 2021-11-25 | 2022-04-01 | 山东方明药业集团股份有限公司 | 一种海洋生物多肽在制备治疗骨质疏松症药物中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102161699B (zh) | 2013-07-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102161699B (zh) | 一种文蛤多肽及其制备方法 | |
| CN102558296B (zh) | 贻贝酶解多肽及其制备方法和应用 | |
| CN104630318B (zh) | 一种金钱龟抗肿瘤多肽的制备方法 | |
| CN104610432B (zh) | 一种海洋芽孢杆菌多肽及其制备和应用 | |
| CN106188084B (zh) | 海洋真菌来源的萘螺缩酮类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN103304635B (zh) | 一种环肽类化合物抗肿瘤的应用及其制备方法 | |
| CN112955460B (zh) | 一种拟穴青蟹抗菌肽Scyreprocin及其应用 | |
| CN101343651A (zh) | 具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白、提取方法及其制剂 | |
| CN105175500A (zh) | 采用高效液相色谱制备的活性多肽及其用途 | |
| CN107536833B (zh) | 一种4-羟基-2-吡啶酮类生物碱在制备抗肿瘤产品中的应用 | |
| CN107459568B (zh) | 一种Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39及其应用 | |
| EP3173420B1 (en) | Polypeptide and polypeptide complex for suppressing tumor metastasis and treating leukemia as well as preparation method therefor and application thereof | |
| CN105316380A (zh) | 泥螺多肽在抗肺癌中的应用 | |
| CN103254302A (zh) | 从毛蚶中分离制备一种抗肿瘤多肽化合物的方法和用途 | |
| CN103933048B (zh) | 一种熊果酸衍生物在制备预防和***转移药物中的应用 | |
| CN107188930A (zh) | 一种抑制肿瘤细胞扩散转移的多肽及其制备方法和应用 | |
| CN102172394A (zh) | 一种玻璃海鞘多肽的应用 | |
| CN103739690A (zh) | 从魁蚶中分离制备一种抗肿瘤多肽化合物的方法和用途 | |
| CN107537027A (zh) | Tnfsf15蛋白在制备治疗黑色素瘤药物中的用途 | |
| CN114940701B (zh) | 一种靶向抗真菌肽li及其制备方法和应用 | |
| CN105175567B (zh) | 鳄鱼血多糖的提取方法及其在肺癌治疗中的应用 | |
| CN102125686A (zh) | 一种文蛤多肽的应用 | |
| CN101058572A (zh) | 一种新的具有抗肿瘤活性的肽类化合物 | |
| CN102286085A (zh) | 一种骆驼蓬脂转移蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN104523675A (zh) | 莪术环氧酮在制备防治银屑病药物或食品中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130724 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |