CN105175567B - 鳄鱼血多糖的提取方法及其在肺癌治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明为鳄鱼血多糖的提取方法及其在肺癌治疗中的应用，本发明所述的所述鳄鱼血多糖为首次从鳄鱼血血粉中提纯的多糖成分，同时所述鳄鱼血多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等都有着密切的关系，具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用；同时，所述鳄鱼血多糖成分在药学上可与酸、碱、盐、水合物或酯；以及其他辅料结合制备成片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液、注射液或它们的组合，作为治疗癌症或肿瘤药物使用，有利于抗肿瘤活性的研究。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及鳄鱼血冻干粉中鳄鱼血多糖的提取方法及其在肺癌治疗中的应用。
背景技术
鳄鱼是最古老的爬行动物，在地球上已生存了2亿3千多万年,因而具有“活化石”之称。
中医古书记载，鳄鱼血具有清热解毒、消炎、消肿瘤等功效。近年来，国外学者对鳄鱼血的功效进行了研究，已有鳄鱼血具有抗菌、抗病毒等方面作用的报道，而且有助于提升实验动物在病理条件下的初级免疫应答能力。现代研究表明，鳄鱼血有两大显著的功能特点：鳄鱼全血、血红蛋白、血清、血浆和白细胞有抗细菌、真菌、病毒和抗癌活性。另一个显著功能特点是，鳄鱼血红蛋白的携氧量超过其它动物的100倍以上，这种特殊的血红蛋白进入人体和人体血红蛋白合成后可提高人体的血液携氧量，将足够的氧送到大脑及身体的各个部位，增强体液和细胞的活力及抗突变能力。
鳄鱼血之所以有如此多的功效，我们认为可能与血液中的多糖有很大的关系，因为大量研究表明，多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等都有着密切的关系，具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用。因此我们将鳄鱼血中的多糖提取出来，进行了抗肿瘤活性的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提供出一种鳄鱼血多糖的提取方法及其在肺癌治疗中的应用，以解决现有技术中存在的问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
鳄鱼血多糖，所述鳄鱼血多糖为从鳄鱼血血粉中分离纯化后所得的含至少一种多糖组分的混合物。
进一步的，所述鳄鱼血多糖是在制备治疗或抑制癌症、肿瘤药物中的应用。
更进一步的，所述鳄鱼血多糖是在制备抑制肺癌生长及转移的治疗药物中的应用。
进一步的，所述药物可制备成片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液和注射液中的至少一种。
更进一步的，所述鳄鱼血多糖包含1～3种多糖组分。
相对于现有技术，本发明所述的鳄鱼血多糖具有以下优势：
所述鳄鱼血多糖为首次从鳄鱼血血粉中提纯的多糖成分，同时所述鳄鱼血多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等都有着密切的关系，具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用；同时，所述鳄鱼血多糖成分在药学上可与酸、碱、盐、水合物或酯；以及其他辅料结合制备成片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液、注射液或它们的组合，作为治疗癌症或肿瘤药物使用，有利于抗肿瘤活性的研究。
本发明还提供一种鳄鱼血多糖粗提取物的制备方法，所述制备方法为将鳄鱼血冻干粉按料液比1：(20～40)加入蒸馏水中，于超声波细胞破碎机中破碎处理；然后离心3～4次合并上清液，加入3～4倍体积的无水乙醇静止过夜，再离心，弃上清液，沉淀用适量无水乙醇清洗2～3次，离心弃上清液后，用适量***吹打成粉末状，得到鳄鱼血多糖粗提取物。
进一步的，所述蒸馏水为双蒸水。
更进一步的，所述离心过程为4℃环境下保持4000～4600rpm/min的离心10～20min。
相对于现有技术，本发明所述的鳄鱼血多糖粗提取物的制备方法具有以下优势：
本发明利用水沉醇提法处理鳄鱼血冻干粉得到的鳄鱼血多糖粗提取物，可以准确得出鳄鱼血中的鳄鱼血多糖具有明显提高抗肿瘤功能，并有效地控制肿瘤细胞的生长。
除此以外，本发明还提供一种鳄鱼血多糖的单组分纯化分离方法，其中，所述纯化步骤为将鳄鱼血多糖粗提取物溶于蒸馏水中得到多糖溶液，按1:4的体积比在多糖溶液中加入氯仿-正丁醇溶液，混合后剧烈振荡20～30min，离心后除去中间层的变性蛋白质，重复数次至中间层无蛋白质析出为止，然后析出下层多糖溶液，置于透析袋中，透析48～72h，不断换水，以除去低聚糖等小分子杂质，然后进行浓缩，最终冷冻干燥得到纯化的鳄鱼血多糖粉末；
所述分离步骤为将纯化的鳄鱼血多糖粉末过葡聚糖凝胶柱进行进一步分离，收集出峰位置相应洗脱管中的多糖溶液，并合并统一峰型下的多糖，得到1～3种多糖组分。
进一步的，所述蒸馏水为双蒸水，所述氯仿-正丁醇溶液为氯仿与正丁醇按4:1体积比混合而成。
相对于现有技术，本发明所述的鳄鱼血多糖的单组分纯化分离方法具有以下优势：
采用本发明方法得到的鳄鱼血多糖为纯化分离后的鳄鱼血多糖，含有1～3中多糖组分，能广泛作为医药、功能食品的原料，治疗效果更显著。同时，本发明提供的制备方法工艺简单，较易实现产业化生产。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了鳄鱼血干粉中提取的多糖粗提取物过Sephadex G-200柱后的洗脱曲线；
图2示出了MTT检测鳄鱼血多糖中三种不同组分对NCI-H446肺癌细胞增殖的抑制作用；
图3示出了MTT检测鳄鱼血多糖中三种不同组分对NCI-H460肺癌细胞增殖的抑制作用；
图4示出了MTT检测鳄鱼血多糖中三种不同组分对A549肺癌细胞增殖的抑制作用；
图5示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSI对NCI-H446细胞迁移的抑制作用；
图6示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSII对NCI-H446细胞迁移的抑制作用；
图7示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSIII对NCI-H446细胞迁移的抑制作用；
图8示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSI对NCI-H460细胞迁移的抑制作用；
图9示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSII对NCI-H460细胞迁移的抑制作用；
图10示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSIII对NCI-H460细胞迁移的抑制作用；
图11示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSI对A549细胞迁移的抑制作用；
图12示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSII对A549细胞迁移的抑制作用；
图13示出了鳄鱼血多糖中组分ABPSIII对A549细胞迁移的抑制作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中，实施例中，所用的试验材料及其来源包括：
1.细胞系
NCI-H446(人小细胞肺癌细胞)：购自南京凯基生物科技发展有限公司；
NCI-H460(人大细胞肺癌细胞):购自南京凯基生物科技发展有限公司；
A549(人肺腺癌细胞系):购自南京凯基生物科技发展有限公司；
实验药物与试剂
鳄鱼血冻干粉：粉末状，由北京百生康生物科技有限公司提供。
四甲基偶氮唑盐(MTT)：上海生工生物工程有限公司，货号：TB0799-1g，批号：XP1008B3012J，级别：分析纯，规格1g。
二甲基亚砜(DMSO)：购自上海生工生物工程有限公司，货号：DN3039A，批号：SJ0731S4013J，级别：分析纯，规格500mL，用于MTT法溶解紫色结晶。
二甲基亚砜(DMSO)细胞培养级：购自北京索莱宝科技有限公司，货号：D8370-500，批号：2P005970，级别：细胞培养级，规格500mL，用于细胞冻存，及药物配制。
RPMI 1640培养基：购自赛默飞世尔科技有限公司，批号：NYG0920，规格：500mL。
胰蛋白酶：购自上海生工生物工程有限公司，货号：T0458-10，批号：0301C314，级别：USP，规格：10g。
3.主要仪器
AKTA***：GE公司，型号：UPC-900
生物安全柜：西班牙泰事达(Telstar)，型号：Bio II A。
CO2培养箱：施都凯仪器设备(上海)有限公司，型号：STIK IL-161HI。
倒置相差显微镜：厂家：奥林巴斯，型号：CKX41。
电子天平：上海奥豪斯仪器有限公司，型号：AR2202CN；
台式冷冻离心机：赛默飞世尔科技公司，型号:ST16R；
超声波细胞破碎机：赛默飞世尔(Thermo Fisher),型号：SCIENTZ-IID；
旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-5205；
4℃冰箱：青岛海尔股份有限公司，型号：BCD-192KJ；
涡漩混匀器:海门市其林贝尔仪器制造有限公司,型号：QZ-861。
4.所用试剂的配制方法包括：
四甲基偶氮唑盐(MTT)储液：取MTT粉末1.0g，溶于200ml磷酸缓冲液(PBS)中，终浓度为5mg/ml，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装，-20℃避光保存。其中，溶液的配制及使用均应在无菌生物安全柜中操作。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例1鳄鱼血多糖的制备方法
1、鳄鱼血多糖粗提物的制备
称取鳄鱼血冻干粉4.0g，按料液比1：20加入相应的双蒸水(ddH2O),于超声波细胞破碎机中，破碎5min；4℃离心机中4600rpm/min,离心10min，取上清液，重复3次，合并上清液，加入3倍体积的无水乙醇静止过夜，4600rpm/min，离心10min后，弃去上清液，沉淀用适量无水乙醇清洗3次，离心弃上清液后，用适量***吹打成粉末状，得到鳄鱼血多糖粗提取物。
2、鳄鱼血多糖不同组分的分离纯化
根据蛋白质在氯仿等溶剂中变性的特点，把氯仿与正丁醇按4:1体积混合后，置于棕色瓶中保存。将鳄鱼血多糖粗提取物溶于ddH2O中，按1:4在多糖溶液中加入氯仿-正丁醇溶液，混合后，剧烈振荡20min，离心后除去中间层的变性蛋白质，重复数次至中间层无蛋白质析出为止，然后析出下层多糖溶液，置于透析袋中，透析72h，不断换水，以除去低聚糖等小分子杂质，然后进行浓缩，最终冷冻干燥为多糖粉末。
多糖经过去蛋白、除杂后，用ddH2O将鳄鱼血多糖配制成多糖溶液，使用分离纯化***(AKTA***)过Sephadex G-200葡聚糖凝胶柱进行进一步分离，上样前用ddH2O首先平衡柱子，经上样针上样后***自动使用ddH2O进行多糖的洗脱，***根据分子量大小不同在不同的洗脱体积处出峰，收集出峰位置相应洗脱管中的多糖溶液，并合并统一峰型下的多糖。
如图1所示，鳄鱼血多糖的粗提取物经过Sephadex G-200分子筛分离纯化后分别在5.6、11.4、17.3洗脱体积处出现最高峰，从而分离得到三种不同分子量大小的多糖组分，分别记为：ABPSI、ABPSII、ABPSIII。
实施例2鳄鱼血多糖的不同组分对人肺癌细胞增殖的影响
实验方法为MTT比色法：检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，甲瓒结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
方法步骤如下：
(1)细胞复苏及培养
将冻存的人肺癌细胞从液氮中取出，立即投入37℃水浴锅中使细胞融化。生物安全柜中将细胞悬液吸到装有适量培养基的离心管中，800rpm/min离心5分钟；弃上清液，用1mL培养基悬浮细胞，吸到装有适量培养基的细胞培养皿中，将细胞置于37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下培养。待细胞达到80％-90％接触汇合时进行传代，0.2％胰酶消化成单细胞悬液，800rpm/min离心5分钟；弃上清，加1-2mL培养基悬浮细胞，将细胞传到2-3个装有适量培养基的培养皿中，继续培养。
(2)MTT法测定药物对细胞生长的抑制作用
将处于对数生长期的贴壁细胞经胰蛋白酶消化后，分散成单个细胞，并使其悬浮在相应细胞培养基中。将细胞接种于96孔培养板上，每孔100μL细胞悬液，3000cells/孔。将上述96孔培养板置于37℃，二氧化碳(5％)培养箱中过夜培养24小时，使细胞贴壁。
待24小时后细胞完全贴壁后，弃去培养液，试验组分别加入含有不同浓度的ABPSI、ABPSII、ABPSIII的细胞培养液，并设置不加药物只加相应药物溶剂的对照孔(鳄鱼血多糖溶剂为ddH2O)，同时设置只加培养基不含细胞的调零孔。每组设6个平行孔，然后将96孔板置于37℃，二氧化碳(5％)培养箱中培养48小时。
48小时后，每孔加入25μL MTT(浓度为5mg/mL)，继续孵育4h。然后将培养液轻轻吸出，每孔加入150μL DMSO作溶剂溶解，溶解后用酶标仪测定570nm处的吸光度。
(3)数据分析
计算细胞的存活率和抑制率，并计算药物对细胞的半数抑制浓度IC50。存活率％＝(实验组OD值-调零孔OD值)/(阴性模型组OD值-调零孔OD值)×100％；抑制率％＝(1-存活率)×100％。用Graphpad Prism 5软件进行IC50值的计算；测定结果见表1。
表1鳄鱼血多糖不同组分对肺癌细胞的抑制作用(IC50值)
| 组别 | NCI-H446 | NCI-H460 | A549 |
| ABPSI | 1.559 | 2.944 | 2.013 |
| ABPSII | 2.092 | 2.397 | 1.883 |
| ABPSIII | 2.534 | 1.147 | 1.935 |
从表1中可以看出，在低浓度时鳄鱼血多糖即对人肺癌细胞有明显的抑制增殖的作用。
如图2-4所示，为实施例2中检测的不同浓度不同组分的鳄鱼血多糖药物对多种不同的人肺癌细胞的生长的抑制作用曲线图，从图中可以得出浓度与对人肺癌细胞的生长在低浓度时即呈现明显的抑制作用，随着鳄鱼血多糖浓度的增大，对人肺癌细胞的抑制作用逐渐增强，且呈现明显的浓度依赖性。
实施例3鳄鱼血多糖的不同组分对人肺癌细胞迁移的影响
方法步骤如下：
(1)细胞复苏及培养
将冻存的人肺癌细胞从液氮中取出，立即投入37℃水浴锅中使细胞融化。生物安全柜中将细胞悬液吸到装有适量培养基的离心管中，800rpm/min离心5分钟；弃上清液，用1mL培养基悬浮细胞，吸到装有适量培养基的细胞培养皿中，将细胞置于37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下培养。待细胞达到80％-90％接触汇合时进行传代，0.2％胰酶消化成单细胞悬液，800rpm/min离心5分钟；弃上清，加1-2mL培养基悬浮细胞，将细胞传到2-3个装有适量培养基的培养皿中，继续培养。
(2)细胞铺板
先用marker笔和直尺在24孔板的板底，均匀得划横线，横穿过孔，每孔两条横线，间距0.2-0.5cm。将处于对数生长期的贴壁细胞经胰蛋白酶消化后，分散成单个细胞，并使其悬浮在相应细胞培养基中。将细胞接种于24孔培养板上，每孔500μL细胞悬液，500000cells/孔。将上述24孔培养板置于37℃，二氧化碳(5％)培养箱中过夜培养24小时，使细胞贴壁。
待24小时细胞完全贴壁长满后，用20μL枪头垂至于板底的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。PBS清洗3次后，试验组分别加入含有不同浓度的ABPSI、ABPSII、ABPSIII的细胞无血清培养基，空白对照组加入同等体积的无血清培养基。分别在0h，24h，48h时于倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。
(3)数据分析
用Graphpad Prism 5软件进行迁移抑制率的计算。
如图5-13所示(图5-13中的图像均为Y迁移率-X时间曲线，分别表示0、1、2μmol三个不同浓度的用药量及用药时间对迁移率的影响)，展示了三种鳄鱼血多糖对三种不同的人肺癌细胞迁移运动的抑制作用，图示中显示作用48h后三种鳄鱼血多糖均有不同程度的抑制肺癌细胞迁移的作用。
其中，如图5-7所示，为三种鳄鱼血多糖成分对NCI-H446细胞迁移抑制作用的迁移抑制率，可以从图中看出，多糖成分浓度越高，对癌症细胞的抑制迁移作用越明显。
如图8-10所示，三种鳄鱼血多糖成分对NCI-H460细胞迁移抑制作用的迁移抑制率，可以从图中看出，多糖成分浓度越高，对癌症细胞的抑制迁移作用越明显。
如图11-13所示，三种鳄鱼血多糖成分对A549细胞迁移抑制作用的迁移抑制率，可以从图中看出，多糖成分浓度越高，对癌症细胞的抑制迁移作用越明显。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.鳄鱼血多糖，其特征在于：所述鳄鱼血多糖为从鳄鱼血血粉中分离纯化后所得的含至少一种多糖组分的混合物，且所述鳄鱼血多糖具有治疗或抑制癌症、肿瘤的活性。
2.根据权利要求1所述的鳄鱼血多糖，其特征在于：所述鳄鱼血多糖具有抑制肺癌生长及转移的活性。
3.根据权利要求1或2所述的鳄鱼血多糖，其特征在于：所述鳄鱼血多糖在应用时制备成片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液和注射液中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的鳄鱼血多糖，其特征在于：所述鳄鱼血多糖包含1～3种多糖组分。
5.鳄鱼血多糖粗提取物的制备方法，其特征在于：所述制备方法为将鳄鱼血冻干粉按料液比1：(20～40)加入蒸馏水中，于超声波细胞破碎机中破碎处理；然后离心3～4次合并上清液，加入3～4倍体积的无水乙醇静止过夜，再离心，弃上清液，沉淀用适量无水乙醇清洗2～3次，离心弃上清液后，用适量***吹打成粉末状，得到鳄鱼血多糖粗提取物。
6.根据权利要求5所述的鳄鱼血多糖粗提取物的制备方法，其特征在于：所述蒸馏水为双蒸水。
7.根据权利要求5所述的鳄鱼血多糖粗提取物的制备方法，其特征在于：所述离心过程为4℃环境下保持4000～4600r/min离心10～20min。
8.鳄鱼血多糖的单组分纯化分离方法，其特征在于：所述纯化步骤为将鳄鱼血多糖粗提取物溶于蒸馏水中得到多糖溶液，按1:4的体积比在多糖溶液中加入氯仿-正丁醇溶液，混合后剧烈振荡20～30min，离心后除去中间层的变性蛋白质，重复数次至中间层无蛋白质析出为止，然后析出下层多糖溶液，置于透析袋中，透析48-72h，不断换水，以除去低聚糖小分子杂质，然后进行浓缩，最终冷冻干燥得到纯化的鳄鱼血多糖粉末；
所述分离步骤为将纯化的鳄鱼血多糖粉末过葡聚糖凝胶柱进行进一步分离，收集出峰位置相应洗脱管中的多糖溶液，并合并统一峰型下的多糖，得到1～3种多糖组分。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述蒸馏水为双蒸水，所述氯仿-正丁醇溶液为氯仿与正丁醇按4:1体积比混合而成。
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