CN102159723A - 循环的组织因子的体外测定方法及其用于检测凝血性疾病的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及止血领域,特别是与组织因子的异常表达相关的凝血病症以及与所述因子的超表达相关的生理病理学现象。本发明提供了测定生物学样本中循环的组织因子活性的方法。本发明的方法在体外进行,特别是对采集自患者的血液样本进行。
Description
本发明涉及止血领域,特别是与组织因子的异常表达相关的凝血病症以及与该因子的超表达相关的生理病理学现象。
本发明涉及测定生物学样本中循环的组织因子活性的方法。
本发明的方法在体外进行,特别是对取自患者的血样或者由所获取的血样制备的样本进行。
本发明的方法优选地在血浆介质中进行。有利地,本发明方法使用显色类型的测定。
组织因子是体内凝血的主要激活物,为一种47kDa的跨膜糖蛋白,它与因子VII或VIIa结合而形成组织因子-因子VIIa复合物,该复合物通过激活因子IX和X,引发凝血的激活,从而导致凝血酶的产生和纤维蛋白的形成。真正凝血的开始需要因子VII与其特异性表面蛋白受体即组织因子结合,组织因子由一定数量的细胞或其组件表达(血管内皮细胞、单核细胞-巨噬细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞、细胞来源的微粒,从单细胞来源的微粒分子转移后的血小板、赘生性细胞)。组织因子-因子VIIa复合物的活性不仅与正常的止血相关,而且也与由恶性疾病、急性冠状动脉综合征和重度脓毒症引起的血栓形成的发作相关。组织因子途径抑制剂(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)保证了维持止血平衡中的这一关键活性的调控。这种抑制剂TFPI并不是使组织因子失活,而是使组织因子-因子VIIa复合物的催化活性失活。首先,TFPI与因子Xa结合,然后抑制因子Xa;接着,Xa/TFPI复合物可与因子VIIa-组织因子复合物结合而形成四聚体的因子Xa/TFPI/因子VIIa/组织因子复合物,其中,因子Xa、因子VIIa和组织因子不再具有活性。这样,TFPI就限制了由组织因子(TF)的表达所诱导的凝血的激活,在凝血的初始分子事件之前,强加一种初始阶段来克服,实际上能够诱导凝血级联反应的激活。因此,TFPI使得组织因子可以低噪音地暴露而不会有促凝血后果。TFPI由内皮细胞和血小板合成。
在生理条件下,组织因子的表达很广泛,它存在于多种类型的细胞表面上,但是不存在于与循环血直接接触的细胞(内皮细胞和成形血液成分(elements figrés du sang))的表面上。血管、心肌、粘液组织和表皮组织的外膜中富含组织因子。
动脉粥样硬化斑块上的血栓形成会导致急性缺血性动脉疾病,它与组织因子的病理性暴露有很密切的关系。动脉粥样硬化斑块的血栓发生与存在的组织因子的数量相关,在斑块破裂的情况下,所述存在的组织因子在相当程度上促进了血栓发生的过程。类似地,在脓毒症中,组织因子可由单核细胞和内皮细胞表达,并导致弥散性血管内凝血。还在来源于细胞膜的微粒表面识别到了组织因子。已在动脉粥样硬化斑块中识别到了这种来源于单核细胞和淋巴细胞的微粒。它们具有促凝血活性,来源于凋亡的细胞。
除了其促凝血活性之外,现在还认为组织因子是对多种细胞群具有与激素相似的功能的蛋白(1)。
因此,例如,已表明组织因子能够增强血管内皮生长因子(VEGF)的产生,并能在体内和体外诱导血管生成。
组织因子还能刺激细胞迁移,已经报道了组织因子参与肿瘤转移和与肿瘤相关的血管生成中的血管壁的组织化和完整性(2)。
因此,目前已经清楚地知道组织因子与多种生理病理环境相关,出于这一原因,必须要有可用的测定方法,该测定方法不仅能够在血栓形成风险的条件下追踪组织因子活性的变化,还能够监测某些病理情况特别是癌症的进程。
用于测定血液或血浆中的组织因子的常规方法为免疫学方法,例如ELISA类的方法,这类方法仅测量抗原,因此是定量测定而不是定性测定。
在现有文献中已经说明了多种活性测试方法,其中大多数都是使用利用(3)中所述的原理的精密计时方法(测量凝块形成的时间),由细胞提取物开始而进行的。
其它TF活性测试方法包括在存在激活的因子VII(FVIIa)和钙以及因子Xa的特异性底物的条件下评估激活的因子X(FXa)的产生。
因此,这种测试包括测量TF-FVIIa复合物将FX激活为FXa的能力。
FX的这种激活可以通过水解的底物的数量来计算,例如当使用能够在水解后产生显色基团的底物时,使用显色方法。
基于该方案的大多数活性测试均针对被除去纤维蛋白即经处理而防止纤维蛋白单体聚合的血浆样本进行,这种聚合会在进行测试时干扰所进行的光学测量。然而,该在先步骤使这类测试的自动化变得复杂,并且使测试必须分两个阶段进行。
而且,现有技术的活性测试没有考虑到血浆中TFPI数量的变化,这也会曲解所测的TF的实际活性,从而提供关于与TF计数相关的患者血栓发生的潜在可能的错误信息。
本发明旨在解决现有技术的测试所遇到的问题。
为此目的,提出了对循环的组织因子活性进行单步骤测定的方法,在该方法中,消除了TFPI对组织因子的抑制作用。
实际上,本发明包括:在存在纤维蛋白聚合抑制剂和抑制TFPI对组织因子的作用的化合物的条件下,在生物学样本中对循环的组织因子的活性进行体外测定。
更准确地说,当向测试生物学样本、纤维蛋白聚合抑制剂和TFPI对TF的作用的抑制剂所形成的反应介质中加入过量的凝血因子VII和X时,本发明允许测量循环的组织因子的活性所产生的因子Xa。
本发明还涉及在生物学样本中对循环的组织因子进行单步骤体外测定的方法,所述方法基于循环的组织因子在存在过量的因子VII和X的条件下产生因子Xa的能力。
进行本发明方法所使用的生物学样本为从个体采样而得到的样本。
所述样本优选地为血液样本,更优选地为血浆样本。
然而,本发明的方法也可用于尿样或脑脊液(liquide cephalo-rachidien,LCR)或其他生物学样本。
本发明的方法优选地为酶学方法,其中通过测量该因子对特异性底物的水解活性而测定所形成的Xa的量。
特别是,所述底物为酶促底物,可为天然的或合成的。优选地,所述底物能够测定因子Xa的酰胺分解活性。特别是,所述底物为显色底物或荧光底物。
这类显色底物为,例如Diagnostica Stago的CBS 5244(其他可能的供应商:American Diagnostica;Biopep SA;Kabi Vitrum;Biogenic;Biophen;Chromogenix)。
通过测定水解底物的量来计算所产生的因子Xa的量(并由此测量循环的组织因子的活性)。
所述测定可以根据所选择的底物,通过测量反应混合物在读数窗中的光密度的变化而进行。
在本发明的一个具体实施方案中,在合适的缓冲液中稀释由取自患者的生物学样本所获得的血浆。
所述缓冲液可以是例如止血测试常用的Owren Koller缓冲液。
所得的稀释度依赖于测试样本的性质和所用底物的灵敏度。
对于血浆样本,有利的是,稀释范围为1/2至1/20,优选范围为1/2至1/4。
钙离子例如可以以CaCl2的形式提供。
纤维蛋白聚合抑制剂选自本领域常用的化合物。
具体而言,它为多肽抑制剂,例如寡肽GPRP.AcOH,其商品名为Pefabloc,由Pentapharm提供。
用于该反应介质中的所述抑制剂的浓度可为5-25g/L,这根据测试血浆的稀释度进行选择。例如,当将血浆以1/3稀释至,有利的是,所用的所述抑制剂的浓度为10g/L,即终浓度范围为0.666g/L至3.33g/L,特别是1.332g/L。
虽然Pefabloc构成了本发明方法中的优选的纤维蛋白聚合抑制剂,但也可以使用其他类型的抑制剂,例如抗纤维蛋白原抗体。
TFPI抑制剂为这样的化合物,它能够抑制TFPI对循环的TF的抑制作用,从而使得TF的定量测定不致受到样本中存在的TFPI水平变化的影响。
TFPI抑制剂选自具有TFPI拮抗剂作用的任何类型的化合物。它优选地为抗-TFPI抗体或结合TFPI的抗体片段,所述抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体或单链抗体。
根据本发明的具体实施方案,使用抗体T4E2,该抗体为Diagnostica Stago提供的单克隆抗体。
选择抗体的浓度,以使其能够抑制测试样本中含有的所有TFPI。所述浓度可以根据所研究样本而在5至500μg/mL(在稀释缓冲液中的浓度)而变化。对于以1/3稀释的血浆样本,抗体的终浓度优选地为6.6μg/mL。
根据本发明的方法,反应介质有利地包含过量的因子VII和X。这些因子可用于测量组织因子的活性,因为,如上所解释的,组织因子与激活的因子VII(FVIIa)结合而形成复合物,然后该复合物会激活因子IX和X。由于是通过所产生的因子Xa的量来测量TF的活性,测量的是Xa的特异性底物的水解,所以因子VII和X不能限制反应,以便使得所产生的Xa的量与TF的活性直接相关。
所以,这些因子被过量地加入,这就意味着避免了它们干扰测量的风险。
根据测试样本的类型,这两种因子的每一种的终浓度的有利范围为:因子VII为5至20PEU/mg/mL,因子X为3至16PEU/mg/mL。
根据本发明的具体实施方案,当样本为以1/3稀释的血浆时,因子VII的浓度为137PEU/mg/mL,因子X的浓度为80PEU/mg/mL(PEU=血浆当量单位)。
这些因子可为人类或动物来源的纯化的或重组形式。例如,它们可由Diagnostica Stago、Enzyme Research Laboratories或Sigma提供。
在一个优选的变化的实施方案中,测试的血浆样本还含有肝素抑制剂化合物,以便当例如测定的样本来自于接受肝素治疗的患者时,使得测试的结果独立于血浆中存在的肝素。
所述化合物例如为在止血测试中常用于抑制肝素效果的聚凝胺。
有利的是,所述化合物所使用的终浓度的范围为0.5-10mg/L。
本领域技术人员应能够根据所选择的试剂调整浓度和活性。
作为举例说明,应注意,对于包含于本发明内的指示,试剂的浓度和活性可以以±50%的量而变化,例如±20%或甚至±10%。这一变化可以涉及独立于其他试剂的每种试剂。
根据具体实施方案,本发明的方法按照如下流程进行:
使用来自Diagnostica Stago提供的STA系列的自动设备进行本发明的方法。
将血浆样本在稀释缓冲液中以1/3稀释,所述稀释缓冲液为Owren Koller缓冲液,添加有12mg/L的聚凝胺和50μg/L的抗-TFPI抗体(T4E2)。
向50μl该混合物中加入下述试剂:
●25μl的含有80PEU/mg/mL因子X的溶液(装有纯化水的冻干瓶:终浓度8PEU/mg/mL);
●25μl的含有137PEU/mg/mL因子VII的溶液(装有纯化水的冻干瓶:终浓度13.7PEU/mg/mL);
●50μl的25mM的CaCl2溶液。
将这一反应介质在37℃孵育500秒。
在孵育步骤后,加入100μl的含有浓度为0.84μM的CBS 5244底物的溶液,得到的终浓度为3.36μM(装有纯化水的瓶)。
为了建立校准曲线,从而得到组织因子的功能性活性,使用以下试剂:
●富含组织因子的正常混合血浆:例如通过富集而获得的含有0.00至44pM的TF的混合血浆(图3);
●或者富含组织因子的NaCl-CaCl2溶液(图3)。
每种血浆稀释液均在1/3的稀释度下进行测试。
测定了加入混合血浆的对应于44pM、22pM、11pM、5.50pM、2.75pM和0pM的活性的TF的浓度。
根据因子Xa的合成底物CBS 52.44,测定了组织因子活性。事实上,在FVII的存在下,TF将FX激活为FXa。通过在405nm的波长下对硝基苯胺的释放来测量FXa的酰胺分解活性。在405nm的波长下,在6-600秒的读数窗中,测量对应于组织因子活性的每个值(pM)的光密度。
然后测量了抗-TFPI抗体对校准的影响(图4和表1)。
表1
校准(1)
±抗-TFPI抗体
TF(pM) | 44 | 22 | 11 | 5.5 | 2.75 | 0 |
无抗体 | 0.161 | 0.088 | 0.059 | 0.046 | 0.041 | 0.031 |
有抗体 | 0.427 | 0.224 | 0.127 | 0.080 | 0.057 | 0.035 |
本发明还涉及用于特别是在血浆样本中测量循环的组织因子的活性的试剂盒,包含:
●试剂1,包含用于测试的样本的稀释缓冲液、纤维蛋白聚合抑制剂、TFPI抑制剂,以及如果合适,肝素抑制剂;
●纯化的或重组的因子VII,有利地为冻干形式;
●纯化的或重组的因子X,有利地为冻干形式;
●钙离子,例如为CaCl2的形式;
●激活的因子X的酶促底物,有利地为冻干形式;
●如果合适的话,校准试剂,有利地为冻干形式。
本发明还涉及用于在体外检测异常凝血的方法,包括如本申请所述地测量循环的组织因子的活性。所述测量可在多种生理病理环境中进行。
特别是,可以考虑测定患者血栓发生的潜在可能,所述患者易于发生血栓并易于组织因子异常释放,导致所述因子相对于因子X的活性增加。
此外还进行了各种研究,以评估一些止血标记物在妊娠过程中的作用,以便将先兆子痫与正常的妊娠过程区分开。
如下文实施例中所述,看起来,在来自具有先兆子痫的女性的血浆中所测量的组织因子活性,比在正常妊娠的女性和未妊娠女性中所测量的高。
因此,组织因子可能可以作为新的生物标记,用于评估先兆子痫中由血管内皮造成的损伤。
因此,本发明有利地提供了在妊娠期间评估先兆子痫风险的方法,在所述方法中,根据本发明测量循环的TF活性。本发明还提供了实施所述方法的试剂盒。
类似地,也如下文实施例所述,TF活性测定,特别是激活的TF/游离TFPI的比例,为监测病理进程提供了新的工具,例如为了监测急性心肌梗塞(AMI),在该急性心肌梗塞中,激活的TF计数以及激活的TF/游离TFPI的比例均比对照值增高,以及为了确认相关于这一病理学进程的有利的或不利的预后。
因此,本发明提供了用于监测急性心肌梗塞或确认急性心肌梗塞预后的方法,在所述方法中,根据本发明,测量循环的TF活性或循环的TF/游离TFPI比例。本发明还提供了用于实施所述方法的试剂盒。
最后,最近报道的数据证实,例如国际会议(ASH Meeting,Atlanta USA,7-11 Decembre 2007,Thrombosis and Haematosis Issues in Cancer,Bergame,Italie 26-28 Octobre 2007))中,现在已经明确认识到组织因子与癌症的出现和发展相关。在诊断学水平上,测定TF活性特别是TF活性的增加是用于监测癌性病理进程的新的指征。
因此,本发明有利地提供了用于监测癌性病理进程的,在所述方法中,根据本发明,测量循环的TF活性。本发明还提供了用于实施所述方法的试剂盒。
因此,测定组织因子活性可能有利于与妊娠相关的多种病理的评估和预后,特别是为了评估诸如先兆子痫、血栓形成、脓毒症、癌症、炎症、DIVC、糖尿病、血小板减少症的流产和妊娠并发症风险,并且,在评估抗血栓治疗,例如TFPI治疗方面,所述测定也是令人感兴趣的。
下述附图和实施例用于说明本发明。
为了估算血浆的正常值,使用本发明的方法,测定31份正常血浆的组织因子活性。光密度测量结果以及对应的TF活性百分比示于下表。可以认为所述测量结果是正常血浆中组织因子功能性活性的正常值的指标。
正常血浆
通过向在上述测定条件下测定的富含TF(22pM)的血浆中加入浓度逐渐增高的肝素钙(0-2IU/mL),评估了对于肝素的敏感性。对于肝素的不敏感性测试表现出的恢复率>94%(表2)。这表明肝素钙对TF的功能活性的影响力很低。
表2
对肝素的敏感性
在混合血浆+TF 22pM中对一系列肝素钙进行敏感性研究
使用上述方法对含有不同预定浓度的因子VII的富含TF的血浆进行了测定。
它们为:
●缺乏因子VII的血浆(0%的列);
●来自或多或少地缺乏因子VII的混合血浆的血浆(25-87.5%的列);
●来自正常混合血浆的血浆(100%的列)。
结果(图5和表3)表明,由于恢复率≥99%,样本中的因子VII不影响TF的功能性活性值。
表3
对因子VII的敏感性(1)
针对缺乏因子VII的和富含组织因子的混合血浆进行敏感性测定。
0:缺乏因子VII-TF混合血浆
25-87.5%:TF混合血浆/缺乏因子VII-TF
100%:TF混合血浆
使用上述方法对含有不同预定浓度的因子X的富含TF的血浆进行了测定。
它们为:
●缺乏因子X的血浆(0%的列);
●来自或多或少地缺乏因子X的混合血浆的血浆(25-87.5%的列);
●来自正常混合血浆的血浆(100%的列)。
结果(图6和表4)表明,由于恢复率≥99%,样本中的因子X不影响TF的功能性活性值。
表4
对因子X的敏感性(1)
因子X比率,% | 0 | 25 | 50 | 75 | 87.5 | 100 |
TF理论比率(pM) | 45.57 | 44.86 | 44.16 | 43.45 | 43.47 | 42.76 |
TF测量比率(pM) | 45.57 | 45.10 | 43.82 | 44.63 | 44.41 | 42.76 |
恢复率% | 100 | 101 | 99 | 103 | 102 | 100 |
针对缺乏X的和富含组织因子的混合血浆进行敏感性测定。
0:缺乏X-TF
25-87.5%:TF混合血浆/缺乏X-TF
100%:TF混合血浆
使用上述方法对含有不同预定浓度的TFPI的富含TF的血浆进行了测定。
它们为:
●缺乏TFPI的血浆(0%的列);
●来自或多或少地缺乏TFPI的混合血浆的血浆(25-87.5%的列);
●来自正常混合血浆的血浆(100%的列)。
结果(图7和表5)表明,由于恢复率≥93%,样本中的因子X不影响TF的功能性活性值。
表5
对于TFPI的敏感性(1)
TFPI比率,% | 0 | 25 | 50 | 75 | 87.5 | 100 |
TF理论比率(pM) | 48.25 | 46.86 | 45.50 | 44.13 | 43.44 | 42.76 |
TF测量比率(pM) | 48.25 | 44.86 | 40.77 | 42.54 | 40.55 | 42.76 |
恢复率% | 100 | 96 | 90 | 96 | 93 | 100 |
针对缺乏TFPI的和富含组织因子的混合血浆进行敏感性测定。
0:缺乏TFPI-TF
25-87.5%:TF混合血浆/缺乏TFPI-TF
100%:TF混合血浆
作为实例,在各种病理学中,
●对于一组没有患病的个体和相关的一组患有心肌梗塞的患者在其入院日进行了TF活性测量,所述患者组被划分为具有良好预后的个体和心肌梗塞几天后死亡(MI DCD)的患者;MI患者的TF比率显著高于正常个体,并且那些死亡患者的TF比率显著地更高(图9);
●还在其他血栓发生病理中测定了循环的TF活性,所述病理例如癌症,流产:3.65±1.35至3.92±1.29,这取决于胎儿流产发生时的阶段;由肝素诱导的血小板减少症(HIT):6.33±2.10pM;CIVDs:2.81±1.52pM;危重糖尿病:2.98±0.99pM;以及狼疮:1.95±0.82pM,或者在妊娠期内特别是在诸如先兆子痫的妊娠期内并发症时:3.58±1.34pM,与正常妊娠期的1.98±1.35pM相比;所有这些测定均表明,TF活性的显著增高(图10);
●测量的可重复性:
测试了测量的可重复性并产生下列值:
●将病理血浆与因子X(ERL和Stago)的测量结果相关联产生下列结果,并示于图8:
X ERL-X Stago相关性(1)
●根据本发明测量了来自American Diagnostic的组织因子的比率(pM)。
基于在Neo-R瓶中重溶后浓度为6.2nM的TF,对Neo-R Stago产生的一系列结果进行读取(单一测试)。
混合血浆+TF A.D.30pM | 0.259 | 23 |
混合血浆+TF A.D.15pM | 0.175 | 13 |
混合血浆+TF A.D.7.5pM | 0.113 | 5.9 |
混合血浆+TF A.D.3.75pM | 0.089 | 3.0 |
混合血浆+TF A.D.1.88pM | 0.073 | 1.1 |
参考文献
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Claims (30)
1.用于在来源于患者的预先采样的生物学样本中对循环的组织因子(cTF)进行体外测定的方法,其中在反应介质中测量激活的因子X(Xa)的产生,所述反应介质包括测试的生物学样本、过量的因子VII和因子X、钙离子、纤维蛋白聚合抑制剂和TFPI(组织因子途径抑制剂)活性抑制剂。
2.如权利要求1所述的用于对循环的组织因子(cTF)进行体外测定的方法,其特征在于所述生物学样本为血液样本或其衍生性样本,特别是血浆样本。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法,其特征在于通过测量因子Xa对特异性底物的水解活性,测定所述反应介质中该因子Xa的产生。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于所述特异性底物为酶促底物。
5.如权利要求3所述的方法,其特征在于使用显色底物或荧光底物测定激活的因子X(FXa)的酰胺分解活性。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于测量由合成的显色底物CBS 5244释放的对硝基苯胺。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法,其特征在于所述反应介质包含在诸如Owren Koller缓冲液的合适的缓冲液中稀释的血浆。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于在1/2至1/20,例如1/2至1/4的稀释范围内,稀释所述血浆;特别是,将所述血浆以1/3稀释。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法,其特征在于所述纤维蛋白聚合抑制剂为多肽抑制剂,例如H-GlyProArgPro-OH.AcOH(GPRP.AcOH)或为抗纤维蛋白原抗体。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法,其特征在于凝血开始所需的钙离子以CaCl2的形式提供。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法,其特征在于TFPI对所述循环的组织因子的活性的抑制剂由能够抑制TFPI对循环的组织因子的活性的抗-TFPI抗体和结合TFPI的功能性抗体片段构成。
12.如权利要求11所述的方法,其中所述TFPI抑制剂为单克隆抗体T4E2或所述抗体的功能性片段。
13.如权利要求2至12中任一项所述的方法,包括下述步骤:
a)使血浆样本与试剂1接触,所述试剂1包含纤维蛋白聚合抑制剂、TFPI对cTF的活性的抑制剂,以及如果合适的话,稀释缓冲液;
b)将步骤(a)中获得的反应介质与包含过量的因子X、过量的因子VII以及钙离子溶液的试剂2一起孵育,以便产生激活的因子X(FXa);
c)在孵育后,使步骤(b)中获得的反应介质与激活的因子X(FXa)的酶促底物接触;
d)检测所述因子Xa底物的转化。
14.如权利要求12或权利要求13所述的方法,其特征在于所述试剂1还包含肝素抑制剂,例如聚凝胺。
15.如权利要求13或14中任一项所述的方法,其特征在于将所述血浆样本在添加有1.2mg/L聚凝胺和50μg/L抗-TFPI抗体的Owren Koller缓冲液中以1/3稀释。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法,其特征在于所述因子Xa的酶促底物的转化的定量测量通过在预定窗中读取光密度而实现。
17.如权利要求13至16中任一项所述的方法,其特征在于转化的因子Xa底物的量通过参照校准曲线而测定。
18.如权利要求13至17中任一项所述的方法,其特征在于所述反应在下述条件下进行:
●对于步骤a),使所述在Owren Koller缓冲液稀释以1/3稀释的血浆样本与50μg/L的抗-TFPI抗体和1.2mg/L的聚凝胺和浓度为10g/L的称为GPRP.AcOH的纤维蛋白聚合抑制剂接触;
●对于步骤b),将25μl 80PEU/mg/mL比例的因子X、25μl 137PEU/mg/mL比例的因子VII以及50μl 25mM的CaCl2溶液加入到50μl的步骤a)的混合物中,并将所获得的反应混合物在37℃孵育500秒;
●对于步骤c),加入100μl的所述激活的因子X的酶促底物,并通过在405nm的波长下6-600秒的读数窗中的光密度读数,测定转化的酶促底物的量。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法,其特征在于所述方法还包括测定内部对照。
20.如权利要求1至17任一项所述的方法,其特征在于将所获得的光密度值与使用富含组织因子的正常混合血浆或使用富含组织因子的NaCl-CaCl2溶液制备的校准曲线的值进行比较。
21.用于在生物学介质中测量生物学样本特别是血浆样本中的循环的组织因子活性的试剂盒,包含:
●试剂1,包括用于测试的样本的稀释缓冲液、纤维蛋白聚合抑制剂、TFPI抑制剂,以及如果合适的话,肝素抑制剂;
●纯化的或重组的因子VII,有利地为冻干形式;
●纯化的或重组的因子X,有利地为冻干形式;
●钙离子,例如为CaCl2的形式;
●激活的因子X的酶促底物,有利地为冻干形式;
●如果合适的话,校准试剂,有利地为冻干形式。
22.如权利要求21所述的试剂盒,其特征在于所述样本稀释缓冲液为Owren Koller缓冲液,所述肝素抑制剂为聚凝胺,且所述纤维蛋白聚合抑制剂为为H-GlyProArgPro-OH.AcOH(GPRP.AcOH)或为抗纤维蛋白原抗体。
23.如权利要求21或权利要求22所述的试剂盒,其特征在于所述试剂盒还包括内部对照。
24.如权利要求21至23中任一项所述的试剂盒,其特征在于所述试剂盒包含因子Xa活性的校准曲线。
25.用于在体外检测异常凝血的方法,包括如权利要求1至20中任一项所述,测量循环的组织因子的活性。
26.如权利要求25所述的方法,包括将所测量的循环的组织因子活性与所述活性的正常值进行比较。
27.如权利要求26所述的方法,其中所述正常值通过测定正常血浆样本的混合物中的循环的组织因子活性而获得。
28.如权利要求26所述的方法,其中所述正常值通过针对单独测定的正常血浆样本而测量的所述循环的组织因子活性的值来建立。
29.如权利要求25至28中任一项所述的方法,用于检测与血栓形成风险或血栓形成相关的循环的组织因子比率的增加,特别是与急性心肌梗塞(AMI)、急性冠状动脉综合征、弥散性血管内凝血(DIVC)、糖尿病、先兆子痫、流产、血栓形成、脓毒症、炎症或癌症的症状相关的循环的组织因子比率的增加。
30.如权利要求20至25中任一项所述的试剂盒,用于检测与血栓形成风险或血栓形成相关的循环的组织因子比率的增加,特别是与急性心肌梗塞(AMI)、急性冠状动脉综合征、弥散性血管内凝血(DIVC)、糖尿病、先兆子痫、流产、血栓形成、脓毒症、炎症或癌症的症状相关的循环的组织因子比率的增加。
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