CN102153666B - 一种海洋星虫多糖及其制备方法和在抗疲劳功能中的应用 - Google Patents
一种海洋星虫多糖及其制备方法和在抗疲劳功能中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种海洋星虫多糖及其制备工艺，以及该多糖在抗疲劳功能中的应用。该多糖的单糖组成是由***糖(7.91％)和葡萄糖(79.32％)2种单糖组成，且该多糖中多糖含量为80％以上。该多糖的制备工艺，取清洗干净的海洋星虫原料适量，依次加入碱溶液，加热提取，调pH值，离心，脱蛋白，浓缩，醇沉，冷冻干燥，得星虫多糖，该多糖具有明显抗疲劳功能。该海洋星虫多糖的提取方法简单易行，成本低，能耗少，不污染环境，且明显提高多糖含量，有效克服了动物多糖难于富集、难于提取以及糖含量低这一难题，使海洋星虫多糖能在较大程度上实现商品化，在工业上有很好的推广应用前景。
Description
技术领域：
本发明属医药技术领域，涉及一种海洋生物多糖及其制备方法和应用，具体涉及一种海洋星虫多糖及其制备方法和在抗疲劳功能中的应用。
背景技术：
疲劳是一种常见的心理-生理现象，疲劳的发生常常导致工作能力和工作效率的降低。尤其在军事作业中，广大官兵疲劳现象普遍存在，抗疲劳研究对于提高我军的战斗力具有重要的意义。多糖作为一类重要的活性物质具有多种功效，如何有效地对多糖进行分离并进行功能测试，已成为国内外研究的一个热点和难点。
海洋星虫具有丰富的营养物质，我国多种本草中记载了其食用和药用价值。海洋星虫不仅是味道鲜美的海味珍品，亦是一种低脂肪、高蛋白和富含锌、铁、钙、磷、碘多种矿物质的高级保健食品，除作食用外，民间还把它作为治疗虚火上炎及滋阴补肾之食疗药物。一般用于目赤、面部潮红。夏日盛暑因烈日暴晒，身体发热，便秘的患者，用之可缓解症状。此外，在闽、台、粤、琼等沿海地区，渔民家常用海洋虫草煮稀饭喂养幼儿，具有健脾滋补等食疗作用。
海洋星虫的保健功能，在我国古代医药专著中多有记载，自古以来被视为“海药”，唐末五代时的著名本草学家李荀广游岭南，知晓南国乡土风物，熟悉南国药用动植物，所著《海药本草》记载了大量外来药，其中就记载了“海蚕沙”，云其“生南海山石间，其蚕形，大如姆指，沙甚白，如玉粉状，每有节”。海蚕沙“味咸，大温，无毒。主虚劳冷气，褚风不遂。久服令人光泽，补虚羸，轻身，延年不老”。著名本草学家李时珍，在其所著《本草纲目》之中同样也记载有“海蚕”的药用功效。中医认为海洋星虫性味甘、咸、寒，有清肺补虚、滋阴降火功效，临床实践证实骨蒸潮热、阴虚盗汗、肺虚咳喘、胸闷痰多等疾病，食用海洋星虫有疗效。对肺痨咳嗽、神经衰弱、小儿脾虚等疾患，若用海洋星虫与姜片煲炖亦有很好的治疗效果。以淮杞园肉煲海洋星虫汤，不仅营养丰富，味道鲜美，而且具有滋阴养颜之效。民间效方有：①海沙虫煎：取海沙虫30g，水煎煮熟，1剂，每日水煎服2次，具有滋阴降火、清肺化痰功效，主治肺结核病、咳嗽吐痰、潮热盗汗；②加味海沙虫汤：取海沙虫10g，百部15g，生甘草5g；水煎，1剂，每日水煎服2次，具有滋阴润肺、止咳祛痰功效，主治阴虚型肺结核病。
现代医药研究表明海洋星虫含有多种活性物质，能够调节机体多种机能，含有丰富的蛋白质、微量元素等。锌的含量达到2.3×102μg/g，牛磺酸含量是普通生物的70倍(达3％)，蛋白质含量为55％以上，精氨酸含量高达6.8％；具有显著的延缓衰老、抗氧化等功效，对心血管***具有明显的保护作用。
窦宝昌等人发现海洋星虫的水解提取液具有收缩血管、加快心率、增强心博出量和冠脉血流量的作用，对失血性低血压有显著升压作用，亦有良好的镇静止痛效果。也有学者对海洋星虫的成分进行分析，发现它们含有6-7种人体必需氨基酸，尤其以Lys，Leu，Val含量较高；微量元素中尤其含锌量很高，可达2.3×102μg/g。我们在前期实验中，除了对海洋星虫中的牛磺酸、氨基酸、微量元素、蛋白质等进行研究之外，特别对海洋星虫中的多糖进行了深入研究。
本发明涉及一种海洋星虫多糖的制备方法，通过该方法所制备多糖，含量明显增高，其制备方法可靠易行，不污染环境，成本低，适用于大规模生产。经药效学实验研究，该多糖具有明显的抗疲劳功效果。
发明内容：
为了有效克服动物多糖难于富集、难于提取以及糖含量低这一难题，本发明所解决的关键技术问题是根据海洋星虫所含多糖的特性，采用提取分离技术，开发一种高纯度的、适用于工业化大生产的海洋星虫多糖提取方法，并公开其在抗疲劳功能中的应用。
本发明是这样实现的：
本发明海洋星虫多糖提取工艺，是通过碱提、脱蛋白、醇沉等步骤获取该活性组分。具体提取工艺是：取清洗干净的海洋星虫原料适量，依次加入2-8倍2-10％碱溶液，30-80℃提取2-8h，调pH值为4.0-10.0，离心，9000rpm，时间30min，弃去沉淀，得上清液。采用三氯乙酸脱蛋白，至pH值为3.0-8.0，静止50min左右后倒入分液漏斗中，静止后分离上层水溶液，浓缩到原体积的1/4左右，用95％的乙醇与分离液充分混合，搅拌，使其浓度达到20-80％，4℃静置过夜，离心，冷冻干燥，得海洋星虫多糖。
本发明海洋星虫多糖提取最优工艺是：取清洗干净的海洋星虫原料适量，加入6倍6％NaoH，50℃提取4h，调pH值为7.0，离心，9000rpm，时间30min，弃去沉淀，得上清液。采用三氯乙酸脱蛋白，至pH值为4.0，静止50min左右后倒入分液漏斗中，静止后分离上层水溶液，浓缩到原体积的1/4左右为止取出，用95％的乙醇与分离液充分混合，搅拌，使其浓度达到75％左右，4℃静止过夜，离心，冷冻干燥，得海洋星虫多糖。
用本发明的方法获得的海洋星虫多糖为灰白色粉末，溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂，多糖含量为80％以上。该海洋星虫多糖的单糖组成是由***糖(7.91％)和葡萄糖(79.32％)2种单糖组成；该海洋星虫多糖中糖含量为80％以上；该海洋星虫多糖遇Molish试剂、斐林(Fehling)试剂、蒽酮-硫酸试剂、苯酚-硫酸试剂均显示特定的颜色反应；红外光谱显示特征性吸收。
用本发明的方法获得的海洋星虫多糖经过抗疲劳实验研究，具有明显抗疲劳功能。
本发明的优点：
1、本提取方法主要根据动物多糖的特点，通过对pH值、加热温度、加碱量、碱浓度、醇浓度等因素的精确选择及对加入试剂先后次序的选择，从而达到对多糖的有效富集和有效分离。在提取过程中没有使用有机溶剂和其它特殊设备，提取方法简单易行，成本低，能耗少，不污染环境，有效克服了动物多糖难于富集、难于分离这一难题，使海洋星虫多糖能在较大程度上实现商品化，在工业上有很好的推广应用前景。
2、通过提取工艺比较，本提取方法所得多糖，明显提高了多糖含量，使多糖含量超过80％，有效克服掉动物多糖含量低的特点。
3、通过对抗疲劳实验研究，该多糖糖含量高，且具有明显的抗疲劳功效。
附图说明：
图1：混合单糖标准品色谱图
图2：样品色谱图
图3：Molish试剂反应鉴别图
图4：斐林(Fehling)试剂反应鉴别图
图5：蒽酮-硫酸试剂反应鉴别图
图6：苯酚-硫酸试剂反应鉴别图
图7：红外光谱鉴别图
具体实施方式：
实施例1
海洋星虫多糖中单糖组分的测定：
1、样品与试剂
海洋星虫多糖样品为自制。单糖标准品为鼠李糖、***糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、肌醇、果糖，均为分析纯生化试剂，均购自上海源聚科技有限公司。三氟乙酸、醋酐、甲醇、无水硫酸钠、氯仿均为国产分析纯试剂。
2、仪器与条件
采用气相色谱法进行测定。检测仪器：HP 6890(Plus)型气相色谱仪。检测器：FID，色谱柱：HP-INNOWAX，(30m*0.25mm*0.25μm)。汽化室温度：240℃，检测器温度：260℃。用氮气作为载气，纯度99.999％。色谱柱初温140℃，然后，以10℃/min的升温速率升至240℃，保持10min。分流比：20/1，进样量：1μl，面积归一化法定量。
3、样品处理称取海洋星虫多糖15mg，用3mol/L三氟乙酸于烘箱120℃水解6h，取出浓缩至干，加甲醇并吹干，待用。
4、糖肟乙酸酯衍生物的制备
取海洋星虫多糖水解液的干燥品5mg，加盐酸羟胺6mg，吡啶0.5mL，90℃烘箱中放置10min，取出放冷至室温，加入醋酐0.3mL，再于90℃烘箱中放置20min，取出后减压至干，用氯仿溶解，备用。
5、单糖衍生物的制备
分别精密称取标准品鼠李糖、***糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、肌醇、果糖各5mg，分别加入6mg盐酸羟胺，吡啶0.5mL，90℃烘箱中放置10min，取出放冷至室温，加入醋酐0.3mL，再于90℃烘箱中放置20min，取出后减压至干，用氯仿溶解，备用。分别取已制备好的单糖衍生物各0.5ml，混合后，制成标准单糖衍生物混合液。
6、定性和定量
先将每个标准单糖衍生物和标准单糖衍生物混合液进样，记录色谱峰的保留时间(RT)并进行确认，然后将制备好的星虫多糖水解物经衍生化后的样品进样，得到样品的色谱图(分别见图1和图2)。用标准单糖衍生物色谱峰的RT与样品衍生物色谱峰的RT比对，以确定星虫多糖中含有哪几种单糖。再作定量计算，定量方法为归一化法，即用色谱峰峰面积的百分含量法(Area％)表示，结果见表1。
表1单糖组分及相对百分含量
7、结论
在标准单糖混合液和样品进样后的色谱图上，可得到各单糖的RT，范围在9～20min之间，各峰分离度好，无干扰现象。根据归一化法数据处理，计算出峰面积百分率(Area％)，结果显示星虫多糖中主要由***糖(7.91％)和葡萄糖(79.32％)2种单糖组成，其余约有12％的成分为一些信号很小的杂峰，未能与所选择的单糖标准品进行对应，也可能为其他杂质，有待进一步深入研究。
实施例2
海洋星虫多糖含量测定：
1、溶液配制
1.1对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品50mg，置500ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
1.2供试品溶液制备取所制备的海洋星虫多糖20mg，置100ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2、标准曲线制备
2.1测定波长的选择分别精密量取无水葡萄糖对照品溶液和供试品溶液0.3mL，置10mL刻度试管中，加水稀释至2.0mL，加0.2％蒽酮-硫酸溶液显色，以相应试剂为空白，扫描光谱图，葡萄糖对照品与供试品均在625nm处有最大吸收。
2.2标准曲线的制备分别精密吸取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，置10ml具塞试管中，加水至2.0ml，精密加入硫酸蒽酮溶液(精密称取0.1g蒽酮，加80％的硫酸溶液100ml使溶解，摇匀)6ml，摇匀，置水浴中加热15分钟，取出，放入冰浴中冷却15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，得标准曲线回归方程为：y＝50.576x+0.0281，R2＝0.9967。试验结果表明，葡萄糖质量在0.02～1.2mg，用0.2％蒽酮-硫酸溶液显色后的线性关系良好。
3、方法学考察
3.1精密度试验取同一份供试品溶液0.3ml 3份，按2.2项下方法显色，于625nm处测定吸收度，结果见表2，相对标准差(RSD)为0.6％。
表2精密度试验
3.2重复性试验精密称取样品3份，各约20mg，按供试品溶液方法制备，显色，于625nm处测定各样品的吸收度，结果见表3，相对标准差(RSD)为0.6％。表明该方法重现性好，结果可靠。
表3重复性试验
3.3稳定性实验
取供试品溶液适量，用0.2％蒽酮-硫酸溶液显色，以相应的试剂作空白，置比色皿中，在分光光度计上于625nm测定吸光度，每隔10min读数，共考察60min，结果(见表4)表明供试品溶液显色后在60min稳定。
表4 稳定性试验
3.4回收率试验 取已知含量的样品溶液0.3ml共3份，向其中加入0.2ml葡萄糖对照品溶液，依法制备供试品溶液并测定多糖含量，计算加样回收率，结果(表5)平均加样回收率为100.47％，RSD为1.03％(n＝3)。
表5回收率实验(n＝6)
4、样品的含量测定 精密称取所制备的海洋星虫多糖各3份，分别置100ml容量瓶中，加水使溶解，摇匀，精密量取0.4ml溶液，置10ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至2.0ml”起，依法测定吸光度，并从标准曲线上计算出供试品溶液中多糖的含量，结果见表6。
表6 含量测定结果(n＝3)
实施例3
海洋星虫多糖鉴别实验：
1、化学鉴别
1.1Molish试剂反应
1.1.1实验原理：多糖在浓硫酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与α-萘酚作用那个形成***复合物，在糖液与浓硫酸的液面间形成紫环。
1.1.2Molish试剂配制：取5克α-萘酚用95％乙醇溶解至1000mL，临用前配制，棕色瓶保存。
1.1.3实验方法：取试管，加入星虫多糖(1％浓度)1mL，然后加两滴Molish试剂，摇匀。倾斜试管，沿管壁小心加入约1mL浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。用水代替糖溶液，重复一遍，观察结果。
1.1.4实验结果：见图3
1.2斐林(Fehling)试剂反应
1.2.1实验原理：新配制的斐林试剂溶液，在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红色的沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。用斐林试剂鉴定可溶性还原糖时，溶液的颜色变化过程为：深蓝色→黄色(CuOH沉淀)→砖红色(沉淀)。
1.2.2斐林试剂配制：斐林A：将3.5g含五个结晶水的硫酸铜溶于100mL的水中既得淡蓝色的斐林A试剂。斐林B：将17g五结晶水的酒石酸钾溶于20mL热水中，然后加入含有5g氢氧化钠的水溶液20mL，稀释至100mL既得无色清亮的斐林B试剂。使用时斐林A和等量混合。
1.2.3实验方法：向试管内加入待测糖(1％浓度)1mL。然后加入1mL斐林试剂(AB液等体积混合均匀后再加入)。将试管放入盛有50-60℃温水的大烧杯中加热约2min后观察试管中出现的颜色变化。
1.2.4实验结果：见图4。
1.3.1蒽酮-硫酸试剂反应
1.3.2实验原理：多糖遇浓硫酸脱水生成糖醛或其它衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝色。
1.3.2蒽酮试液制备：蒽酮溶于浓硫酸中，浓度为2mg/mL，当日配制使用。
1.3.3实验方法：
配制0.01mg/mL的多糖溶液，吸取1mL，加入蒽酮4mL，混匀，沸水浴煮10min，冷却至室温。用水代替糖溶液，重复上述操作，比较观察结果。
1.3.4实验结果：见图5
1.4苯酚-硫酸试剂反应
1.4.1实验原理：多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
1.4.2苯酚试液制备：取一定量苯酚，加水，配制5％苯酚溶液，临用前配制。
操作方法：
1.4.3实验方法：试管中加入待测糖溶液1mL，然后加入5％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，摇匀冷却，室温放置20分钟以后观察试管中出现的颜色变化。
1.4.4实验结果：见图6
实施例4
海洋星虫多糖红外光谱鉴别实验：
取海洋星虫多糖，进行红外光谱测定，从红外光谱图7显示，星虫多糖具有典型的多糖特征吸收峰(3 403、2 930、1 728、1 647、1 416cm-1)，其中3 403cm出现的吸收峰主要是由多糖的配糖体羟基(缔合)伸缩振动引起的，由于羟基形成氢键缔合后，-O-H+键拉长，偶极矩增大，因此3 403cm-1处表现强而宽的峰；2 930cm-1处的吸收峰与碳氢键的伸缩振动相对应，强度较弱；1 728cm-1处的吸收峰为C＝O伸缩振动引起的吸收，1 647cm-1附近的吸收峰为乙酰氨基(-NH2COCH3)的C＝O伸缩振动，1 416cm-1处的吸收峰为c-H弯曲振动峰，1 238cm处的吸收峰为酮糖类C-C键伸缩振动引起，1 081cm-1处出峰则为分子中C-O键的伸缩振动，是碳氧键伸缩振动的特征。
实施例5
海洋星虫多糖提取工艺研究：
海洋星虫为一种海洋动物，对于海洋动物而言，其中的多糖含量较低，如何采取一种有效的提取方法对其中动物多糖进行富集，已成为动物多糖提取的一大难题。因此本技术主要通过对各种提取方法进行考查，并进行脱蛋白研究，通过工艺比较，最终筛选得出一条最优工艺。具体如下：
(一)、碱解法和酶解法工艺比较研究
1、器材与试药
高速组织捣碎仪(上海精科实业有限公司)，电热恒温水浴锅(余姚新波仪表公司)，GL-21M离心机(上海市离心机械研究所)；氢氧化钠(AR级，中国医药集团上海化学试剂公司，批号：F20090921)，盐酸(AR级，中国医药集团上海化学试剂公司，批号：T050704)，95％乙醇(上海胜德化工有限公司，批号：F20090921)，三氯乙酸(进口分装，批号：LJ0910B508J)，胰酶(国药集团试剂)，氯仿(国药集团试剂)，正丁醇(国药集团试剂)，海洋星虫(购自北海)。
2、提取方法
2.1碱解法
取清洗干净的海洋星虫原料100g，粉碎、匀浆，加水至六倍体积，加入6％NaoH，50℃提取4h，调pH值为8.0，9000rpm×30min离心，弃去沉淀，得上清液。用95％的乙醇与分离液充分混合，搅拌，使其浓度达到75％左右，4℃静止过夜，离心，冷冻干燥，得粗多糖。
2.2酶解法
取清洗干净的星虫原料100g，粉碎、匀浆，按料液比1∶6加入蒸馏水，调PH值至8.0，加入胰酶至终浓度为0.3％，加热至60℃，作用3h，加热至100℃作用30min，终止酶解反应。将上述样品离心，9000rpm，时间30min，弃去沉淀，得上清液。用95％的乙醇与分离液充分混合，搅拌，使其浓度达到75％左右，4℃静止过夜，离心，冷冻干燥，得粗多糖。
3、实验结果
通过对上述工艺所提取多糖进行含量测定和得率计算，结果如下(见表7)。
表7粗多糖含量测定和得率
4、实验结论
通过对上述两个工艺进行比较，结果表明，碱解法提取优于酶解法。
(二)脱蛋白效果考查
由于碱解法提取优于酶解法，因此本实验对碱解法进行深入，并对脱蛋白方法进行比较。
1、器材与试药
高速组织捣碎仪(上海精科实业有限公司)，电热恒温水浴锅(余姚新波仪表公司)，GL-21M离心机(上海市离心机械研究所)；氢氧化钠(AR级，中国医药集团上海化学试剂公司，批号：F20090921)，盐酸(AR级，中国医药集团上海化学试剂公司，批号：T050704)，95％乙醇(上海胜德化工有限公司，批号：F20090921)，三氯乙酸(进口分装，批号：LJ0910B508J)，胰酶(国药集团试剂)，氯仿(国药集团试剂)，正丁醇(国药集团试剂)，方格星虫(购自北海)。
2、提取方法
2.1工艺一：碱解法
取清洗干净的星虫原料100g，粉碎、匀浆，加水至六倍体积，加入6％NaoH，50℃提取4h，调pH值为8.0，9000rpm×30min离心，弃去沉淀，得上清液。用95％的乙醇与分离液充分混合，搅拌，使其浓度达到75％左右，4℃静止过夜，离心，冷冻干燥，得粗多糖。
2.2工艺二：碱解酶解联用法
取清洗干净的星虫原料100g，粉碎、匀浆，加水至六倍体积，加入6％NaoH，50℃提取4h，调pH值至8.0，加入胰酶至终浓度为0.3％，加热至60℃，作用3h，加热至100℃作用30min，终止酶解反应。9000rpm×30min离心，弃去沉淀，得上清液。用95％的乙醇与分离液充分混合，搅拌，使其浓度达到75％左右，4℃静止过夜，9000rpm×300min离心，冷冻干燥，得粗多糖。
2.3工艺三：碱解和sevage脱蛋白法
取清洗干净的星虫原料100g，粉碎、匀浆，加水至六倍体积，加入6％NaoH，50℃提取4h，调pH值为8.0，9000rpm×30min离心，弃去沉淀，得上清液。按照1∶1的比例加入sevage试剂，搅拌，静止50min左右后倒入分液漏斗中，静止后分离上层水溶液，用95％的乙醇与分离液充分混合，搅拌，使其浓度达到75％左右，4℃静止过夜，离心，冷冻干燥，得粗多糖。
2.4工艺四：碱解和三氯乙酸脱蛋白法
取清洗干净的星虫原料100g，粉碎、匀浆，加水至六倍体积，加入6％NaoH，50℃提取4h，离心，9000rpm，时间30min，弃去沉淀，得上清液。调pH值为7.0，加入三氯乙酸脱蛋白，调至pH值为4.0，9000rpm×30min离心，上清转移，用95％的乙醇与分离液充分混合，搅拌，使其浓度达到75％左右，4℃静置过夜，9000rpm×300min离心，冷冻干燥，得粗多糖。
2.5工艺五：碱解、酶解和sevage脱蛋白法
取清洗干净的星虫原料100g，粉碎、匀浆，加入6倍6％NaOH，50℃提取4h，调pH值至8.0，加入胰酶至终浓度为0.3％，加热至60℃，作用3h，加热至100℃作用30min，终止酶解反应。9000rpm×30min离心，弃去沉淀，得上清液。按照1∶1的比例加入sevage试剂，搅拌，静止50min左右后倒入分液漏斗中，静止后分离上层水溶液，用95％的乙醇与分离液充分混合，搅拌，使其浓度达到75％左右，4℃静止过夜，离心，冷冻干燥，得粗多糖。
2.6工艺六：碱解、酶解和三氯乙酸脱蛋白法
取清洗干净的星虫原料100g，粉碎、匀浆，加水至6倍体积，加入6％NaoH，50℃提取4h，调pH值调至8.0，加入胰酶至终浓度为0.3％，加热至60℃，作用3h，加热至100℃作用30min，终止酶解反应。9000rpm×30min离心，弃去沉淀，得上清液。调pH值至7.0，加入三氯乙酸脱蛋白，至pH值为4.0，9000rpm×30min离心，上清转移，用95％的乙醇与分离液充分混合，搅拌，使其浓度达到75％左右，4℃静止过夜，9000rpm×300min离心，冷冻干燥，得粗多糖。
3、实验结果
通过对上述工艺所提取多糖进行含量测定和得率计算，结果如下(见表8)。
表8粗多糖含量测定和得率
4、实验结论
通过对上述工艺比较，结果表明工艺四所制备多糖含量测定结果最好，且得率较高。
实施例6
海洋星虫多糖抗疲劳实验研究：
疲劳一般指机体生理过程不能持续其功能在特定水平上，或不能维持预定的运动强度致使身体和精神状态的下降，从而导致工作能力和工作效率的衰退。能源物质的消耗、代谢物质的堆积是产生疲劳的重要原因。尤其在军事作业中，广大官兵疲劳现象普遍存在，抗疲劳研究对于提高我军的战斗力具有重要的意义。运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最有力的宏观表现，游泳时间的长短可以反应动物运动疲劳的程度。本实验采用负重游泳持续时间，研究海洋星虫多糖的抗疲劳作用。
(一)抗疲劳实验一(负重游泳实验)
1、实验器材
电子天平(型号TB-214，北京赛多利斯仪器***有限公司)；托盘天平(上海医疗器械八厂)；西洋参胶囊(厦门市福宁春保健食品有限公司，批准文号：国食健字G20030007)；海洋星虫多糖(实验室自制)。
2、实验动物及分组
BalB/c雄性小鼠60只，7-8周龄，20±1g，(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证：SCXK(沪)2007-0003使用许可证：SYXK(沪)2007-0003)。随机分为5组，每组12只，分别为空白对照组、阳性对照组(0.5g/kg)、星虫多糖低、中、高剂量组(即0.2g/kg、0.4g/kg、0.6g/kg)共5组，并用苦味酸进行标记。
3、实验方法
给所有小鼠灌胃给药，连续给药10d，小鼠于末次给药后，称重。30min后(灌胃之前不空腹)，使尾部负重10％体重的铅皮，4个不锈钢大桶，直径80cm，使水深45cm，不断加入热水使水温保持在25±1℃，同时打开空调，保持室温为25℃。记录小鼠游泳的时间，即小鼠自入水开始到头部全部没入水中8s不能浮出水面为止的时间。
4、药物配制
低剂量组配制：称取0.72g前期提取的星虫多糖粉末溶于36ml蒸馏水中，充分混匀，每试管均3ml，共12管，备用。
中剂量组配制：称取1.44g前期提取的星虫多糖粉末溶于36ml蒸馏水中，充分混匀，每试管均3ml，共12管，备用。
高剂量组配制：称取2.16g前期提取的星虫多糖粉末溶于36ml蒸馏水中，充分混匀，每试管均3ml，共12管，备用。
西洋参胶囊溶液配制：将西洋参胶囊剥开，称量内部粉末0.9g，将其溶解于36ml蒸馏水中，充分振荡混匀，摇匀后分装到12只试管中，每管3ml，备用。
5、实验结果
记录小鼠游泳时间，即小鼠自入水开始到头部全部没入水中8s不能浮出水面为止的时间，经过对其统计结果如下，见表9
表9小鼠游泳实验统计结果(单位：秒)
与空白对照组相比#P＜0.05，##P＜0.01
与阳性对照组相比：*P＜0.05
6、实验结论
6.1阳性对照组、星虫多糖低、中、高剂量组均与空白组具有非常显著性差异(p＜0.01)。
6.2星虫多糖低剂量组与阳性对照组相比，具有显著性差异(p＜0.05)。
6.3星虫多糖低剂量组对小鼠的抗疲劳效果优于星虫多糖中、高剂量组。
7、注意事项
7.1在小鼠负重游泳实验时，水温应严格控制在25±1℃，水温对游泳时间会产生较大影响。
7.2负重按10％体重计算，而不采用大多数文献所述的5％，负重较重可更明显区别各组小鼠的游泳时间。
7.3选择铅丝时应选择较细的铅丝，先用锤子将铅丝锤扁，然后再均匀地绑在小鼠尾部，这样既不易滑落，又不会对小鼠尾部造成伤害。
7.4本次阳性药采用的是西洋参胶囊配制的，由于有不溶的有效成分，故在配制试剂时应充分研磨研细。在灌胃时，应充分混匀，为了不造成针头堵塞，可每次仅抽取0.2ml，少量多次。
(二)抗疲劳实验二(生化指标测定)
1、实验器材
西洋参胶囊(厦门市福宁春保健食品有限公司，批准文号：国食健字G20030007)；星虫多糖(实验室自制)；电子天平(型号TB-214，北京赛多利斯仪器***有限公司)；托盘天平(上海医疗器械八厂)。
2、实验动物及分组
BalB/c雄性小鼠65只，7-8周龄，20±lg，(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证：SCXK(沪)2007-0003使用许可证：SYXK(沪)2007-0003)。随机分为5组，每组13只，分别为空白对照组(蒸馏水组)、阳性对照组(西洋参0.5g/kg)、星虫多糖低、中、高剂量组(即0.2g/kg、0.4g/kg、0.6g/kg)共5组，并用苦味酸进行标记。
3、药物配制
低剂量组配制：称取0.72g前期提取的星虫多糖粉末溶于36ml蒸馏水中，充分混匀，每试管均3ml，共12管，备用。
中剂量组配制：称取1.44g前期提取的星虫多糖粉末溶于36ml蒸馏水中，充分混匀，每试管均3ml，共12管，备用。
高剂量组配制：称取2.88g前期提取的星虫多糖粉末溶于36ml蒸馏水中，充分混匀，每试管均3ml，共12管，备用。
西洋参溶液配制：将西洋参胶囊剥开，称量内部粉末0.9g，将其溶解于36ml蒸馏水中，充分振荡混匀，摇匀后分装到12只试管中，每管3ml，备用。
4、实验方法
给所有小鼠灌胃给药，连续给药12d，小鼠于末次给药后30min，使不负重游泳。在4个不锈钢大桶，直径80cm，使水深45cm，不断加入热水使水温保持在25±1℃，同时打开空调，保持室温为25℃。在游泳38min后取出小鼠，立即用吸水纸擦，并用电吹风吹干，放人桶中休息20min后眼眶取血，所得血样进行血清尿素氮和乳酸脱氢酶的测定。取血完毕后，将动物颈椎脱臼处死，立即取后肢肌肉和肝脏，以生理盐水冲洗后，用滤纸吸干，称取肌肉和肝脏，分别放入预冷的生理盐水中清除其血液，并用吸水纸吸干，称重，待用。
5、实验结果
5.1血清尿素氮含量测定将上述血样进行离心，分离血清。精密取血清20ul，严格依照血清尿素氮试剂盒说明书进行操作，于620nm下30min内测定各管小鼠血清吸光度，换算为血清尿素氮含量，结果见表10。
表10小鼠血清尿素氮的含量测定统计结果(单位：秒)
与空白对照组相比#P＜0.05，##P＜0.01
与阳性对照组相比：*P＜0.05，**P＜0.01
5.2乳酸脱氢酶的含量测定将上述血样进行离心，分离血清。精密取血清20ul，严格依照乳酸脱氢酶试剂盒说明书进行操作，于490nm下30min内测定各管小鼠血清吸光度，换算为乳酸脱氢酶的含量，结果见表11。
表11小鼠乳酸脱氢酶的含量测定统计结果(单位：秒)
与空白对照组相比#P＜0.05，##P＜0.01
与阳性对照组相比：*P＜0.05，**P＜0.01
6、实验结论
6.1从表2血清尿素氮的含量统计结果可知，与空白组比较，低剂量和中剂量组明显优于空白组，具有非常显著性意义(P＜0.01)；与阳性组比较，低剂量和中剂量组明显优于阳性组，也具有非常显著性意义(P＜0.01)。从表3乳酸脱氢酶含量统计结果可知，低剂量明显优于空白组，具有非常显著性意义(P＜0.01)；与阳性组比较，低剂量优于阳性组，具有显著性意义(P＜0.05)。
Claims (4)
1.一种海洋星虫多糖提取物，其特征在于该多糖提取物是以海洋星虫为原料，清洗干净、粉碎、匀浆，依次加入碱溶液，加热提取，提取结束后调pH值，离心，弃去沉淀，得上清液；对上清液脱蛋白，再次调pH值，静置，分离上层水溶液，浓缩，醇沉，静置过夜，离心，冷冻干燥，即得；其中加入的碱溶液其特征为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸氢钠中的一种，所加入的碱溶液浓度为2-10％，加入体积为原液体的2-8倍，其加热提取温度为30-80℃提取2-8h，调pH值为4.0-10.0，其中采用三氯乙酸脱蛋白，至pH值为3.0-8.0，其中醇沉的最终浓度为20-80％。
2.如权利要求1所述的海洋星虫多糖提取物，其特征在于其中多糖主要是由***糖和葡萄糖2种单糖组成，百分含量分别为7.91％和79.32％。
3.如权利要求1所述的海洋星虫多糖提取物，其中多糖含量为80％以上。
4.如权利要求1所述的多糖提取物，其特征在于具有抗疲劳功能。
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