CN102146118B - 核蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及核蛋白的提取方法，具体包括以下步骤：在洗涤并去上清液的细胞或组织匀浆中加入裂解液，4℃条件下缓慢旋转裂解细胞或组织45-60分钟，得核蛋白粗提液；将步骤A所得核蛋白粗提液冰浴超声，静置或离心后，取上清液，核蛋白存在于所述上清液中；本方法在细胞裂解液处理的基础上，联合使用超声裂解的方法，避免大量的核蛋白随DNA一起沉淀而被丢弃，含量和活性最大化的获得总蛋白提取物及核蛋白，本方法操作简单，适用于大规模提取。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及核蛋白的提取技术。
背景技术
随着人类基因组测序的完成和后基因组时代的到来，寻找疾病相关基因和鉴定基因的功能，已成为当今首要任务。提取蛋白对研究其功能至关重要，如抗体制备，晶体结构，功能域分析等均需要设计蛋白的提取。核蛋白属于结合蛋白质中的一类，普遍存在于各种生物的细胞核中的特殊形态的蛋白质，由核酸，组蛋白及精蛋白等的碱性蛋白结合而成，为细胞核的主要成分。根据核酸种类不同，可分为核糖核酸核蛋白和脱氧核糖核酸核蛋白，可从细胞核中提取得到，能溶解于1mol/L NaCl溶液中。对提取核蛋白的要求是：合理的效率、速度、收率和纯度，同时保留该提取纯化蛋白的生物活性和化学完整性。
核蛋白主要从细胞和组织中提取，其中从细胞蛋白中提取的具体步骤为：
取一定量的细胞，在4℃，500×g条件下离心2～3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。每20μl细胞压积中加入200μl冷的Buffer A，2μl蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒，置冰上10分钟。再次高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，离心，快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。在沉淀中加入200μL冷的Buffer B，2μL蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒。置冰上40分钟，每隔10分钟高速涡旋振荡15秒；在4℃，16000×g条件下离心10分钟，快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。从组织中提取核蛋白的步骤和从细胞中提取核蛋白的方法雷同，其区别在于组织需经匀浆处理，具体为： 取适量组织样本剪碎，加冷PBS，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。在4℃，500×g条件下离心2～3分钟，弃上清。但是，上述方法将大量的核蛋白随DNA一起沉淀而被丢弃，进而不能满足诸如酵母双杂交、免疫共沉淀和蛋白质芯片技术，尤其新近被广泛推广的串联亲和纯化技术等，其研究核蛋白相互作用过程中对总蛋白制备的要求更高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种核蛋白的提取方法，该方法在细胞裂解液处理的基础上，联合使用超声裂解的方法，避免大量的核蛋白随DNA一起沉淀而被丢弃，含量和活性最大化的获得总蛋白提取物及核蛋白。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
核蛋白的提取方法，具体包括以下步骤：
A 核蛋白粗提液的制备：在洗涤并去上清液的细胞或组织匀浆中加入裂解液，4℃条件下缓慢旋转裂解细胞或组织45~60分钟，得核蛋白粗提液；
B 核蛋白的制备：将步骤A所得核蛋白粗提液冰浴超声， 静置或离心后，取上清液，核蛋白存在于所述上清液中。
进一步，步骤A所述的裂解液由pH值为7.5、浓度为50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，浓度为150mM的氯化钠溶液，体积百分数为5%的甘油，体积百分数为1%的NP-40裂解液，质量百分数为0.5%的脱氧胆酸钠，浓度为50mM的氟化钠溶液，浓度为1mM的原钒酸钠十二水溶液，浓度为1mM的乙二胺四乙酸溶液，浓度为1mM的二硫苏糖醇溶液，浓度为1mM的苯甲基磺酰氟溶液，浓度为5μg/mL的糜蛋白酶抑制素，浓度为5μg/mL的胃酶抑素a和浓度为5μg/mL的亮抑蛋白酶肽和浓度为5μg/mL的抗蛋白酶素组成的混合液；
进一步，步骤A中，在洗涤并去上清液的细胞或组织匀浆中加入所述裂解液，其中每107细胞中加入1mL裂解液，4℃缓慢旋转裂解细胞1小时，得核蛋白粗提液；
进一步，步骤B中，将步骤A所得核蛋白粗提液冰浴超声，40瓦功率条件下每10毫升体积的核蛋白粗提液超声5分钟，100000×g离心1小时，取上清液，核蛋白存在于所述上清液中；
进一步，所述核蛋白为非变性核蛋白。
本发明的有益效果在于：在细胞裂解液处理的基础上，联合使用超声裂解的方法，避免大量的核蛋白随DNA一起沉淀而被丢弃，含量和活性最大化的获得总蛋白提取物及核蛋白，本方法操作简单，适用于大规模提取。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为Western Blotting凝胶图，其中A为对照组提取的核蛋白，B为运用本申请所述方法提取的核蛋白。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
一 裂解液的配制
裂解液为pH值为7.5、浓度为50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，浓度为150mM/L的氯化钠溶液，体积百分数为5%的甘油，体积百分数为1%的NP-40裂解液，质量百分数为0.5%的脱氧胆酸钠，浓度为50mM的氟化钠溶液，浓度为1mM的原钒酸钠十二水溶液，浓度为1mM的乙二胺四乙酸溶液，浓度为1mM的二硫苏糖醇溶液，浓度为1mM的苯甲基磺酰氟溶液和15mL/片 Complete, Mini, EDTA-free组成的混合液，商品名为Complete, Mini, EDTA-free的片剂中每片含有糜蛋白酶抑制素、胃酶抑素a和亮抑蛋白酶肽和抗蛋白酶素各 5μg/mL。
二 核蛋白的制备
取10×106个转染了带SBP-tag标签的靶核蛋白的HepG2细胞株，在4℃，500×g条件下离心2～3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。在洗涤并去上清液的细胞或组织匀浆中加入所述裂解液，其中以每107细胞中加入1mL裂解液的比例加入裂解液，4℃缓慢旋转裂解细胞1小时，得核蛋白粗提液。将步骤A所得核蛋白粗提液冰浴超声10分钟，离心后，取上清液，上清液为核蛋白。
三 提取效果比较
1、收集稳定转染了带SBP-tag标签的靶核蛋白的HepG2细胞株2×107个分成等份两管；《一种高效分析哺乳动物细胞蛋白质相互作用的串联亲和纯化方法》（“An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nature methods. Dec 2006;3(12):1013-1019”一文介绍的方法收集的核蛋白为对照组，和本发明方法分别进行处理，收获非变性总蛋白。
2、Western Blotting检测核蛋白提取量
用等量与SBP-tag结合的珠子分别与非变性总蛋白孵育，4℃结合1小时，取未结合的上清50μL；用靶核蛋白的抗体对总蛋白和未结合部分做Western Blotting检测，其中所有样本上样量及方法相同。图1显示，同一组内，总蛋白均比未结合部分条带要浓，显示两方法都能提取有活性的核蛋白；两组间比较，本发明（图1-B）提取的总蛋白条带明显浓于对照组（图1-A），显示本发明方法能够提取更多的有活性的核蛋白。
运用本方法从组织中提取总蛋白和核蛋白，可以实现同样的提取效果。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (2)
1.核蛋白的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
A 核蛋白粗提液的制备：在洗涤并去上清液的细胞或组织匀浆中按加入裂解液，每107细胞中加入1mL裂解液，4℃条件下缓慢旋转裂解细胞或组织45~60分钟，得核蛋白粗提液；
所述的裂解液由pH值为7.5、浓度为50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，浓度为150mM的氯化钠溶液，体积百分数为5%的甘油，体积百分数为1%的NP-40裂解液，质量百分数为0.5%的脱氧胆酸钠，浓度为50mM的氟化钠溶液，浓度为1mM的原钒酸钠十二水溶液，浓度为1mM的乙二胺四乙酸溶液，浓度为1mM的二硫苏糖醇溶液，浓度为1mM/L的苯甲基磺酰氟溶液，浓度为5μg/mL的糜蛋白酶抑制素，浓度为5μg/mL的胃酶抑素a和浓度为5μg/mL的亮抑蛋白酶肽和浓度为5μg/mL的抗蛋白酶素组成的混合液；
B 核蛋白的制备：将步骤A所得核蛋白粗提液冰浴超声，40瓦功率条件下每10毫升体积的核蛋白粗提液超声5分钟，100000×g离心1小时，取上清液，核蛋白存在于所述上清液中。
2.根据权利要求1所述的核蛋白的提取方法，其特征在于：所述核蛋白为非变性核蛋白。
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