CN102138921B - 邻苯二甲酰亚胺衍生物在制备抗新血管生成的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通式I和II的邻苯二甲酰亚胺衍生物在制备抗新血管生成的药物中的作用。其中各个取代基的定义如说明书中所述。
Description
本申请是申请日为2005年11月8日、申请号为200510120018.6、发明名称为“邻苯二甲酰亚胺衍生物在制备抗新血管生成的药物中的用途”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及邻苯二甲酰亚胺衍生物在制备治疗涉及新血管生成的药物中的用途。
背景技术
血管生成(angiogenensis)是指从已存在的血管床中产生新生血管的过程，在正常情况下，血管生成被严格控制于某些短暂的、特定的生理过程，如：生殖过程、发育过程及伤口愈合过程等。而持续的血管生成是某些病变如肿瘤组织的恶性增长、糖尿病性视网膜病变、关节炎及骨质增生等的特性。
肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原来的部位，转向身体其他部位并形成新的病灶的过程。研究发现，体积在1-2mm的瘤体可通过渗透作用从周围组织中获得营养维持自身的生存，但它的进一步生长则要依赖形成新生血管以获得充分的营养供应，一旦新生血管长进肿瘤组织，肿瘤即加速生长，且易发生浸润和转移。近年来有关血管生成调节方面的研究十分活跃，已发现许多血管生成刺激因子和抑制因子，它们在肿瘤发生、发展整个过程中的生物学意义正逐渐被人们所认识。
现有技术披露，新的血管生成抑制剂不断被发现或合成，其中沙利度胺较引人注目。沙利度胺(thalidomide，Thd)，化学名称为α-酞胺哌啶酮(α-N-phthalimidoglutarimide)，其结构式如下：
沙利度胺是一种合成谷氨酸衍生物，具有镇静、催眠药物作用，曾被推荐用于治疗妇女的妊娠反应，由于其强烈的致畸作用，于60年代被撤出市场，但已酿成近代药物史上最严重的药害事件。沙利度胺近年来被发现是有效的免疫调节剂和抗炎症药物，可望应用于AIDS及某些癌症及多种自身免疫性疾病。这一偶然的重新发现起源于20世纪60年代早期以色列皮肤病学家Jacobsheski的工作，他将沙利度胺用于麻风结节性红斑(ENL)获得良好疗效。70年代早期，通过双盲临床研究进一步肯定其疗效，使之得以应用至今。此外，10余年来还被作为免疫抑制剂应用于骨髓及肾移植患者，它对慢性移植物抗宿主疾病的疗效已被确立。临床研究表明，沙利度胺具有强大的抗肿瘤作用，可对抗多种实体瘤，对骨髓瘤有效率达50％。
现有技术披露，沙利度胺可抑制bFGF诱导的角膜新生血管生成，并且能显著下调灵长目动物胚胎四肢芽细胞上的一些黏附受体分子，使一些黏附受体消失或低密度表达。另一些研究显示，沙利度胺可抑制单核细胞或巨噬细胞产生的TNF-G诱导新生血管生成。
现有技术进一步披露，沙利度胺可有效抑制碱性成纤维细胞因子(bFGF)介导的兔角膜血管生成。沙利度胺可抑制内皮细胞增殖，其抑制作用与核因子SP1活性的下调剂内皮细胞核提取物中NF-KB的抑制强度相关。沙利度胺对血管生成抑制有明显的种属特异性，并需要经肝细胞粒体活化。
但是现有技术披露沙利度胺及其衍生物的缺点是水溶性差，并且作为药用毒性较大。在现有文献中，迄今尚未公开含有本发明所述邻苯二甲酰亚胺水溶性衍生物的组合物及本发明所述邻苯二甲酰亚胺水溶性衍生物用于预防和治疗新血管生成的用途。
经文献检索，与本发明相关的文献报道如下：
[1]Harris AL.Antiangiogenesis for cancer therapy.The Lancet，1997，349(Suppl II)：13-15.
[2]Brooks PC，Clark RAF.Cheresh DA.Requirement of vascular integrinα，β，for Antiangiogenesis.Science，1994，264：569-571.
[3]钟裕国，邓勇，刘绍华，杨大成。非肽类新生血管生成抑制剂.CN1349983A。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抑制血管内皮细胞增殖和抗新血管生成活性的化合物以及所述化合物用于***、骨质疏松、糖尿病性视网膜病变、动脉粥样硬化等与新血管生成过度有关的疾病的用途。
为了完成本发明之目的，本发明采取如下技术方案：
本发明涉及通式I所示的邻苯二甲酰亚胺衍生物在制备治疗与新血管生成有关的疾病的药物中的用途：
式中
n为1至6的整数；R1选自氢、卤素、直链或支链烷基、硝基、腈基等；R2选自直链或支链烷基、芳基、芳基烷基或杂环基等(优选所述芳基烷基或杂环基含有5-12个碳原子，所述烷基含有1-12个碳原子)。优选所述通式(I)中n为2或3；R2选自含2至12个碳原子的烷基。进一步优选的是R1为氢原子。更优选所述的化合物(I)中n为2或3；R1为氢原子；R2选自甲基、乙基、丙基、丁基、吗啉基、哌啶基和吡咯烷基。
本发明还涉及通式II所示的邻苯二甲酰亚胺衍生物在制备治疗与新血管生成有关的疾病的药物中的用途：
式中
n为1至6的整数；R1选自氢、卤素、直链或支链烷基、硝基、腈基等；R2选自直链或支链烷基、芳基、芳基烷基或杂环基等(优选所述芳基烷基或杂环基含有5-12个碳原子，所述烷基含有1-12个碳原子)。优选所述通式(I I)中n为2或3；R2选自含2至12个碳原子的烷基。进一步优选的是R1为氢原子。更优选所述的化合物(II)中n为2或3；R1为氢原子；R2选自甲基、乙基、丙基、丁基、吗啉基、哌啶基和吡咯烷基。
本发明所述化合物的可药用盐选自可作为药用的各种有机和无机羧酸盐，包括盐酸、氢溴酸、磷酸、亚磷酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、马来酸、富马酸、酒石酸、以及各种天然或非天然氨基酸的盐等。
本发明所述的化合物及其可药用盐可用于制备具有抑制血管内皮细胞增殖和抗新血管生成作用的药物组合物。特别是可用于制备***、骨质疏松、糖尿病性视网膜病变、动脉粥样硬化等与新血管生成过度有关的疾病。
为了制备发明通式I中所示的化合物，本发明包括，将邻苯二甲酰亚胺与合适烷胺基卤代烃在适当的溶剂中和碱作用下，于室温至回流温度下，进行胺化反应。
通式I的邻苯二甲酰亚胺衍生物的合成：
[1]邻苯二甲酰亚胺；[2]丙酮，室温至回流；[3]无水碳酸钾；[4]仲胺，苯；
[5]氯化氢***溶液
通式I所代表的化合物可按本领域已知或惯用的合成类似化合物的方法制备，例如参见(1)《全国原料药生产工艺汇编》，1980：205-210；(2)Frederick Leonard and Leon Simer.Antispamodics.II.Studies on the synthesis of 2-diethylaminoethyl-(2-cycloalken-1-yl)-2-thienylacetates.Journal of the American Chemical Society，1952，74：3218-3223。将仲胺溶于干燥的苯中，缓慢滴入含有N-(溴代烷基)-邻苯二甲酰亚胺的干燥苯中，滴完后搅拌回流至反应结束。反应液中加入水，振荡分层后，分离苯层，加入10％盐酸，分离水层并用苯萃取。水层用1N氢氧化钠溶液中和至pH为9-13(优选pH为11)，***萃取，合并***液，依次用饱和氯化钠溶液和水洗涤至中性，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液中加入盐酸***溶液，立即有大量白色沉淀生成，重结晶得白色晶体。
通式II的邻苯二甲酰亚胺衍生物的合成
[6]***或苯，常温；[7]沙利度胺；[8]二氧六环，回流；[9]氯化氢***溶液
通式II所代表的化合物可按本领域已知或惯用的合成类似化合物的方法制备，例如参见(1)杨若林，李娜.葛根素衍生物的制备及活性，中国药科大学学报，1999，30：81-85；(2)Frederick Leonard and Leon Simer.Antispamodics.III.Basic alkyl ester acid addition and quaternary ammonium salts of α-(2-cycloalken-1-yl)-2-thienyacetic acids.Journal of the American Chemical Society，1955，77：2855-2918。采用无水碳酸钾作为缚酸剂，卤代脂肪胺与沙利度胺(7)反应的方法合成通式II化合物。当仲胺不同时，反应的溶剂也相应不同，二甲胺、二乙胺可用低沸点试剂如***；而二丙胺、二丁胺等可以用苯等试剂使反应更完全。
本发明所涉及的化合物在常温条件下在水中的溶解度优于沙利度胺。
药理学研究表明，通式I和通式II所代表的化合物，对ECV304细胞的增殖具有抑制作用，提示该类化合物能抑制新血管生成。
本发明化合物可用口服方法或非肠胃道通用药。口服药可以是片剂、胶囊剂、包衣剂、非经肠用药剂型有注射剂和栓剂等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟知的方法制备的。为了制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规的助剂，例如淀粉，明胶，***胶，硅石，聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂例如水，乙醇，丙二醇，植物油类如玉米油，花生油，橄榄油等。含有本发明化合物的制剂中还可以有其它助剂，例如表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂，色素等。另一方面，本发明化合物的水溶性优于沙利度胺，因此易于制成全身给药制剂用于肿瘤的防治。
在片剂、胶囊剂、包衣剂、注射剂和栓剂中含有本发明式通式I和通式II化合物的剂量是以单元剂型中存在的化合物计算的。
附图说明
图1表示邻苯二甲酰亚胺衍生物对鸡胚绒毛***血管生成的抑制作用；A：生理盐水；B：化合物TD-1；C：化合物TD-2；D：化合物TD-3；E：化合物TD-5；F：化合物TD-7；G：化合物TD-13。
图2表示邻苯二甲酰亚胺衍生物对鸡胚绒毛***血管分支点数的影响；A：化合物TD-1；B：化合物TD-2；C：化合物TD-3；D：化合物TD-5；E：化合物TD-13；F：化合物TD-7。与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
图3表示化合物TD-2对昆明小鼠移植性肿瘤S180肉瘤的作用。与生理盐水组比较，*P＜0.05，***P＜0.001
具体实施方案
以下将结合实施例对本发明进一步说明，但并不限制本发明的范围。
实施例1：通式I的邻苯二甲酰亚胺衍生物(TD-1至TD-18)的制备
将仲胺(0.05mol)溶于10ml干燥的苯中，缓慢滴入含有N-(溴代烷基)-邻苯二甲酰亚胺(0.01mol)的干燥的苯中。滴完后搅拌回流24h。反应液中加入水50ml，振荡分层后，分离苯层，加入10％盐酸，分离水层并用苯萃取(20ml×3)。水层用1N氢氧化钠溶液中和至pH为11，***提取，合并***液，依次用饱和氯化钠溶液和水，洗涤至中性，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液中加入盐酸***溶液，立即有大量白色沉淀生成，过滤，白色沉淀重结晶(乙醇∶***)，得白色晶体。衍生物的结构和代号为：N-(2-二甲胺基-乙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-1)；N-(2-二乙胺基-乙基)-邻苯二酰亚胺盐酸盐(TD-2)；N-(2-二正丙胺基-乙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-3)；N-(2-二正丁胺基-乙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-4)；N-(2-吗啉基-乙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-5)；N-(2-哌啶基-乙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-6)；N-(2-吡咯烷基-乙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-7)；N-(3-二甲胺基-丙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-8)；N-(3-二乙胺基-丙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-9)；N-(3-正丙胺基-丙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-10)；N-(3-二正丁胺基-丙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-11)；N-(3-吗啉基-丙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-12)；N-(3-哌啶基-丙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-13)；N-(4-乙基-丁基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-14)；N-(3-二正丙胺基-丁基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-15)；N-(3-二正丁胺基-丁基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-16)；N-(3-吗啉基-乙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-17)；N-(3-哌啶基-乙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-18)。所得化合物的性状和熔点见下表：
| 化合物代号 | 性状 | 熔点(℃) |
| TD-1 | 白色针状晶体 | 215-217 |
| TD-2 | 白色针状晶体 | 237-239 |
| TD-3 | 白色片状晶体 | 246-248 |
| TD-4 | 白色粒状晶体 | 246-248 |
| TD-5 | 白色针状晶体 | 252-253 |
| TD-6 | 白色针状晶体 | 158-160 |
| TD-7 | 白色针状晶体 | 198-200 |
| TD-8 | 白色针状晶体 | 215-217 |
| TD-9 | 白色片状晶体 | 240-242 |
| TD-10 | 白色片状晶体 | 222-224 |
| TD-11 | 白色针状晶体 | 243-246 |
| TD-12 | 白色针状晶体 | 244-246 |
| TD-13 | 白色粒状晶体 | 242-244 |
| TD-14 | 白色片状晶体 | 190-191 |
| TD-15 | 白色针状晶体 | 183-186 |
| TD-16 | 白色针状晶体 | 219-220 |
| TD-17 | 白色针状晶体 | 215-216 |
| TD-18 | 白色片状晶体 | 220-222 |
实施例2：(±)-N-(2-二甲胺基-乙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮盐酸盐(TD-19)的制备。
取1-氯-2-二甲氨基-乙烷盐酸盐2g加入5ml水溶解，冰浴，加10％氢氧化钠溶液，调PH值为11，***萃取(10ml×3)，合并萃取液，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，***液减压低温(20-25℃)除去，在此过程中，有少量固体出现，为1-氯-2-二甲氨基-乙烷自身反应产物，滤出固体，加入二氧六环20ml，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，无水碳酸钾 0.27g搅拌回流2h，过滤，滤液中加入水20ml，振荡分层后，分离二氧六环层，加入10％盐酸20ml，分离水层并用***萃取(20ml×3)。水层用1N氢氧化钠溶液中和至pH为11，***萃取(20ml×3)，合并***液，依次用饱和氯化钠溶液和水洗涤至中性，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液中加入盐酸***溶液，立即有大量白色沉淀生成，过滤，白色沉淀重结晶(乙醇∶***)，得白色雪花状晶体0.15g。产率41.09％，mp188-190℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.75-7.90(dq，4H，Ph)，5.00(m，1H，H-3)，4.05(m，2H，H-5)，2.85(m，2H，H-4)，2.5(j，2H，-CH2CH2-)，2.25(s，6H，-CH3)，2.20(j，2H，-CH2CH2-)。
实施例3：(±)-N-(2-二乙胺基-乙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮盐酸盐(TD-20)的制备。
取1-氯-2-二乙氨基-乙烷盐酸盐3g加入5ml水溶解，溶液为淡***，冰浴，加10％氢氧化钠溶液，调PH值为11，***萃取(10ml×3)，合并萃取液，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，滤液为淡黄色，***液减压低温(20-25℃)除去，在此过程中，有少量白色固体出现，为1-氯-2-二乙氨基-乙烷自身反应产物，滤出固体，加入二氧六环20ml，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，无水碳酸钾0.27g搅拌回流2h。纯化方法同TD-19。大量白色沉淀生成，过滤，白色沉淀重结晶(乙醇∶***)，得白色颗粒状晶体0.08g。产率21.02％，mp192-195℃。1HNMR(CDCl3，ppm)9.65(s，1H，HCl)，7.65-7.82(dq，4H，Ph)，4.80(m，1H，H-3)，3.65-3.75(m，2H，H-5)，3.00-3.25(m，6H，CH2N(CH2)2)，2.65(j，2H，H-4)，2.40(j，2H，CH 2 CH2-)，1.30(j，2H，-CH2-)。
实施例4：(±)-N-(3-二甲胺基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮盐酸盐(TD-21)的制备。
取(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)- 二酮(沙利度胺)0.13g，1-氯-3-二甲胺基丙烷盐酸盐0.11g，加入甲苯50ml，搅拌回流7h。减压除去甲苯，残余物***提取(20ml×3)，合并提取液，外置水浴，滴加氯化氢***溶液，有白色固体析出，重结晶(乙醇∶***)，得颗粒状晶体0.13g。产率68.5％，mp165-167℃。 1HNMR(CDCl3，ppm)7.75-7.90(dq，4H，Ph)，4.85(m，1H，H-3)，3.25-3.35(m，2H，H-5)，2.95-3.10(m，2H，H-4)，2.65-2.74(m，8H，-CH2N(CH2) 2)，2.45(j，2H，CH 2 CH2CH2-)，1.90(m，2H，CH2 CH 2 CH2-)。
实施例5：(±)-N-(2-二乙胺基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮盐酸盐(TD-22)的制备。
取1-氯-3-二乙氨基-丙烷盐酸盐2g加入5ml水溶解，冰浴，加10％氢氧化钠溶液，调PH值为11，***萃取(10ml×3)，合并萃取液，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，***液减压低温(20-25℃)除去，在此过程中，有少量固体出现，为1-氯-2-二乙氨基-丙烷自身反应产物，滤出固体，加入二氧六环20ml，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，无水碳酸钾0.27g搅拌回流2h。纯化方法同TD-19。得针状结晶0.11g。产率26.9％，mp198-200℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.75-7.85(dq，4H，Ph)，5.00(m，1H，H-3)，4.03(m，2H，H-5)，3.82(j，2H，H-4)，2.85(j，2H，CH2CH2 CH 2 -)，2.65(m，4H，N(CH2)2)，1.70(m，2H，4H，CH2 CH 2 CH2-)，1.00(j，5H，-CH3)。
实施例6：(±)-N-(3-二正丙胺基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮盐酸盐(TD-23)的制备。
取1-氯-3-二正丙氨基-丙烷0.71g，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，无水碳酸钾0.27g，二氧六环20ml，搅拌回流2h。纯化方法同TD-19。得雪花状结晶0.20g。产率36.8％，mp203-205℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.75-7.85(dq， 4H，Ph)，5.00(m，1H，H-3)，3.85(m，2H，H-5)，2.75(m，2H，H-4)，2.55-2.65(m，6H，-CH2N(CH2)2)，1.50-1.70(m，4H，CH2CH2CH2-)，0.90(j，6H，-CH3)。
实施例7：(±)-N-(3-吗啉基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮盐酸盐(TD-24)的制备。
取1-氯-3-吗啉基-丙烷0.50g，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，无水碳酸钾0.27g，二氧六环20ml，搅拌回流2h。纯化方法同TD-19。得颗粒状结晶0.14g。产率34.2％，mp215-216℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.75-7.85(dq，4H，Ph)，5.00(m，1H，H-3)，3.92(m，2H，H-5)，3.90(j，2H，H-5)，3.75(j，4H，O(CH2)2)，2.85(m，2H，H-4)，2.43-2.62(m，6H，CH2N(CH2) 2)，2.20(j，2H，CH 2 CH2CH2-)，1.85(m，2H，CH2 CH 2 CH2-)。
实施例8：(±)-N-(3-哌啶基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮盐酸盐(TD-25)的制备。
取1-氯-3-哌啶基-丙烷0.49g，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，无水碳酸钾0.27g，二氧六环20ml，搅拌回流2h。纯化方法同TD-19。得颗粒状结晶0.17g。产率40.4％，mp222-224℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.75-7.90(dq，4H，Ph)，5.00(m，1H，H-3)，3.90(m，2H，H-5)，2.75(m，2H，H-4)，2.23-2.34(m，6H，CH2N(CH2)2)，1.80(j，2H，CH 2 CH2CH2-)，1.40(m，2H，CH2 CH 2 CH2-)。
实施例9：(±)-N-(3-(4-乙基哌嗪基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮盐酸盐(TD-26)的制备。
取1-氯-3-(4-乙基哌嗪基)-丙烷1.00g，(±)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(沙利度胺)0.26g，无水碳酸钾0.27g，二氧六环20ml，搅拌回流2h。纯化方法同TD-19。得 颗粒状结晶0.11g。产率24.5％，mp235-238℃。1HNMR(CDCl3，ppm)7.78-7.90(dq，4H，Ph)，5.00(m，1H，H-3)，3.85(m，2H，H-5)，2.85(m，2H，H-4)，2.50(m，12H，-CH2N(CH2)2，-(CH2)2NCH2-)，1.75(j，2H，H-4)，1.40(m，2H，CH2CH2CH2-)，1.12(j，3H，CH 3)。
下面的生物活性实验用来进一步说明本发明
生物活性实验实施例1：
抗血管活性评价试验
根据本发明，一组优选的通式I化合物是通式III，一组优选的通式II化合物是通式IV。
根据药理实验结果的统计学分析，表1中的化合物TD-3、TD-4、TD-5、TD-6、TD-8、TD-13、TD-14、TD-17、TD-18能够显著抑制ECV 304细胞生长，其中特别优选的是N-(2-哌啶基-乙基)-邻苯二甲酰亚胺盐酸盐(TD-6)。表2中的化合物TD-19，TD-21，TD-22，TD-23，TD-25对ECV304细胞生长也有抑制作用。
表1邻苯二甲酰亚胺衍生物(通式III)对ECV304细胞增殖的抑制作用结果(N＝7，X±SD)
*P＜0.05，**P＜0.01vs对照组
表2通式IV的邻苯二甲酰亚胺衍生物对ECV304细胞增殖的抑制作用结果(N＝7，X±SD)
*P＜0.05，**P＜0.01vs对照组
经过上述试验结果，本领域技术人员可得知，本发明的化合物对哺乳动物具有抑制血管内皮细胞增殖和抗新血管生成的活性。本发明在制备哺乳动物包括人抗新血管生成药物的应用上具有良好的前景和潜在的价值。
生物活性实验实施例1的研究方法：内皮细胞增殖是血管生成的关键步骤，因而能抑制血管内皮细胞增殖的化合物就有可能抑制血管生成。因此我们采用体外脐静脉血管细胞株(ECV304细胞)培养的方法，观察合成的化合物对ECV304细胞增殖的抑制作用来进行初步筛选具有抑制新生血管生成的活性化合物，抑制细胞增殖的检测方法采用四氮唑盐还原法(MTT法)，筛选结果用血管内皮细胞增殖百分抑制率作为衡量目标化合物活性的指标。材料：ECV304细胞；MTT，瑞典AMERSHAM公司产品；方法：(1)ECV304细胞的复苏、传代与培养：a从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中；b轻轻摇晃冻存管，使其尽快解冻；用75％乙醇擦拭外壁，进行无菌操作；用吸管吸出细胞悬液，加入10ml离心管中，再加入8ml培养液(RMP+10％小 牛血清和60μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，吹打使细胞悬浮；1000g离心5min；f弃上清，加入10ml培养液吹打；g 1000g离心5min，弃上清；加入5ml适量培养液，转移至培养瓶中；在37℃，5％C02培养箱内培养；倒去培养瓶中的培养液，PBS洗涤并弃去PBS；加入0.25％胰酶和0.02％EDTA消化液消化；半分钟后，加入培养液终止反应，吹打，将细胞悬浮液转移至离心管中；1000g离心5min，弃上清；加入培养液吹打，将细胞悬浮液转移至培养瓶中；在37℃，5％C02培养箱内培养。
(2)MTT法检测：根据各化合物分子量，用无血清培养液配成10-2M浓度，再取10-2M各化合物10μl+99μl无血清培养液制成10-4M；104ml ECV304细胞，接种于96孔板中，90μl/孔在在37℃，5％C02培养箱内培养24小时；实验分生理盐水对照组、沙利度胺阳性对照组和各待试化合物。在ECV304细胞培养到对数生长期后，加入10-4M的各化合物10μl/孔，药物的终浓度为10-5M，在37℃，5％C02培养箱内培养24小时；每孔加入MTT25μl，孵育4小时；弃上清，加入DMSO100μl，轻振10min，570nm测A值。
生物活性实验实施例2：
本发明的化合物对鸡胚绒毛***血管生成的影响
如表3所示，在实验开始时，每个待测化合物的受精鸡卵数为10个，到第11天取膜时各组存活的鸡胚均在6枚以上。本发明的典型化合物TD-1，TD-2，TD-3，TD-4，TD-5，TD-7，TD-9，TD-10，TD-12和TD-13对鸡胚绒毛***的血管生成有显著抑制作用。
表3通式III的邻苯二甲酰亚胺衍生物对鸡胚绒毛***血管生成的抑制作用(x±s，n＝6-10)
与生理盐水组相比，*P＜0.05，*P＜0.05。
将上述实验筛选出来的10种化合物按不同浓度分组，每组10枚鸡卵，至第11天时存活的鸡胚在7枚以上，在此10个化合物中，发现化合物TD-1，TD-2，TD-3，TD-5，TD-7和TD-13等6个化合物在 1-1000mmol.L-1浓度范围内，对CAM的血管生成均有抑制作用(见图1和图2)。
以上生物活性实验实施例2提示：通过对邻苯二甲酰亚胺衍生物的研究，优选的化合物TD-1，TD-2，TD-3，TD-5，TD-7和TD-13对鸡胚绒毛***的新血管生成有明显的抑制作用。
生物活性实验实施例2的研究方法：受精鸡卵，每蛋重51-65克。第一批实验，取各化合物浓度均为1000mmol/L，将鸡卵随机分成18组，每组10枚鸡卵，同时用沙利度胺、生理盐水作为阳性及阴性对照，因沙利度胺是用二甲基亚砜溶解，故将二甲基亚砜同时作溶剂对照。通过初筛后选择有抑制作用的化合物，各按1mmol/L、10mmol/L、100mmol/L、1000mmol/L浓度分成4组，每组10枚鸡卵，同时做阳性及阴性对照及溶剂对照，进行第二批实验。新鲜受精鸡卵以1‰新洁尔灭清洗后放入37℃，60％相对湿度的孵箱内孵育，每天翻蛋2次。孵育至第7天在照蛋器指示下距胚头右下方1.5cm处做标记，用碘酒、酒精消毒后，以标记处为中心开出一个1×1cm的小窗，滴加2滴生理盐水使鸡胚绒毛***下塌，与卵壳膜分离，去除卵壳膜，暴露鸡胚绒毛***，制成假气室，用无菌贴膜封口，窗口朝上继续孵育，不再翻蛋。开窗后第2天揭开贴膜，将事先准备好的明胶海绵载体放于两条前卵黄静脉间的相对无血管的鸡胚绒毛***上，用微量移液器向载体上加入待测的不同浓度的样品，每次20μl，每天一次，共3天，每次加完药后继续孵育。继续孵育至第11天，揭去贴膜，向假气室内加入等量甲醇、丙酮配成的固定液，固定15分钟，剪下鸡胚绒毛***，平铺于滤纸上，摄片。以载体为中心，计数载体周围0.5cm范围内的血管分支点数。
实验方法详见参考文献：付生法等。检测血管生长因子作用的鸡胚绒毛***技术。军事医学科学院院刊，1993；17(4)：294-297。
生物活性实验实施例3：
本发明式I代表性化合物TD-2对昆明小鼠移植性肿瘤S180肉瘤的影响
如表4和图3所示，化合物TD-2在50，100和200mg/kg均可显著抑制S180肉瘤生长，其瘤重均显著小于对照组，P均小于0.05，其抑瘤率分别为26.5％，30.1％和28.9％。相同实验条件下，沙利度胺100mg/kg组抑瘤率为31.9％，与TD-2抑瘤作用近似。阳性对照药环磷酰胺30mg/kg对昆明小鼠S 180肉瘤生长具有显著抑制作用，其瘤重显著低于对照组瘤重(P＜0.01)，抑瘤率为68.1％。
表4化合物TD-2对昆明小鼠移植性肿瘤S 180肉瘤的作用
以上生物活性实验实施例3提示：化合物TD-2 50，100和200mg/kg均可显著抑制昆明小鼠移植性肿瘤S180肉瘤的生长。
生物活性实验实施例3的研究方法：昆明小鼠，雌雄各半，体重17-22g，随机分为7组：生理盐水组，溶剂对照组(甲基纤维素)，阳性对照组(环磷酰胺30mg/kg)，TD-2 50mg/kg，100mg/kg和200mg/kg 组以及沙利度胺100mg/kg组。
药物配制方法：用生理盐水溶解TD-2到所需浓度，过筛除菌。沙利度胺微溶于水，其溶解度在1‰-1％之间，不能满足试验对溶解度的要求，故选用甲基纤维素M450作溶剂，将Tha过80目筛，用生理盐水配制1％甲基纤维素M450混悬剂，然后按给药剂量，将沙利度胺悬浮于其中，临用现配。给药容积为0.2ml/10g体重，使用前摇匀。
无菌条件下抽取体内传代的小鼠S180肉瘤腹水，用无菌生理盐水按V∶V＝1∶3稀释，制成细胞悬液，以每只0.2ml体积接种于昆明小鼠右腋皮下，24h后分组给药。TD-2设50，100，200mg/kg三个剂量组，采用po途径给药，每天1次，连续给药7天，给药容积0.2ml/10g。选用环磷酰胺作为阳性对照药，剂量30mg/kg，采用皮下注射给药，1次/日，连给3天，给药容积0.1ml/10g。沙利度胺组：100mg/kg，采取po途径给药，连续给药7天，给药容积0.2ml/10g。溶剂对照为等体积1％甲基纤维素M450，采用po途径给药，每天1次，连续7天。生理盐水组：采用po途径给药，每天1次，连续7天。
给药7天后，于停药次日处死小鼠，称重后剥取皮下瘤块称瘤重，计算各组平均瘤重，并计算抑瘤率。
Claims (4)
1.一种选自下列的化合物或其药学上可接受的盐在制备具有抑制血管内皮细胞增殖和抗新血管生成作用的药物中的用途：
(±)-N-(2-二甲胺基-乙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮
(±)-N-(3-二甲胺基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
(±)-N-(2-二乙胺基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；
(±)-N-(3-二正丙胺基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮；以及
(±)-N-(3-哌啶基-丙基)-2-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮。
2.权利要求1所述的用途，其中所述化合物或其药学上可接受的盐用于制备具有抗新血管生成作用的药物。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的化合物或其可药用盐用于制备治疗与新血管生成过度有关的肿瘤、骨质疏松、糖尿病性视网膜病变或动脉粥样硬化的药物。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述的化合物或其可药用盐用于制备***的药物。
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| Sonja Hess etc..《Synthesis and Immunological Activity of Water-Soluble Thalidomide Prodrugs》.《Bioorganic & Medicinal Chemistry》.2001,第9卷(第5期),1279页摘要及1280页左栏第24-30行. * |
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