CN1312180C - 牙鲆淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是由两株杂交瘤细胞分别分泌的淋巴囊肿病毒的中和单克隆抗体A和B，该两株杂交瘤培养细胞的名称分别为：小鼠杂交瘤细胞株LCDV-E1和小鼠杂交瘤细胞株LCDV-E2，该两杂交瘤细胞的保藏号分别为：CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，该中和单抗A和B具有与淋巴囊肿病毒上的粘附蛋白结合，从而封闭该粘附蛋白，阻断该病毒的粘附蛋白与该病毒敏感细胞——牙鲆鳃细胞的细胞膜上的该病毒受体结合，阻止该病毒入侵细胞的功能；该单抗制备是以提纯淋巴囊肿病毒为抗原，经免疫学方法，建立抗淋巴囊肿病毒的单克隆抗体库，再应用中和实验测定方法筛选出中和单抗A和B。该两中和单抗对淋巴囊肿病毒病的诊断与治疗具有非常重要的应用价值。

Description

牙鲆淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗体应用技术的改进，具体讲是一种牙鲆淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体及其制备方法。该中和单克隆抗体是由杂交瘤细胞分泌的牙鲆(Paralichthys olivaceus)淋巴囊肿病毒(Lymphocystis virus)中和单克隆抗体，其属于免疫学和病毒学交叉技术领域。

背景技术

在危害鱼类生存生长的生物因素中，病毒是危害最大、也是最难防范的病原。由于病毒是一类寄生于宿主细胞内的非细胞型超微微生物群体，所以至今也未研究出既能杀伤病毒又不损伤宿主细胞的有效药物。另外，由于病毒的隐性感染和鱼类特殊的水生环境，使病毒的感染难以觉察，常常一旦发现症状，即到了无法挽救的地步。牙鲆淋巴囊肿病是我国首次大规模爆发的海水鱼类病毒病。患病鱼的表皮、鳍和尾部等处出现许多囊肿。20世纪90年代以来，这种疾病的发生频率逐渐增加，每年养殖鱼类都会因此病大量死亡，造成的直接和间接经济损失达百亿元之巨。具有中和活性的单克隆抗体对病毒病的针对性治疗具有潜在的实用价值。中和单克隆抗体所针对的抗原表位可以诱导保护性作用，该抗原表位合成肽疫苗可以有效地预防病毒感染。这在畜禽类动物中，已有先例，如商品化治疗鸡传染性法氏囊病毒的药物“灭囊灵”，即是由中和单克隆抗体制成。从牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体库中筛选出该病毒的中和单克隆抗体，对研制淋巴囊肿病毒疫苗，进而预防及治疗该病毒病有着极为重要理论和现实意义。

发明内容

本发明的目的是填补有关鱼类淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体研究的空白，提供一种由两株杂交瘤细胞分别分泌的牙鲆淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体。从而达到预防和控制牙鲆淋巴囊肿病毒病的目的。

本发明的任务是由以下技术方案实现的，研制了一种由两株杂交瘤细胞分别分泌的淋巴囊肿病毒的中和单克隆抗体，所述的分泌淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体的该两杂交瘤培养细胞的名称分别为：小鼠杂交瘤细胞株LCDV-E1和小鼠杂交瘤细胞株LCDV-E2，该两杂交瘤细胞的保藏号分别为：CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，其保藏日期：2004年12月14日；其分泌的特异性淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体(简称：中和单抗A和中和单抗B)具有与淋巴囊肿病毒上的粘附蛋白结合，从而封闭该粘附蛋自，阻断该病毒的粘附蛋白与该病毒敏感细胞——牙鲆鳃细胞的细胞膜上的该病毒受体结合，阻止该病毒入侵细胞的功能；在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞***旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限***增生能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体；在细胞中和实验中，该中和单抗A和中和单抗B中和效果明显，具有保护牙鲆鳃细胞不受淋巴囊肿病毒侵染的特性。

本发明的淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体的制备方法，其制备技术路线是：从以牙鲆淋巴囊肿病毒为抗原开始，采用免疫学方法建立抗淋巴囊肿病毒的单克隆抗体库：选择中和实验测定方法，从该单克隆抗体库中检测筛选出淋巴囊肿病毒的中和单抗A和中和单抗B。

所述的中和实验测定方法是：对牙鲆淋巴囊肿病毒敏感的牙鲆鳃细胞系为材料的中和实验，采用稀释病毒法，即首先，不同稀释度的淋巴囊肿病毒分别与该病毒单抗库中的单抗等体积孵育；其次再将病毒——抗体混合物接种于牙鲆鳃细胞，待已接种的牙鲆鳃细胞充分出现感染效应，即参照对照培养的牙鲆鳃细胞在感染后的病变和死亡情况，依据单克隆抗体能否阻止细胞病变的发生，确定具有中和活性的单克隆抗体。

所述的中和实验测定方法的具体步骤是：

(1)细胞准备：将生长旺盛的牙鲆鳃细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔3～5×10⁴个，15～25℃，2％ CO₂培养；

(2)病毒准备：将病毒悬液用孔径为0.45μm的滤膜过滤，MEM培养液2倍或10倍连续稀释，设立七个连续梯度；

(3)对照准备：设置3组对照：病毒对照，单克隆抗体毒性对照；牙鲆鳃细胞空白对照；

(4)病毒与抗体孵育：将抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体分别与不同梯度淋巴囊肿病毒液等体积混合，25～37℃孵育1h～2h；

(5)接种：在状态良好的牙鲆鳃细胞上接种孵育完毕的病毒与单抗的混合液、每个病毒梯度接种8～10个孔，每孔接种量25～200μl，25～37℃吸附1h～2h，而后15～25℃，2％ CO₂培养；

(6)结果判定：判定的必要条件为病毒对照组出现由淋巴囊肿病毒引起的典型细胞病变现象即牙鲆鳃细胞聚缩、变圆，空泡化严重，细胞颗粒增多，后期病变细胞脱壁形成空斑，出现细胞病变效应，而单克隆抗体毒性对照组、牙鲆鳃细胞空白对照组细胞饱满呈梭形，铺满培养孔底部，细胞间无空隙，细胞状态良好；依据单克隆抗体能否阻止细胞病变的发生从抗牙鲆淋巴囊肿病毒单抗库中筛选出中和单克隆抗体A和中和单克隆抗体B。

本发明的优点在于：本发明利用对牙鲆淋巴囊肿病毒敏感的牙鲆鳃细胞系为材料的中和实验证明单克隆抗体对病毒感染具有明显的中和作用。细胞中和实验是免疫学和病毒学中常用的一种抗原抗体反应实验方法，其用以测定抗体中和病毒感染性的生物学效应。细胞中和实验具有高度的敏感性和免疫特异性，且结果稳定一致，不存在个体差异问题，是一种非常可靠、可重复性好的实验方法。本发明获得的具有中和活性的淋巴囊肿病毒单抗A、单抗B，可进一步应用到淋巴囊肿病毒病的深入研究中，为鉴定淋巴囊肿病毒的保护性抗原，区分不同地域、不同宿主的淋巴囊肿病毒，对淋巴囊肿病毒特异性抗原决定簇变异的分析，制备抗独特型抗体、利用中和抗体抗原表位合成肽进行诊断研究，以及疫苗有效成分的研究、提取纯化等提供了最有效的工具，同时，对淋巴囊肿病毒基因工程疫苗、合成肽疫苗、亚单位疫苗的研制、病毒诊断试剂生产等奠定了理论和实践基础。

附图说明

本发明的实施例通过附图说明如下：

图1为本发明的工艺流程方框图；

图2为放大4倍倒置显微镜下观察的牙鲆鳃细胞的活细胞形态；

图3为接种病毒后出现细胞病变的牙鲆鳃细胞形态；

图4为接种病毒与单抗混合液，未出现细胞病变的牙鲆鳃细胞形态。

本发明的具体实施例不仅局限本发明的保护范围。

本发明研制的一种由两株杂交瘤细胞分别分泌的淋巴囊肿病毒的中和单克隆抗体。所述的分泌淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体的该两杂交瘤培养细胞的名称分别为：小鼠杂交瘤细胞株LCDV-E1和小鼠杂交瘤细胞株LCDV-E2，该两杂交瘤细胞的保藏号分别为：CCTCC-C200419和CCICC-C200420，其保藏日期：2004年12月14日；其分泌的特异性淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体(简称：中和单抗A和中和单抗B)具有与淋巴囊肿病毒上的粘附蛋白结合，从而封闭该粘附蛋白，阻断该病毒的粘附蛋白与该病毒敏感细胞——牙鲆鳃细胞的细胞膜上的该病毒受体结合，阻止该病毒入侵细胞的功能；在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞***旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限***增生能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体；在中和实验中，该中和单抗A和中和单抗B中和效果明显，具有保护牙鲆鳃细胞不受淋巴囊肿病毒侵染的特性。

本发明的淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体的制备方法，如本发明的图1所示的技术路线是：从以牙鲆淋巴囊肿病毒为抗原开始，采用免疫学方法建立抗淋巴囊肿病毒的单克隆抗体库；选择中和实验测定方法，从该单克隆抗体库中检测筛选出淋巴囊肿病毒的中和单抗A和中和单抗B。

具体实施方式如下：

一)、研制抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体：

1)病毒提纯：

(1)取患病牙鲆，先用70％酒精棉球消毒患部，再用灭菌手术刀片切下囊肿，加入石英砂和TNE(50mM Tris，100mM NaCl，1mM EDTA，pH7.4)缓冲液，匀浆；

(2)匀浆液离心4℃，500g，20min，取上清；

(3)上清液离心4℃，1800g，，20min，取上清；

(4)上清液和蔗糖配成30％(W/W)的蔗糖溶液，4℃，78500g离心120min，弃上清；

(5)向沉淀中添加TNE至1ml，混匀，将其轻置于蔗糖梯度液(37％、40％、47％、52％、57％、62％)上方，4℃，78500g离心120min；

(6)吸出蔗糖梯度中的病毒带，调整蛋白含量为1mg/ml，-80℃保存备用。

2)免疫：

免疫共分4次进行，每次的免疫剂量为0.1ml。

(1)基础免疫，腹腔注射，提纯的病毒与完全福氏佐剂等量(V/V)混匀作为抗原；

(2)二两周后，加强免疫，腹腔注射，提纯的病毒与不完全福氏佐剂等量(V/V)混匀作为抗原；

(3)三周后，二次加强免疫，尾静脉注射，提纯的病毒作为抗原；

(4)融合前三天的扩增免疫，尾静脉注射，提纯的病毒作为抗原。

3)细胞融合：

(1)脱颈椎处死免疫小鼠，抽血，4℃放置过夜，取血清；无菌取出脾脏和胸腺细胞后，分别过100目网筛，用RPMI-1640吹打形成单细胞悬液；

(2)分别将脾细胞悬液和胸腺细胞悬液200g离心3min，弃去上清液，脾细胞沉淀用RPMI-1640重悬，胸腺细胞沉淀用含有1％HAT的选择性细胞培养液重悬；

(3)取3×10⁷个处于对数生长期的P3-X63-Ag8U1骨髓瘤细胞，200g离心3min，去上清液后，用RPMI-1640重悬；

(4)将脾细胞悬液与瘤细胞悬液混合均匀后，200g离心3min，吸去上清液，轻弹离心管底，使沉淀充分混匀。吸取预温到37℃的PEG液1ml，滴加到离心管内；

(5)补加RPMI-1640液至40ml，经200g离心5min，弃去上清液；

(7)细胞沉淀轻悬于3ml细胞培养液中，冻存2ml；

(8)剩下的细胞悬液中加入(2)制成的胸腺细胞悬液，混合均匀后滴加到96孔培养板中，37℃，4.5％ CO₂培养箱培养，大约两周后，取上清液检测

4)检测：

(1)取新鲜囊肿，切成约3mm见方的小块，生理盐水清洗，吸干水分后，用冷冻包埋剂OCT包埋，-20℃放置30min，冰冻切片，切片厚度5μm。丙酮固定20min，室温干燥，-20℃冻存备用；

(2)分别以免疫小鼠血清和杂交瘤上清为第一抗体，加在切片上；

(3)37℃湿盒中孵育45min；

(4)取出载玻片，用0.01M PBS洗三次，每次5min；

(5)异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠IgG第二抗体，加在切片上；

(6)37℃湿盒中避光孵育45min；

(7)取出载玻片，用0.01M PBS洗三次，每次5min；

(8)甘油封片，荧光显微镜下观察，拍照；

5)克隆：

采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆；

(1)脱颈椎处死小鼠，无菌取出胸腺，在100目网筛上研磨，用RPMI-1640吹打形成单细胞悬液；

(2)把胸腺细胞悬液200g离心3min，弃上清液，沉淀用10ml细胞完全培养液重悬；

(3)血球记数板记数要克隆的阳性细胞，用培养液以10倍梯度稀释，取出100个阳性杂交瘤细胞，放入重悬后的胸腺细胞悬液中；

(4)细胞悬液吹打均匀，滴加到96孔培养板中，每孔100μl；

(5)免疫荧光抗体法检测单克隆细胞孔上清液，阳性孔细胞扩大培养。

6)冻存：

取生长旺盛，形态良好的待冻存细胞，制成细胞悬液，200g离心5min，去上清，加冻存液(含10％DMSO的细胞培养液)，使最终细胞密度为5×10⁶个/ml，将1ml细胞悬液装于2ml冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管装入盛有棉花的小盒内，放于-80℃超低温冰箱内过夜后，再浸入液氮内长期保存。

7)结果：

本发明所得到的长势良好的阳性杂交瘤细胞大小均一，浑圆，透亮，***旺盛，有无限***增生能力；大小均一，浑圆，透亮，***旺盛；间接免疫荧光法检测结果显示细胞质边缘出现散布的块状强阳性信号，阳性信号呈楔状、块状，或数个成链圈状排列，且大多集中在细胞的边缘部分。而正常组织中没有发现荧光。

二)、敏感细胞系—牙鲆鳃细胞系的培养：

1)液体配制：

制备细胞培养液：MEM/EBSS一袋(9.5g)溶于1L灭菌三蒸水中，加入NaHCO₃ 2.2g，氨苄青霉素1×10⁵IU，链霉素1×10⁵μg，调整pH为7.0-7.4。通过0.22μm微孔滤膜滤菌，分装，4℃保存。临用前，加入10％小牛血清(V/V)。

制备细胞消化液：0.25％胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)液，无菌PBS(0.01M，pH7.4)缓冲液配制，通过0.22μm微孔滤膜滤菌，分装，-20℃保存。

制备细胞清洗液：在PBS(0.01M，pH7.4)缓冲液中加入0.02％EDTA，高压灭菌，室温保存。

2)牙鲆鳃细胞培养：

(1)复苏：从液氮中取出冻存管，立即投入40-42℃水中快速晃动，直至冻存液完全溶解；200g离心5min，弃上清；向沉淀加入培养液1ml，轻轻吹吸均匀；将细胞悬液移入25cm2培养瓶中，补充培养液4ml，20℃培养。

(2)传代：细胞长满底层后，倒掉旧培养液，加3ml细胞清洗液，除掉上层的死细胞，倒掉清洗液，然后加0.3ml细胞消化液，待细胞收缩变圆，用手轻轻震动培养瓶，使细胞从培养瓶底部脱落下来，加入新鲜培养液2ml，混匀后，分成两瓶每瓶各补充新鲜培养液4ml，20℃培养。

(3)鳃细胞的形态特征及生长规律

鳃细胞为上皮样细胞，贴壁分布。细胞在倒置显微镜下观察呈梭形，形态饱满，大小均匀，长轴为30-40μm。鳃细胞传代后，前3天为快速增长期，细胞数量增加约一倍；细胞密度达7-8×10⁵cells/ml后，细胞生长趋势减慢，数量基本不增加。

三)、细胞中和实验：

1)病毒提纯：

(1)取患病牙鲆，先用70％酒精棉球消毒患部，再用灭菌手术刀片切下囊肿，加入石英砂和TNE(50mM Tris，100mM NaCl，1mM EDTA，pH 7.4)缓冲液，匀浆；

(2)匀浆液离心4℃，500g，30min，取上清；

(3)上清液离心4℃，1800g，，30min，取上清，-80℃保存备用；

2)病毒感染牙鲆鳃细胞实验：

(1)将生长旺盛的牙鲆鳃细胞接种到96孔板中，每孔100μl(3-5×10⁵cells/ml)，20℃，2％CO₂培养；

(2)待细胞长成单层，用PBS缓冲液清洗1-2遍，每孔加入0.45μm的滤膜过滤的病毒悬液40μl，20℃吸附1h(间或轻轻震荡)，加维持液(Eagle MEM，2％小牛血清)100μl，20℃，2％CO₂培养，每天在倒置显微镜下观察细胞病变情况，拍照。对照组细胞加入无菌PBS缓冲液40μ；

(3)结果：参见图2——图4所示；

接种病毒后1-2天，单层鳃细胞出现细胞病变。病变细胞聚缩、聚堆、脱壁，随着病变程度加深，细胞空泡化并逐渐崩解，形成明显的空斑；

3)细胞中和试验：采用稀释病毒法；

(1)细胞准备：将生长旺盛的牙鲆鳃细胞接种到96孔板中，每孔3-5×10⁴cells，20℃，2％ CO₂培养；

(2)病毒准备：将粗提病毒用0.45μm的滤膜过滤，MEM培养液稀释，设立七个连续梯度，2^-1、2^-2 2^-3、2^-4、2^-5、2^-6、2^-7；

(3)对照准备：设置3组对照：病毒对照，每个浓度病毒液均设对照；单克隆抗体毒性对照；牙鲆鳃细胞空白对照；

(4)病毒与抗体孵育：将抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体分别与不同梯度淋巴囊肿病毒液等体积混合，25℃孵育1h(间或轻轻震荡)；

(5)接种：当96孔细胞长成单层时，用PBS缓冲液清洗1～2遍，分别接种已孵育好的病毒与单抗的混合液以及对照组的病毒液、单抗、MEM，每种每个梯度接种8个孔，每孔40μl。20℃吸附1h(间或轻轻震荡)，加维持液(Eagle MEM，2％小牛血清)100μl，20℃，2％CO₂培养。

(6)观察：每天在倒置显微镜下观察并记录接种24h，48h，72h，96h，120h后的细胞变化，拍照。

(7)结果：连续观察5天，接种病毒液的病毒感染阳性对照孔，在48h后出现明显细胞病变效应，病变细胞聚缩、变圆，空泡化严重，细胞颗粒增多，最后细胞脱壁形成空斑，出现淋巴囊肿病毒引起的典型细胞病变效应。单克隆抗体毒性对照孔和未接种病毒的鳃细胞对照孔，细胞饱满呈梭形，铺满培养孔，细胞间无空隙。接种单克隆抗体A或单克隆抗体B与病毒混合液孔中的细胞状态良好，根据Reed——Muench方法计算半数感染量分别为：病毒感染阳性对照为2^-2.9，即该病毒7.5倍稀释液40μl等于1个TCID₅₀，单抗A中和后病毒的半数感量为2^-2，即该病毒4倍稀释液40μl等于1个TCID₅₀。单抗B中和后病毒的半数感染量为2^-2.5。即该病毒5.7倍稀释液40μl等于1个TCID₅₀。多次中和实验均测定此2株单克隆抗体具有较好中和活性，能够抑制接种病毒后细胞CPE的出现。根据以上结果可知，单抗A和单抗B均为具有中和活性的单抗。

本发明所用仪器及试剂：培养基MEM/EBSS(购自Hyclone公司)；小牛血清(购自Hyclone公司)；胰蛋白酶Trypsin 1∶250(购自Amersco公司)；二甲亚砜(DMSO)(购自Sigma公司)；冰冻切片机(购自Leica公司)；荧光显微镜(购自Olympus公司)；倒置相差显微镜(购自Olympus公司)；1640(购自Gibco公司)；胎牛血清(购自Hyclone公司)；HAT(购自Gibco公司)；异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠抗体(购自Sigma公司)。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims (2)

1、一种淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体，其特征在于：所述的中和单克隆抗体是由保藏号为CCTCC-C200420的杂交瘤细胞分泌产生的。

2、一种如权利要求1所述淋巴囊肿病毒中和单克隆抗体的制备方法，其特征在于：以牙鲆淋巴囊肿病毒为抗原免疫balb/c小白鼠，应用免疫学的间接免疫荧光抗体法，检测筛选出阳性杂交瘤细胞，并建立抗淋巴囊肿病毒的单克隆抗体库；再将对牙鲆淋巴囊肿病毒敏感的牙鲆鳃细胞系作为中和实验材料，进行中和实验测定，进一步筛选出保藏号为CCTCC-C200420杂交瘤细胞，并由该杂交瘤细胞分泌获得淋巴囊肿病毒的中和单克隆抗体。

Images