CN102115753A

CN102115753A - 植物耐旱相关蛋白GpLhcb5及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102115753A
Application number: CN201010575966XA
Authority: CN
Inventors: 王英典; 赵君怡; 李萌萌
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2010-12-07
Filing date: 2010-12-07
Publication date: 2011-07-06

Abstract

本发明公开了一种植物耐旱相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还保护编码所述蛋白的基因。所述蛋白及其编码基因为控制植物中耐旱相关基因的表达提供了基础，应用转基因技术有效地利用该基因，可提高植物在缺水环境下的适应性，最终达到提高植物抗旱能力的目的。

Description

植物耐旱相关蛋白GpLhcb5及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物耐旱相关蛋白GpLhcb5及其编码基因与应用。

背景技术

苔藓植物是自然界的拓荒者之一，许多种属具有很强的耐旱能力，在世界范围内的干旱、半干旱地区广泛分布着耐旱藓类，起着重要的生态作用。苔藓是水生到陆地的先锋植物，面临干旱与低温等恶劣环紧的胁迫，苔藓植物形成了一套独特的适应恶劣环境的机制，成为极端生境的主要植被和极地海拔地带的优势植被类群。藓类植物的抗旱能力极强，其极端的耐旱能力早就引起研究者的密切关注，其研究水平已经深入到寻找抗旱基因水平。

当植物处于高于光合作用所能利用的光强时易产生光抑制，甚至光破坏。植物的避光性反应就是前一种降低能量捕获机制的反映。而过多能量的非辐射耗散则是通过LHC蛋白参与不同过程的复杂机制来实现的。这种机制是通过PSII的捕光色素结合蛋白在跨类囊体膜的ΔpH存在下和从PSII反应中心转移能量的调节来使能量陷井开放。此过程产生光保护以保证在高光强下不降低光合效率。研究表明若LHCII的含量减少，则会干扰植物执行正常光合功能时所必需的类囊体膜的正常垛叠，使类囊膜的结构发生紊乱，那么就无法维持类囊体的功能，随之会产生叶绿素的丧失，进而导致光合***的崩溃，植株的生活力会立即下降。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐旱相关蛋白GpLhcb5及其编码基因与应用。

本发明提供的植物耐旱相关蛋白(GpLhcb5)，来源于毛尖紫萼藓(Grimmia.pilifera)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由序列2衍生的蛋白质。

序列表中的序列2由310个氨基酸残基组成，包含一个叶绿素a/b结合的超家族(Chloroa_b-bind Superfamily)(自序列2的106至274位氨基酸残基)。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指将序列2的上述结构域外的氨基酸进行取代/或缺失和/或添加。

序列表中的序列1所示的由1176个核苷酸组成，自5’第1至74位核苷酸为5’非编码区(5’-UTR)(74bp)，第75至1007位核苷酸为编码序列(933bp)，第1008至1010位核苷酸为终止密码子，第1011至1176位核苷酸为3’非编码区(3’-UTR)(169bp)。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包含双元农杆菌载体和可用与植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以ATG起始密码子或邻近接区起始密码子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，也可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体1利用GateWay技术，先将所述基因PCR产物前加CACC四个碱基，将含有CACC的PCR产物与pENTR/D-TOPO进行Capture反应，之后用pENTR-target与目的载体pEarley Gate201进行Recombine反应得到最终载体；所述重组表达载体2利用GateWay技术，先将所述基因PCR产物前加CACC四个碱基，将pMDC32载体的35S启动子用BamHI和PstI切除并连上AtLhcb5promoter，后用pENTR-target与目的载体pMDC32进行Recombine反应得到最终载体。

含有以上任一所述基因(GpLhcb5)转基因细胞系、重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐旱转基因植物的方法。

本发明所提供的培育耐旱转基因植物的方法，可将编码所述植物耐旱相关蛋白的基因导入目的植物(如植物细胞或组织)中，得到耐旱能力高于目的植物的转基因植物。具体来说，可以将所述重组表达载体导入目的植物中，得到耐旱能力高于目的植物的转基因植物。

本发明同时提供了一种培育持水力提高的转基因植物的方法，是将所述植物耐旱相关蛋白的基因导入目的植物(如植物细胞或组织)中，得到持水力高于目的植物的转基因植物。具体来说，可以将所述重组表达载体导入目的植物中，得到持水力高于目的植物的转基因植物。作物离体叶片在空气中的相对含水量反应叶片的持水力，或称植物组织的抗脱水能力。离体叶片失水速率与植株的抗旱之间有密切关系。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得耐旱能力增强的转基因细胞系及转基因植物。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、水稻、小麦等。

本发明发现了一种植物耐旱相关蛋白(GpLhcb5)及其编码基因(GpLhcb5)。GpLhcb5基因可在干旱胁迫下诱导表达。将转化GpLhcb5基因后得到的过量表达的拟南芥植株进行逆境生理实验，证明转入GpLhcb5基因后，可以提高拟南芥的耐旱性。将GpLhcb5基因转化到拟南芥AtLhcb5功能缺失型突变体进行回补实验，证明转入GpLhcb5基因后拟南芥AtLhcb5功能缺失型突变体的耐旱性有所提高。本发明的耐旱相关蛋白及其编码基因为人为控制植物中耐旱相关基因的表达提供了基础，将在培育耐旱植物中发挥重要作用。

以下结合附图及具体实施进一步阐述本发明。

附图说明

图1.A.毛尖紫萼藓GpLhcb5蛋白的序列分析。毛尖紫萼藓GpLhcb5与小立碗藓(XP_001786046.1)的相似性为92％，与松树(CAA78900.1)的相似性分别为80％，与拟南芥(NP_192772.1)的相似性为76％，与芸苔属植物(CAA65042.1)的相似性为75％。实线指示叶绿素a/b结合super-family。毛尖紫萼藓GpLhcb5蛋白与其他Lhcb5蛋白相应结构域的序列比对。本图显示为毛尖紫萼藓，拟南芥，水稻，芸苔属植物等蛋白的保守氨基酸。

B.毛尖紫萼藓GpLhcb5，Arabidopsis thaliana、Brassica juncea、Populustrichocarpa、Nicotiana tabacum、Capsicum annuum、Phyllostachys edulis、Pinussylvestris、Grimmia pilifera P.Beauv、Physcomitrella patens相应Lhcb5的进化分析。

图2.毛尖紫萼藓GpLhcb5基因的表达受干旱胁迫诱导。提取不同干旱胁迫时间点毛尖紫萼藓的总RNA用于RT-PCR，扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，Actin作为内参对照。

图3.过表达载体pEG201-GpLhcb5构建示意图

图4.转基因拟南芥提取基因组DNA进行PCR鉴定

图5.Real-time RT-PCR方法检测35S::GpLhcb5转基因拟南芥mRNA水平GpLhcb5基因的表达量

图6.35S::GpLhcb5转基因植物的干旱耐受性被提高

图7.拟南芥野生型及转基因植物失水率的测定

图8.AtLhcb5mutant染色体T-DNA***位点示意图

图9.LB、RP和LP、RP两组引物进行PCR检测AtLhcb5mutant纯和体

图10.AtLhcb5mutant和野生型的形态学观察

图11.AtLhcb5mutant和野生型植株正常生长的株高进行测量

图12.pMDC32-GpLhcb5功能缺失型突变体回补表达载体构建示意图

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限于本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。

毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera P.Beauv.)：采自山东省青岛市崂山。实施例1、毛尖紫萼藓光***II捕光色素复合体蛋白基因及蛋白质序列的发现

在高通量筛选获得毛尖紫萼藓干旱胁迫下相关候选基因信息的基础上，针对特异表达的抗旱相关的光***II捕光色素复合体蛋白基因(GpLhcb5)，挑选一段368bp的GpLhcb5的EST，设计特异扩增引物，通过5’及3’-RACE的方法获得全长序列。将得到的5’端和3’端序列拼接获得ORF序列，并重新设计引物扩增得到全长片段，测序最终得到全基因序列。下图为3’RACE、5’RACE引物设计：

上述用于扩增开放阅读框ORF。

以干旱处理的毛尖紫萼藓总RNA的逆转录样品为模板进行RACE扩增。PCR反应体系组成为：10x pfx buffer 2μl，50mM MgSO₄ 2μl，10mM dNTPs 1μl，10μM上游引物和下游引物各1μl，pfx DNA聚合酶0.2μl和适量模板，补充无菌水至总体积20μl。PCR循环条件，第一次PCR：94℃变性30sec，72℃延伸2min，5个循环；94℃变性30sec，70℃退火30sec，72℃延伸2min，5个循环；94℃变性30sec，68℃退火30sec，72℃延伸1min，25个循环，最后72℃延伸5min。第二次巢式PCR条件为94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，12个循环。全基因扩增PCR循环条件为：94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环。

琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR扩增得到了约400bp和1000bp的片段，将经电泳分离纯化后的扩增产物，分别与pJET载体连接，转化宿主细胞JM109，选取阳性克隆送至英俊进行核苷酸序列测定。将获得的序列进行拼接，得到GpLhcb5全基因序列。GpLhcb5全长1176bp，其中5’端非编码序列长74bp，3’端非编码序列长169bp，开放阅读框长933bp，编码一个由310个氨基酸组成的蛋白。经NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线分析表明，该蛋白的第107～274位氨基酸构成了叶绿素a/b结合的Super family结构域。该蛋白与其他植物中相似序列进行同源性分析及相似性分析表明，其与小立碗藓(XP_001786046.1)的相似性为92％，与松树(CAA78900.1)的相似性分别为80％，与拟南芥(NP_192772.1)的相似性为76％，与芸苔属植物(CAA65042.1)的相似性为75％，最终获得序列表中序列1所示的核苷酸序列，该核苷酸具有完整的编码框。将序列1所示的核苷酸序列命名为GpLhcb5。

实施例2、植物耐旱相关蛋白GpLhcb5基因受干旱诱导表达

分别以野外采集的毛尖紫萼藓干旱胁迫不同程度的全植株为材料提取RNA的逆转录样品为模板通过RT-PCR方法检测GpLhcb5基因的表达。

如图2所示，RT-PCR的结果表明，干旱胁迫能强烈的诱导GpLhcb5基因的表达，干旱前期处理对基因表达的诱导量明显增加。

实施例3、耐旱转基因植株的获得与耐旱性的鉴定

一、重组表达载体的构建

构建流程见图3、12

1、过表达载体的构建

①GpLhcb5的全长cDNA序列用以下引物进行PCR扩增：

GpLhcb5-U：CACCATGGCCGCCATGGCAGCAGCGA

GpLhcb5-L：TTATAGGCTGGGGGCTCGCTCTGCGGTTCC

将得到的PCR进行测序，测序保证准确无误后继续后面的实验。

②扩增所得的片段，经凝胶回收，进行TOPO Cloning reaction，直接将片段倒入pENTR^TM/D-TOPO vector(Invitrogen)

③通过LR reaction将片段克隆到过表达载体转入植物表达载体pEarleyGate201 (购自http://www.arabidopsis.org/)得到过表达重组质粒，重组载体命名为：pEarleyGate201-GpLhcb5

二、耐旱转基因植株的获得

1、将步骤一构建的pEarleyGate201-GpLhcb5通过电转到农杆菌EV3101中，用蘸花法转化野生型拟南芥，具体步骤为：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇透水。于中午12点接菌于LB培养液的试管中10μl∶10ml接种。28℃，200rpm摇过夜，次日下午2点将已摇活的菌按(1∶400)及750ul菌液转至含300毫升LB+Kana+gen+Rif的LB培养基中，28℃培养，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，当菌液达到OD₆₀₀为1.5～3.0之内时，可收集菌体。用15％蔗糖(含0.02％Silwet)稀释至OD₆₀₀约为0.8～1.0左右。转化时将花在溶液中浸泡30s左右，于弱光下生长。

2、提取抗Basta转35S::GpLhcb5基因拟南芥和野生型植株基因组DNA，进行PCR检测。结果表明得到了含有目的基因的转基因植株。

3、Real time RT-PCR分析。拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型和转基因植物总RNA用Trizol(Invitrogen)提取，以1μg总RNA作为模板，在20μl反应体系中用QuantiTeck Reverse Transciption Kit(Qiagen)进行反转录合成第一条cDNA。cDNA反应混合物稀释50倍后，5μl稀释物作为模板被用于20μl real timeRT-PCR反应体系。反应条件为：95℃变性30sec，60℃两步法30sec，共40个循环。所有反应都用SYBR Green PCR Master Mix(ABI)作为荧光染料。Real time RT-PCR所用引物都为基因特异性引物。每个反应都被重复至少三次。融解曲线被用于数据分析。根据每个株系中GpLhcb5的过表达水平，我们得到过表达GpLhcb5的转基因株系，选择其中的3个株系(#5，7和10)进行后续的实验(图5)。

三、转基因拟南芥耐旱性的测定

1、自然干旱处理

为了评价GpLhcb5过表达后对植物抗旱性的作用，在温室内，相同条件土培三周的野生型植物和35S::GpLhcb5转基因植物停止浇水12天观察植株的萎蔫程度。大部分野生物萎蔫，而35S::GpLhcb5转基因植物仍正常生长并保持绿色(图6)。这个结果暗示35S::GpLhcb5转基因植物消耗水分的速度比野生型慢，所以萎蔫速度也慢。

2、叶片失水(Water Loss)测定

作物离体叶片在空气中的失水速率(单位时间的失水量)反映叶片的持水力，或称植物组织抗脱水能力。离体叶片失水速率与植株的抗旱性之间有密切关系。三周龄的土培生长良好的拟南芥(Arabidopsis.thaliana)野生型和转基因植物。每个植株收集六片叶子，将其放置在半开的培养皿中置于桌面上，在预定的时间称量叶片的鲜重，计算其失水率。每个实验至少重复四次。失水率用预定时间点的鲜重比上起始鲜重(Time point fresh weight/initial fresh weight)。转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片在脱水过程中的失水率变化结果见图7。

实施例4、转GpLhcb5对拟南芥Lhcb5基因功能缺失型突变体的回复

一、拟南芥Lhcb5基因功能缺失型突变体的鉴定

1、在拟南芥突变体库中(http://www.arabidopsis.org/)查找拟南芥AtLhcb5的突变体株系，此基因定位在拟南芥第4条染色体上，编号为AT10340，编码光***II捕光色素蛋白CP26，选择一个在AT10340第3位外显子上的T-DNA***突变(图8)，从ABRC上订购的突变体为SALK_014869C，用于后续实验。

2、对订购的AtLhcb5突变体进行纯和体的检测，根据SALK提供的T-DNA引物设计进行三引物PCR检测。

3、用CTAB法提取拟南芥AtLhcb5mutant和野生型的基因组DNA，分别用LB、RP和LP、RP两组引物进行PCR检测纯和体。检测后的电泳结果(图9)保证准确无误后继续后面的实验。

二、拟南芥Lhcb5基因功能缺失型突变体的回复载体的构建

1、GpLhcb5的全长cDNA序列用以下引物进行PCR扩增：

GpLhcb5-U：CACCATGGCCGCCATGGCAGCAGCGA

GpLhcb5-L：TTATAGGCTGGGGGCTCGCTCTGCGGTTCC

2、扩增所得的片段，经凝胶回收，进行TOPO Cloning reaction，直接将片段倒入pENTR^TM/D-TOPO vector(Invitrogen)

3、通过LR reaction将片段克隆到过表达载体转入植物表达载体pMDC32(购自 http://www.arabidopsis.org/)得到功能缺失型突变体回补表达重组质粒，并切除BamHI和PstI双酶切pMDC32本身含有的35S启动子，连接AtLhcb5基因的promoter作为启动子。重组载体命名为：pMDC32-GpLhcb5

三、AtLhcb5mutant和野生型的形态学观察

对AtLhcb5mutant和野生型在正常生长情况下(同温度、同湿度、同光照下)进行观察，对其进行2周到5周的形态学观察，经过观察可发现AtLhcb5mutant相对于野生型生长较快(图10)。

鉴于对AtLhcb5mutant和野生型在正常生长情况下的观察对其3，4，5，6周的植株的株高进行测量，如图11所示。

四、转基因植株的获得

1、将步骤一构建的pEarleyGate201-GpLhcb5通过电转到农杆菌EV3101中，用蘸花法转化野生型拟南芥，具体步骤为：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇透水。于中午12点接菌于LB培养液的试管中10μl∶10ml接种。28℃，200rpm摇过夜，次日下午2点将已摇活的菌按(1∶400)及750ul菌液转至含300毫升LB+Kana+gen+Rif的LB培养基中，28℃培养，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，当菌液达到OD₆₀₀为1.5～3.0之内时，可收集菌体。用15％蔗糖(含0.02％ Silwet)稀释至OD₆₀₀约为0.8-1.0左右。转化时将花在溶液中浸泡30s左右，于弱光下生长。

2、提取抗潮霉素转pMDC32-GpLhcb5基因拟南芥和野生型植株基因组DNA，含有目的基因的转基因植株。

Claims

1.一种编码植物耐旱相关蛋白的核酸分子，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)的DNA分子

1)其编码序列是序列表中序列1自5’第75至1007位核苷酸所示；

2)序列表中序列1所示；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码耐旱相关蛋白。

2.一种植物耐旱相关蛋白的多肽，其特征在于：所述多肽是如下(a)或(b)的多肽：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成；

(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关。

3.含有权利要求1所述核酸的重组表达载体。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将权利要求1所述核酸经过Gateway拓扑置换方法转入pEarleyGate201/pMDC32载体得到的。

5.含有权利要求1所述核酸的转基因细胞系。

6.含有权利要求1所述核酸的重组菌。

7.一种培育耐旱转基因植物的方法，所述方法包括将权利要求1所述核酸导入目的植物中，得到耐旱能力高于目的的植物的转基因植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求1所述核酸通过权利要求3或4所述重组表达载体导入目的植物中。

9.如权利要求7或8所述的方法，所述目的植物为拟南芥。

10.一种培育持水力提高的转基因植物的方法，是将权利要求1所述核酸导入目的植物中，得到持水力高于目的植物的转基因植物。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于：权利要求1所述核酸通过权利要求3或4所述重组表达载体导入目的植物中。

12.如权利要求10或11所述的方法，所述目的植物为拟南芥。

13.权利要求1所述核酸或权利要求2所述多肽在提高植物抗旱能力中的应用。