CN102114044A - 一种人工加工熊胆粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种熊胆汁的提取方法，在熊的胆囊上切开创口，并与肌肉组织形成瘘管，扎紧；痊愈后挤动瘘口采集胆汁。该方法可用于非连续、定时定量和长期采集，而且不会对熊自身利用胆汁造成影响。本发明公开了一种优质熊胆粉及其制备方法，该熊胆粉在365nm紫外灯下呈亮黄色荧光，其在198nm下有3个色谱峰；制备方法包括将胆汁静置、分离、干燥后粉碎过筛，即得，制备的熊胆粉外观色泽纯正，熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量高，不吸潮，利于储运和加工。

Description

一种人工加工熊胆粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种从动物体内提取胆汁的方法、胆粉的生产方法及胆粉，特别尤其一种从熊的体内提取胆汁的方法、熊胆粉的生产方法及优质熊胆粉。

背景技术

熊胆，是熊科动物黑熊Selenarctos thibetanus(G.Cuvier)、东北马熊Ursus arctos lasiotus Gray或棕熊Ursus arctos L.胆囊内的干燥胆汁。在中国，主产云南、黑龙江、吉林。此外，贵州、四川、青海、西藏、新疆、甘肃、湖北、湖南、陕西、福建等地亦产。熊胆中的主要成份是胆汁酸类的碱金属盐，此外，还含有胆甾醇及胆色素。从黑熊胆中可得约20％的牛磺熊脱氧胆酸，为熊胆的主要成分，被水解则生中磺酸与熊脱氧胆酸。熊胆又含少量鹅脱氧胆酸及胆酸。熊脱氧胆酸为鹤脱氧胆酸的立体异构物，乃熊胆的特殊成分，可与它兽的胆相区别。

熊胆能清热解毒，明目，具有解痉、抗惊厥、利胆作用，此外，对流感嗜血杆菌、大肠杆菌、肺炎球菌、甲型链球菌、绿脓假单胞菌、卡他奈瑟菌等均有抑制作用。在治疗胆结石、急性黄疸型肝炎和慢性乙型肝炎、急性结膜炎和白内障、抗脑血栓和脑缺血、抗肿瘤、抗溃疡、抗病毒、解热镇痛、降血脂及抗衰老等方面均发挥着药理作用及保健功效。

传统的制备方法一直是杀熊取胆，致使药源动物濒于灭绝。20世纪80年代后期，国内开发和逐步应用活熊胆囊造漏术***引流管采集胆汁(有管引流采集法)或有管引流连续取胆汁技术(有管连续引流采集法)，来生产引流熊胆粉。连续有管引流生产熊胆粉的技术不足是，引流管在熊体内长期存留，容易引起创口局部发炎和感染；同时有管引流连续采集也影响熊胆汁的自身代谢。

专利号为ZL 01112258.7的发明公开了一种人造熊胆粉的制备方法，用禽胆汁通过生物抽取，分别获得牛磺熊去氧胆酸组份、胆汁色素成份和胆汁酸组份，然后将这些组份进行测定后按比例加工配制成人造熊胆粉。虽然人造熊胆粉含有天然熊胆中的一些主要成份，但其组份单一，制备工艺复杂，不适合大规模的工业化生产。

目前市售熊胆粉价格昂贵，易吸潮，熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量较低，使其在医药及保健方面的应用受到极大的限制。

本发明采用人工无管引流采集熊胆汁，此方法可以明显减少胆囊的感染，提高胆汁的产量与质量，减少因有管存留对胆囊的破坏；同时，还可以减少黑熊的手术次数。通过外科造瘘术在胆囊切开创口，并与肌肉组织形成瘘管后，可用于每日非连续、定时定量进行采集，使胆汁在胆囊里充分浓缩，从而获得优质胆汁。即使长期采集，也不会对黑熊自身利用胆汁(供其生理和生长发育所需)造成影响。

通过此方法提取的胆汁制成的熊胆粉，外观色泽纯正，不吸潮，利于储运和加工成口服剂型，而且熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量明显高于目前市售的普通熊胆粉。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种从熊的体内提取胆汁的方法和一种人工熊胆粉及其制备方法，本发明的人工熊胆粉中的有效成分含量高，含水量低，不吸潮，适于储藏、存放和运输，而且熊胆粉的疗效高，明显提高了其应用效果。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种从熊的体内提取胆汁的方法。

其中，在熊的胆囊上切开创口，并与肌肉组织形成瘘管，扎紧；痊愈后挤动瘘口采集胆汁。

其中，在熊的腹中线剑突向下1～10cm处，切开皮下组织，拉出胆囊；在胆囊切开1～3cm的创口，并与肌肉组织形成瘘管，扎紧。

特别是，于腹中线剑突向下1～10cm处，切开皮下组织，钝性分离肌肉，切开肌膜、腹膜，拉出胆囊；在胆囊切开1～3cm的创口，并与肌肉组织形成瘘管，用缝合线适度扎紧；再固定胆囊和胆囊皮肤；分别缝合腹膜、脂肪、肌膜、肌肉和皮肤；然后清洗和消毒术口。

其中，在熊术后苏醒2～4小时，饲喂营养液。

特别是，营养液为蜂蜜水、糖水或鸡蛋水。

其中，在术后1-15天内，给熊予肌注或口服抗生素。

其中，每天定时采集熊胆汁1～3次，每天采集总量为50～200mL。

其中，熊为黑熊，优选为养殖于亚洲的黑熊，进一步优选为养殖于中国福建省的黑熊。

本发明另一方面提供一种人工加工熊胆粉，在365nm下呈亮黄绿色荧光，即在365nm的紫外光下呈亮黄绿色荧光。

特别是，所述熊胆粉的有效成分牛磺熊去氧胆酸的紫外特征吸收波长为198nm；在其后出现的色谱峰中，还有2个色谱峰的紫外吸收波长也是198nm。

其中，熊胆粉采用高效液相色谱法测定的色谱峰中，在甲醇溶剂峰后保留时间为3.3-3.4分钟的色谱峰的紫外特征吸收波长为198nm和226nm；其中，所述高效液相色谱法的色谱条件：流动相-甲醇0.03mol/L磷酸二氢钠(65∶30)；用磷酸调PH4.4；流速：1.0ml/min；检测波长：210nm；检测器：Agilent 1100 DAD；柱温：30℃；柱子：Hypersil ODS sum 4.6×250mm。

特别是，还含有249nm和494nm的紫外特征吸收峰。

其中，所述熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量≥40％，优选≥40-60％，进一步优选为40-45％。

特别是，所述熊胆粉的水分含量≤2％。

本发明的优质熊胆粉，经高效液相色谱DAD检测器采集各峰的紫外指纹图谱，主要有效成分牛磺熊去氧胆酸和另外2个主要色谱峰的紫外吸收谱波长都是198nm，3.5分出峰的杂质色谱峰的紫外吸收波长为198nm、226nm，其余杂质峰均无紫外吸收峰；

其中，将所述熊胆粉首先溶于水后，采用乙酸乙酯萃取，得到熊胆粉的乙酸乙酯萃取物和水溶性物质，其中，所述乙酸乙酯萃取物的紫外吸收波长为262nm；所述水溶性物质的紫外吸收波长为249nm和494nm；

其中，将所述熊胆粉以甲醇溶解，然后去除不溶部分，得熊胆粉甲醇溶解物，所述甲醇溶解物的紫外吸收波长为249nm和262nm。

本发明的优质熊胆粉，经薄层层析，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，其Rf值分别为0.96，0.8，0.7，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出9个亮蓝色荧光斑点，其Rf值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.18，0.1。其中，Rf值为0.18的亮蓝色荧光斑点，为其特有斑点。

本发明又一方面提供了一种人工加工熊胆粉的生产方法，包括如下步骤：

1)将熊胆汁静置澄清，获得上清液；

2)将上清液进行除杂处理，得到水溶性熊胆汁；

3)对水溶性熊胆汁进行干燥处理，粉碎，过筛，即得。

其中，步骤1)中所述静置澄清的温度为4～10℃，静置时间为2～24小时；步骤2)中采用离心、过滤或吸附处理方法对熊胆汁上清液进行所述的除杂处理；步骤3)中所述的干燥处理选择烘干、真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。

特别是，所述离心除杂处理的转速为10000～12000rpm，时间为10-120min；所述过滤处理为加压过滤，过滤处理的相对压力为0.1～0.3MPa；所述吸附除杂处理是采用大孔吸附树脂进行吸附除杂。

其中，过滤处理的过滤精度为0.2-0.5微米；所述大孔树脂选择为D101型大孔树脂。

特别是，所述的大孔吸附树脂与熊胆汁上清液的重量之比为1～80∶1。

其中，所述的真空干燥的相对压力为-0.05～-0.095MPa；干燥温度为30～60℃；干燥时间为8-60小时。

特别是，所述的烘干温度为60～80℃；烘干时间为24～48小时。

特别是，所述冷冻干燥为将熊胆汁在-40℃下预冻3～5小时，接着在-40～-15℃下升华干燥18～24小时，然后再于-15～30℃下干燥12～20小时。

尤其是，冷冻干燥的相对压力为2-20MPa。

特别是，将水溶性熊胆汁在射流速度300～990米/秒，温度为30～60℃、相对压力为-0.04～-0.09MPa的条件下进行所述的喷雾干燥。

其中，所述的经过干燥处理后的粉碎的熊胆粉过100～180目筛。

本发明另一方面提供一种按照上述方法制备而成的人工加工熊胆粉。

其中，熊胆粉在365nm下呈亮黄绿色荧光，即在365nm的紫外光下呈亮黄绿色荧光。

特别是，所述熊胆粉的有效成分牛磺熊去氧胆酸的紫外特征吸收波长为198nm；在其后出现的色谱峰中，还有2个色谱峰的紫外吸收波长也是198nm。

其中，熊胆粉采用高效液相色谱法测定的色谱峰中，在甲醇溶剂峰后保留时间为3.3-3.4分钟的色谱峰的紫外特征吸收波长为198nm和226nm；其中，所述高效液相色谱法的色谱条件：流动相-甲醇0.03mol/L磷酸二氢钠(65∶30)；用磷酸调PH4.4；流速：1.0ml/min；检测波长：210nm；检测器：Agilent 1100 DAD；柱温：30℃；柱子：Hypersil ODS sum 4.6×250mm。

特别是，还含有249nm和494nm的紫外特征吸收峰。

其中，所述熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量≥40％，优选≥40-60％，进一步优选为40-45％。

特别是，所述熊胆粉的水分含量≤2％。

本发明再一方面提供一种优质人工提纯熊胆粉。

其中，熊胆粉为玻璃样光泽的亮金黄色或鲜黄色粉末，呈亮黄色荧光且不吸潮。

其中，所述熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量≥40％，优选≥40-60％，进一步优选为40-45％。

本发明又一方面提供一种人工熊胆粉在制备用于治疗和预防肝炎、肝纤维化、胆结石、抗肿瘤、抗病毒、眼病、解热药物中的应用。

本发明的优点如下：

1、通过人工无管引流技术，在熊的胆囊上切开创口，并与肌肉组织形成瘘管，扎紧；痊愈后挤动瘘口采集胆汁。该方法可用于非连续、定时定量和长期采集，而且不会对熊自身利用胆汁造成影响。

2、本发明制备的人工加工熊胆粉外观色泽纯正，不吸潮，吸湿率≤2％；熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量高，达到40％以上，其有效成分牛磺熊去氧胆酸含量显著高于目前市售的普通熊胆粉，利于熊胆粉的储运和加工，尤其利于口服剂型的制备。

3、本发明的人工加工熊胆粉的制备方法简单，工艺条件温和，成本低廉，费用低。

附图说明

图1：反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，展开剂氯仿-丙酮-冰醋酸(7∶2∶1)，展距5cm。紫外灯254nm下荧光照片；体积之比为7∶2∶1

图2：反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，展开剂氯仿-丙酮-冰醋酸(7∶2∶1)，展距5cm。紫外灯365nm下荧光照片；

图3：本发明实施例4制备的熊胆粉高效液相色谱图；

图4：本发明实施例4的熊胆粉高效液相色谱-3D图；

图5：本发明实施例4的熊胆粉在保留时间2.635分钟的甲醇溶剂色谱峰的高效液相色谱-3D图(紫外吸收波长198nm)；

图6：本发明实施例4的熊胆粉在保留时间3.355分钟的色谱峰的高效液相色谱-3D图(紫外吸收波长198nm、226nm)；

图7：本发明实施例4的熊胆粉在保留时间11.02分钟的色谱峰的高效液相色谱-3D图(牛磺熊去氧胆酸紫外吸收波长198nm)；

图8：本发明实施例4的熊胆粉在保留时间20.74分钟的色谱峰的高效液相色谱-3D图(紫外吸收波长198nm)；

图9：本发明实施例4的熊胆粉在保留时间31.218分钟的色谱峰的高效液相色谱-3D图(紫外吸收波长198nm)；

图10：熊胆粉在254nm紫外灯下荧光照片图；

图11：熊胆粉在356nm紫外灯下荧光照片图。

照片附图标记说明：

1.本发明实施例4制备的熊胆粉样品；2.对照例1熊胆粉样品；3.对照例2熊胆粉样品

具体实施例方式

以下通过试验例来进一步阐述本发明所述药物的有益效果，这些试验例包括了本发明药物的药效学试验。

试验例1 熊胆粉抗肿瘤作用

试验材料：

本发明实施例4制备熊胆粉，1g/瓶；第一对照熊胆粉，10g/袋(对照例1熊胆粉，四川省养麝研究所生产)；第二对照熊胆粉，5g/瓶(对照例2的熊胆粉，黑龙江省黑宝药业股份有限公司生产)；阳性对照药：环磷酰胺(CTX，上海华联制药集团生产)。

1.对B16小鼠黑色素瘤的抑瘤作用

1)试验方法：

无菌条件下取对数生长期的B16小鼠黑色素瘤培养细胞，制备成2.5×10⁵/ml的B16小鼠黑色素瘤培养细胞悬液。

取C57BL/6小鼠70只，体重150-200g，雌雄各半，接种B16小鼠黑色素瘤培养细胞悬液，接种量为0.2ml/只小鼠；接种后的第二天将小鼠随机分成7组，每组10只，即给药高、中、低剂量组，第一对照熊胆粉、第二对照熊胆粉、阳性对照药物组和阴性对照组羧甲基纤维素(CMC)；给药高、中、低剂量组分别口服给予本发明熊胆粉，隔天给药一次，给药高剂量组260mg/kg；给药中剂量组130mg/kg；给药低剂量组65mg/kg；第一对照熊胆粉口服给药，隔天给药一次，给药剂量为260mg/kg，第二对照熊胆粉口服给药，隔天给药一次，给药剂量为260mg/kg，阳性药物组腹腔注射给予CTX100mg/kg，每天给药一次；阴性对照组口服给予等重量的CMC混悬液，隔天给药一次，各组小鼠在给药3周后处死，剖取小鼠的肺脏，计测每只小鼠肺脏所转移的集落数。

肿瘤抑制率计算：以各组小鼠的肿瘤平均集落数，按下列公式计算肿瘤抑制率：

肿瘤抑制率％＝[(对照组平均集落数-给药组平均集落数)/对照组平均集落数]×100％。

2)试验结果：

不同给药组的抗肿瘤转移疗效比较结果见表1。

表1 熊胆粉对小鼠黑色素瘤B16疗效试验(n＝3)

^***与阴性对照组相比p值＜0.01。

试验结果表明：本发明制备的熊胆粉对小鼠黑色素瘤B16有明显抑制作用，高剂量组260mg/kg(相当于临床剂量1.0g/60kg/日)抑瘤率可达56.57％，明显优于同等剂量的第一对照熊胆粉(260mg/kg抑瘤率为44.07％，^#p值＜0.05)，第二对照熊胆粉(260mg/kg抑瘤率为43.64％，^#p值＜0.05)。

2.对人体肝癌QGY的抑瘤作用

1)试验方法：

无菌条件下取生长旺盛的体内传第二代QGY瘤源，以匀浆法1∶6制成1-2×10⁷/ml人体肝癌QGY培养细胞悬液，匀浆经100目不锈钢筛网过滤，备用。

裸小鼠(上海市中科院实验动物中心提供，合格证号：SCXK 2003-0003)常规消毒，麻醉后，于腹腔正中剑突下切开皮肤和腹腔，暴露肝脏，用注射器肝部注射0.05ml细胞悬液，关闭腹腔，逐层缝合腹腔及皮肤。术后的裸小鼠置于层流架中饲养，所用的饲料、垫料、笼具及接触的器械等均应高压消毒后使用。术后第二天将裸小鼠随机分成7组，每组6只，即给药高、中、低剂量组，第一对照熊胆粉组、第二对照熊胆粉组、阳性药物组和阴性对照组；给药高、中、低剂量组分别口服给予本发明熊胆粉，隔天给药一次，给药高剂量组260mg/kg；给药中剂量组130mg/kg；给药低剂量组65mg/kg；第一对照熊胆粉组口服给药，隔天给药一次，给药剂量为260mg/kg，第二对照熊胆粉组口服给药，隔天给药一次，给药剂量为260mg/kg，阳性药物组环磷酰胺组腹腔注射给予环磷酰胺100mg/kg，每天给药一次；阴性对照组隔天口服给予等重量羧甲基纤维素(CMC)一次，观察各组动物45天内的生存时间，与阴性对照组进行比较，统计生命延长率。

2)实验结果计算：

试验各组小鼠按下列公式计算其生命延长率：生命延长率％＝给药组平均生存天/阴性对照组平均生存天×100％，结果见表2。

表2 熊胆粉对人体肝癌QGY抑瘤试验(n＝3)

^***与阴性对照组相比，p值＜0.01；生命延长率＞125％以上以抗肿瘤有效计。

试验结果表明：本发明制备的熊胆粉对人体肝癌QGY有明显延长荷瘤裸鼠生命率，高剂量组260mg/kg(相当于临床剂量1.0g/60kg/日)延长生命率为142.93％，显优于同等剂量的对照一组熊胆粉(260mg/kg抑瘤率为129.33％，^#p值＜0.05)，对照二组熊胆粉(260mg/kg抑瘤率为130.02％，^#p值＜0.05)。

试验例2 熊胆粉抗病毒作用

试验材料：

本发明实施例4制备熊胆粉1g/瓶；第一对照熊胆粉，10g/袋(对照例1熊胆粉，四川省养麝研究所生产)；第二对照熊胆粉，5g/瓶(对照例2的熊胆粉，黑龙江省黑宝药业股份有限公司生产)；阳性对照药：利巴韦林片(厦门鱼肝油厂生产，产品批号：03048402，国药准字H19993827)。

病毒株：流感病毒FM₁株，购于中国预防医学科学院病毒研究所；副流感病毒，购于中国预防医学科学院病毒研究所；

主要试剂：培养基，IMDM(美国Sigma产品)；胎牛血清(长春生物制品研究所产品)；胰蛋白酶，(日本关东株式会社生产，上海化学试剂厂分装)。

实验动物：

ICR小鼠，雌雄各半，3-4W龄，18-22g，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供。实验动物合格证号：SCXK(吉)2003-0001。

1.抗小鼠流感病毒肺指数的测定试验

试验方法：

ICR小鼠随机分成8组，10只/组，本发明熊胆粉给药高、中、低剂量组、阴性对照组、模型组和阳性药物(利巴韦林片)组、第一对照熊胆粉组，第二对照熊胆粉组，于感染前一天开始灌胃给药，本发明熊胆粉给药高、中、低剂量组260mg/kg/d、130mg/kg/d、65mg/kg/d、模型对照组及阴性对照组灌服相同体积(0.03ml)的蒸馏水、阳性药物(利巴韦林片)组58.5mg/kg/d、第一对照熊胆粉组260mg/kg/d、第二对照熊胆粉组260mg/kg/d；给药第二天，在***浅麻醉下分别滴鼻感染流感病毒和副流感病毒15LD₅₀(0.03ml)，阴性对照组不进行滴鼻感染病毒的处理，仅灌服相同体积(0.03ml)的蒸馏水；连续给药4d，分别记录，然后于感染后96h解剖，取肺称重，计算肺指数，与模型对照组比较，进行组间t检验，根据统计学意义判断效果。试验重复3次，试验结果见表3、4。

表3 熊胆粉对小鼠流感病毒性肺炎的作用

表4 熊胆粉对小鼠副流感病毒性肺炎的作用

2.抗小鼠肺甲型流感病毒、副流感病毒增殖和抗原滴度测定试验

动物分组、药物剂量、给药方法、病毒感染方法同上述“抗小鼠流感病毒肺指数的测定试验”。感染病毒72h后，脱颈处死小鼠，解剖取肺，组织匀浆器研磨，生理盐水制成10％的肺组织悬液，离心取上清，倍比稀释，按0.2ml/孔滴于滴定板上后，每孔加入0.2ml 1％鸡红细胞悬液，混匀，置室温30min，观察记录血凝滴度。以红细胞凝集(++)时为终点，并以悬液稀释倍数表示其滴度。结果见表5、6.

表5 熊胆粉对流感病毒性肺炎小鼠肺组织血凝滴度的影响

表6 熊胆粉对副流感病毒性肺炎小鼠肺组织血凝滴度的影响

试验结果表明：体内抗病毒试验结果显示本发明制备的熊胆粉能明显降低流感病毒和副流感病毒所引起的小鼠病毒性肺炎的肺指数和血凝滴度，与模型组比较差异显著，本发明熊胆粉的抗病毒作用显著。

试验例3 熊胆粉解热作用

试验材料：

本发明实施例4制备熊胆粉，1g/瓶；第一对照熊胆粉，10g/袋(对照例1熊胆粉，四川省养麝研究所生产)；第二对照熊胆粉，5g/瓶(对照例2的熊胆粉，黑龙江省黑宝药业股份有限公司生产)；阳性对照药：扑热息痛(东北制药总厂生产，20片/盒，批号：20090311)。

1.对啤酒酵母致大鼠发热的影响

试验方法：

雄性Wistar大鼠，体重180～200g。试验前分别用WSC-411P型便携式数字测温仪测量正常肛温2次(每次间隔1h)，取两次测量的平均值作为大鼠的正常体温。然后选体温在36.5～38℃的大鼠70只，随机分为7组：模型(0.5％羧甲基纤维素)组，本发明熊胆粉高剂量组200mg/kg、中剂量组100mg/kg、低剂量组50mg/kg、第一对照熊胆粉组200mg/kg、第二对照熊胆粉组200mg/kg及阳性药扑热息痛(100mg/kg)组，每组10只。各组大鼠均背部皮下注射10％鲜啤酒酵母混悬液10ml/kg致热。注射10％鲜啤酒酵母混悬液6.0h后，本发明熊胆粉高、中、低剂量组、第一对照熊胆粉组、第二对照熊胆粉组及阳性药物组均灌胃给药，模型组灌胃等体积0.5％羧甲基纤维素。分别于给药后1、2、3及4h测量肛温。观察体温变化情况，并通过解热百分率进行组间t检验处理，比较各组间的差异，试验结果见表7。

试验结果表明：

1.各组大鼠皮下注射10％鲜啤酒酵母混悬液6h后，体温升高均在1.5℃左右，与致热前比较差异显著(p＜0.001)，表明啤酒酵母致大鼠发热模型建立成功；

2.与模型组比较，本发明熊胆粉高剂量组200mg/kg于给药后1、2、3及4h对啤酒酵母混悬液所致大鼠发热均有明显的降温作用，而普通熊胆粉(即第一对照熊胆粉、第二对照熊胆粉)200mg/kg剂量组对啤酒酵母混悬液所致大鼠发热则无明显的降温作用(p＞0.05)；

3.本发明熊胆粉低剂量组50mg/kg及中剂量组100mg/kg于给药后1、2、3及4h对啤酒酵母混悬液所致大鼠发热则无明显的降温作用(p＞0.05)，普通熊胆粉(即第一对照熊胆粉、第二对照熊胆粉)200mg/kg剂量组与本发明的熊胆粉的中剂量组无明显差异，表明本发明熊胆粉的降温效果提高。

2.熊胆粉对伤寒、副伤寒疫苗致家兔发热的影响

实验方法：

雄性日本大耳白兔，体重1.5～2.0kg。试验前分别用WSC-411P型便携式数字测温仪测量正常肛温2次，取均值作为正常体温。然后选体温在38～39.6℃的日本大耳白兔48只，随机分为8组，即：空白对照(生理盐水)组，模型对照(0.5％羧甲基纤维素)组，本发明熊胆粉高剂量组104mg/kg、中剂量组52mg/kg、低剂量组26mg/kg、第一对照熊胆粉组104mg/kg、第二对照熊胆粉组104mg/kg及阳性药扑热息痛(50mg/kg)组。将大耳白兔置于固定器内固定。空白对照组由耳缘静脉注射生理盐水1ml/kg；模型对照组、各药物组耳缘静脉注射伤寒、副伤寒疫苗0.8ml/kg。待兔体温升高超过1℃时(约需1～1.5h，本实验限定在1h)，空白对照组和模型组灌胃给予0.5％羧甲基纤维素1ml/kg，给药组分别灌胃给予本发明高、中、低剂量熊胆粉、第一对照熊胆粉和第二对照熊胆粉、阳性对照药扑热息痛，于给药后30、60、90、120、180及240min测量肛温，观察体温变化情况，并通过解热百分率进行组间t检验处理，比较各组间的差异，结果见表8。

实验结果表明：

1、大耳白兔耳缘静脉注射伤寒、副伤寒疫苗1h后，体温升高在1℃左右，表明伤寒、副伤寒疫苗可制备家兔发热模型；

2、与空白对照组比较，模型组的体温在240min内持续升高，与模型组比较，本发明熊胆粉、第一对照熊胆粉、第二对照熊胆粉于给药后30～240min对伤寒、副伤寒疫苗所致家兔发热均有明显的解热作用，以本发明制备的熊胆粉的104mg/kg剂量组解热效果最好。

试验例4 熊胆粉抗四氯化碳致大鼠肝纤维化作用的试验

试验材料：

本发明实施例4制备熊胆粉，1g/瓶；第一对照熊胆粉，10g/袋(对照例1熊胆粉，四川省养麝研究所生产)；第二对照熊胆粉，5g/瓶(对照例2的熊胆粉，黑龙江省黑宝药业股份有限公司生产)；阳性药物：复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司，0.5g/片，批号：20090112)。

试验方法：

取清洁级雄性SD大鼠82只，体重150-200g。以其中72只采用15％四氯化碳溶液(以分析纯四氯化碳溶于植物油中，配成150ml/L溶液备用)1ml/100g体重灌胃，2次/周，连续7周。造模7周后随机处死2只大鼠，取肝脏做病理组织学检查，证实已造成肝纤维化模型。将造模成功的大鼠随机分为7组，即模型组、阳性药物组、给药高剂量组、中剂量组、低剂量组，第一对照熊胆粉组、第二对照熊胆粉组，停止造模并开始灌胃给药。取另外未造模的10只大鼠作为空白对照组。

分别灌胃给予本发明药物熊胆粉高剂量200mg/kg、中剂量100mg/kg、低剂量50mg/kg及第一对照熊胆粉200mg/kg、第二对照熊胆粉200mg/kg，每日一次；阳性药组则灌胃给予软肝片1g/kg，空白对照组及模型组均灌胃给予等容积的蒸馏水，所有大鼠灌胃容积均为10ml/kg，连续灌胃给药8周，每天观察动物一般情况，于末次给药后次日空腹采血，分离血清，以全自动生化分析仪检测血清中AST、ALT指标，结果见表9。

表9 对四氯化碳所致肝纤维化大鼠肝功能及羟脯氨酸含量的影响

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

检测结果说明：

1、由四氯化碳所诱导的肝纤维化模型大鼠的肝功能有明显损伤，模型组大鼠血清中AST、ALT及羟脯氨酸含量水平均极显著地高于正常对照组(P＜0.01)。而本发明药物高、中剂量组治疗后大鼠血清中AST、ALT及羟脯氨酸含量水平与模型组相比均有显著降低。

2、本发明药物对四氯化碳所诱导的肝纤维化模型大鼠的肝功能有明显的改善作用。普通熊胆粉(即第一对照熊胆粉、第二对照熊胆粉)的疗效相当于本发明药物的中剂量组。

试验例5 熊胆粉抗小鼠急性肝损伤作用的试验

试验材料：

本发明实施例4制备熊胆粉，1g/瓶；第一对照熊胆粉，10g/袋(对照例1熊胆粉，四川省养麝研究所生产)；第二对照熊胆粉，5g/瓶(对照例2的熊胆粉，黑龙江省黑宝药业股份有限公司生产)；阳性药物：联苯双酯滴丸(浙江万邦药业有限公司生产，1.5mg/丸；批号：20090316)

实验方法：

取清洁级NIH小鼠(长春高新医学动物实验中心，合格证号：医动字第10-5115)，160只，体重22～25g，随机分成8组，每组20只，本发明组熊胆粉低剂量组(65mg/kg)、中剂量组(130mg/kg)、高剂量组(260mg/kg)3组；第一对照熊胆粉组(260mg/kg)和第二对照熊胆粉组(260mg/kg)；空白对照组：生理盐水320mg/kg；模型组：刀豆蛋白20mg/kg；阳性药物组：联苯双酯滴丸(150mg/kg)。

本发明熊胆粉、第一对照熊胆粉、第二对照熊胆粉、阳性药物经水溶解后，按照给药剂量制备成无菌的适宜浓度溶液。除空白对照组外，其余小鼠于实验首日以20mg/kg剂量静脉注射刀豆蛋白A，用药组溶液和空白对照生理盐水均按1.2ml/kg经口灌胃，每天1次。连续3天，检测血浆ALT活性、IFN-γ和TNF-α含量，实验结果见表10。

表10 对刀豆蛋白所致免疫肝损伤小鼠血浆ALT、IFN-γ和TNF-α的影响

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

检测结果说明：本发明组熊胆粉高剂量组小鼠的ALT活性、IFN-γ和TNF-α含量均明显低于模型组，具有有显著性差异(t＝5.19，3.63，15.90，P＜0.05，0.01)，表明其对刀豆蛋白所致小鼠免疫性肝损伤具有较好的保护作用；同时，小鼠TNF-α含量与阳性药组无显著差异，也表明本发明组熊胆粉对刀豆蛋白所致小鼠免疫性肝损伤具有较好的保护作用。

试验6 抗结膜炎作用

试验材料：

本发明实施例4制备熊胆粉，1g/瓶；第一对照熊胆粉，10g/袋(对照例1熊胆粉，四川省养麝研究所生产)；第二对照熊胆粉，5g/瓶(对照例2的熊胆粉，黑龙江省黑宝药业股份有限公司生产)；阳性药物：氯霉素眼药水(吉林省博宁医药有限公司生产，8ml/支；批号：20090112)；致炎药物：二甲苯(分析纯，上海化学试剂厂生产，批号：20080915)

实验方法：

分别称取本发明熊胆粉、第一对照熊胆粉和第二对照熊胆粉各10g，用无菌注射用水溶解，过0.22μm滤膜，定溶于100毫升玻璃瓶中，灭菌后备用。试验时按实验要求稀释至相应浓度。

大耳白兔42只，雄性，体重2.3-3.0kg。首先每只白兔的右眼结膜囊上滴入8％二甲笨1滴，闭眼30秒钟，然后用注射用生理盐水冲洗3遍，制成结膜炎白兔。将白兔随机分为7组，每组6只。本发明组熊胆粉低剂量组(0.5％)、中剂量组(1％)、高剂量组(1.5％)3组；第一对照熊胆粉组(1.5％)和第二对照熊胆粉组(1.5％)；阳性药物组、模型组，每组分别滴眼给予本发明1.5％的高剂量熊胆粉滴眼液、1.0％的中剂量熊胆粉滴眼液、0.5％的低剂量熊胆粉滴眼液及1.5％的第一对照熊胆粉液、1.5％的第二对照熊胆粉液；阳性药组则滴眼给予0.25％氯霉素眼药水；模型组以注射用生理盐水滴眼，每日滴眼3次，连续滴2日，并于滴入致炎剂二甲苯后48小时，以左眼为对照判断右眼的发炎程度及药物疗效，结果进行H检验，详见表11。

发炎程度判断如下：0级结膜囊无充血水肿，无分泌物增多现象，象膜透明清晰。无水肿，混浊。1级：结膜轻度水肿和充血，但角膜透明清晰；Ⅱ级：结膜中度红肿，角膜轻度水肿；Ⅲ级：结膜明显红肿，伴角膜水肿，眼睛分泌物明显增多1Ⅳ级：结膜囊严重红肿，分泌物外溢或伴脓性分泌物，角膜水肿、混浊。

表11 熊胆粉对二甲苯刺激性眼结、角膜损伤的影响

从表11可见，对二甲苯刺激诱发的眼结膜和角膜损伤，本发明制备的熊胆粉滴眼液具有良好的治疗作用，其中1％和1.5％浓度均有显著疗效(与模型组比较，P＜0.01)；第一对照组合第二对照组熊胆粉制备的滴眼液，也具有抗炎作用，但疗效低于本发明组(与模型组比较，P＜0.05)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

将养殖于四川省养麝研究所的成年黑熊在完成术部清洗、除毛、消毒后，于腹中线剑突向下1cm处，切开皮下组织，钝性分离肌肉，切开肌膜、腹膜，把胆囊缓慢拉出，在胆囊切开1cm的创口，并与肌肉组织形成瘘管，用缝合线适度扎紧；再固定胆囊和胆囊皮肤；分别缝合腹膜、脂肪、肌膜、肌肉和皮肤；然后清洗和消毒术口。术苏醒后2小时，给予黑熊饲喂蜂蜜水或糖水和鸡蛋水；术后一周内，给予黑熊肌注或口服抗生素，防止创口感染，并注意定量饲喂合理搭配的营养饲料。痊愈后轻微挤动瘘口采集胆汁，每天定时无管引流采集熊胆汁1次，每日采集总量为50ml，共采集30天，所得熊胆汁总量为1500ml。

实施例2

将养殖于黑龙江省黑宝药业股份有限公司的成年黑熊在完成术部清洗、除毛、消毒后，于腹中线剑突向下5cm处，切开皮下组织，钝性分离肌肉，切开肌膜、腹膜，把胆囊缓慢拉出，在胆囊切开2cm的创口，并与肌肉组织形成瘘管，用缝合线适度扎紧；再固定胆囊和胆囊皮肤；分别缝合腹膜、脂肪、肌膜、肌肉和皮肤；然后清洗和消毒术口。术苏醒后3小时，给予黑熊饲喂蜂蜜水或糖水和鸡蛋水；术后一周内，给予黑熊肌注或口服抗生素，防止创口感染，并注意定量饲喂合理搭配的营养饲料。痊愈后轻微挤动瘘口采集胆汁，每天定时无管引流采集熊胆汁2次，每日采集总量为100ml，共采集30天，所得熊胆汁总量为3000ml。

实施例3

将养殖于福建省归真堂药业股份有限公司的成年黑熊在完成术部清洗、除毛、消毒后，于腹中线剑突向下10cm处，切开皮下组织，钝性分离肌肉，切开肌膜、腹膜，把胆囊缓慢拉出，在胆囊切开3cm的创口，并与肌肉组织形成瘘管，用缝合线适度扎紧；再固定胆囊和胆囊皮肤；分别缝合腹膜、脂肪、肌膜、肌肉和皮肤；然后清洗和消毒术口。术苏醒后4小时，给予黑熊饲喂蜂蜜水或糖水和鸡蛋水；术后一周内，给予黑熊肌注或口服抗生素，防止创口感染，并注意定量饲喂合理搭配的营养饲料。痊愈后轻微挤动瘘口采集胆汁，每天定时无管引流采集熊胆汁3次，每日采集总量为200ml，共采集30天，所得熊胆汁总量为6000ml。

实施例4

将购自于四川省养麝研究所的熊胆汁在4℃静置2小时，取静置后的上清液采用高速离心机进行离心处理，离心液即水溶性熊胆汁，离心转速为12000转/分，离心时间30分钟；

将水溶性熊胆汁置于真空干燥机(SZG-4500)中，在30℃、相对压力为-0.06MPa下，真空干燥8小时后，进行粉碎，过120目筛，即得到含水率为2％的熊胆粉成品。

熊胆粉为具有玻璃样光泽的亮金黄色粉末，不吸潮，于紫外灯365nm处观察呈亮黄色荧光；经薄层层析(1次，反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，层析展开剂：氯仿-丙酮-冰醋酸体积之比为7∶2∶1)，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.8，0.7，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出9个亮蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.18，0.1。其中，R_f值为0.18的亮蓝色荧光斑点，为其特有斑点。薄层层析谱图见图1、2。

实施例5

将购自于黑龙江省黑宝药业股份有限公司的熊胆汁在10℃静置24小时，取静置后的上清液采用高速离心机进行离心处理，离心液即水溶性熊胆汁，离心转速为10000转/分，离心时间45分钟；

将水溶性熊胆汁置于真空干燥机(SZG-4500)中，在60℃、相对压力-0.09MPa压力下，真空干燥48小时后粉碎，过150目筛，即得含水率为1％的熊胆粉成品。

熊胆粉为具有玻璃样光泽的亮金黄色粉末，不吸潮，于紫外灯365nm处观察呈亮黄色荧光；经薄层层析(1次，反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，层析展开剂：氯仿-丙酮-冰醋酸体积之比为7∶2∶1)，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.8，0.7，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出9个亮蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.18，0.1。其中，R_f值为0.18的亮蓝色荧光斑点，为其特有斑点。

实施例6

将购自于四川省养麝研究所的熊胆汁在4℃静置5小时，取静置后的上清液于相对压力0.3MPa下通过过滤精度为0.2微米的钛板钛棒过滤器过滤，滤液采用浸膏喷雾干燥机(ZLG300型)，在射流速度300米/秒，60℃、相对压力-0.09MPa下，以超音速速度瞬时干燥，然后粉碎，过180目筛，即得含水率为1.5％的熊胆粉成品。

熊胆粉为具有玻璃样光泽的亮金黄色粉末，不吸潮，于紫外灯365nm处观察呈亮黄色荧光；经薄层层析(1次，反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，层析展开剂：氯仿-丙酮-冰醋酸体积之比为7∶2∶1)，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.8，0.7，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出9个亮蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.18，0.1。其中，R_f值为0.18的亮蓝色荧光斑点，为其特有斑点。

实施例7

将福建省归真堂药业股份有限公司生产的熊胆汁在8℃静置10小时，取静置上清液于相对压力0.1MPa下通过过滤精度为0.5微米的钛板钛棒过滤器过滤，滤液采用浸膏喷雾干燥机(ZLG300型)，在射流速度990米/秒，30℃、相对压力-0.06MPa下，以超音速速度瞬时干燥，然后粉碎，过120目筛，即得含水率为1％的熊胆粉成品。

熊胆粉为具有玻璃样光泽的亮金黄色粉末，不吸潮，于紫外灯365nm处观察呈亮黄色荧光；经薄层层析(1次，反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，层析展开剂：氯仿-丙酮-冰醋酸体积之比为7∶2∶1)，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.8，0.7，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出9个亮蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.18，0.1。其中，R_f值为0.18的亮蓝色荧光斑点，为其特有斑点。

实施例8

将购自于四川省养麝研究所的熊胆汁在10℃静置12小时，取静置后的上清液与D101型工业大孔吸附树脂混合均匀，其中上清液与D101型工业大孔吸附树脂的重量份之比为1∶1，用水洗涤至大孔树脂流出液无胆汁颜色，所得流出液于压盖型冷冻干燥机(FD-1)中进行程序升温冷冻干燥，首先在-40℃下预冻3小时，接着，在-40℃，相对压力为20Pa下升华，干燥18小时；然后在-15℃，相对压力为5Pa下真空干燥20小时，粉碎后过100目筛，即得含水率为2％的熊胆粉成品。

熊胆粉为具有玻璃样光泽的亮金黄色粉末，不吸潮，于紫外灯365nm处观察呈亮黄色荧光；经薄层层析(1次，反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，层析展开剂：氯仿-丙酮-冰醋酸体积之比为7∶2∶1)，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.8，0.7，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出9个亮蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.18，0.1。其中，R_f值为0.18的亮蓝色荧光斑点，为其特有斑点。

实施例9

将购自于黑龙江省黑宝药业股份有限公司的熊胆汁在4℃静置18小时，取静置后的上清液与D101型工业大孔吸附树脂混合均匀，其中上清液与D101型工业大孔吸附树脂的重量份之比为1∶80，用水洗涤至大孔树脂流出液无胆汁颜色，所得流出液于压盖型冷冻干燥机(FD-1型)中进行程序升温冷冻干燥，首先在-40℃预冻5小时，接着在-15℃，相对压力为15Pa下升华，干燥24小时，然后在30℃，相对压力为10Pa下，真空干燥12小时，粉碎后过180目筛，即得含水率为1％的熊胆粉成品。

熊胆粉为具有玻璃样光泽的亮金黄色粉末，不吸潮，于紫外灯365nm处观察呈亮黄色荧光；经薄层层析(1次，反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，层析展开剂：氯仿-丙酮-冰醋酸体积之比为7∶2∶1)，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.8，0.7，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出9个亮蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.18，0.1。其中，R_f值为0.18的亮蓝色荧光斑点，为其特有斑点。

实施例10

将购自于四川省养麝研究所的熊胆汁在6℃静置8小时，取静置后的上清液采用高速离心机进行离心处理，制得水溶性熊胆汁，离心转速为12000转/分，离心时间60分钟；

将所得的水溶性熊胆汁在60℃烘干24h，粉碎后过180目筛，即得含水率为2％的熊胆粉成品。

熊胆粉为具有玻璃样光泽的亮金黄色粉末，不吸潮，于紫外灯365nm处观察呈亮黄色荧光；经薄层层析(1次，反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，层析展开剂：氯仿-丙酮-冰醋酸体积之比为7∶2∶1)，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.8，0.7，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出9个亮蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.18，0.1。其中，R_f值为0.18的亮蓝色荧光斑点，为其特有斑点。

实施例11

将购自于黑龙江省黑宝药业股份有限公司的熊胆汁在10℃静置24小时，取静置后的上清液于相对压力为0.3MPa下通过过滤精度为0.2微米的钛板钛棒过滤器过滤，滤液在80℃烘干48h后，粉碎过100目筛，即得含水率为1％的熊胆粉成品。

熊胆粉为具有玻璃样光泽的亮金黄色粉末，不吸潮，于紫外灯365nm处观察呈亮黄色荧光；经薄层层析(1次，反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，层析展开剂：氯仿-丙酮-冰醋酸体积之比为7∶2∶1)，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.8，0.7，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出9个亮蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.18，0.1。其中，R_f值为0.18的亮蓝色荧光斑点，为其特有斑点。

实施例12

将购自于四川省养麝研究所的熊胆汁在4℃静置18小时，取静置后的上清液与D101型工业大孔吸附树脂混合均匀，其中上清液与D101型工业大孔吸附树脂的重量份之比为1∶50，用水洗涤至大孔树脂流出液无胆汁颜色，所得流出液采用浸膏喷雾干燥机(ZLG300型)进行喷雾干燥，在射流速度600米/秒，45℃、相对压力-0.07MPa下，以超音速速度瞬时干燥，粉碎后过120目筛，即得含水率为1.5％的熊胆粉成品。

熊胆粉为具有玻璃样光泽的亮金黄色粉末，不吸潮，于紫外灯365nm处观察呈亮黄色荧光；经薄层层析(1次，反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，层析展开剂：氯仿-丙酮-冰醋酸体积之比为7∶2∶1)，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.8，0.7，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出9个亮蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.18，0.1。其中，R_f值为0.18的亮蓝色荧光斑点，为其特有斑点。

对照例1

以四川省养麝研究所提供的成年黑熊产的熊胆汁直接进行真空干燥处理制得的熊胆粉作为对照例2。

熊胆粉为黄色粉末，无玻璃样光泽，经薄层层析(1次，反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，层析展开剂：氯仿-丙酮-冰醋酸体积之比为7∶2∶1)，于254nm紫外灯下可检出5个蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出8个亮蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.1，薄层层析谱图见图1、2。

对照例2

以黑龙江省黑宝药业股份有限公司提供的成年黑熊产的熊胆汁直接进行真空干燥处理制得的熊胆粉作为对照例2。

熊胆粉为黄色粉末，无玻璃样光泽，经薄层层析(1次，反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，层析展开剂：氯仿-丙酮-冰醋酸体积之比为7∶2∶1)，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.8，0.7，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出8个亮蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.1，薄层层析谱图见图1、2。

对照例3

以福建省归真堂药业股份有限公司生产的的成年黑熊产的熊胆汁直接进行真空干燥处理制得的熊胆粉作为对照例3。

熊胆粉为黄色粉末，无玻璃样光泽，经薄层层析(1次，反相高效薄层板：RP-18F₂₅₄，层析展开剂：氯仿-丙酮-冰醋酸体积之比为7∶2∶1)，于254nm紫外灯下可检出7个蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.8，0.7，0.54，0.46，0.4，0.2；于365nm紫外灯下可检出8个亮蓝色荧光斑点，其R_f值分别为0.96，0.84，0.76，0.56，0.5，0.4，0.7，0.1。

实验例1 熊胆粉中有效成分的含量测定

采用中国人民共和国***部颁标准(新药转正第11册)测定优质熊胆粉样品主要有效成分牛磺熊去氧胆酸的含量。色谱条件：流动相-甲醇0.03mol/L磷酸二氢钠(65∶30)；用磷酸调PH4.4；流速：1.0ml/min；检测波长：210nm；检测器：Agilent 1100 DAD；柱温：30℃；柱子：Hypersil ODS sum 4.6×250mm。精密称定实施例4-12、对照例1、2所制备的熊胆粉，每份25mg，分别用甲醇溶解并定溶于10ml量瓶中，分别取5微升注入高效液相色谱仪测定，成品中有效成分牛磺熊去氧胆酸(C₂₆H₄₅NO₈S)含量测定结果如表12所示。

表12 熊胆粉牛磺熊去氧胆酸含量检测结果

实验例2 熊胆粉不同组分紫外吸收波长的测定

分别取实施例5、对照例1、对照例2所制备的熊胆粉各4g，以3倍量水溶解后，以等量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，乙酸乙酯萃取液水浴蒸干，得熊胆粉乙酸乙酯萃取物，再用乙腈溶解得实验样品a；水层，水浴蒸干水层，残留物干法上样，进行硅胶柱层析，洗脱剂为：体积之比为1∶2∶0.01的丙酮-水-冰醋酸，洗脱剂用量为5倍柱体积；然后，取出层析柱中的硅胶，取出硅胶柱的最上层荧光部分的硅胶，以甲醇洗脱，洗脱液蒸干后再用水溶解得实验样品c；

另取实施例5、对照例1、对照例2所制备的熊胆粉各4g，以甲醇溶解后，去除不溶部分，得熊胆粉甲醇溶解物实验样品b；

实验样品a、b、c分取用紫外分光光度仪扫描，其结果见表13。

表13 福建优质熊胆粉与不同产地熊胆粉紫外吸收波长测定结果

实验例3 熊胆粉高效液相色谱紫外指纹图谱的测定

取实施例4中的熊胆粉样品25mg溶于甲醇并定溶于10ml量瓶中，然后取20微升，注入高效液相色谱仪，用Agilent 1100 DAD检测器采集各峰的紫外指纹图谱，色谱条件：流动相-甲醇0.03mol/L磷酸二氢钠(65∶30)；用磷酸调PH4.4；流速：1.0ml/min；检测波长：210nm；检测器：Agilent 1100 DAD；柱温：30℃；柱子：Hypersil ODS sum 4.6×250mm。证实主要有效成分牛磺熊去氧胆酸和另2个主要色谱峰的紫外吸收谱波长都是198nm，唯有保留时间在3.36分钟的色谱峰的紫外吸收波长为198nm、226nm，所测定实施例4的熊胆粉的高效液相色谱图3、紫外3D谱图分别见图4-9；各峰吸收波长见表14。

表14 熊胆粉高效液相色谱紫外指纹图谱的测定结果

色谱峰号	出峰时间(min)	相对面积％	吸收波长(nm)
				1(甲醇峰)	2.54	21.04	198

2	2.90	4.95	——
				3	3.17	1.72	——
4	3.36	2.65	198，226
				5	3.58	2.96	——
6	4.02	0.89	——
				7	4.98	0.64	——
8	7.12	0.72	——
				9	11.02	37.71	198
10	20.74	2.98	198
				11	31.22	23.73	198

实验例4 熊胆粉的吸湿率测定

将实施例4-12、对照例1、2制备的熊胆粉，按照《中国药典》中的【烘干法】进行熊胆粉的水分含量测定，并计算其吸水率即含水率。

取实施例4-12、对照例1、2制备的熊胆粉各供试品2g，分别平铺于干燥至恒重的扁形称瓶中，厚度不超过5mm，精密称定；打开瓶盖在100～105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30分钟，精密称定重量；再在上述温度干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含有水分的百分数。测定结果见表15。

表15 熊胆粉的吸湿结果

组别	吸湿率(％)
		实施例4	1.01
实施例5	1.15
		实施例6	1.40
实施例7	1.52
		实施例8	1.11
实施例9	1.22
		实施例10	1.35

实施例11	1.23
		实施例12	1.18
对照例1	5.02
		对照例2	6.15

实验例5 紫外光下熊胆粉的荧光颜色观察实验

将实施例4、对照例1、2制备的熊胆粉同时置于254nm、365nm的紫外光下，观察熊胆粉的荧光颜色。观察结果如表16所示，荧光照片如图10、11。

表16 熊胆粉紫外光下荧光检测结果

Claims (10)

1.一种人工加工熊胆粉，在365nm下呈亮黄色荧光。

2.如权利要求1所述的熊胆粉，其特征是牛磺熊去氧胆酸的紫外特征吸收波长为198nm；在其后出现的色谱峰中，还有2个色谱峰的紫外吸收波长也是198nm。

3.如权利要求1所述的熊胆粉，其特征是采用高效液相色谱法测定的色谱峰中，在甲醇溶剂峰后保留时间为3.3-3.4分钟的色谱峰的紫外特征吸收波长为198nm和226nm；其中，所述高效液相色谱法的色谱条件：流动相：甲醇-0.03mol/L磷酸二氢钠，甲醇与0.03mol/L磷酸二氢钠的体积之比为65∶30；用磷酸调pH为4.4；流速：1.0ml/min；检测波长：210nm；检测器：Agilent 1100 DAD；柱温：30℃；柱子：Hypersil ODS sum 4.6×250mm。

4.如权利要求1或2所述的熊胆粉，其特征是水分含量≤2％，其中牛磺熊去氧胆酸含量≥40％。

5.一种人工加工熊胆粉的制备方法，包括如下步骤：

1)将熊胆汁静置澄清，获得上清液；

2)将上清液进行除杂处理，得到水溶性熊胭汁；

3)对水溶性熊胆汁进行干燥处理，粉碎，过筛，即得。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是步骤1)中所述静置澄清的温度为4-10℃，时间为2-24小时。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征是采用离心、过滤或吸附方法对熊胆汁上清液进行所述的除杂处理。

8.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征是步骤3)中所述的干燥处理选择烘干、真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。

9.一种人工熊胆粉，其特征是按照如权利要求5-8任一所述方法制备而成。

10.如权利要求9所述人工熊胆粉在制备治疗和预防肝炎、肝纤维化、胆结石、抗肿瘤、抗病毒、眼病、解热药物中的应用。

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