CN101129473B - 一种五指毛桃提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种五指毛桃提取物及其制备方法，该五指毛桃提取物含有香豆精、黄酮成分，其中香豆精成分质量百分比含量占15～40％，黄酮成分质量百分比含量占20～55％。本发明还公开了五指毛桃提取物在制备急慢性支气管炎、哮喘、肺气肿、慢性阻塞性肺病药物、免疫力低下疾病药物、病毒性肝炎、慢性乙型肝炎等药物中的应用。以五指毛桃提取物作为活性成分的药物组合物可制成片剂、胶囊、颗粒、滴丸、口服液或喷雾剂等剂型。本发明制备方法简单、生产成本低、可连续化生产。本发明首次从五指毛桃中分离纯化得到芹菜素，并且在五指毛桃中同时得到黄酮、香豆精有效部位的提取物。

Description

一种五指毛桃提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种天然植物有效部位提取物，特别涉及一种五指毛桃提取物及其制备方法和用途。

背景技术

五指毛桃是广东道地中药材，五指毛桃别名五指牛奶、五爪龙、南芪，并被誉为“广东人参”，特指学名为桑科植物粗叶榕Ficux hirta vahl.的干燥根。五指毛桃在广东民间使用有上千年历史，民间用于保健养生，有健脾祛湿、止咳化痰、活筋通络功效。五指毛桃的使用历史悠久，安全无毒副作用，但是五指毛桃的药用价值一直得不到深入的研究。五指毛桃在民间和临床上的用药经验主要集中在治疗慢性肺病，如慢性支气管炎、肺气肿、肺结核，和治疗慢性肝炎。但在民间和临床上，五指毛桃主要以中药复方形式使用，单味中药五指毛桃应用经验少，难以确定其药用价值与意义。曾晓春在中国中医药信息杂志2002年2月第2期，发表研究文章表明五指毛桃有镇咳、祛痰、平喘作用。中国专利申请200510002111.7公开了五指毛桃在制备化学性肝损害的辅助治疗药物用途。但是迄今为止对于五指毛桃的有效成分一直未有进行深入研究。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种五指毛桃提取物。

本发明的另一目的在于提供上述五指毛桃提取物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述五指毛桃提取物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种五指毛桃提取物，按下述方法制备而成：

(1)五指毛桃用50～100％(V/V)的乙醇或甲醇加热提取1～3次，每次提取1～3小时，过滤，合并提取液；

或者，用50～100％(V/V)乙醇或甲醇浸渍12～24小时，3～10ml/kg·min速度渗漉，收集8～16倍重量50～100％(V/V)乙醇或甲醇的渗漉液。

(2)将步骤(1)获得的提取液或渗漉液经浓缩除尽乙醇或甲醇后，加2～6倍体积量的水后，用石油醚或乙酸乙酯充分萃取，收集有机溶剂溶解部分经浓缩除尽溶剂，干燥，即得到五指毛桃提取物。

或者，将步骤(1)获得的提取液或渗漉液浓缩除尽乙醇或甲醇后，加5～10％(V/V)乙醇溶解分散后上大孔树脂吸附，先用2～4倍柱体积量的水淋洗，弃去水淋洗液，再用2～6倍柱体积量的40～70％(V/V)乙醇洗脱，收集洗脱液经浓缩除尽溶剂，干燥，即得五指毛桃提取物。

[五指毛桃提取物的化学成分分析]

五指毛桃提取物含有香豆精和黄酮成分，其中以紫外分光光度计测定五指毛桃提取物中香豆精成分含量占15～40％(质量百分比)，黄酮成分含量占20～55％(质量百分比)。其中，香豆精成分为补骨脂素、佛手柑内酯类，黄酮成分为芹菜素类。

五指毛桃提取物通过硅胶柱，薄层制备色谱，以石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，用石油醚∶乙酸乙酯结晶，分别得到补骨脂素、佛手柑内酯、芹菜素，经过化学、波谱方式测定这三个化合物通式如下：

所述五指毛桃提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)五指毛桃用50～100％(V/V)乙醇或甲醇加热提取1～3次，每次提取1～3小时，过滤，合并提取液；

或者，用50～100％(V/V)乙醇或甲醇浸渍12～24小时，3～10ml/kg·min速度渗漉，收集8～16倍重量50～100％(V/V)乙醇或甲醇的渗漉液；

(2)将步骤(1)获得的提取液或渗漉液经浓缩除尽乙醇或甲醇后，用2～6倍体积量的水后，用石油醚或乙酸乙酯充分萃取，收集有机溶剂溶解部分经浓缩除尽溶剂，干燥，即得到五指毛桃提取物；

或者，将步骤(1)获得的提取液或渗漉液浓缩除尽乙醇或甲醇后，用5～10％(V/V)乙醇溶解分散后上大孔树脂吸附，先用2～4倍柱体积量的水淋洗，弃去水淋洗液，再用2～6倍柱体积量的40～70％(V/V)乙醇洗脱，收集洗脱液经浓缩除尽溶剂，干燥，即得五指毛桃提取物。

为了更好地实现本发明，步骤(1)中特别优选五指毛桃用4～10倍重量的50～100％(V/V)乙醇或甲醇于50～85℃加热提取1～3次。

步骤(1)中，特别优选用3～6倍重量的50～100％(V/V)乙醇或甲醇浸渍12～24小时。

步骤(2)中，特别优选将步骤(1)获得的提取液或渗漉液浓缩除尽乙醇或甲醇后，用2～6倍体积量的5～10％(V/V)乙醇溶解分散后上大孔树脂吸附。

上述五指毛桃提取物的药物组合物是以五指毛桃提取物作为活性成分；所述药物组合物可制成片剂、胶囊、颗粒、滴丸、口服液或喷雾剂。

本发明所述的五指毛桃提取物具有止咳、化痰、平喘作用，可在制备急慢性支气管炎、哮喘、肺气肿或慢性阻塞性肺病等药物中应用。

本发明所述的五指毛桃提取物具有调节机体免疫力作用，可在制备肿瘤或艾滋病等免疫力低下疾病等药物中应用。

本发明所述的五指毛桃提取物具有抑制乙肝病毒DNA复制作用，可在制备病毒性肝炎或慢性乙型肝炎等药物中应用。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

本发明制备方法简单、生产成本低、可连续化生产。本发明首次从五指毛桃中分离纯化得到芹菜素，表明五指桃中含有芹菜素类黄酮成分，并且在五指毛桃中同时得到黄酮、香豆精有效部位的提取物，本发明五指毛桃提取物可用于制备治疗慢性肺病、慢性肝炎、免疫低下疾病等药物。本发明五指毛桃提取物在治疗慢性肺病中能标、本同治，具有明显的抗肺部支气管慢性炎症，有明显的止咳、祛痰、平喘作用，并且还具有明显的提高机体免疫力，提高呼吸道的的防御能力，提高肺部呼吸道对各种细菌、病毒等有害刺激的抵抗能力，防止慢性肺病的反复发作，五指毛桃提取物在治疗慢性肺病与目前其它药物有明显的优势。本发明五指毛桃提取物具有明显的抗乙型肝炎病毒作用，并且保护病毒引起的免疫性肝损害，使五指毛桃提取物在治疗慢性乙型肝炎时同时实现直接抗病毒和经免疫机制抗病毒两种途径，提高其乙型肝炎病毒表面抗原转阴率，与目前治疗慢性乙型肝炎药物相比具有明显优势。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：五指毛桃提取物的制备

取五指毛桃饮片10kg，用60kg 75％(V/V)乙醇80℃加热回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液(即提取液)减压浓缩回收除尽乙醇后，浓缩液加3倍体积量的水后，用乙酸乙酯充分萃取，收集乙酸乙酯萃取液部分，减压浓缩回收乙酸乙酯，除尽溶剂，得萃取浸膏，将萃取浸膏真空干燥，即得到五指毛桃提取物96g。

实施例2：五指毛桃提取物的制备

取五指毛桃10kg，用40kg 75％(V/V)甲醇50℃加热回流提取3次，每次提取1小时，过滤，合并滤液(即提取液)减压浓缩回收甲醇后得浓缩液。加4倍体积量的5％(V/V)乙醇溶解分散后，上20升AB-8大孔树脂吸附，用40L水洗脱淋洗除去杂质，再用40L 70％(V/V)的乙醇淋洗，收集洗脱液减压浓缩回收乙醇，得五指毛桃柱分离浸膏，将浸膏真空干燥即得五指毛桃提取物85g。

实施例3：五指毛桃提取物的制备

取五指毛桃10kg，用40kg 70％(V/V)乙醇浸渍24小时，3ml/kg·min速度渗漉，收集100kg 70％(V/V)乙醇的渗漉液；渗漉液经减压浓缩除尽乙醇后，加2倍体积量的水后，用石油醚充分萃取，收集有机溶剂溶解部分经减压浓缩除尽溶剂，真空干燥，即得到五指毛桃提取物91g。

实施例4：五指毛桃提取物的制备

取五指毛桃10kg，用30kg 100％(V/V)乙醇浸渍20小时，10ml/kg·min速度渗漉，收集80kg 100％(V/V)乙醇的渗漉液；渗漉液减压浓缩除尽乙醇后，加2倍体积量的10％(V/V)乙醇溶解分散后，上20升DA-201大孔树脂吸附，依次用80L水洗脱淋洗除去杂质，再用120L 40％(V/V)的乙醇淋洗，收集洗脱液减压浓缩回收乙醇，得五指毛桃柱分离浸膏，将浸膏真空干燥即得五指毛桃提取物88g。

实施例5：五指毛桃提取物的制备

取五指毛桃饮片10kg，用100kg 50％(V/V)乙醇85℃加热回流提取1次，每次3小时，过滤，合并滤液(即提取液)减压浓缩回收除尽乙醇，浓缩液加6倍体积量的水后，用石油醚充分萃取，收集石油醚萃取液部分，减压浓缩回收石油醚，除尽溶剂，得萃取浸膏，将萃取浸膏真空干燥，即得到五指毛桃提取物97g。

实施例6：五指毛桃提取物的制备

取五指毛桃10kg，用60kg 50％甲醇浸渍12小时，8ml/kg·min速度渗漉，收集160kg 50％甲醇的渗漉液；渗漉液减压浓缩除尽甲醇，加4倍体积量的8％乙醇溶解分散后，上20升DA-201大孔树脂吸附，依次用60L水洗脱淋洗除去杂质，再用100L 50％(V/V)的乙醇淋洗，收集洗脱液减压浓缩回收乙醇，得五指毛桃柱分离浸膏，将浸膏真空干燥即得五指毛桃提取物84g。

实施例7：五指毛桃提取物中香豆精、黄酮的测定

1.香豆精含量测定

仪器：紫外分光光度仪：Perk Elmer Lambda 35(德国)。

对照品溶液的制备：精密称取对照品补骨脂素4.9mg于50ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，精密称取该溶液4ml于10ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，得0.0392mg/ml对照品溶液。

供试品溶液的制备：分别精密称取①五指毛桃提取物(实施例1制得)18.6mg，②五指毛桃提取物(实施例2制得)18.4mg，③五指毛桃提取物(实施例3制得)18.5mg，④五指毛桃提取物(实施例4制得)18.4mg置100ml的容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度得供试品溶液。分别精密量取四个供试品溶液各1ml于5ml容量瓶中，加乙醇稀释至刻度得四个供试品溶液的浓度分别为0.0372mg/ml、0.0368mg/ml、0.0370mg/ml、0.0368mg/ml。

测定波长的选择：在190～550nm分别扫描补骨脂素对照品及样品①供试品溶液，两者在286nm处均有一个吸收峰，且峰形变化平缓，便于定量测定，因此，将286nm作为测定波长。

标准曲线的制定：精密吸取补骨脂素对照品溶液各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，分别用乙醇定容至5ml容量瓶中。以乙醇为空白，于286nm处测定。以浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标作图，得回归方程：A＝0.0672C-0.0241(r²＝0.9995，n＝6)。结果表明，补骨脂素对照品溶液浓度在1.57～9.41μg/ml范围内，吸光度与浓度的线性关系良好。

香豆素含量测定结果如表1所示。

表1测定①、②、③、④样品中总香豆素的含量结果

2.黄酮含量测定

仪器：紫外分光光度仪：Perk Elmer Lambda 35(德国)。

对照品溶液的制备：精密称取对照品芹菜素4.7mg于50ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，精密称取该溶液4ml于10ml容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，得0.0376mg/ml对照品溶液。

供试品溶液的制备：分别精密称取①五指毛桃提取物(实施例1制得)18.6mg，②五指毛桃提取物(实施例2制得)18.4mg，③五指毛桃提取物(实施例3制得)18.5mg，④五指毛桃提取物(实施例4制得)18.4mg置100ml的容量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度得供试品溶液。分别精密量取四个各1ml于5ml容量瓶中，加乙醇稀释至刻度得四个供试品的浓度分别为0.0372mg/ml、0.0368mg/ml、0.0370mg/ml、0.0368mg/ml。

测定波长的选择：分别精密吸取芹菜素对照品溶液及①供试品溶液，分别置5mL量瓶中，加1mL的5％NaOH乙醇溶液，加乙醇至刻度，摇匀，于50℃水浴加热2h，放置至室温，以相应试剂作空白，参照紫外一可见分光光度法，在190～600nm波长范围内进行光谱扫描，考察最大吸收波长。结果表明，对照品溶液和供试品溶液均在250nm处有最大吸收，故确定250nm为测定波长。

标准曲线的制定：精密吸取芹菜素对照品溶液各0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml，按NaOH显色方法进行显色。以乙醇为空白，于250nm处测定。以浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标作图，得回归方程：A＝0.066C-0.2786(r²＝0.9993，n＝6)。结果表明，芹菜素对照品溶液浓度在6.02～13.54μg/ml范围内，吸光度与浓度的线性关系良好。

黄酮含量测定结果如表2所示。

表2测定①、②、③、④样品中总黄酮的含量结果

实施例8：五指毛桃提取物止咳、化痰、平喘作用研究

药物：①五指毛桃提取物(实施例1制得)，②五指毛桃提取物(实施例2制得)，③五指毛桃提取物(实施例3制得)，④五指毛桃提取物(实施例4制得)。

动物：SPF级NIH小鼠，18～22g，雌雄各半；白化豚鼠，200g～220g，雌雄各半。

仪器：YLS-8A多功能诱咳引喘仪，752N型紫外可见分光光度计，SIGMA3K30冷冻高速离心机，Sartorius BS224S万分之一电子天平。

1、对小鼠氨水致咳的影响：

取NIH小鼠，雌雄各半，随机分为7组，分别为空白组、磷酸可待因对照组，牡荆油滴丸对照组，五指毛桃提取物①、②、③、④四组，每组5.20生药/kg剂量给药。各给药组按剂量灌胃给药，空白组给予等体积生理盐水，每天1次，连续3d。末次给药1h后，将小鼠逐只放入YLS-8A多功能诱咳引喘仪中，由仪器喷雾氨水15s，记录小鼠的咳嗽潜伏期和2min内的咳嗽次数，计算咳嗽次数抑制率。

表3  五指毛桃提取物对小鼠氨水致咳的影响

注：①可待因、牡荆油剂量单位为mg/kg；②与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

实验结果如表3所示，五指毛桃提取物具有明显的镇咳作用，五指毛桃提取物镇咳作用接近于可待因镇咳作用，并明显优于牡荆油的镇咳作用。

2、对小鼠气管酚红***量的影响：

取NIH小鼠，雌雄各半，随机分为7组，分别为空白组、氯化胺对照组，牡荆油滴丸对照组，五指毛桃提取物①、②、③、④四组，每组5.20生药/kg剂量给药。各给药组按剂量灌胃给药，对照组给予等体积生理盐水，每天1次，连续3d。末次给药1h后，各鼠按剂量0.01mL/g^-1体重腹腔注射5％的酚红溶液，注射后0.5h，将小鼠颈椎脱臼处死，仰位固定于手术板上剪开颈前皮肤，分离气管，剥离气管周围组织，剪下甲状软骨下缘至气管分叉处之气管，用5％碳酸氢钠溶液0.5mL冲洗气管，连续3次，洗出液合并，置于紫外可见分光光度计上于546nm波长处测定A，并根据实验前制定的标准曲线计算出气管冲洗液中酚红浓度。

实验结果如表4所示，五指毛桃提取物具有明显的祛痰作用，五指毛桃提取物祛痰作用明显优于牡荆油，接近氯化胺祛痰作用。

3、对组织胺喷雾致豚鼠哮喘的影响：

取豚鼠，雌雄各半，随机分为7组，分别为空白组、氨茶碱对照组，牡荆油滴丸对照组，五指毛桃提取物①、②、③、④四组，每组5.20生药/kg剂量给药。各给药组按剂量灌胃给药，对照组给予等体积生理盐水，每天1次，连续3d。末次给药1h后，将豚鼠逐只放入YLS-8A多功能诱咳引喘仪中，由仪器喷雾1mg/mL磷酸组胺1min，观察并记录豚鼠从接受喷雾开始到发生抽搐跌倒的时间(即引喘潜伏期)，引喘潜伏期超过5min者以5min计，以给药前后引喘潜伏时间差，计算引喘潜伏时间。

表4五指毛桃提取物以小鼠气管酚红***量的影响

注：①氯化胺、牡荆油剂量单位为mg/kg；②与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

表5  五指毛桃对组织胺喷雾豚鼠哮喘的影响

注：①氨茶碱、牡荆油剂量单位为mg/kg。

实验结果如表5所示，五指毛桃提取物具有明显的平喘作用，五指毛桃提取物平喘作用接近于氨茶碱作用，并明显优于牡荆油的平喘作用

实施例9：五指毛桃提取物治疗慢性支气管炎的研究

药物：①五指毛桃提取物(实施例1制得)，②五指毛桃提取物(实施例2制得)，③五指毛桃提取物(实施例3制得)，④五指毛桃提取物(实施例4制得)。

试剂：内毒素。

仪器：万分之一电子称，全自动生化分析仪，奥林巴斯显微镜等。

动物：SPF级Wistar大鼠。

取雄性SPF级Wistar大鼠，体重180～220g，随机分为空白组、COPD模型组(模型组)、牡荆油滴丸阳性药物组、五指毛桃提取物①、②、③、④四组每组5.20生药/kg剂量给药，每组10只。除空白组外，其余各组大鼠第1、14天气管内注入2g/2L内毒素LPS(Sigma公司)200uL，第2～28天(第14d除外)将大鼠置入有机玻璃仓内，注入大前门过滤嘴香烟烟雾，浓度约5％(v/v)，0.5h/d。造模的同时，各给药组按剂量灌胃给药，空白组和模型组给予等体积蒸馏水，每天1次，连续28d。

支气管形态学测量  随机选取HE染色切片中直径(100～200um)较规整的小支气管横截面，每只动物选3个，采用多功能彩色图像分析***(CMIAS)。管腔测量模块测量下列指标：管腔内径、管腔外径。

表6五指毛桃提取物对大鼠慢性支气管炎支气管壁厚度影响

注：①牡荆油剂量单位为mg/kg；②与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

实验结果如表6所示，五指毛桃提取物能明显减轻烟熏+LPS致大鼠慢性支气管炎模型的细支气管炎症增厚狭窄，并且效果明显优于牡荆油对照组。表明五指毛有明显治疗支气管慢性炎症作用。

实施例10：五指毛桃提取物对乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的抑制作用

药物：①五指毛桃提取物(实施例1制得)，②五指毛桃提取物(实施例2制得)，③五指毛桃提取物(实施例3制得)，④五指毛桃提取物(实施例4制得)；培养液配成5mg/ml，1000转/分离心5分钟，0.2um滤膜除菌过滤。

实验用细胞：2.2.15细胞株。

2.2.15细胞株是用共转染法将克隆的HBV-DNA和抗6418质粒同时转入人肝癌细胞株HepG2而建立，能长期稳定地分泌HbsAg、HBcAg和完整的Dane颗粒，是目前体外抗HBV药物筛选和评价较好的细胞模型。2.2.15细胞用DMEM培养液，培养液添加10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，80ug/ml G418，0.03％谷氨酰氨，用0.238％Hepes调pH至6.8。用0.06％胰蛋白酶将2.2.15细胞分散成单个细胞悬液，按3×10⁴细胞/0.1ml/孔分种于96孔板，2d后换用含药培养液，每个浓度加四孔，根据预实验结果，3组五指毛桃提取物用细胞维持液分别稀释成8个浓度10mg/ml、5mg/ml、2.50mg/ml、1.25g/ml、0.625mg/ml、0.312mg/ml、0.156mg/ml、0.078mg/ml，并设空白对照组和细胞对照组。与细胞作用11d后，吸上清液以ELISA法测定HBsAg和HBeAg，余下细胞用MTT法测定药物细胞毒性。MTT法测定药物对细胞生长的半数毒性浓度，向细胞加入400ug/ml MTT 0.1ml/孔，37℃5％CO₂孵育4h，可见黄黑色甲攒颗粒，弃去MTT液，加入100％DMSO 0.1ml/孔，待甲攒颗粒完全溶解(约10min)后，用酶标仪570nm波长测定OD值，空白对照设四孔，加100％DMSO 0.1ml/孔。按下式计算半数毒性浓度(TC₅₀)。

A＝log＞50％药物浓度；B＝log＜50％药物浓度；C＝A-B

HBsAg、HBeAg的检测，采用ELISA测定盒检测。用酶标仪450/630nm双波长测定每孔OD值，并计算药物的半数有效浓度(IC₅₀)

A＝log＞50％药物浓度；B＝log＜50％药物浓度；C＝A-B；

治疗指数(TI)TI＝TC₅₀/IC₅₀。

选择HBsAg、HBeAg作为药物效果的初步筛选指标，通过MTT法测定药物的细胞毒性浓度，并相应计算出治疗指数来评价药物临床应用前景，其中TI＞2为有效低毒，1＜TI＜2为低效有毒，TI＜1为毒性作用。研究结果显示，受试药物对细胞存活影响较小，治疗指数大于2，均属有效低毒，五指毛桃提取物对HBsAg和HBeAg的分泌呈著抑制作用。

表7五指毛桃提取对HBsAg和HBeAg的抑制效果及其细胞毒性

实验结果如表7所示，五指毛桃提取物有明显体外抗HBsAg和HBeAg作用。

实施例11：五指毛桃提取物对免疫性肝损害的保护作用研究

药品：①五指毛桃提取物(实施例1制得)，②五指毛桃提取物(实施例2制得)，③五指毛桃提取物(实施例3制得)，④五指毛桃提取物(实施例4制得)。

动物：SPF级NIH小鼠，18～22g，雌雄各半。

将实验小鼠随机分成7组，模型组、阳性药物对照组、五指毛桃提取物①、②、③、④四组，每组5.20生药/kg剂量给药，每只尾静脉各注射卡介苗(BCG，含菌量约为5×10⁶/只)0.2ml，空白组注射等体积生量盐水0.2ml，用药组每日给药一次，感染BCG后12天，末次给药2h后，ivLPS10ug/鼠，16h后测血清转氨酶水平。

表8五指毛桃提取物对BCG+LPS诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用

注：①联苯双酯剂量单位为mg/kg；②与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

实验结果如表8所示，用BCG+LPS诱导免疫性肝损伤模型鼠血清ALT明显升高，而五指毛桃提取物能显著降低血清ALT水平，且接近空白组，说明五指毛桃提取物对小鼠免疫性肝损伤有明显保护作用。

实施例12：五指毛桃提取物对环磷酰胺致小鼠免疫功能低下的作用

实验药物：①五指毛桃提取物(实施例1制得)，②五指毛桃提取物(实施例2制得)，③五指毛桃提取物(实施例3制得)，④五指毛桃提取物(实施例4制得)。

实验动物：雌性健康Balb/c小鼠，体重18～22g。

取雌性健康小鼠72只，随机分为7组，生理盐水空白对照组，五指毛桃提取物①、②、③、④四组，每组5.20生药/kg剂量给药，模型组，每组12只。实验开始时除正常对照组外，其余各组小鼠分别每3d分别腹腔注射环磷酰胺30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg，共3次。同时按各剂量组开始灌胃给药，正常对照组及环磷酰胺模型组每日灌胃给予同体积的生理盐水。给药2周，于末次给药30min后，将小鼠处死，解剖，取脾脏，胸腺准确称重。结果用脏器指数(mg/10g)＝胸腺或脾重量(mg)/小鼠体重*10g。

表9五指毛桃提取物对正常小鼠免疫器官，脾指数，胸腺指数的影响

注：与空白组对比^**P＜0.01。

实验结果如表9所示，用环磷酰胺引起小鼠免疫低下模型，小鼠脾指数与胸腺指数明显降低，而五指毛桃提取物能显著对抗环磷酰胺致小鼠免疫低下，且接近空白组，说明五指毛桃提取物对小鼠免疫力有明显提高作用。

实施例13：五指毛桃提取物对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

实验药物：①五指毛桃提取物(实施例1制得)，②五指毛桃提取物(实施例2制得)，③五指毛桃提取物(实施例3制得)，④五指毛桃提取物(实施例4制得)。

实验动物：雌性健康Balb/c小鼠，体重18～22g。

取50只雌性健康Balb/c小鼠，随机分为6组，生理盐水空白对照组，五指毛桃提取物①、②、③、④四组，每组5.20生药/kg剂量给药，黄芪颗粒对照组，每组10只。分别给小鼠灌胃给各组药物，连续给7d。第8天脱颈处死小鼠，迅速剪开腹腔皮肤，无菌注射Hank′s溶液3ml于腹腔中，轻揉腹部，抽取腹腔液，1000r/min离心10min，取上清液。用PH7.4磷酸缓冲液定容至5ml，加入0.5％鸡红细胞0.4ml，于37℃，5％CO₂养箱孵育30min。取1～2滴离心推片，用瑞氏液染色1分钟，再加等量蒸馏水，轻轻混合，经5分钟后用蒸馏水冲洗，待干，油镜下观察镜检，计算吞噬百分数＝(吞噬CRBC的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数)×100％和吞噬指数＝(被吞噬的CRBC数/计数的巨噬细胞数)。

表10五指毛桃提取物对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

注：与空白组对比^*P＜0.05，^**P＜0.01

实验结果如表10所示，五指毛桃提取物能明显提高小鼠巨噬细胞吞噬能力，且效果明显优于黄芪对照组。

实施例14：五指毛桃提取物滴丸的制备

五指毛桃滴丸各组份的重量配比为：

五指毛桃提取物    4.35g

聚乙二醇(4000)    26.10g

聚乙二醇(6000)    6.53g

制备五指毛桃滴丸的方法如下：

将聚乙二醇(4000)26.10g、聚乙二醇(6000)6.53g置于水浴上加热，使熔融；加入4.35g五指毛桃提取物，搅拌均匀，持续搅拌，98℃保温待用；将滴丸机预热，贮液室恒温为98±2℃，冷却大豆油预冷至10～12℃，调节滴嘴与冷却液面的距离，将药液倒入贮液室，启动阀门，将药液逐滴滴入冷却剂中，滴速约为30滴/分；打开收集口阀门，收集滴丸，纱布滤除冷却剂，并吸除表面残余油渍，摊开，晾干，即得成型的五指毛桃提取物滴丸。

实施例15：五指毛桃提取物胶囊的制备

五指毛桃胶囊各组份的重量配比为：

五指毛桃提取物    5g

淀粉              100g

乳糖              20g

羟丙纤维素    20g

聚山梨酯80    16g

滑石粉        2.5g

将按上述配比的五指毛桃提取物、淀粉、乳糖和羟丙纤维素过60目筛混均，加入16g的聚山梨酯80，制软材，过20目筛制粒。40～50℃烘箱鼓风干燥，干颗粒过20目筛整粒，加入2.5g的滑石粉，混合均匀。按处方量灌装1号胶囊，即得五指毛桃提取物胶囊。

实施例16：五指毛桃提取物片的制备

五指毛桃片各组份的重量配比为：

五指毛桃提取物    5g

淀粉              100g

微晶纤维素        20g

羟甲基纤维素钠    20g

聚山梨酯80        16g

滑石粉            2.5g

将按上述配比的五指毛桃提取物、淀粉和微晶纤维素、羟甲基纤维素钠过60目筛混均，加入16g的聚山梨酯80，制软材，过20目筛制粒。40～50℃烘箱鼓风干燥。干颗粒过20目筛整粒，加入2.5g的滑石粉，混合均匀，压片，即得五指毛桃提取物片。

实施例17：五指毛桃提取物颗粒的制备

五指毛桃颗粒各组份的重量配比为：

五指毛桃提取物  5g

甲基纤维素      15g

糖粉            240g

将五指毛桃提取物、甲基纤维素和糖粉按上述配比混合均匀，用70％乙醇制成软材，制粒，挥去乙醇，制成颗粒，即得五指毛桃提取物颗粒。

实施例18：五指毛桃提取口服液的制备

五指毛桃提取物    5g

糖粉          100g

吐温-80       10ml

无菌水        1000ml

将按上述配比的五指毛桃提取物和糖粉溶于1000ml无菌水中，加入10ml吐温-80，搅匀溶解，过滤，分装于10ml棕色瓶中，置灭菌柜中灭菌，即得五指毛桃提取物口服液。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1. 4.根据权利要求2所述的五指毛桃提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中用3～6倍重量的50～100％乙醇或甲醇浸渍12～24小时。
2. 5.根据权利要求2所述的五指毛桃提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中将步骤(1)获得的提取液或渗漉液浓缩除尽乙醇或甲醇后，用2～6倍体积量的5～10％乙醇溶解分散后上大孔树脂吸附。
3. 6.根据权利要求2所述的一种五指毛桃提取物的制备方法，其特征在于：所述五指毛桃提取物含有香豆精和黄酮成分，所述香豆精成分质量百分比含量占15～40％，黄酮成分质量百分比含量占20～55％。
4. 7.一种权利要求1所述的五指毛桃提取物的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物是以五指毛桃提取物作为活性成分；所述药物组合物制成片剂、胶囊、颗粒、滴丸、口服液或喷雾剂。
5. 8.权利要求1所述的五指毛桃提取物在制备治疗急慢性支气管炎、哮喘、肺气肿或慢性阻塞性肺病药物中的应用。
6. 9.权利要求1所述的五指毛桃提取物在制备治疗免疫力低下疾病药物中的应用。
7. 10.权利要求1所述的五指毛桃提取物在制备治疗病毒性肝炎或慢性乙型肝炎药物中的应用。