CN102108376A

CN102108376A - 茯砖茶中金花菌菌种鉴定方法

Info

Publication number: CN102108376A
Application number: CN 201010598206
Authority: CN
Inventors: 赵运林; 彭晓赟
Original assignee: Hunan City University
Current assignee: Hunan City University
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2010-12-21
Publication date: 2011-06-29

Abstract

一种茯砖茶中金花菌菌种鉴定方法，将茯砖茶的金花菌接种于PDA培养基上进行分离、纯化，再通过20％察式培养基与70％察氏培养基分别诱导产生有性型与无性型，观察其菌落结构，并结合光学显微镜与电子显微镜观察其显微结构，对金花菌进行鉴定。本发明选择了合适的培养基对茯砖茶上的菌种进行了有效的分离、纯化及保存，同时，在最短的时间内诱导出金花菌的有性型和无性型，并进行观察、鉴定，为茯砖茶上金花菌对茯砖茶的食用安全性以及对茶叶品质的影响和茯砖茶的保健功能等后续研究奠定基础。

Description

茯砖茶中金花菌菌种鉴定方法

技术领域：

本发明涉及农产品加工技术领域，具体涉及茯砖茶中金花菌的分离纯化及其有性型与无性型亚显微特征的鉴定方法。所述金花，即冠突散囊菌。

背景技术

茯砖茶是古老茶类——黑茶中的高档品种。与其它茶类的不同之处在于茯砖茶的制作过程中多了一步“发花”工艺，从而使其在饮用的过程中具有特殊的“菌花香”，而“发花”的实质是促进冠突散囊菌(Eurotium cristatum)滋生，产生金黄色的闭囊壳(俗称“金花”)的过程并且消费者根据“金花”的多少来评价茯砖茶品质好坏。

从20世纪50年代就有学者对茯砖茶发花中优势菌种名的鉴定做过研究。1952年赵学慧曾研究指出茯砖茶的“金花菌”为子囊菌纲(Ascomycetes)闭囊壳菌类(Plectomycetes))，其种名可能是谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri)或匍匐曲霉(A.repers)。但由于缺乏电镜观察有性和无性孢子形态特征的证据，故未定论。1986年温琼英对该菌的子囊孢子进行了电镜观察并拍摄了照片，与英联邦真菌研究所的冠突曲霉模式菌株172280作了比较，认为此菌与模式菌株在培养特征和显微特征上是一致的，因此将该菌初步定为冠突曲霉(A.cristatum)。1990年齐祖同对该菌又作了进一步的研究，认为使用冠突曲霉这一名称与国际植物命名法规相抵触，正式将该菌鉴定为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)，无性型名称为针刺曲霉(A.spiculosus)，异名为冠突曲霉。但同年，刘作易对不同来源茯砖茶上“金花菌”的生长发育过程、形态特征、菌落特征、子囊孢子和分生孢子的亚显微结构等进行了研究，鉴定为灰绿曲霉组谢瓦氏曲霉变种(A.chevalieri var.intermidius)。1991年，***等人对18份茯砖茶样品进行分离鉴定，共分离出冠突散囊菌、间型散囊菌(E.intermedius)、匍匐散囊菌(E.repens)、谢瓦散囊菌(E.chevalieri)、阿姆斯特丹散囊菌(E.amstelodami)、赤散囊菌(E.rubrum)和一种未定名的散囊菌(E.sp.)共7种散囊菌。由此可见，前人在缺乏电镜观察其有性和无性孢子亚显微结构特征的前提下，仅凭肉眼观察菌落特征和光镜观察显微结构而对“金花菌”进行种名鉴定有一定的局限性。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：解决上述现有技术存在的问题，而提供一种茯砖茶中金花菌菌种鉴定方法，对茯砖茶金花菌进行分离、纯化及其有性型与无性型进行鉴定，为茯砖茶金花菌对茯砖茶食用安全性以及对茶叶品质影响和茯砖茶保健功能等后续研究奠定基础。

本发明采用的技术方案是：将茯砖茶的金花菌接种于马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)上进行分离、纯化，再通过20％察式培养基与70％察氏培养基分别诱导产生有性型与无性型，观察其菌落结构，并结合光学显微镜与电子显微镜观察其显微结构，对金花菌进行鉴定。

上述技术方案中，所述的茯砖茶的金花菌接种于PDA培养基上进行分离、纯化，具体为：将长有金花的茶叶或茶梗接种于PDA培养基上，27℃下恒温箱培养3天，挑取菌种一小块接种于PDA平板中央，反复三次后，菌落外形一致即已纯化，将纯化了的单个菌种接种于PDA斜面培养基上，于27℃下培养，长成菌落后于4℃冰箱保存。

上述技术方案中，所述的通过20％察氏培养基诱导产生有性型，观察其菌落结构，具体为：从纯化的PDA培养基上挑取一小块菌落接种于20％察式培养基上(CZ20)上，27℃下恒温箱培养12天，观察其形态特征，并结合光学显微镜与电子显微镜观察其亚显微结构，鉴定金花有性型为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。

上述技术方案中，所述的通过70％察氏培养基诱导产生无性型，观察其菌落结构，具体为：从纯化的PDA培养基上挑取一小块菌落接种于70％察式培养基(CZ70)上，27℃恒温箱培养3天，观察其形态特征，并结合光学显微镜与电子显微镜观察其亚显微结构，鉴定金花菌无性型为小冠曲霉(Aspergilus cristatellus)

由此可见，金花菌是产生有性型即子囊孢子阶段和无性型即分生孢子阶段的全型真菌，以《The GENUS Aspergillus》(Raper and Fennen 1965)为主要鉴定参考，按照国际植物命名法规它的正确名称是以有性型为模式的最早合法名称，故金花菌鉴定结果为冠突散囊菌。

上述技术方案中，所述的PDA指Potato Dextrose Agar的简称，中文含义为：马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

PDA琼脂培养基指将马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块放入烧杯中，加1000mL蒸馏水，煮沸10-20min，稍冷后用双层纱布过滤，在滤液中加入15g琼脂，加热熔化，最后加入葡萄糖20g，混匀，用量筒定容至1000mL，趁热分装在三角瓶中，在1.1kg/cm²(121℃)中保持20分钟灭菌。

PDA平板指上述培养基灭菌结束后冷却至50℃左右，在超净工作台上将培养基倒入事先已经灭菌并干燥的培养皿中，待冷却即为制得的PDA琼脂固体培养基平板。

本发明选择了合适的培养基对茯砖茶上的菌种进行了有效的分离、纯化及保存；同时，本发明选择了几种高效的培养基，在最短的时间内诱导出金花菌的有性型和无性型，在光学显微镜和电子显微镜下观察、鉴定，为茯砖茶的食用安全性，以及对茶叶品质的影响和茯砖茶的保健功能等后续研究奠定了基础。

附图说明：

图1为金花菌有性型闭囊壳的电子显微镜观察照片；

图2为金花菌有性型子囊的电子显微镜观察照片；

图3为金花菌有性型子囊孢子的电子显微镜观察照片；

图4为金花菌无性型发育过程中的顶囊的电子显微镜观察照片；

图5为金花菌无性型发育过程中的产孢结构单层的电子显微镜观察照片；

图6为金花菌无性型分生孢子头的电子显微镜观察照片；

图7、图8为金花菌无性型的分生孢子的电子显微镜观察照片；

图9为二枝分生孢子梗的电子显微镜观察照片；

图10为光学显微镜下观察到的分生孢子头与分生孢子照片；

具体实施方式：

实施例1：茯砖茶中菌种分离、纯化的培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(即PDA)：按重量份取：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g。马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，煮沸10-20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。0.1MPa灭菌30min，灭菌后取10ml倒入已灭菌好的培养皿中冷却。

实施例2：茯砖茶中菌种分离、纯化与保存的方法：

按四分法从茯砖茶不同部位取带有金花颗粒的茶叶或茶梗呈三角形接种于PDA培养基上，27℃下恒温箱培养3天，挑取菌种一小块接种于PDA平板中央，反复三次后，菌落外形一致即以纯化。将纯化了的单个菌种接种于PDA斜面培养基上，于27℃下培养，长成菌落后于4℃冰箱保存。

实施例3：诱导金花菌菌种有性型的培养基：

20％察氏培养基(即CZ20)：按重量份取：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖200g，琼脂20g，pH自然，pH为5.0～5.5，定容至1000mL。0.1MPa灭菌30min，灭菌后取10ml倒入已灭菌好的培养皿中冷却。放置3天后观察培养基上无杂菌产生即可接种。

实施例4：金花菌菌种有性型的鉴定：

挑取实施例3中培养的一小块菌落进行接种，菌落生长较快，27℃下菌落直径20.5-38mm，12天50-84mm，周边黄色，或浅橄榄黄色，中间部分颜色较深，淡桔黄色，背面橙褐色，老后颜色变深，菌落中央有时具有少量黑色渗出液，背面呈黑褐色、灰黄褐色或深橄榄褐色。在光学显微镜下观察其特征：可见大量闭囊壳，球形或近球形，黄色，闭囊壳直径62-177μm，子囊球形，直径7.8-12μm，内含8个子囊孢子，子囊孢子双凸透镜形，具两条明显的纵向鸡冠状突起，表面粗糙，大小为4.8-6.6×3.9-6.3μm。在电镜下观察，其特征：闭囊壳近球形，在闭囊壳内有很多子囊，每个子囊由8个子囊孢子组成，子囊孢子双凸透镜形，中缝道沟部分具两条明显的裙边，较薄，偶见反卷，宽约0.3-1.3μm，中缝道沟较深，都底几乎与孢子表面平行，孢子表面粗糙具疣突。以《The GENUS Aspergillus》(Raper and Fennen 1965)为主要鉴定参考，鉴定金花菌有性型为冠突散囊菌，其亚显微结构如图1、图2、图3所示。

实施例5：诱导金花菌菌种无性型的培养基：

70％察氏培养基(即CZ70)：按重量份取：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖700g，琼脂20g，pH自然，pH为5.0～5.5，定容至1000mL。0.1MPa灭菌30min，灭菌后取10ml倒入已灭菌好的培养皿中冷却。放置3天后观察培养基上无杂菌产生即可接种。

实施例6：金花菌菌种无型性的鉴定：

挑取实施例5中的一小块菌落进行接种，27℃下恒温箱培养3天，观察发现大量灰绿色分生孢子头生于灰白色的直立菌丝上，球形，直径一般为14-30mm，分生孢子梗长度为163-622.5μm，壁光滑；孢子梗独立生长或分两枝，顶囊烧瓶形，直径15-31μm，产孢结构单层，瓶梗密集于顶囊上，分生孢子串生于瓶梗上，未成熟时分生孢子外有薄膜包被，成熟后薄膜裂开露出分生孢子外形，光学显微镜下可见表面有刺突，电子显微镜下观察表面有瘤状突起，无刺，这主要是由于放大倍数的不同而导致观察结果有所出入，从而在亚显微结构的形态学描述上因以电镜观察的结果为准，与《The GENUS Aspergillus》(Raper and Fennen 1965)中的描述并不矛盾。分生孢子椭圆形，少数近球形，两端平截，3.9-6.1×3.9-5.9μm，鉴定金花菌无型性为小冠曲菌，其亚显微结构如图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10。

上述技术方案中和具体实施方式中，所述的四分法：一种取样方法。将采集的样品放在干净的塑料薄膜上平铺成四方形，划分对角线，分成四份，保留对角的两份，其余两份弃去；如果保留的数量仍很多，可再用四分法处理，直至对角的两份达到所需数量为止。

所述的孢子″赤道部分″：孢子为真菌在繁殖过程中的就是无性生殖细胞。冠突散囊菌孢子为球形或近球形，″赤道部分″即是环绕孢子表面并介于远、近两极之间的圆周线。

所述的70％或20％察氏培育基：

察氏培养基是一种运用于青霉、曲霉鉴定及保存菌种用的培养基。其配方是硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，pH自然(pH为5.0～5.5)，定容至1000mL。70％(或20％)察氏培养基其实就是改良察氏培养基。70％察氏培养基就是在传统察氏培养基的基础上将其蔗糖含量调制培养基总量的70％，20％察氏培养基就是在传统察氏培养基的基础上将其蔗糖含量调制培养基总量的20％。

Claims

1.一种茯砖茶中金花菌菌种鉴定方法，其特征在于：将茯砖茶的金花菌接种于PDA培养基上进行分离、纯化，再通过20％察氏培养基与70％察氏培养基分别诱导产生有性型与无性型，观察其菌落结构，并结合光学显微镜与电子显微镜观察其显微结构，对金花菌进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的茯砖茶中金花菌菌种鉴定方法，其特征在于：所述的茯砖茶的金花菌接种于PDA培养基上进行分离、纯化，具体为：将长有金花的茶叶或茶梗接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基即PDA上，27℃下恒温箱培养3天，挑取菌种一小块接种于PDA平板中央，反复三次后，菌落外形一致即已纯化，将纯化了的单个菌种接种于PDA斜面培养基上，于27℃下培养，长成菌落后于4℃冰箱保存。

3.根据权利要求1所述的茯砖茶中金花菌菌种鉴定方法，其特征在于：所述的通过20％察氏培养基诱导产生有性型，观察其菌落结构，具体为：从纯化的PDA培养基上挑取一小块菌落接种于20％察式培养基上，即CZ20上，27℃下恒温箱培养12天，观察其形态特征，并结合光学显微镜与电子显微镜观察其亚显微结构，鉴定金花有性型为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。

4.根据权利要求1所述的茯砖茶中金花菌菌种鉴定方法，其特征在于：所述的通过70％察氏培养基诱导产生无性型，观察其菌落结构，具体为：从纯化的PDA培养基上挑取一小块菌落接种于70％察式培养基上，即CZ70上，27℃恒温箱培养3天，观察其形态特征，并结合光学显微镜与电子显微镜观察其亚显微结构，鉴定金花菌无性型为小冠曲霉(Aspergilus cristatellus)。