CN102105481B - 用于核酸热启动扩增的化学修饰的核苷5’-三磷酸 - Google Patents
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Abstract
本文提供的是用于核酸扩增的方法和组合物。这些方法涉及3’-取代核苷5’-三磷酸或3’-取代终止引物在核酸扩增反应中的应用。在某些方面，该方法通过使用在核酸扩增中提供效用的3’-取代NTPs和/或3’-取代终止引物完成。在优选的实施方式中，NTPs和/或引物在3’-位置被特定热不稳定化学基团诸如醚、酯或碳酸酯取代。
Description
技术领域
本文提供的是用于核酸复制的方法和组合物。在一些具体的方面和实施方式中，所述方法和组合物用于热启动的核酸扩增。
背景技术
提供下列说明以帮助读者理解。所提供的信息或引用的参考文献没有一个被承认是本发明的现有技术。
聚合酶链式反应(PCR)很可能是现代分子生物学和生物技术中最广泛应用的方法，并且被迅速应用到遗传检测、诊断学、法医学和生物防御。Kolmodin，L.A.，etal.，NucleicAcidProtocolsHandbook，569-580(Rapley，R.ed.，HumanaPress2000)；Budowle，B.，etal.，301Science，1852-1853(2003)；Sato，Y.，etal.，5(Suppl.1)LegalMedicine，S191-S193(2003)；Saldanha，J.，etal.，43J.MedicalVirol.，72-76(1994)；Dahiya，R.，etal.，44BiochemistryandMolecularBiologyInternational，407-415(1998)；和Elnifro，E.M.，etal.，13Clin.Microbiol.Rev.，559-570(2000)。PCR被描述在美国专利号4,683,195和4,683,202中。在PCR扩增过程的各个循环中一般有几个步骤。双链DNA靶序列首先在高温(～95℃)下热变性。变性的第一次出现在本文中被称为“初始变性步骤(initialdenaturationstep)”。接着是合成寡核苷酸引物在较低温度(～60℃)下与每个链退火。这些正向和反向引物然后都通过热稳定的、镁离子依赖性的DNA聚合酶在高温(～70℃)下从其3’-末端延伸，所述聚合酶结合2’-脱氧核苷5’-三磷酸(dNTPs)并且产生焦磷酸(PPi)。
PCR的效用由其迅速提供～106倍的靶扩增的能力以及高特异性驱动，所述高特异性部分取决于寡核苷酸引物杂交的特异性。因此对寡核苷酸引物序列和长度进行设计以在退火所用温度下仅能杂交到预期靶序列。然而，PCR扩增反应一般在环境室温下制备几分钟或几小时的时间，所述室温室温完全低于确保寡核苷酸引物杂交的特异性所需的温度范围。在这种低严格性的样品制备条件下并且在初始预PCR变性步骤后，寡核苷酸引物可非特异性地结合到其他序列并且潜在地引发不期望延伸产物的合成，其可沿着靶序列进行扩增。与引物具有部分互补性的非特异性靶序列的扩增，所谓的“错误引发(mis-priming)”，可与期望靶序列的扩增进行竞争，并且可显著降低期望序列扩增的效率，尤其对于低拷贝数靶(Chou，Q.，etal.，20NucleicAcidsRes.1717-1723(1992))。
“引物二聚体”的形成是另一种非特异性杂交的问题形式，根据Chou，Q.，etal.，这是在彼此的序列上杂交而没有没有明显间插序列的两个延长寡核苷酸引物的扩增的结果。这些研究进一步注意到，引物二聚体可在PCR期间经历扩增的寡聚体化作用以产生寡核苷酸引物人为产物(artifact)的复杂混合物，其数量和性质经常与低拷贝数扩增中特异性PCR产物的产率成反比。
尽管由于错误引发和引物二聚体形成引起的前述问题在所有PCR应用中都可遇到，但是这些问题可能对于高灵敏性分析PCR方案特别具有挑战性，诸如血液性传播传染因子(Saldanha，J.，etal.；Elnifro，E.M.，etal.)、生物危害性细菌(Budowle，B.，etal.)、缺陷或癌基因(Dahiya，R.，etal.)以及法医学(Budowle，B.，etal.；Y.Sato，etal.)的检测所用的方案。此外，在多重PCR中形成假的扩增产物的机会更大。Markoulatos，P.，etal.，16J.ofClin.LaboratoryAnalysis，47-51(2002)。在逆转录酶PCR(RT-PCR)中，检测靶RNA序列的最灵敏方式是在RT步骤中采用基因特异性寡核苷酸引物。Zhang，J.，etal.，337Biochem.J.，231-241(1999)；LekanneDeprez，R.H.，etal.，307AnalyticalBiochem.，63-69(2002)；Bustin，S.A.，etal.，15J.ofBiomolecularTechniques，155-166(2004)。鉴于这些高灵敏性应用——其要求高的特异性以避免“假阴性”和“假阳性”的严重不利结果——的重要性，关键是具有这样的试剂和方案，其提供机能上不含由于错误引发和引物二聚体形成所引起的人为产物的分析。
基于所谓“热启动”的方法，许多一般策略已经被研究用于减少非特异性扩增，所述“热启动”的方法旨在减弱在样品制备期间以及在初始预PCR变性步骤之后，在低严格条件例如室温下，由于错误引发和寡核苷酸引物二聚体形成引起的不期望的扩增。当反应混合物达到高严格性即“热的”温度以“启动”聚合酶介导的、仅与靶序列杂交的寡核苷酸引物延伸时，扩增随即开始。因此，仅在引物/靶杂交条件的严格性对特异性来说为最佳时的高温下，温度触发寡核苷酸引物的酶促延伸。
这些对于“热启动”的一般策略包括使用(1)温度敏感材料，如蜡作为屏障或螯合剂以控制反应物的混合(Chou，Q.，etal.；Tanzer，L.R.，etal.，273AnalyticalBiochem.，307-310(1999))；(2)寡核苷酸适配体(Dang，C.，etal.，264J.Mol.Biol.，268-278(1996))或抗体(Eastlund，E.，etal.，2LifeScienceQuarterly，2-5(2001)；Mizuguchi，H.，etal.，126J.Biochem.(Tokyo)，762-768(1999))，其抑制DNA聚合酶的功能；(3)使用第二热稳定酶，如焦磷酸酶(Clark，D.R.，etal.，国际专利申请号WO2002088387)以除去通过加入焦磷酸(PPi)引起的抑制；(4)用水解可逆的反应物化学修饰的聚合酶，如柠康酸修饰的赖氨酸(Birch，D.E.，etal.，美国专利号5,773,258)在AmpliTaqGold(Moretti，T.，etal.，25BioTechniques，716-722(1998)；Saldanha，J.，etal.)中；(5)不喜低温错误引发的寡核苷酸引物序列构建物，如竞争序列(competitorsequence)(Puskas，L.G.，etal.，5GenomeResearch，309-311(1995))或“修补和环结合的寡核苷酸引物”(TULIPS-PCR)(Ailenberg，M.，etal.，29(5)BioTechniques，1018-1023(2000))；和(6)在引物的3’-末端附近包含磷酸三酯核苷酸间键(或多个)的化学修饰引物(即磷酸三酯引物)(Zon，G.，etal.，美国专利申请号20070281308(2007))。
发明内容
本文提供的是用于核酸复制的方法和组合物。这些方法涉及核苷5’-三磷酸(NTPs)、寡核苷酸引物和酶在温度依赖性核酸模板依赖性聚合反应中的应用。在某些方面，所述方法通过使用修饰NTPs进行，该修饰NTPs在核酸复制中提供效用。在特别优选的实施方式中，修饰NTPs具有3’-取代，即在末端3’-位置除了羟基外的基团。这种NTPs在这些方法中的应用可以是用于核酸扩增，尤其热启动扩增。在某些实施方式中，在核酸复制的高温下初始温育阶段之前诸如PCR的初始变性步骤中，NTP的3’-取代消弱了聚合酶介导的寡核苷酸引物延伸。在某些方面和实施方式中，提供的是这样的方法和组合物，其中如本文所公开的NTPs的3’-取代基在核酸复制的初始变性步骤期间或之后以及如果适用的话在随后的复制循环期间转变成开放的3’-羟基(3’-OH)基团。
在一些方面，提供的是核酸(如DNA)被复制的方法，其中至少一个修饰NTP被添加到具有如本文所公开的3’-取代的复制反应中。优选地，在初始温育期间之前，即核酸复制的初始变性温度诸如在PCR的80-105℃以及RT-PCR的42-70℃下，至少一个修饰NTP的3’-取代不支持(例如，在一些实施方式中，优选地核酸聚合酶能结合并延伸未取代的或天然NTPs并且不能结合并延伸3’-取代NTPs)、消弱或防止聚合酶介导的寡核苷酸引物延伸。在一些优选的实施方式中，3’-取代消弱了在寡核苷酸引物下核酸聚合酶介导的3’-取代NTP的结合，因此防止了引物的3’-延伸。这种3’-取代NTP代表了“非底物NTP”。在其它一些优选的实施方式中，3’-取代NTP可结合到寡核苷酸引物的3’-末端并且3’-取代基然后消弱寡核苷酸引物任何另外的核酸聚合酶介导的延伸。这种3’-取代NTP代表“终止NTP”。
在文献中已经描述了适合用于本文所述组合物和方法的修饰基团的热不稳定保护基团(例如，3’-取代和核苷酸间键)在寡核苷酸合成方法中的应用。参见例如，Grajkowski，etal.，3Org.Lett.，1287-1290(2001)；Wilk，A.，etal.，42TetrahedronLett.，5635-5439(2001)；Wilk，A.，etal.，67J.Org.Chem.，6430-6438(2002)；Cieslak，J.，etal.，68J.Org.Chem.，10123-10129(2003)；Cieslak，J.，etal.，69J.Org.Chem.，2509-2515(2004)；Beaucage，etal.，美国专利号7,355,037；和Beaucage，etal.，美国专利号6,762,298。
已经开发了几种基于利用3’-取代NTPs和核苷二磷酸(NDPs)的应用。Jengetal.，3J.Supramol.Struct.，448-468(1975)描述了3’-芳基叠氮基ATP类似物的合成及其在肌球蛋白ATP酶的光亲和标记上的应用。类似的化合物在其它ATP酶***中进行制备和测试(Schafer，et.al.，87FEBSLett.，318-322(1978)；Lunardi，et.al.，20Biochemistry，473-480(1981))。Hiattetal.，美国专利号6,232,465及引用的专利描述了用于酶催化的不依赖于模板产生磷酸二酯键的3’-保护的核苷5’-三磷酸在寡核苷酸合成中的应用。形成磷酸二酯键后，所结合的核苷酸的3’-保护基团可以被化学去除并且可以继续合成寡核苷酸。3’-取代NTPs的另一用途是逐步合成法测序。Cheeseman，美国专利号5,302,509描述了3’-修饰NTPs，其包含多核苷酸测序用的可去除荧光标记。Metzker，etal.，22NucleicAcidsRes.，4259-4267(1994)描述了作为新测序策略开发的关键组分的具有UV-可去除的3’-保护基团的修饰NTPs的合成。类似的方法包括包含3’-O-烯丙基和3’-O-甲氧基甲基保护基团的染料标记的NTPs的应用，如Ju，etal.，美国专利号6,664,079；Meng，Q.，etal，78J.Org.Chem.，3248-3252(2006)；和Bi，L.，etal.，128J.Amer.Chem.Soc.，2542-2543(2006))所开发。3’-O-烯丙基保护基团可在高温下中性水溶液中通过钯催化剂去除。其他专利也描述了具有可去除3’-取代基的3’-取代dNTPs的合成和应用。例如，3’-保护基团可通过加入盐酸至pH2(例如，Tsien，R.Y，WO91/06678)；或通过加入还原剂如巯基乙醇(例如，Kwiatkowski，M.，美国专利号7,279,563)；或者通过加入三(2-羧乙基)膦(例如，Milton，J.，etal，美国专利号7,414,116)而去除。某些3’-取代基可通过UV照射(例如，Dower，etal.，WO92/10587)去除。已经描述了寡核苷酸的可去除3’-取代基(例如，Bi，W.，WO08/016562(A2))。
在某些方面，提供的是这样的组合物(即3’-取代NTPs)，其包括本文进一步描述的式IA和IB中所示的化学式。在相关的方面，提供的是这样的方法，其中DNA被复制，其利用包括本文进一步描述的式IA和IB中所示的化学式的组合物；和/或利用包含至少一个单体单元的寡核苷酸，所述单体单元由包括式IA和IB中所示的化学式的3’-取代NTP的结合得到。
如本文所用，术语“非底物NTP”是指这样的3’-取代NTP，其具有不能结合入寡核苷酸引物的3’-取代(图1A)。本文提供的方法和组合物的非底物NTP具有两种状态。非底物NTP由于3’-取代基的存在是非活性状态，并且不是核酸聚合酶的底物(图1A)。达到初始变性温度——通常95℃之后，非活性非底物NTP可以被转变成活性状态，这是通过3’-取代基的热诱导的分子内和/或分子间转变或者通过其他导致3’-取代基转变成未修饰或开放的3’-OH基团的化学反应。这种活性状态的非底物NTP是相应的天然或3’-未取代NTP或其功能衍生物，其具有未取代或开放的3’-OH基团，并且可以是核酸聚合酶的底物并支持核酸复制(图1和2)。在特别优选的实施方式中，3’-取代基的部分或完全转变在温育期间于大约95℃下发生大约1-120分钟。在一些实施方式中，本文公开的3’-取代NTPs可与本领域已知的一种或多种其他热启动方法和组合物联合使用，诸如利用温度敏感性材料如蜡作为屏障或鳌合剂以控制反应物的混合；寡核苷酸适配体或抗体，其抑制DNA聚合酶的功能；使用第二热稳定酶，如焦磷酸酶以除去通过加入焦磷酸(PPi)引起的抑制；用水解可逆的反应物化学修饰的聚合酶，如柠康酸修饰的赖氨酸；不喜低温错误引发的寡核苷酸引物序列构建物，如竞争序列；和在引物的3’-末端附近包含磷酸三酯核苷酸间键(或多个)的化学修饰引物(即磷酸三酯引物)。在优选的实施方式中，除了标准dNTPs的复制反应中通常使用的那些条件外，3’-取代基的转变与温度相关地发生并且不需要酶、另外的化学试剂或修改的聚合反应条件。本文提供的组合物和方法的核苷和核苷酸的不同3’-取代基被描述在例如Greene，T.W.和Wuts，P.G.M.，Protectivegroupsinorganicsynthesis，JohnWiley&Sons，Inc.(1999)中。
如本文所用，术语“终止NTP”是指这样的3’-取代NTP，其能被结合到寡核苷酸引物的3’-末端(图1B)。由于终止NTP的结合，形成了终止引物并且防止了引物的进一步延伸。终止NTP具有两种状态并且在两种状态下都是核酸聚合酶的底物。由于3’-取代基的存在，终止NTP处于终止状态。终止NTP在引物3’-末端的结合导致(N+1)延长的终止引物的形成并且防止引物的进一步延伸(图1B)。在高温如95℃下，终止NTP可转变成活性状态，这是通过3’-取代基的热诱导的分子内和/或分子间去除或者通过其他导致3’-取代基转变成未修饰或开放的3’-OH基团的化学反应(图1B)。在这种状态下，终止NTP被转变成相应的天然或未取代NTP或其功能衍生物，其具有未取代或开放的3’-OH，并且可以是核酸聚合酶的底物。在特别优选的实施方式中，3’-取代基的部分或完全转变在温育期间大约95℃下发生大约1-120分钟。在优选的实施方式中，除了标准dNTPs的复制反应中通常使用的那些条件外，3’-取代基的转变与温度相关地发生并且不需要酶、另外的化学试剂或修改的聚合反应条件。本文提供的组合物和方法的核苷和核苷酸的不同3’-取代基被描述在例如Greene，T.W.，etal中。
在核酸聚合酶结合终止NTP到引物的3’-末端的情况下，终止NTP变成(N+1)延长引物——其被称为“终止引物”——的一部分。在达到高温——通常95℃之前，终止引物由于在其末端3’-取代基的存在不可能被进一步延长并且保持在“终止状态”，最后的核苷单元源于结合的终止NTP。终止引物的这种终止状态等同于本文定义的非底物NTP的非活性状态。在优选的实施方式中，除了包含3’-取代基外，终止引物包含另外的修饰，例如具有修饰的糖、碱基、(5’-3’)-核苷酸间键或其组合的修饰核苷残基。更优选地，终止引物包含热不稳定的3’-取代基。一旦达到高温(例如，PCR的初始变性温度)，终止引物就可通过去除3’-取代基的热诱导分子内和/或分子间片段化变成可延长引物(图1B和2)。“可延长引物(extendableprimer)”具有未取代或开放的3’-OH并且能通过核酸聚合酶延长。在特别优选的实施方式中，3’-取代基的部分或完全转变在温育后大约95℃下发生大约1-120分钟。在优选的实施方式中，除了标准dNTPs的复制中通常使用的那些条件外，终止引物的3’-取代基的转变与温度相关地发生并且不需要酶、另外的化学试剂或修改的聚合反应条件。
在优选的实施方式中，聚合反应中存在的NTP聚合反应混合物的一种或多种成分诸如3’-取代NTP、修饰NTP、未修饰NTP或其组合可用可检测标记进行标记。因此，复制后，目标片段可通过例如大小、质量、亲合力捕获或颜色进行鉴定。可检测标记优选地是荧光染料，亲合力捕获标记优选为生物素。
在另一方面，本文的方法和组合物提供用于核酸复制的3’-取代NTPs，其包括具有一个或多个修饰基团的NTP。3’-取代NTPs可包括本文进一步描述的式IA和IB中所述化学结构中的一个或多个。
在又一方面，本文的方法和组合物提供合成本文所公开的3’-取代NTPs的方法。
还提供了包括本文所述用于进行复制的3’-取代NTPs的试剂盒。例如，试剂盒可包含针对普通复制靶标诸如持家基因的PCR试剂。包含3’-取代NTP的试剂盒可包括标定用于核酸复制的容器、进行核酸复制的说明书、和/或一种或多种试剂，所述试剂选自修饰引物、未修饰引物、修饰NTPs(例如，3’-取代NTPs)、未修饰NTPs、核酸聚合酶、氯化镁或其它二价阳离子(例如，镁和锰)和反应缓冲剂。在一种实施方式中，试剂盒包括3’-取代NTPs、核酸聚合酶和至少一种另外的酶(例如，第二核酸聚合酶、逆转录酶、连接酶或限制酶)，并且可包括适于所述至少一种另外的酶的另外缓冲成分。优选地，试剂盒包括两种或更多种核酸复制试剂，优选地三种或更多种以及更优选地四种或更多种。包含3’-取代NTP的试剂盒还可包括寡核苷酸引物。在一种实施方式中，寡核苷酸引物被修饰，例如，在核苷酸间键、核苷酸糖、三磷酸链和/或核苷酸碱基上具有任何取代或修饰。试剂盒可包括标定用于核酸复制的容器、进行核酸复制的说明书、和/或一种或多种试剂，所述试剂选自dNTPs、核酸聚合酶、镁和反应溶液。
本文提供的用于核酸复制的方法和组合物可用于这样的应用中，所述应用利用合成和/或天然NTPs、修饰寡核苷酸引物、未修饰寡核苷酸引物和用于延伸核酸的聚合酶。本文提供的方法和组合物的NTPs可具有单个3’-取代或者可任选地具有另外的修饰位点。
本文提供的方法和组合物的3’-取代NTPs具有重大的优点。例如，终端用户可采用与未取代标准NTPs已经采用的相同的复制方案和方法。本文提供的方法和组合物的3’-取代NTPs与现有的复制***和试剂兼容(包括各种热启动PCR方法)；不需要另外的酶或试剂但是可以使用。标准化学和酶促合成方法可被用于合成本文提供的方法和组合物的3’-取代NTPs。要求保真度、基于聚合酶的复制应用可与本文提供的方法和组合物的3’-取代NTPs一起应用。
如本文所用，术语“复制(replication)”、“扩增(amplification)”或“扩增(amplify)”是指本领域已知的、用于复制靶核酸从而增加选择的核酸序列的拷贝数的方法。涉及本文提供的组合物和方法的复制和扩增可以利用3’-取代NTPs和/或核酸聚合酶延伸的引物。靶核酸的复制或扩增可以是指数的、非线性的或线性的。优选地，复制或扩增是指数的或非线性的。靶核酸(目标核酸)可以是DNA、RNA、cDNA或修饰的核酸模板。尽管下文描述的示例性方法涉及PCR扩增，但是适于本文提供的方法和组合物的很多其它用于核酸酶促扩增和复制的方法是本领域已知的。例如，其它酶促复制和扩增方法包括等温法(isothermalmethods)、滚环法(rollingcirclemethods)、热启动PCR、实时PCR、等位基因特异性PCR、装配PCR或聚合酶循环装配(PCA)、不对称PCR、菌落PCR、乳液PCR、快速PCR、实时PCR、核酸连接、缺口连接链式反应(缺口LCR)、连接介导的PCR、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、缺口延伸连接PCR(GEXL-PCR)、定量PCR(Q-PCR)、定量实时PCR(QRT-PCR)、多重PCR、解旋酶依赖性扩增、序列间特异性(ISSR)PCR、反向PCR、线性-然后-指数性-PCR(LATE-PCR)、甲基化特异性PCR(MSP)、嵌套式PCR、重叠-延伸PCR、PAN-AC分析、逆转录PCR(RT-PCR)、cDNA末端迅速扩增(RACEPCR)、单分子扩增PCR(SMAPCR)、热不对称交错PCR(TAIL-PCR)、递降PCR、长PCR、核酸测序(包括DNA测序和RNA测序)、转录、逆转录、复制、DNA或RNA连接和本领域已知的其它核酸延伸反应。本领域技术人员将理解，其它方法可以替代PCR方法使用或与PCR方法一起使用，包括未来开发的酶促复制反应。参见，例如Saiki，“AmplificationofGenomicDNA”inPCRProtocols，Innisetal.，eds.，AcademicPress，SanDiego，CA，13-20(1990)；Wharam，etal.，29(11)NucleicAcidsRes，E54-E54(2001)；Hafner，etal.，30(4)Biotechniques，852-6，858，860passim(2001)；Ross，P.，etal.，国际专利申请号WO91/06678；Kwiatkowski，M.，美国专利号US6,255,475、US6309836和US6,639,088以及EP1218391；Anazawa，T.，etal.，美国专利号6242193；Ju，etal.，美国专利号US6,664,079；Tsien，R.Y.，etal.，国际专利申请号WO91/06678；和Dower，etal.，国际专利申请号WO92/10587。
如本文所用，术语“核酸”、“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段、任意核糖或脱氧核糖衍生物，并且指天然产生或合成分子，其包含天然和/或修饰的核苷酸残基以及核苷酸间键。这些短语也指天然的(例如，基因组的)或合成来源的DNA或RNA——其可以是单链的、双链的、三链的或四链的，并可以代表有义链或反义链——或指任何DNA-样或RNA-样物质。“RNA等同物”相对于DNA序列，由核苷酸的线性序列组成，该核苷酸的线性序列与参照DNA序列是相同的，除了所有或大部分存在的含氮碱基胸腺嘧啶被尿嘧啶取代，并且糖骨架由核糖，而不是2’-脱氧核糖组成。适合本文提供的方法和组合物的另外可选的核酸骨架包括，但不限于，硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、烷基磷酸三酯、芳基磷酸三酯、烷基膦酸酯、芳基膦酸酯、锁定核酸(LNA)和肽核酸(PNA)和硼磷酸酯(phosphoboronate)。RNA可以被用于本文所述的方法和/或可以通过逆转录被转变为cDNA用于本文所述的方法。
如本文所用，术语“3’-取代NTP”是指这样的核苷5’-三磷酸，其在3’-位置具有除了开放羟基外的化学部分基团。3’-取代NTP包括，例如包括修饰糖、碱基或三磷酸链或者修饰糖、碱基或三磷酸链的任意组合的NTP，例如，如本文进一步描述的式IA和IB中所示。这种NTPs的实例可以在例如“NucleosideTriphosphatesandTheirAnalogs：Chemistry，BiotechnologyandBiologicalApplications，”Vaghefi，M.，ed.，TaylorandFrancis，BocaRaton(2005)；Metzker，M.L.15GenomeResearch1767-1776(2005)(以及本文的参考文献)中找到。
如本文所用，术语“引物”、“寡核苷酸”或“寡核苷酸引物”是指核糖-或脱氧核糖-多核苷酸，通常为单链，可以是天然发生的或合成的，通常包含约5至约50个核苷酸之间的序列，更优选为约10至约30个核苷酸，或更优选为约15至25个核苷酸。寡核苷酸可包含一个或多个修饰基团。寡核苷酸可包括DNA、RNA、PNA、LNA和/或其他修饰核苷。熟练技术人员能设计和制备适合复制靶序列的引物。在本文提供的方法和组合物中使用的引物的引物杂交序列的长度取决于几个因素，包括核苷酸序列的同一性以及这些核酸在体外核酸复制期间被杂交或使用的温度。对于确定特定序列同一性的引物的引物杂交序列的优选长度所必需的考虑事项，是普通技术人员所熟知的。例如，短核酸或寡核苷酸的长度可以与其杂交特异性或选择性相关。
如本文所用，术语“终止引物”是指这样的引物或寡核苷酸引物，其通过将终止NTP核酸聚合酶介导的结合到引物的3’-末端而结合的3’-取代基。终止引物——其可包括本文提供的方法和组合物的一个或多个另外的修饰基团——在将3’-取代基转化为开放的3’-OH基团之前不可能被延长。终止引物可包括天然DNA或RNA核苷、修饰核苷或核苷类似物，其包含天然核苷酸间磷酸二酯键或其修饰，或者其组合。优选地，3’-取代基是热不稳定的，并且随着复制反应介质的温度升高以增加的速度与终止引物解离。
如本文所用，术语“可延长引物(extendableprimer)”是指这样的引物或寡核苷酸引物，其包含未修饰的或开放的3’-OH基团并且其可通过将NTP核酸聚合酶结合到引物的3’-末端而被延长。可延长引物可以是原始启动引物，或者可以是转化的终止引物，其中3’-取代基已经被转化为自由的3’-OH基团。
如本文所用，术语“3’-取代基”是指除了未修饰或开放的羟基(3’-OH)外NTP或引物的3’-位置上的化学部分。在某些实施方式中，化学部分是醚、酯或碳酸酯。在一些优选的实施方式中，3’-取代基选自O-(对甲苯)磺酸酯；O-磷酸酯；O-硝酸酯；O-[4-甲氧基]四氢吡喃基；O-[4-甲氧基]-四氢硫代吡喃基；O-四氢硫代吡喃基；O-[5-甲基]-四氢呋喃基；O-[2-甲基，4-甲氧基]-四氢吡喃基；O-[5-甲基]-四氢吡喃基；O-四氢吡喃基；O-四氢呋喃基；O-苯氧基乙酰基；O-甲氧基乙酰基；O-乙酰基；O-C(O)-OCH3；O-C(O)-CH2CH2CN；和O-C(S)-OCH3。在一些特别优选的实施方式中，3’-取代基选自O-甲氧基四氢吡喃基；O-四氢吡喃基；和O-四氢呋喃基。
本文提供的方法和组合物的3’-取代NTPs对于寡核苷酸或核酸延伸优选地没有功效或具有降低的功效。优选地，下列情况认为延伸被削弱：作为复制反应中的底物，3’-取代NTP与其对应的3’-未取代NTP相比功效降低至少50％，作为复制反应中的底物比其对应的3’-未取代NTP优选地功效降低至少60％，优选地功效降低至少70％，更优选地功效降低至少80％，更优选地功效降低至少90％，更优选地功效降低至少95％，更优选地功效降低至少99％以及最优选地功效降低100％。本领域技术人员能容易确定底物活性的水平以及NTPs的功效。在实施例4中阐明了一种确定底物功效的方法。在一些优选的实施方式中，3’-取代基是热不稳定的，并且随着复制反应介质的温度升高以增加的速度与3’-取代NTP解离。
如本文所用，术语“3-未取代”、“天然”或“未修饰”在NTPs和寡核苷酸引物的上下文中是指不带有修饰基团的NTPs和寡核苷酸引物或者不带有修饰基团的NTPs和寡核苷酸引物的功能等同物。
除了3’-取代基外，3’-取代NTP或3’-取代引物可包含一个或多个另外的修饰基团。如本文所用，术语“修饰基团”是指可在包括但不限于磷酸酯、糖、三磷酸酯链或核苷碱基部分的位置连接到NTP或引物上的任何化学部分。NTP或引物的修饰基团可以是与核酸复制过程兼容的任何性质的基团。修饰基团可以是不稳定的基团，其随着酶反应介质的温度升高以增加的速度与修饰NTP或修饰引物解离。在一种实施方式中，聚合反应中存在的修饰引物的修饰基团可以存在于核苷酸间键中，例如，如美国专利申请号20070281308中所述。在另一实施方式中，聚合反应中存在的修饰NTP或引物的修饰基团可以是可检测标记。因此，复制后，靶片段可以通过大小、质量、亲和力捕获和/或颜色进行鉴定。可检测标记优选地是荧光染料；亲和力捕获标记优选地是生物素。
如本文所用，关于寡核苷酸的术语“末端”，指在寡核苷酸的3′或5′末端上的核苷酸。优选地，寡核苷酸的末端包括末端的6个核苷酸，更优选地末端的5个核苷酸，更优选地末端的4个核苷酸，更优选地末端的3个核苷酸，更优选地末端的2个核苷酸或更优选地末端的1个核苷酸。
如本文所用，术语“转化(convert)”、“解离(dissociate)”、“解离(dissociation)”或“片段化(fragmentation)”是指修饰基团从NTP或引物中的去除或转化(例如，通过3’-取代基的去除或3’-取代基转化为3’-OH基团)。修饰基团的去除或转化可以是部分的，例如当3’-取代基与一部分修饰分子解离时，或者是完全的，例如当3’-取代基与所有修饰分子解离时。在某些优选的实施方式中，3’-位置上修饰基团的去除或转化导致在NTP或引物的3’-位置上形成了开放的3’-OH基团。修饰基团的去除或转化可以通过分子间反应或通过与另一分子的反应发生。优选地，3’-取代基的去除或转化将3’-取代NTP转化为活性状态并且将终止引物转化为可延长引物。
如本文所用，术语“核苷酸间键”是连接寡核苷酸引物或核酸的两个核苷的键(一个或多个)并且可以是天然磷酸二酯键或者修饰的键。
如本文所用，术语“靶(标)”、“靶核酸序列”或“核酸靶(标)”是指待被鉴定的核苷酸序列。
如本文所用，术语“标记”或“可检测标记”是指任何分子或分子的组合，其可以被附着或以其他方式连结于分子上，以致该分子能通过检测此标记被直接或间接地检测。可检测标记可以是放射性同位素(例如，碳、磷、碘、铟、硫、氚等)、质量同位素(例如，H2、C13或N15)、染料或荧光团(例如，花青、荧光素、若丹明)、半抗原(例如，生物素)或任何其它能被直接或间接检测的试剂。在标记的NTP结合到扩增子或其他聚合产物后，标记可被检测。
如本文所用，术语“热诱导”或“热转化”是指这样的过程，其中应用热以将3’-取代NTP的3’-取代基去除或转化，从而产生核酸聚合酶的合适底物。术语热诱导或热转化还是指这样的过程，其中应用热以将终止引物的3’-取代基去除或转化产生可延长引物，由此使其成为核酸聚合酶的底物。
如本文所用，术语“热启动”是指核酸扩增反应，其中聚合酶介导的核酸复制被减弱，直至反应达到期望温度，所述期望温度优选地是高于酶的最佳延伸温度的初始温度。在热启动PCR应用中，初始温度达到约80-105℃之间；或至少80℃、或至少85℃、或至少90℃、或约94℃、或约95℃、或约96℃或约100℃。优选地，“热启动”PCR要求在初始变性步骤之前加入核酸聚合酶和所有其他PCR成分。术语热启动在本领域中是熟知的，并且有很多已知的减弱复制的方法，如修饰的聚合酶、具有减弱杂交的二级结构的寡核苷酸或具有减弱延长的化学修饰的寡核苷酸以及包含在温度敏感屏障如蜡中的反应物。在一个优选实施方式中，热启动扩增是由热诱导转化非底物NTP、终止NTP或终止引物中的3’-取代基成开放的3’-OH基团引起的。
如本文所用，术语“错误引发(mis-priming)”是指核酸聚合酶介导的引物延伸的非特异性启动。具体地，它涉及与引物具有一定程度的非互补性并且可能启动不期望延伸产物的合成的核酸序列，其可沿着靶序列扩增。
如本文所用，术语“无活性状态”或“无活性的”在NTP的上下文中是指具有3’-取代基的非底物NTP。在一种实施方式中，3’-取代基与NTP的连接使其无活性并且消弱了3’-取代NTP向寡核苷酸引物中的结合，因此防止通过核酸聚合酶的3’-延长(图1A)。如本文所用，术语“终止状态”在终止NTP的上下文中是指这样的3’-取代NTP，其能被结合到引物的3’-末端以形成不可延长的N+1延长引物(即终止引物)(图1B)。
如本文所用，术语“终止状态”在引物的上下文中是指在其3’-末端包含3’-取代基的引物(图1B)。在一种实施方式中，将3’-取代终止NTP结合到引物的3’-末端引起引物延伸的暂时终止。所得终止引物不支持核酸复制反应并且直到3’-取代基被转化为开放的3’-OH基团才可能被进一步延长。
如本文所用，术语“活性状态”或“活性的”在NTP的上下文中是指这样的NTP，其可以是聚合酶的底物。优选地，“活性的”NTP不具有3’-取代或者它可以是包含转化的3’-取代基的终止NTP。优选地，活性的NTP具有未修饰的3’-OH基团并且可在复制反应中充当核酸聚合酶的底物。活性状态NTP可以是从未具有3’-取代的NTP，或者3’-取代已经被转变、去除或转化的NTP。
如本文所用，术语“引物二聚体”是指非特异性寡核苷酸引物延长产物，这是在彼此的序列上杂交而没有没有明显间插序列的两个延长寡核苷酸引物的扩增的结果。
如本文所用，术语“杂交”或“特异性杂交”是指这样的过程，其中两条互补的核酸链在适当的严格条件下互相退火。与靶核酸的杂交典型的并且优选以探针长度核酸分子进行，其优选为20-100长度的核苷酸。核酸杂交技术在本领域中是熟知的。参见，例如，Sambrook，etal.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，SecondEdition，ColdSpringHarborPress，Plainview，N.Y.(1989)；Ausubel，F.M.，etal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，Secaucus，N.J.(1994)。
如本文所用，术语“严格杂交(stringenthybridization)条件”是指不允许两个非完全互补的核酸杂交的杂交条件。
如本文所用，术语“样品”或“测试样品”是指任何被认为包含目的核酸的液体或固体材料。测试样品可以来自任何生物源(即，生物样品)，如培养基中的细胞或组织样品或合成产生的，包括化学合成的模板。
如本文所用，术语“互补(complement)”、“互补的(complementary)”或“互补性(complementarity)”，在寡核苷酸或多核苷酸(即核苷酸序列，如寡核苷酸引物或靶核酸)的上下文中，指标准Watson/Crick碱基配对原则。互补序列也可以是与DNA序列或其互补序列互补的DNA或RNA序列，并且也可以是cDNA。例如，序列“5′-A-G-T-3”与序列“3′-T-C-A-5’”是互补的。某些在天然核酸中一般不被发现的或化学合成的核苷酸可以包括本文所述的核酸中；这些包括但不限于碱基和糖修饰的核苷、核苷酸和核酸，诸如肌苷、7-脱氮鸟嘌呤、2’-O-甲基鸟嘌呤、2’-氟-2’-脱氧胞啶、锁定核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。互补性不需要是完全的；稳定的双链体可以包含错配的碱基对、简并的或未配对的碱基。核酸技术领域的技术人员可以经验地确定双链体稳定性，这考虑到许多变量，包括，例如，寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、错配碱基对的发生率、离子强度和其他杂交缓冲成分和条件。
互补性可以是“部分的”，其中两条核酸链的仅仅一些核苷酸碱基根据碱基配对原则匹配。互补性可以是完全的或全部的，其中两条核酸链的所有核苷酸碱基都根据碱基配对原则匹配。互补性可以是不存在的，其中两条核酸链中没有核苷酸碱基根据碱基配对原则匹配。核酸链之间的互补性的程度显著影响核酸链之间杂交的效率和强度。这在扩增反应以及依赖核酸之间结合的检测方法中是特别重要的。这些术语也可以用于指单独的核苷酸，尤其是在多核苷酸的上下文中。例如，在对比或比较在寡核苷酸的剩余部分和核酸链之间的互补性中，在寡核苷酸中的特定核苷酸可被记下其与另一条核酸链中的核苷酸的互补性或其互补性的缺乏。
如本文所用，术语“基本上互补的”是指两个序列，其在严格杂交条件下杂交。技术人员将会理解基本上互补的序列不必沿着它们的全长杂交。尤其是，基本上互补的序列包含不与靶序列杂交的碱基的相邻碱基序列，其定位在严格杂交条件下与靶序列杂交的碱基的相邻序列的3′或5′端。
如本文所用，术语“正向引物”是指寡核苷酸引物，其与单链的RNA、单链的DNA或双链的DNA的反义链退火。“反向引物”与单链的RNA、单链的DNA或双链的DNA的有义链退火。
如本文所用，如果当寡核苷酸引物和核酸比对时，寡核苷酸引物的寡核苷酸引物杂交序列与核酸的一部分具有至少50％的序列同一性，寡核苷酸引物对核酸是“特异性的”。对核酸特异性的寡核苷酸引物是，在适合的杂交或清洗条件下，能与目的靶杂交杂交，且基本上不与非目的核酸序列杂交的寡核苷酸引物。更高水平的序列同一性是优选的，并包括至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％以及更优选100％的序列同一性。
如本文所用，术语“核苷”包括所有天然发生的核苷，包括在天然核酸中发现的所有形式的核苷碱基和呋喃糖苷。天然发生的核苷中最常见的碱基环是嘌呤和嘧啶环。天然发生的嘌呤环包括，例如，腺嘌呤、鸟嘌呤和N6-甲基腺嘌呤。天然发生的嘧啶环包括，例如胞嘧啶、胸腺嘧啶和5-甲基胞嘧啶。天然发生的核苷例如，包括但不限于，腺苷、鸟苷、胞啶、胸苷、胞苷、肌苷、7-脱氮鸟苷、7-甲基鸟苷的核糖和2’-脱氧核糖衍生物。
如本文所用，术语“核苷类似物”、“修饰的核苷”或“核苷衍生物”包括如本文所述的合成的核苷。核苷衍生物也包括具有修饰的碱基或/和糖部分的核苷，其具有或不具有保护基。这种类似物包括，例如，2’-脱氧-2’-氟尿苷、2’-O-甲基尿苷和类似物。本文提供的化合物和方法包括这些碱基环和其合成的类似物，以及非自然的杂环-取代碱基糖和甚至非环取代碱基糖。而且，核苷衍生物包括其它嘌呤和嘧啶类似物，例如，卤素-取代嘌呤(例如，6-氟嘌呤)、卤素-取代嘧啶、N6-乙基腺嘌呤、N4-(烷基)-胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶以及类似物。核苷衍生物和类似物包含广泛的多种修饰，如那些在美国专利号6,762,298中所描述的。
如本文所用，术语“通用碱基NTP”、“简并碱基NTP”、“通用碱基NTP类似物”、“简并碱基NTP类似物”包括，例如，具有人工碱基的NTP类似物，其优选地作为任何特异性NTP的替代品可被核酸聚合酶识别，所述特异性NTP诸如dATP、ATP、dTTP、dUTP、dCTP、CTP、dGTP、GTP和其它特异性NTP。具有通用碱基或变性碱基的NTPs也可以使用并且实例也可在Loakes，D.，29NucleicAcidsRes.2437-2447(2001)；Crey-Desbiolles，C.，et.al.，33NucleicAcidsRes.1532-1543(2005)；Kincaid，K.，et.al.，33NucleicAcidsRes.2620-2628(2005)；Preparata，FP，Oliver，JS，11J.Comput.Biol.753-765(2004)；和Hill，F.，et.al.，95ProcNatlAcadSciUSA.4258-4263(1998)中找到。
如本文所用，术语“修饰的寡核苷酸”包括，例如，这样的寡核苷酸，其包含修饰的核苷、修饰的核苷酸间键、或者具有修饰的核苷和修饰的核苷酸间键的任意组合(即使在寡核苷酸链中仅存在天然核苷)。寡核苷酸核苷酸间键修饰的实例可以在例如Waldner，etal.，6Bioorg.Med.Chem.Letters2363-2366(1996)中找到。修饰的寡核苷酸的实例是寡核苷酸的硫代磷酸酯、磷酸三酯、和甲基膦酸酯衍生物，可以在例如Stec，W.J.，etal.，33Chem.Int.Ed.Engl.，709-722(1994)；Lebedev，A.V.，etal.，E.，4Perspect.DrugDiscov.Des.，17-40(1996)；和Zon，etal.，美国专利申请号20070281308中找到。术语修饰的寡核苷酸包括在3’-末端核苷上具有3’-取代的寡核苷酸。
如本文所用，术语“酰基”表示基团-C(O)Ra，其中Ra是氢、低级烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基和类似物。
如本文所用，术语“取代的酰基”表示基团-C(O)Ra′，其中Ra′是取代的低级烷基、取代的环烷基、取代的杂环基、取代的芳基、取代的杂芳基和类似物。
如本文所用，术语“酰氧基”表示基团-OC(O)Rb，其中Rb是氢、低级烷基、取代的低级烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基和类似物。
如本文所用，术语“烷烃”是指这样的有机化合物，其包括碳原子和氢原子，包括C-H键并且另外在除了甲烷外的烷烃中包括C-C单键。术语“烷烃”包括直链烷烃诸如具有1至20个碳原子的烷烃。在一些实施方式中，烷烃包括直链烷烃诸如具有1至8个碳原子的烷烃，诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷和辛烷。术语“烷烃”也包括支链烷烃，诸如，但不限于具有1-20个碳原子的支链烷烃，并且在一些实施方式中具有1-8个碳原子的支链烷烃诸如，但不限于，2-甲基丙烷、2，2-二甲基丙烷、2-甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、2，2-二甲基丁烷、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、2，3-二甲基戊烷、2，4-二甲基戊烷、2，2-二甲基戊烷、3，3-二甲基戊烷、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2，2-二甲基己烷、2，3-二甲基己烷、2，4-二甲基己烷、2，5-二甲基己烷、3，3-二甲基己烷、3，4-二甲基己烷、2-甲基庚烷、3-甲基庚烷、4-甲基庚烷、3-乙基戊烷、3-乙基-2-甲基戊烷、3-乙基己烷和类似物。烷烃的C-C或C-H键可以用与另一基团的键取代，诸如羟基，卤素诸如F、Cl、Br或I，硫氢基或胺基。被这样的基团取代的烷烃可分别命名为羟基烷烃、卤代烷烃诸如氟代烷烃、氯代烷烃、溴代烷烃、碘代烷烃、巯基烷烃和氨基烷烃。
如本文所用，术语“链烯基”表示直-链或支-链烃基，其具有一个或多个双键，并且除非另外特别说明，其包含约2至约20个碳原子，优选约2至约10个碳原子，更优选约2至约8个碳原子，并且最优选为约2至约6个碳原子。链烯基的实例包括乙烯基、烯丙基、1，4-丁间二烯基、异丙烯基和类似物。
如本文所用，术语“烯基芳基”是指烯基-取代的芳基，并且“取代的烯基芳基”是指这样的烯基芳基，其进一步包含一个或多个如本文所列的取代基。
如本文所用，术语“亚链烯基(alkenylene)”是指二价的直链或支链的烃基基团，其具有至少一个碳碳双键，并且典型的包含2-20个碳原子，优选为2-12个碳原子，优选为2-8个碳原子，并且“取代的亚链烯基”是指这样的亚链烯基基团，其进一步包含一个或多个如本文所列的取代基。
如本文所用，术语“烷基”是指烃的单键链，通常范围从1-20个碳原子，优选为1-8个碳原子，其实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基和类似物。此烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、辛基、十二烷基和类似物。
如本文所用，术语“低级烷基”是指烃的直链或支链，其范围通常是从1-6个碳原子，优选为2-5个碳原子。其实例包括乙基、丙基、异丙基和类似物。
如本文所用，术语“亚烷基”是指二价的烃基，其包含1-20个碳原子，优选为1-15个碳原子，直链或支链，其中两个氢原子从相同的碳原子或从不同的碳原子被夺取。亚烷基的实例包括，但不仅限于，亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)和类似物。
如本文所用，术语“炔基”表示直-链或支-链烃基，其具有一个或多个三键，并包含从约2-20个碳原子，优选为从约2-10个碳原子，更优选为从约2-8个碳原子，并且最优选为从约2-6个碳原子。炔基的实例包括乙炔基、丙炔基(炔丙基)、丁炔基和类似物。
如本文所用，术语“炔芳基”是指炔基-取代的芳基，并且“取代炔芳基”是指进一步包含一个或多个如本文所列的取代基的炔芳基。
如本文所用，术语“烷氧基”表示基团-ORc，其中Rc是所限定的低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂烷基、杂芳烷基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基。
如本文所用，术语“低级烷氧基”表示基团-ORd，其中Rd是低级烷基。
如本文所用，术语“烷基芳基”是指烷基-取代的芳基，并且“取代烷基芳基”是指进一步包含一个或多个如本文所列的取代基的烷基芳基。
如本文所用，术语“烷基羰基氨基”表示基团-NReC(O)Rf，其中Re是任选取代的烷基，并且Rf是氢或烷基。
如本文所用，术语“烷基亚磺酰基”表示基团-S(O)Rg，其中Rg是任选取代的烷基。
如本文所用，术语“烷基磺酰基”表示基团-S(O)2Rg，其中Rg是任选取代的烷基。
如本文所用，术语“烷基磺酰氨基”表示基团-NReS(O)2Rf，其中Re是任选取代的烷基，并且Rf是氢或烷基。
如本文所用，术语“烷基硫代”是指-S-Rh基团，其中Rh是烷基。
如本文所用，术语“取代的烷基硫代”是指-S-Ri基团，其中Ri是取代的烷基。
如本文所用，术语“亚炔基(alkynylene)”是指二价的直链或支链的烃基团，其具有至少一个碳碳三键，并且通常具有约2-12个碳原子、优选为约2-8个碳原子，以及“取代的亚炔基”是指进一步包含一个或多个如本文所列的取代基的亚炔基基团。
如本文所用，术语“酰氨基(amido)”表示基团-C(O)NRjRj’，其中Rj和Rj’可以独立地为氢、低级烷基、取代的低级烷基、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
如本文所用，术语“取代的酰氨基”表示基团-C(O)NRkRk’，其中Rk和Rk’独立地为氢、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基，然而条件是，Rk和Rk’的至少一个不是氢。RkRk’与氮的组合可以形成任选取代的杂环或杂芳环。
如本文所用，术语“脒基”表示基团-C(＝NRm)NRm’Rm”，其中Rm、Rm’和Rm”独立地为氢或任选取代的烷基、芳基或杂芳基。
如本文所用，术语“氨基”或“胺”表示基团-NRnRn’，其中Rn和Rn’可以独立地为如本文所定义的氢、低级烷基、取代的低级烷基、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。“二价胺”表示基团-NH-。“取代的二价胺”表示基团-NR-，其中R是低级烷基、取代的低级烷基、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
如本文所用，术语“取代的氨基”或“取代的胺”表示基团-NRpRp’，其中Rp和Rp’独立地为氢、低级烷基、取代的低级烷基、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基，然而条件是，Rp和Rp’的至少一个不是氢。RpRp’与氮的组合可以形成任选取代的杂环或杂芳环。
如本文所用，术语“芳基炔基”是指芳基-取代的炔基和“取代的芳基炔基”是指进一步包含一个或多个如本文所列的取代基的芳基炔基。
如本文所用，术语“芳烷基”表示如本文所限定的烷基，其中烷基氢原子被本文所限定的芳基取代。芳烷基的实例包括苄基、苯乙基、1-苯丙基、2-苯丙基、3-苯丙基、1-萘丙基、2-萘丙基、3-萘丙基、3-萘丁基和类似物。
如本文所用，术语“芳酰基”是指芳基-羰基类，如苯甲酰基，并且“取代的芳酰基”是指进一步包含一个或多个如本文所列的取代基的芳酰基团。
如本文所用，术语“芳基烷基”是指芳基-取代的烷基，和“取代的芳基烷基”是指进一步包含一个或多个如本文所列的取代基的芳基烷基。
如本文所用，术语“芳基”单独或在组合中表示苯基、萘基或稠合的芳香族杂环，其任选地具有优选5-7个、更优选5-6个环成员的环烷基和/或任选地用1至3个基团或取代基取代，所述基团或取代基是卤素，羟基，烷氧基，烷基硫代，烷基亚磺酰基，烷基磺酰基，酰氧基，芳氧基，杂芳氧基，用烷基、芳基或杂芳基基团任选地单取代或双取代的氨基，脒基，用烷基、芳基、杂芳基或杂环基任选地取代的脲，用烷基、芳基或杂芳基任选地N-单或N，N-双取代的氨基磺酰基，烷基磺酰氨基，芳基磺酰氨基，杂芳基磺酰氨基，烷基羰基氨基，芳基羰基氨基，杂芳基羰基氨基或类似物。
如本文所用，术语“芳基羰基氨基”表示基团-NRqC(O)Rr，其中Rq是氢或低级烷基或烷基，并且Rr是任选取代的芳基。
如本文所用，术语“亚芳基”是指二价的芳基，其通常具有6至14个碳原子，并且“取代的亚芳基”是指进一步包含一个或多个如本文所列的取代基的亚芳基。
如本文所用，术语“芳氧基”表示基团-OAr，其中Ar是芳基或取代的芳基。
如本文所用，术语“芳基磺酰氨基”表示基团-NRqS(O)2Rr，其中Rq是氢或低级烷基或烷基，并且Rr是任选取代的芳基。
如本文所用，术语“氨基甲酸酯基团”表示基团-O-C(O)-NR2，其中每一个R独立地为H、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。
如本文所用，术语“二硫代氨基甲酸酯基团”表示基团-S-C(S)-NR2，其中每一个R独立地为H、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，如本文所列。
如本文所用，术语“碳环”是指具有由连接的碳原子组成的单环或多稠环的饱和的基团、不饱和的基团或芳基。所述环(一个或多个环)可以任选为未取代的或由下列基团取代的：例如卤素、低级烷基、烷氧基、烷基硫代、乙炔、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、硫羟、磺氨基以及类似基团。
如本文所用，术语“环烯基”是指包含环状环的基团，其包含3至20个碳原子并具有至少一个碳碳双键，并且“取代的环烯基”是指进一步具有一个或多个如本文所列的取代基的环烯基。
如本文所用，术语“环烷基”是指单环或多环烷基，其包含3至15个碳原子，并且“取代的环烷基”是指进一步具有一个或多个如本文所列的取代基的环烷基。
如本文所用，术语“亚环烷基”是指包含二价环的基团，其包含约3-12个碳原子，并且“取代的亚环烷基”是指进一步具有一个或多个如本文所列的取代基的亚环烷基。
如本文所用，术语“胍基”表示基团-N＝C(NH2)2，并且“取代的胍基”表示基团-N＝C(NR2)2，其中每个R独立地为如本文所列的H、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。
如本文所用，术语“卤”或“卤素”指所有卤素，即，氯(Cl)、氟(F)、溴(Br)和碘(I)。
如本文所用，术语“杂芳基”指包含5或6个环原子的单环芳环结构，或具有8-10个原子的双环芳基，具有一个或多个，优选具有1-4，更优选1-3，甚至更优选1-2个杂原子，所述杂原子独立地选自O、S和N，并且用如下的1-3个基团或取代基任选地取代：卤，羟基，烷氧基，烷基硫代，烷基亚磺酰基，烷基磺酰基，酰氧基，芳氧基，杂芳氧基，用烷基、芳基或杂芳基任选地进行单取代或双取代的氨基，脒基，用烷基、芳基、杂芳基或杂环基任选地取代的脲，用烷基、芳基或杂芳基任选地进行N-单取代或N，N-双取代的氨基磺酰基，烷基磺酰氨基，芳基磺酰氨基，杂芳基磺酰氨基，烷基羰基氨基，芳基羰基氨基，杂芳基羰基氨基，或类似基团。杂芳基也意在包括氧化的S或N，如亚磺酰基，磺酰基，和叔环氮的N-氧化物。碳或氮原子是杂芳基环结构的连接点，以便保持稳定的芳环。杂芳基的例子是苯邻二甲酰亚胺、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、喹唑啉基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、嘧啶基、吡咯基、唑基、噻唑基、噻吩基、异唑基、噻二唑基(oxathiadiazolyl)、异噻唑基、四唑基、咪唑基、三嗪基、呋喃基、苯并呋喃基、吲哚基和类似基团。取代的杂芳基包含一个连接到适合的碳或氮上以产生稳定的化合物的取代基。
如本文所用，术语“取代的杂芳基”指用如下的一个或多个官能团任选地单取代或多取代的杂环：例如卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷基硫代、乙炔基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环、取代的杂环、杂芳基(hetaryl)、取代的杂芳基(hetaryl)、硝基、氰基、硫羟、磺氨基以及类似基团。
如本文所用，术语“杂芳基羰基氨基”表示基团-NRqC(O)Rr，其中Rq是氢或低级烷基和Rr是任选取代的芳基。
如本文所用，术语“杂芳氧基”是指基团-OHet，其中Het是任选取代的杂芳基。
如本文所用，术语“杂芳基磺酰氨基”表示基团-NRqS(O)2Rs，其中Rq是氢或低级烷基和Rs是任选取代的杂芳基。
如本文所用，术语“杂环”指饱和的基团、不饱和的基团或芳基，其具有单个环(例如吗啉代、吡啶基或呋喃基)或多个稠环(例如萘吡啶基、喹喔啉基、喹啉基、中氮茚基或苯并[b]噻吩基)，以及在环内具有碳原子和至少一个杂原子，如N、O或S，它们可以任选地未取代或者用如下基团取代：例如卤素，低级烷基，低级烷氧基，烷基硫代，乙炔基，氨基，酰氨基，羧基，羟基，芳基，芳氧基，杂环，杂芳基，取代的杂芳基，硝基，氰基，硫羟，磺氨基以及类似基团。
如本文所用，术语“取代的杂环”指用一个或多个，例如1、2或3个取代基取代的杂环，该取代基选自任选取代的烷基，任选取代的烯基，任选取代的炔基，卤，羟基，烷氧基，烷基硫代，烷基亚磺酰基，烷基磺酰基，酰氧基，芳基，取代的芳基，芳氧基，杂芳氧基，氨基，酰氨基，脒基，用烷基、芳基、杂芳基或杂环基任选取代的脲，用烷基、芳基或杂芳基任选地N-单取代或N，N-双取代的氨基磺酰基，烷基磺酰氨基，芳基磺酰氨基，杂芳基磺酰氨基，烷基羰基氨基，芳基羰基氨基，杂芳基羰基氨基，酰基，羧基，杂环，取代的杂环，杂芳基，取代的杂芳基，硝基，氰基，硫羟，氨磺酰以及氧代，它们在任意可利用点被连接以产生稳定的化合物。
如本文所用，术语“烃基”包含任意有机基团，其中其主链仅包含碳和氢。因此烃基包含烷基、环烷基、链烯基、环烯基、炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、芳基烯基、烯基芳基、芳基炔基、炔基芳基和类似物。
如本文所用，术语“取代的烃基”指进一步包含一个或多个取代基的任意上述引用的烃基，所述取代基选自羟基、烃氧基、取代的烃氧基、烷基硫代、取代的烷基硫代、芳基硫代、取代的芳基硫代、氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、羧基、-C(S)SR、-C(O)SR、-C(S)NR2——其中每个R独立地为氢、烷基或取代的烷基——、硝基、氰基、卤素、-SO3M或-OSO3M——其中M是H、Na、K、Zn、Ca或葡甲胺(meglumine)、胍基、取代的胍基、烃基、取代的烃基、烃基羰基、取代的烃基羰基、烃氧基羰基、取代的烃氧基羰基、烃基羰氧基、取代的烃基羰氧基、酰基、酰氧基、杂环、取代的杂环、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基羰基、取代的杂芳基羰基、氨基甲酰基、单烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、氨基甲酸酯基团、二硫代氨基甲酸酯基团、芳酰基、取代的芳酰基、有机磺酰基、取代的有机磺酰基、有机亚磺酰基、取代的烷基亚磺酰基、烷基磺酰氨基、取代的烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨基、取代的芳基磺酰氨基、氨磺酰基团、砜基和类似物，包括两个或更多的上述基团，通过这样的连接/间隔部分(linker/spacermoiety)连接到所述烃基部分，所述连接/间隔部分如-O-、-S-、NR-，其中R是氢、烷基或取代的烷基、-C(O)-、-C(S)-、-C(＝NR’)-、-C(＝CR’2)-——其中R’是烷基或取代的烷基、-O-C(O)-、-O-C(O)-O-、-O-C(O)-NR-(或-NR-C(O)-O-)、-NR-C(O)-、-NR-C(O)-NR-、-S-C(O)-、-S-C(O)-O-、-S-C(O)-NR-、-O-S(O)2-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-NR-、-O-S(O)-、-O-S(O)-O-、-O-S(O)-NR-、-O-NR-C(O)-、-O-NR-C(O)-O-、-O-NR-C(O)-NR-、-NR-O-C(O)-、-NR-O-C(O)-O-、-NR-O-C(O)-NR-、-O-NR-C(S)-、-O-NR-C(S)-O-、-O-NR-C(S)-NR-、-NR-O-C(S)-、-NR-O-C(S)-O-、-NR-O-C(S)-NR-、-O-C(S)-、-O-C(S)-O-、-O-C(S)-NR-(或-NR-C(S)-O-)、-NR-C(S)-、-NR-C(S)-NR-、-S-S(O)2-、-S-S(O)2-O-、-S-S(O)2-NR-、-NR-O-S(O)-、-NR-O-S(O)-O-、-NR-O-S(O)-NR-、-NR-O-S(O)2-、-NR-O-S(O)2-O-、-NR-O-S(O)2-NR-、-O-NR-S(O)-、-O-NR-S(O)-O-、-O-NR-S(O)-NR-、-O-NR-S(O)2-O-、-O-NR-S(O)2-NR-、-O-NR-S(O)2-、-O-P(O)R2-、-S-P(O)R2-或-NR-P(O)R2-，其中每个R独立地为氢、烷基或取代的烷基，和类似物。
如本文所用，术语“烃氧基”表示-O-烃基，其包含2-20个碳原子，并且“取代的烃氧基”是指进一步包含一个或多个如本文所列的取代基的烃氧基基团。
如本文所用，术语“烃基羰基”是指-C(O)-烃基，其包含2-20个碳原子，并且“取代的烃基羰基”是指进一步包含一个或多个如本文所列的取代基的烃基羰基基团。
如本文所用，术语“烃氧基羰基”是指-C(O)-O-烃基，其包含2-20个碳原子，并且“取代的烃氧基羰基”是指进一步包含一个或多个如本文所列的取代基的烃氧基羰基基团。
如本文所用，术语“烃基羰氧基”是指-O-C(O)-烃基，其包含2-20个碳原子，并且“取代的烃基羰氧基”是指进一步包含一个或多个如本文所列的取代基的烃基羰氧基基团。
如本文所用，术语“亚烃基(hydrocarbylene)”包含任意二价有机基，其中其主链仅包含碳和氢。因此亚烃基包含亚烷基、亚环烷基、亚链烯基、亚环烯基、亚炔基、亚芳基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚链烯基、烯基亚芳基、芳基亚炔基、炔基亚芳基和类似物，并且“取代的亚烃基”是指进一步包含一个或多个如本文所列的取代基的任何上述提及的亚烃基基团。
如本文所用，术语“羟基(hydroxyl和hydroxy)”指基团-OH。
如本文所用，术语“有机亚磺酰基”表示基团-S(O)-有机基团，其中有机基团包含烷基-、烷氧基-、烷基氨基-、和芳基部分，以及取代的烷基-、烷氧基-、烷基氨基-、和芳基部分。
如本文所用，术语“有机磺酰基”表示基团-S(O)2-有机基团，其中有机基团包含烷基-、烷氧基-和烷基氨基-部分，以及取代的烷基-、烷氧基-或烷基氨基-部分。
如本文所用，术语“氧代”是指与连接的碳双键连接的氧取代基。
如本文所用，术语“亚磺酰基”表示基团-S(O)-。
如本文所用，术语“取代的亚磺酰基”表示基团-S(O)Rt，其中Rt是低级烷基、取代的低级烷基、环烷基、取代的环烷基、环烷基烷基、取代的环烷基烷基、杂环基、取代的杂环基、杂环基烷基、取代的杂环基烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、芳烷基或取代的芳烷基。
如本文所用，术语“磺酰基”表示基团-S(O)2-。
如本文所用，术语“取代的磺酰基”表示基团-S(O)2Rt，其中Rt是低级烷基、取代的低级烷基、环烷基、取代的环烷基、环烷基烷基、取代的环烷基烷基、杂环基、取代的杂环基、杂环基烷基、取代的杂环基烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、芳烷基或取代的芳烷基。
如本文所用，术语“磺酰氨基”表示基团-NRqS(O)2-，其中Rq是氢或低级烷基。
如本文所用，术语“取代的磺酰氨基”表示基团-NRqS(O)2Ru，其中Rq是氢或低级烷基，并且Ru是低级烷基、取代的低级烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳烷基、取代的杂芳烷基、芳烷基或取代的芳烷基。
如本文所用，术语“砜基(sulfuryl)”表示基团-S(O)2-。
如本文使用的与数值相关的术语“接近”和“约”表示所示数值的30％。
附图说明
图1A和1B是两种机制的示意图，其图解了核酸聚合酶介导的引物延伸如何在热启动激活之前能被3’-取代的dNTP削弱。
图2A和2B是热诱导的热启动激活的示例性方案的示意图。“X”表示取代基。图2A显示包含3’-X基团的3’-取代的dNTP向未取代的、活性状态3’-OHdNTP的转化。图2B显示包含3’-X取代基的“终止引物”向未取代的可延伸引物的转化。
图3显示dTTP在95℃下于PCR缓冲液中从3’-取代的dTTPs形成的动力学。
图4显示3’-醚取代的dTTP通过KlenowDNA聚合酶在引物延伸反应中与未加热的(上图)和预热的(下图)3’-取代的dTTPs的挑战性结合的结果。
图5显示在λ***中几种3’-取代的dTTP衍生物的热启动PCR实验的结果：凝胶电泳分析(上图)和扩增子与脱靶产物的比例的图示(下图)。
图6显示在HIVDNA***中几种3’-取代的dTTP衍生物的热启动PCR实验的结果：凝胶电泳分析(上图)和扩增子与脱靶产物的比例的图示(下图)。
图7显示3’-THF取代的dTTP和dATP对365bpHIV-1片段的热启动PCR扩增的效率的组合影响：凝胶电泳分析(上图)和扩增子与脱靶产物的比例的图示(下图)。
图8是利用3’-取代的dNTPs联合磷酸三酯引物的优选单管缺口延伸连接PCR(GapEXtensionLigationPCR；GEXL-PCR)方法的图示。
发明详述
核酸复制反应如PCR包括(a)寡核苷酸引物与靶核酸的杂交，接着(b)通过核酸聚合酶将核苷5’-三磷酸(NTPs)结合到寡核苷酸上以形成至少一个拷贝，优选多拷贝的靶序列。不过，由于错误引发和引物二聚体形成，复制反应经常产生不需要的产物，这影响该过程和可能的下游过程的效率和精确度。许多不需要的产物在复制反应的样品制备和初始温度升高(初始变性步骤)期间产生。
本文的方法和组合物提供用于核酸复制的改进的方法和组合物。在特定方面，该方法和组合物涉及NTPs在温度依赖性核酸复制反应中的应用。在其他方面，核酸复制方法使用优选在糖的3’-位置具有热可去除修饰基团的一个或多个3’-取代NTPs，其的存在削弱不需要的扩增产物的形成。
在一方面，本文提供的是利用至少一种修饰NTP复制核酸的方法，其中所述修饰NTP包括在3’-位置具有至少一种取代基的一个或多个修饰基团。在一些优选的实施方式中，3’-位置上的取代基在复制反应的初始变性步骤期间转化成3’-OH基团或与NTP解离。例如，初始变性步骤在逆转录酶反应中在大约42-70℃下发生10-100分钟并且对于PCR反应在大约94℃、95℃、96℃或100℃下发生3-30分钟。本领域技术人员基于用本文提供的3’-取代NTPs进行的复制反应将能确定初始变性步骤发生的参数。
在优选的实施方式中，本文的方法和组合物提供3’-取代NTP，其中NTP具有一个或多个修饰基团，其中至少一个修饰在3’-位置(即3’-取代NTP)。根据一种机制，3’-取代NTP是非底物NTP并且不能被用作核酸聚合酶的底物(图1A)。因此，3’-取代NTP直到3’-取代基被去除或者另外地被转化成自由的羟基才被结合到寡核苷酸或多核苷酸链上。在第二种机制中，3’-取代NTP是终止NTP并且可通过核酸聚合酶被结合以在3’-位置延长多核苷酸或寡核苷酸引物一个修饰的核苷单位，从而产生终止引物(图1B)。因此，终止引物进一步的链延长被防止，除非并且直至3’-取代基被去除，或者另外地被转化为自由的羟基，以产生可延长引物。因此，NTP的3’-取代在复制的高温下——诸如在PCR的初始变性步骤中，其优选地为在约95℃下——在初始温育步骤之前消弱了核酸聚合酶介导的引物延伸1-120分钟。在达到期望温度例如高温后，终止引物通过热诱导的分子内和/或分子间片段化——其去除了3’-取代基，或者另外地将3’-取代基转化成开放的(即未修饰的)3’-羟基——变成可延长引物。可延长引物具有开放的3’-羟基(3’-OH)并且可通过核酸聚合酶被有效地延长。
本文提供的3’-取代基的部分转化(例如，从所有修饰分子中的一部分)或完全转化(例如，从所有修饰分子中)为3’-羟基优选地在大约95℃下温育后在1-120分钟内，优选地在1-30分钟内，优选地在1-15分钟内，优选地在1-10分钟内，更优选地在1-5分钟内，并且更优选地在1-2分钟内发生。在某些实施方式中，3’-取代NTP或终止引物向活性状态的转化与温度相关地发生并且不需要酶、另外的化学试剂或改良的聚合反应条件但是可与它们联合应用。在某些实施方式中，复制反应不包括任何另外的物质。另外的物质的实例包括但不限于化学化合物和酶。在特殊实施方式中，不包括在复制反应中的另外化合物是化学切割剂诸如本领域中使用以去除3’-取代基的那些(例如，高温下在中性水溶液中钯催化剂(参见，例如Ju，etal.，美国专利号6,664,079；Meng，Q.，etal，78J.Org.Chem.，3248-3252(2006)；和Bi，L.，etal.，128J.Amer.Chem.Soc.，2542-2543(2006))、盐酸以达到pH2(参见，例如Tsien，R.Y，WO91/06678)、还原剂诸如巯基乙醇(参见，例如Kwiatkowski，M.，美国专利号7,279,563)或者通过加入三-(2-羧乙基)膦(参见，例如Milton，J.，etal，美国专利号7,414,116)。在特殊实施方式中，3’-取代基的去除不是通过UV照射(参见，例如Dower，etal.，WO92/10587)。在一些实施方式中，复制反应不包括3’-取代基的化学切割(例如，通过切割酶)。在其它实施方式中，复制反应是不包括任何另外物质的测序反应，优选地不包括在复制反应中的另外化合物是切割剂。在一些其它实施方式中，复制反应不是通过逐步分析进行的测序(例如，靶序列的线性复制)。
在一方面，根据本发明的3’-取代NTPs和其衍生物提供式IA的化合物：
其中：
n是0或1；
B选自取代或未取代的嘌呤或嘧啶、其任何氮杂或脱氮(deaza)衍生物、或任何NTP类似物的任何“通用碱基”或“简并碱基”，其优选地可被核酸聚合酶识别；
A选自O、S、Se、CR1R2和NR1；
W选自O、S、Se、CR1R2和NR1；
每个R1和每个R2独立地选自H、F、Cl、Br、I、OR3、SR3、SeR3、NR3R4、C(Y)R5以及取代或未取代的烷基、链烯基、炔基、芳基和芳烷基，
其中任何取代基每个可任选地包含一个或多个杂原子；
每个R3和每个R4独立地选自H或取代或未取代的烷基、链烯基、炔基、芳基和芳烷基，
其中任何取代基可每个任选地包含一个或多个杂原子；
每个R5选自H、F、Cl、Br、OR3、SR3、SeR3、NR3R4、C(Y)R3和取代或未取代的烷基、链烯基、炔基、芳基和芳烷基，
其中任何取代基可每个任选地包含一个或多个杂原子；
每个Y选自O、S、Se、CR1R2和NR1；
Z1、Z4和Z7每个独立地选自O、S、Se、CR1R2和NR1；
Z0和Z6每个独立地选自O、S、Se、O2、CR1R2、NR1和C(Y)；
Z3选自O、S、Se、O2、CR1R2、NR1、C(Y)、3’-O-寡核苷酸基残基和寡核苷酸引物，
其中当n是0时，Z3是3’-O-寡核苷酸基残基或寡核苷酸引物，并且
其中当n是1时，Z3是O、S、Se、O2、CR1R2、NR1或C(Y)；
Z2、Z5和Z8每个独立地选自H、F、OR3、SR3、SeR3、NR3R4、NR3OR3、NR3-NR3R4、CN、N3、(BH3)-M+和C(Y)R5；
Z9选自H、F、OR3、SR3、SeR3、NR3R4、NR3OR3、NR3-NR3R4、CN、N3、(BH3)-M+、C(Y)R5和磷酸酯；
Z10选自O、S和Se；
M+是阳离子；
X1、X2、X3、X4和X5每个独立地选自R1、NR3OR3、NR3-NR3R4、CN、N3、NO、NO2、NCO、NCS、OCN、SCN和SSR3；
R选自
R可任选地通过合适的原子或原子组共价连接至式IA中描述的NTP分子的X1、X2、X3、X4、X5、Z0、Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、A、W或B部分；
每个R6独立地选自无机酸残基或其衍生物，除了碳酸外，其中衍生物可包括但不限于卤素、磺酸酯、硫代磺酸酯、硒代硫酸酯、硒代磺酸酯、硫酸酯、硫酸硫代酯、亚硫酸酯、亚磺酸酯(sulphinate)、亚磺酸酯(sulphinicacid)、硝酸酯、亚硝酸酯、含磷、硒和硼的酸；
每个R7、每个R8、每个R9和每个R10独立地选自氢以及具有1-20碳原子、优选地1-10碳原子、优选地1-6碳原子的直链或支链任选取代的烃基，其中所述烃基是可任选地包括至少一个取代基的烷基、链烯基或炔基，所述取代基选自卤、氧代、羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳氧基和杂芳基；
每个X6、每个X7、每个X8和每个X9独立地选自下列的任意取代或未取代的基团：酰基、酰氧基、链烯基、链烯基芳基、亚链烯基、烷基、低级烷基、亚烷基、炔基、炔基芳基、烷氧基、低级烷氧基、烷基芳基、烷基羰基氨基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基氨基、烷基硫代、亚炔基、酰氨基、脒基、氨基、芳基炔基、芳烷基、芳酰基、芳基烷基、芳基、芳基羰基氨基、亚芳基、芳氧基、芳基磺酰基氨基、氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸酯、环链烯基、环烷基、亚环烷基、胍基、卤、卤素、杂芳基、杂芳基羰基氨基、杂芳氧基、杂芳基磺酰基氨基、杂环、杂环、烃基、烃基、烃基羰基、烃氧基羰基、烃基羰氧基、亚烃基、有机亚磺酰基、羟基、有机亚磺酰基、有机磺酰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰基氨基和砜基；
每个X10独立地选自O、S、Se、NR11、N-OR11和CR11R12；
每个R11和每个R12独立地选自下列的任意取代或未取代的基团：酰基、酰氧基、链烯基、链烯基芳基、亚链烯基、烷基、低级烷基、亚烷基、炔基、炔基芳基、烷氧基、低级烷氧基、烷基芳基、烷基羰基氨基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基氨基、烷基硫代、亚炔基、酰氨基、脒基、氨基、芳基炔基、芳烷基、芳酰基、芳基烷基、芳基、芳基羰基氨基、亚芳基、芳氧基、芳基磺酰基氨基、氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸酯、环链烯基、环烷基、亚环烷基、胍基、卤、卤素、杂芳基、杂芳基羰基氨基、杂芳氧基、杂芳基磺酰基氨基、杂环、杂环、烃基、烃基、烃基羰基、烃氧基羰基、烃基羰氧基、亚烃基、有机亚磺酰基、羟基、有机亚磺酰基、有机磺酰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰基氨基和砜基；和
每个Y1独立地选自O、S、Se、NR6、N-OR6和CR6R7。
在式IA的某些实施方式中，B是胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、氨基烯丙基-尿嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-甲基鸟嘌呤、7-脱氮-7-碘鸟嘌呤、7-脱氮-7-氨基烯丙基-鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-硝基-胞嘧啶、5-氨基烯丙基-胞嘧啶、5-(生物素-16)-胞嘧啶、5-(荧光素-11)-胞嘧啶、4-甲基氨基-胞嘧啶、2-硫代-5-甲基尿嘧啶或4-硫代-5-甲基尿嘧啶。
在式IA的优选实施方式中，B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在式IA的某些实施方式中，X1、X3和X4是H；W是CH2；Z0、Z1、Z6和Z7是O；并且Z5和Z8是OH，如下所示。
在式IA的某些实施方式中，A是NH、O、CH2或S；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；并且Z2、Z5、Z8和Z9是OH，如下所示。
在式IA的某些实施方式中，X2是H、OH、F、CH3、OCH3、N3、NH2或NHCH3；A是O；X1、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH，如下所示。
在式IA的某些实施方式中，X5是H、SH、CH3、F、OCH3、NH2或NHCH3；A是O；X1、X2、X3和X4是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；并且Z2、Z5、Z8和Z9是OH，如下所示。
在式IA的某些实施方式中，Z2是OH、SH、BH3、CH3、OCH3或OCH2CH3；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；并且Z5、Z8和Z9是OH，如下所示。
在式IA的某些实施方式中，Z4是O或S；n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z6和Z7是O；并且Z2、Z5、Z8和Z9是OH，如下所示。
在式IA的某些实施方式中，Z9是SH、SCH2CH2CN、OH、F、OCH3、OCH2CH3、OC6H5、NHCH3、NH2、NHCH2CH2NH2、NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2或磷酸酯基团；n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；并且Z2、Z5和Z8是OH，如下所示。
在式IA的某些实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；并且Z2、Z5、Z8和Z9是OH，如下所示。
式IA的某些优选实施方式如下(从上至下，从左至右)。在式IA的一个优选实施方式中，n是1；A是S；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-(对甲苯)磺酸酯。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X3、X4和X5是H；X2是O-CH3；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-(对甲苯)磺酸酯。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3和X4是H；X5＝CH3；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-(对甲苯)磺酸酯。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2是SH；Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-(对甲苯)磺酸酯。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；Z4是S；并且R是O-(对甲苯)磺酸酯。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5和Z8是OH；Z9是SH；并且R是O-(对甲苯)磺酸酯。
式的甚至更优选的实施方式如下所示。在式IA的一个优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-(对甲苯)磺酸酯。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-磷酸酯。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-硝酸酯。
式IA的某些优选实施方式如下所示(从上至下，从左至右)。在式IA的一个优选实施方式中，n是1；A是S；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-四氢呋喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X3、X4和X5是H；X2是O-CH3；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-四氢呋喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3和X4是H；X5＝CH3；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-四氢呋喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2是SH；Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-四氢呋喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；Z4是S；并且R是O-四氢呋喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5和Z8是OH；Z9是SH；并且R是O-四氢呋喃基。
式IA的某些优选实施方式如下所示(从上至下，从左至右)。在式IA的一个优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-[4-甲氧基]-四氢吡喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-四氢吡喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-四氢呋喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-[4-甲氧基]-四氢硫代吡喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-四氢硫代吡喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-[5-甲基]-四氢呋喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-[2-甲基，4-甲氧基]-四氢吡喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-[5-甲基]-四氢吡喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-四氢噻吩基。
式IA的甚至更优选的实施方式如下。在式IA的一个优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-[4-甲氧基]-四氢吡喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-四氢吡喃基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-四氢呋喃基。
式IA的某些优选实施方式如下所示(从上至下，从左至右)。在式IA的一个优选实施方式中，n是1；A是S；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-苯氧基乙酰基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X3、X4和X5是H；X2是O-CH3；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-苯氧基乙酰基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3和X4是H；X5是CH3；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-苯氧基乙酰基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z5、Z8和Z9是OH；Z2是SH；并且R是O-苯氧基乙酰基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z6和Z7是O；Z4是S；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-苯氧基乙酰基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5和Z8是OH；Z9是SH；并且R是O-苯氧基乙酰基。
式IA的甚至更优选的实施方式显示在下面。在式IA的一个优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-苯氧基乙酰基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-甲氧基乙酰基。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-乙酰基。
式IA的某些优选实施方式中显示在下面(从上至下，从左至右)。在式IA的一个优选实施方式中，n是1；A是S；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-C(O)-OCH3。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X3、X4和X5是H；X2是O-CH3；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-C(O)-OCH3。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3和X4是H；X5是CH3；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-C(O)-OCH3。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2是SH；Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-C(O)-OCH3。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z6和Z7是O；Z4是S；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-C(O)-OCH3。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5和Z8是OH；Z9是SH；并且R是O-C(O)-OCH3。
式IA的甚至更优选的实施方式显示在下面。在式IA的一个优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-C(O)-OCH3。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-C(O)-CH2CH2CN。在式IA的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3、X4和X5是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且R是O-C(S)-OCH3。
在式IA的某些实施方式中，n是0，以致于Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、P2和P3不存在；并且Z3是3’-O-寡核苷酸基残基或寡核苷酸引物，从而提供“终止引物”。
在一方面，根据本发明的3’-取代NTPs和其衍生物提供式IB的化合物：
其中：
n是0或1；
B选自取代或未取代的嘌呤或嘧啶、其任何氮杂或脱氮衍生物、或任何NTP类似物的任何“通用碱基”或“简并碱基”，其优选地可被核酸聚合酶识别；
A选自O、S、Se、CR1R2和NR1；
W选自O、S、Se、CR1R2和NR1；
每个R1和每个R2独立地选自H、F、Cl、Br、I、OR3、SR3、NR3R4、C(Y)R5以及取代或未取代的烷基、链烯基、炔基、芳基和芳烷基，
其中任何取代基可每个任选地包含一个或多个杂原子；
每个Y独立地选自O、S、Se、CR1R2和NR1；
每个R3和每个R4独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的芳烷基，
其中任何取代基可每个任选地包含一个或多个杂原子；
每个R5独立地选自H、F、Cl、Br、OR3、SR3、NR3R4、取代或未取代的取代或未取代的烷基、取代或未取代的链烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的芳烷基，
其中任何取代基可每个任选地包含一个或多个杂原子；
Z1、Z4和Z7每个独立地选自O、S、Se、CR1R2和NR1；
Z0和Z6每个独立地选自O、S、Se、O2、CR1R2、NR1和C(Y)；
Z3选自O、S、Se、O2、CR1R2、NR1、C(Y)、3’-O-寡核苷酸基残基和寡核苷酸引物，
其中当n是0时，Z3是3’-O-寡核苷酸基残基或寡核苷酸引物，并且
其中当n是1时，Z3是O、S、Se、O2、CR1R2、NR1或C(Y)；
Z2、Z5和Z8每个独立地选自H、F、OR3、SR3、SeR3、NR3R4、NR3OR3、NR3-NR3R4、CN、N3、(BH3)-M+和C(Y)R5；
Z9选自H、F、OR3、SR3、SeR3、NR3R4、NR3OR3、NR3-NR3R4、CN、N3、(BH3)-M+、C(Y)和磷酸酯；
M+是阳离子；
X1、X2、X3和X4每个独立地选自R1、F、Cl、Br、I、OR3、SR3、SeR3、NR3R4、NR3OR3、NR3-NR3R4、CN、N3、C(Y)R5、NO2、CN和SSR3；
X5选自O、S、Se、NR6、N-OR6和CR6R7；
Y1选自O、S、Se、NR6、N-OR6、CR6R7和C(Y)；
每个R6和每个R7独立地选自氢以及具有1-20碳原子、优选地1-10碳原子、优选地1-6碳原子的直链或支链任选取代的烃基，
其中所述烃基是可任选地包括至少一个取代基的烷基、链烯基或炔基，所述取代基选自卤、氧代、羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳氧基和杂芳基；并且
X5和Y1每个可任选地通过合适的原子或原子组共价连接至式IB中描述的NTP分子的X1、X2、X3、X4、X5、Z0、Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、A、W或B部分。
在式IB的某些实施方式中，B是胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、氨基烯丙基-尿嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-甲基鸟嘌呤、7-脱氮-7-碘鸟嘌呤、7-脱氮-7-氨基烯丙基-鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-硝基-胞嘧啶、5-氨基烯丙基-胞嘧啶、5-(生物素-16)-胞嘧啶、5-(荧光素-11)-胞嘧啶、4-甲基氨基-胞嘧啶和2-硫代-5-甲基尿嘧啶或4-硫代-5-甲基尿嘧啶。
在式IB的优选实施方式中，B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在式IB的某些实施方式中，A是NH、O、CH2或S；X1、X2和X3是H；W是CH2；Z0、Z1、Z6和Z7是O；Z5和Z8是OH，如下所示。
在式IB的某些实施方式中，A是NH、O、CH2或S；X1、X2、X3和X4是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH，如下所示。
在式IB的某些实施方式中，X4是H、SH、CH3、F、OCH3、NH2或NHCH3；A是O；X1、X2和X3是H；；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH，如下所示。
在式IB的某些实施方式中，Z2是OH、SH、BH3、CH3、OCH3或OCH2CH3；A是O；X1、X2、X3和X4是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；并且Z5、Z8和Z9是OH，如下所示。
在式IB的某些实施方式中，Z4是O或S；n是1；A是O；X1、X2、X3和X4是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z6和Z7是O；并且Z2、Z5、Z8和Z9是OH，如下所示
在式IB的某些实施方式中，Z9是SH、SCH2CH2CN、OH、F、OCH3、OCH2CH3、NHCH3、NH2、NHCH2CH2NH2、NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2或磷酸酯基团；n是1；A是O；X1、X2、X3和X4是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；并且Z2、Z5和Z8是OH，如下所示。
在式IB的某些实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3和X4是H；W是CH2；Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；并且Z2、Z5、Z8和Z9是OH，如下所示。
式IB的某些优选实施方式如下(从上至下，从左至右)。在式IB的一个优选实施方式中，n是1；A是S；X1、X2、X3和X4是H；W是CH2；X5、Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且Y1是C＝S。在式IB的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2和X3是H；X4是CH3；W是CH2；X5、Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且Y1是C＝S。在式IB的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3和X4是H；W是CH2；X5、Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2是SH；Z5、Z8和Z9是OH；并且Y1是C＝S。在式IB的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3和X4是H；W是CH2；X5、Z0、Z1、Z3、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；Z4是SH；并且Y1是C＝S。在式IB的另一优选实施方式中，n是1；A是O；X1、X2、X3和X4是H；W是CH2；X5、Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5和Z8是OH；Z9是SH；并且Y1是C＝S。
式IB的甚至更优选的实施方式如下。在式IB的一个优选实施方式中，n是1；X1、X2、X3和X4是H；W是CH2；A、X5、Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且Y1是C＝O。在式IB的另一优选实施方式中，n是1；X1、X2、X3和X4是H；W是CH2；A、X5、Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且Y1是C＝S。在式IB的另一优选实施方式中，n是1；X1、X2、X3和X4是H；X5是S；W是CH2；A、Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是O；Z2、Z5、Z8和Z9是OH；并且Y1是C＝O。
在式IB的一个实施方式中，n是0，以致于Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、P2和P3不存在；并且Z3是3’-O-寡核苷酸基残基或寡核苷酸引物，从而提供“终止引物”。
在一方面，本文的方法和组合物提供用于核酸复制的3’-取代NTPs。在一些实施方式中，3’-取代NTP可在任何位置上不具有其它修饰基团。在其它实施方式中，3’-取代NTP包含另外的修饰诸如在其碱基、三磷酸链、糖或其组合上的修饰。3’-取代NTP可具有本文所述的式IA-IB的化学式。在优选的实施方式中，3’-取代NTP是3’-取代的dTTP、dCTP、dATP、dGTP或dUTP。
在另一方面，本文提供的是合成具有本文进一步描述的式IA-IB中所述的化学结构的3’-取代NTPs的方法。包括3’-取代基的修饰基团可通过采用现有的合成或酶促方法结合到NTP中。本文提供的方法和组合物的3’-取代NTP可通过本领域熟知的任何方法进行合成。对于合成修饰的和未修饰的NTPs的各种方法的全面综述已经被发表(Burgess，K.andCook，D.100Chem.Rev.，2047-2059(2000)；“NucleosideTriphosphatesandTheirAnalogs：Chemistry，BiotechnologyandBiologicalApplications，Vaghefi，M.ed.，TaylorandFrancis，BocaRaton(2005)。合成并提纯3’-取代NTP后，几种不同的程序可被用于从结构和纯度方面测定NTP的可接受性。这种程序的实例是核磁共振光谱、质谱、荧光光谱、紫外光谱、高效液相色谱。这些程序是本领域技术人员所熟知的。本领域中当前用于分离、提纯和分析的方法也可适用于本文提供的方法和组合物的3’-取代NTPs。
可以利用实现本文提供的方法和组合物的目的的任何3’-取代基。3’-取代基应当是这样的3’-取代基，其在要应用3’-取代NTP的复制反应条件下解离、可去除或另外转化成开放的羟基基团。另一方面，3’-取代基在周围环境温度下不应当太快地解离或转化成开放的3’-OH基团。3’-取代基的丧失应当可由用户控制以达到本文提供的方法和组合物的益处。NTP的3’-位置上取代的类型和程度一般凭经验进行测定，目的是达到控制NTP或终止引物的3’-取代基的解离的上述参数。在一些实施方式中，3’-取代基向开放的3’-OH基团的转化是部分的(例如，当3’-取代基从一部分修饰的(例如3’-取代的)分子解离时)，例如，至少10％；或至少20％；或至少30％；或至少40％；或至少50％；或至少60％；或至少70％；或至少80％；或至少90％；或至少95；或至少98％；或至少99％修饰的NTPs(例如，具有3’-取代基的NTPs)转化成未修饰的NTPs(例如，具有3’-OH的NTPs)。在一些实施方式中，3’-取代基的转化发生在这样的温度下：大约0-105℃之间；或大约0-100℃之间；或大约之间20-100℃；或大约之间37-100℃；或大约之间50-100℃；或大约之间70-100℃；或大约45℃；或大约50℃；或大约55℃；或大约60℃；或大约65℃；或大约70℃；或大约75℃；或大约80℃；或大约90℃；或大约95℃；或大约96℃；或大约97℃；或大约98℃；或大约99℃；或大约100℃。在一些实施方式中，两种不同类型的3’-取代NTPs被使用并且两种不同类型的3’-取代NTPs可在相同的温度下或在不同的温度下转化。在优选的实施方式中，第一3’-取代NTP在PCR反应的初始变性温度(～95℃)下转化并且第二3’-取代NTP在逆转录酶反应的初始变性温度(～50℃)下转化。基于其转化特性选择3’-取代基的能力允许用户能够在相同的反应容器中组合不同复制反应的试剂(例如，用户仅需要制备两种不同反应的单一预混合物，而不是为每个反应制备一个预混合物的标准实践)。因此，通过利用对每个不同复制反应具有选择性的3’-取代NTPs可在单一反应容器中进行复制反应的各种组合。
在另一实施方式中，本文提供的方法和组合物的3’-取代NTPs可在含有包含修饰基团(一个或多个)的NTP分子的3’-取代基中或任何其他部分中的手性原子。手性可导致3’-取代NTPs的单个非对映异构体或非对映异构体的混合物。3’-取代NTP可以是外消旋的或非对映异构的混合物，或者70％、或80％、或90％、或95％、或99％、或100％手性纯的化合物。
在一些复制反应中，复制反应中不是所有NTP分子都将包含3’-取代基。优选地，甚至两种非活性/终止状态的3’-取代NTPs和活性的3’-未取代的NTP的混合物相比完全不使用3’-取代NTPs提高了混合群中复制的效率和特异性。优选地，在初始变性温度下温育之前，3’-取代NTPs占总NTP分子的至少25％，优选地总NTP分子的至少50％，优选地总NTP分子的至少75％以及优选地总NTP分子的至少90％，优选地总NTP分子的至少95％，优选地总NTP分子的至少98％，更优选地总NTP分子的至少99％，以及更优选地总NTP分子的100％。在另一实施方式中，两种、三种、四种或所有类型的NTPs可以是3’-取代NTPs。
在一种实施方式中，复制反应中仅有一种类型的NTP是3’-取代的而所有其他类型的NTPs是常规的NTP分子。例如，在dATPs、dTTPs、dGTPs和dCTPs是复制反应中NTPs的类型的情况下，只有dATPs是3’-取代的并且dTTPs、dGTPs和dCTPs是常规的NTP分子。在另一实施方式中，两种或更多种类型的NTPs是3’-取代的。在另一实施方式中，三种或更多种类型的NTPs是3’-取代的。在另一实施方式中，四种或更多种类型的NTPs是3’-取代的。
在另一实施方式中，复制反应中可存在一种以上类型的3’-取代NTP。3’-取代NTPs的混合物可被用在复制反应中。在一种实施方式中，非底物NTPs和终止NTPs的混合物可存在于同一复制反应中。在另一实施方式中，具有不同取代基的3’-取代NTPs的混合物可存在于同一复制反应中。
在一方面，本文提供的方法和组合物提供具有3’-取代基的化学修饰核苷，3’-取代基通过热可去除的或可转化成开放的3’-羟基基团。这样修饰的核苷可通过与现有合成方法兼容的方法转化成相应的NTP。可以制备任何核苷的相应3’-取代NTP。相反，乙醛酰修饰(Bonner，etal.，美国专利申请号20030162199)，其也代表热不稳定基团(但不是3’-取代基)，只可加到包含NTP的鸟嘌呤的杂环碱基上。因此，热不稳定乙醛酰修饰限于一种NTP，而在本文提供的方法和组合物中，任何或所有的NTPs可具有热不稳定的3’-取代基。
在又一方面，本文提供的是利用3’-取代NTPs的模板依赖性核酸合成的方法，如本文所述。
水生栖热菌(Thermusaquaticus(Taq))DNA聚合酶——一种热稳定聚合酶，以及其它DNA或RNA聚合酶，其包括DNA依赖性DNA聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶和RNA依赖性RNA聚合酶，可与本文提供的方法和组合物联合使用。在一些实施方式中，复制反应包括核酸聚合酶以及一种或多种另外的酶，其包括第二核酸聚合酶、连接酶(例如，DNA连接酶、RNA连接酶)、合成酶、核酸酶(例如，核酸限制酶、寻靶核酸内切酶、切口核酸内切酶)、DNA修复蛋白、甲基转移酶、激酶、磷酸酶、磺酰酶、重组酶、逆转录酶、解旋酶和本领域已知的其它酶。
本文提供的方法和组合物的一方面提供具有3’-取代基的3’-取代非底物NTP，所述3’-取代基可以在与目前应用的复制程序或未来可能研发的复制程序相容的温度下通过热去除。3’-取代基的存在可削弱3’-取代NTP被核酸聚合酶的结合，或者可干扰3’-取代NTP被核酸聚合酶的识别或者可另外地防止聚合酶介导的引物延长(图1A)。直到复制反应达到最佳热启动温度以将NTP的3’-取代基转化成3’-OH基团并且将NTP变成活性状态后，寡核苷酸引物才将通过核酸聚合酶进行延长。3’-取代NTP向其活性状态的转变优选地与PCR的初始变性步骤相符。核酸复制反应的这种“热启动”激活通过防止低温引物延长显著降低不需要的复制产物的形成。
本文提供的方法和组合物的另一方面提供具有3’-取代基的3’-取代终止NTP，所述3’-取代基可以在与目前应用的复制程序或未来可能研发的复制程序相容的温度下通过热去除或可转化成开放的羟基基团。3’-取代终止NTP通过核酸聚合酶被结合到引物的3’-末端以产生终止引物。终止引物处于终止状态并且不可通过核酸聚合酶延长，从而防止不需要的复制产物形成。当复制反应达到最佳高严格热启动温度时，3’-取代基被去除或转化成开放的3’-OH基团，导致终止引物转化成可延长引物，其可与核酸复制相容并且可进一步被延长(图1B)。
除了在缓冲溶液中室温下稳定外，本文所公开的3’-取代NTPs优选地在NTP合成、分离和提纯过程诸如色谱、沉淀、长期储存和复制反应混合物的制备条件下稳定。
本文提供的方法和组合物现在将通过参考下列非限制性实施例更详细地描述。
实施例1
3’-取代2’-脱氧核糖核苷的制备
对于dTTP的3’-取代选择了六个基团：四氢吡喃基(THP)、4-甲氧基四氢吡喃基(MTHP)、四氢呋喃基(THF)、乙酰基(Ac)、甲氧基乙酰基(CH3OAc)和苯氧基乙酰基(PhOAc)。
胸苷的3’-醚衍生物根据如下一般合成途径进行合成。首先，胸苷与1.2当量的乙酸酐在吡啶中反应。所得的3’-O-乙酰基、5’-O-乙酰基和3’，5’-O-二乙酰基取代胸苷的混合物利用硅胶色谱法分离成单独的化合物。分离的5’-O-乙酰基胸苷在二烷中对甲苯磺酸的存在下与2，3-二氢呋喃、3，4-二氢-2H-吡喃或5，6-二氢-4-甲氧基-2H-吡喃反应5小时。随后用甲醇的氨水处理以去除5’-O-乙酰基保护基，分别产生胸苷的3’-THF、3’-THP或3’-MTHP衍生物。3’-THF取代的脱氧核糖核苷dA和dC采用与3’-THF-dT合成相似的方法从N-苯甲酰-2’-脱氧腺苷和N-苯甲酰-2’-脱氧胞啶开始制备，其中所要求的5’-位置的保护通过上述核苷与苯甲酰氯在吡啶中的反应实现。3’-THF-2’-脱氧鸟苷采用上述概述的与3’-THF-dT合成相同的合成途径从商业上可购得的5’-乙酰基丙酰基(levulinyl)N-异丁酰(isobutiryl)-2’-脱氧鸟苷开始合成。
胸苷的3’-O-甲氧基乙酰基和3’-O-苯氧基乙酰基酯根据如下另一一般途径进行制备。5’-DMT-胸苷用吡啶中的甲氧基乙酰氯或苯氧基乙酸酐进行处理，接着是DMT基团的酸去除以形成胸苷对应的3’-酯衍生物。3’-O-乙酰基胸苷通过上面指定的硅胶色谱法进行分离。
总之，3’-取代2’-脱氧核苷以12-60％总产率进行分离。
实施例2
3’-取代2’-脱氧核糖核苷的5’-三磷酸化
3’-取代2’-脱氧核苷5’-三磷酸酯根据如下的Ludwig-Eckstein方法(J.Org.Chem.，54，631-635(1989))从3’-醚和3’-酯取代的2’-脱氧核苷进行制备。
3’-取代2’-脱氧核苷与1.1当量的2-氯-4H-1，3，2-苯并二膦-4-酮在二烷-吡啶溶液中反应，接着与1.6当量的焦磷酸三丁铵反应，接着P(III)碘氧化成P(V)，并且最后用含水重碳酸三乙铵处理。所得3’-取代dNTPs通过阴离子交换和反相色谱的组合进行分离和提纯以获得98-99％纯的作为钠盐或钾盐的3’-取代dNTP。合成化合物的结构通过质子和磷的NMR和质谱法被证实。
实施例3
包含3’-取代基的dTTP向相应的天然dTTP转化的动力学
3’-取代dTTP向相应的未修饰dTTP的转化在20℃和95℃下在PCR缓冲液中(pH8.4，在25℃下，表1)进行研究。通过温育的混合物反相和阴离子交换HPLC的分析监控反应。95℃下dTTP最终的形成与时间的关系显示在图3中。表1中显示了95℃下温育2、10和20分钟温育后从3’-取代的dTTP形成的dTTP的估计浓度。
室温下(ca.20℃)在PCR缓冲液中，所有3’-醚取代的dTTP稳定了至少几天。在dTTP的3’-醚衍生物之中，dTTP的3’-O[CH3OAc]和3’-O[PhOAc]衍生物在室温下PCR缓冲液中温育60分钟内分别显示3’-酯基团4％和10％的切割，然而对于dTTP的3’-O-[Ac]衍生物，在24小时温育后仅检测到3’-乙酰基6％的切割。
表1：在PCR缓冲液中(50mMKCl，1.5mMMgCl2，20mMTris(pH8.4，25℃下))95℃下温育期间在250μM3’-取代dTTP溶液中形成的未修饰dTTP的估计浓度
实施例4
在引物延伸试验中3’-取代dTTPs通过水生栖热菌(Taq)和KlenowDNA聚合酶的结合
Klenow(外-)DNA聚合酶进行预退火引物/模板双链体的室温引物延伸的能力在50mMNaCl、10mMTris-HCl(pH7.9)、10mMMgCl2、1mMDTT、0.5单位的酶、0.2mMdATP以及在下列3’-取代dTTP衍生物之一的存在下进行评价：3’-THP-dTTP、3’-MTHP-dTTP或3’-THF-dTTP(图4(上图))。在结合和延伸试验中，发现dTTP的3’-取代衍生物(3’-THP-dTTP、3’-MTHP-dTTP和3’-THF-dTTP)中没有一个被结合到引物中(与“无dTTP”阴性对照一致)。这些发现——3’-取代dTTP衍生物不是Klenow(外-)DNA聚合酶的底物——与图1A提出的机制一致。作为额外的对照，我们发现95℃下预热40分钟后，所有上述3’-取代dTTP类似物变成酶的底物并且以类似的方式变成未修饰的dTTP(图4(下图))。这证实了预热步骤确实将3’-取代dTTP转变成适于结合和延伸反应的dTTP。
时程结合/延伸实验用3’-O-乙酰基-dTTP进行，并且表明3’-O-乙酰基dTTP不是Klenow(外-)DNA聚合酶的底物，这符合公布的数据(Metzker，etal.，22NucleicAcidsRes.，4259-4267(1994))。dTTP的3’-O-甲氧基乙酰基和3’-O-苯氧基乙酰基衍生物没有进行测试，因为动力学实验(实施例3)表明这些3’-取代基在延伸反应期间将是不稳定的。
延伸实验采用25单位的酶以及3’-THF-dTTP或3’-Ac-dTTP在室温下用TaqDNA聚合酶进行重复。结果与采用Klenow(外-)DNA聚合酶所获得的结果相似，因为两种3’-取代dTTP衍生物都不是TaqDNA聚合酶的底物。
也对引物延伸实验中3’-THF-dCTP的性能进行评价。该类似物产生的结果与3’-THF-dTTP类似，这表明3’-取代dATP和dGTP衍生物不是Klenow(外-)或TaqDNA聚合酶的合适底物。
实施例5
在3’-取代dTTPs的存在下PCR期间在DNA模板不存在下非特异性扩增产物的形成
为了探究3’-取代NTPs对PCR性能的影响，在模板不存在下，采用便于非特异性扩增产物形成的PCR条件进行实验。利用靶向或者HIV-1tat基因的365bp片段或者λDNA的1.9kb片段的寡核苷酸引物(表2)。已知两种***在PCR期间产生高水平的非特异性扩增产物，包括引物二聚体在内。扩增反应是在模板不存在下进行的。每个PCR混合物(50μL)包含正向和反向HIV-1引物(每种0.5μM)，dATP、dCTP和dGTP(每种200μM)，Taq聚合酶(0.5单位)，1×PCR缓冲液(参见对表1的说明)和人基因组DNA(50ng)。向每个反应中以200μM最终浓度加入dTTP的3’-衍生物。PCR循环参数包括95℃的初始步骤2min；接着40个循环[95℃，40sec；56℃，30sec；72℃，2min]；接着72℃，7min。包括引物二聚体在内的非特异性扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测为HIVDNA***中～50碱基对片段以及在λDNA***中～500碱基对片段(图5(泳道5和6)和6(泳道6-9))。
3’-取代dTTP衍生物(乙酰基、苯氧基乙酰基、四氢吡喃基、甲氧基四氢吡喃基和四氢呋喃基)在上述扩增***中进行调查。总的来说，琼脂糖凝胶电泳数据的分析(图5和6)揭示在模板不存在下，当使用3’-取代dTTPs而不是天然dTTP时，PCR中非特异性扩增产物的水平减少了几倍。3’-取代dTTPs减少了包括引物二聚体在内的非特异性扩增产物的积聚。
表2.所研究的引物/模板PCR***
| *** | 正向引物(5’-3’) | 反向引物(5’-3’) | 扩增子长度 |
| HIV-1 | GAATTGGGTGTCAACATAGCAGAAT | AATACTATGGTCCACACAACTATTGCT | 365bp |
| λDNA | AAGGAGCTGGCTGACATTTTCG | CGGGATATCGACATTTCTGCACC | 1.9kb |
实施例6
在3’-取代dNTPs存在下的PCR期间DNA模板存在下非特异性扩增产物的形成
对于λDNA和HIV-1DNA***(表2)，采用这样的PCR条件，其中非特异性扩增产物——包括引物二聚体在内，容易在模板存在下形成。这些条件采用1μM浓度的正向和反向寡核苷酸引物、10HIV-1或10,000λDNA拷贝的模板、0.2mMdNTP或3’-取代dNTP中每个，以及2.0mMMgCl2。每个混合物包含50ng人基因组DNA。热循环参数如下：95℃，2min，40个循环[95℃，40sec；56℃，30sec；72℃，2min]；接着72℃，7min。反应通过琼脂糖凝胶电泳进行分析(图5和6)。
在所有情况下，天然dTTP的一种3’-取代dTTP衍生物的取代与对照PCR反应相比提高了PCR的性能，其中使用所有四种天然dNTPs(比较图5中的泳道4和1-3与图6中的泳道1和3-5)。在λ和HIV-1模板***中，分析不仅表明包括引物二聚体在内的非特异性扩增产物的量减少，而且表明扩增子形成相应减少。关于dTTP的3’-THF和3’-PhOAc-衍生物，与dTTP相比扩增子与包括引物二聚体在内的非特异性产物的比例得到3-8倍提高(图5和6)，而关于dTTP的3’-THP和3’-Ac衍生物，整体PCR性能不如天然dTTP那么好(未显示)。
一种、两种、三种或四种3’-THF-dNTPs的取代的所有排列(来自3’-THF-dATP、3’-dGTP、3’-THF-dCTP和3’-THF-dTTP的组)被检测其天然负体和对降低引物二聚体形成的综合影响。一般地，发现3’-THFdNTP对于其天然dNTP的任意单一取代提高了PCR性能。因此，对于3’-THF-dATP衍生物，观察到两种非特异性扩增产物强烈减少以及特异性扩增子形成的增加(图7)。dNTPs对于天然dNTPs的两种或更多种3’-THF衍生物的组合取代进一步提高了PCR性能。因此，3’-THF-dTTP和3’-THF-dATP的组合作为dTTP和dATP的取代几乎完全消除了HIV-1***中的非特异性扩增产物(大约10倍的提高，图7)。总的来说，在PCR混合物中使用一种以上类型的3’-取代dNTP与扩增子产生的效率和特异性之间有强大的相关性。
实施例7
具有3’-取代dNTPs的实时“热启动”PCR
作为病原体检测的原型实验，在人基因组DNA的存在下在模型HIV-1***中检查3’-THFdNTPs在实时PCR扩增中的性能。具体地，dNTPs三重取代组的性能(3’-THF-dATP、3’-THF-dCTP、3’-THF-dTTP和dGTP)与包含所有四种未修饰dNTPs进行比较。在检查到反映扩增子累积的S形扩增曲线后，发现3’-THFdNTP数据组的曲线形状比未修饰天然dNTP的相应曲线更尖锐。曲线形状指示(RamakersC，RuijterJM，DeprezRH，andMoormanAF.339NeurosciLett.62-6(2003))PCR扩增的效率在3’-THFdNTPs存在下比天然dNTPs更好。此外，发现在输入的模板拷贝数与Ct值之间存在好的相关性(指示在实时实验中利用3’-取代dNTPs可产生可靠的数据)。
实施例8
适用于SNP检测分析的“热启动”激活方法
与疾病易感性和/或药物效力相关的遗传多态性的鉴别将有助于诊断学和治疗学的发展。已经开发了单核苷酸多态性(SNP)发现和基因型分型的许多方法(参见，例如，Cozza，A.，etal.，BMCGenomics，2007.8：p.10；Kwok，P.Y.，AnnuRevGenomicsHumGenet，2001.2：p.235-58)。SNP发现的一些商业化方法包括多重功能平台(multiplexingcapableplatforms)，诸如ThirdWaveInvader-Cleavase(Allawi，H.T.，etal.，JClinMicrobiol，2006.44(9)，p.3443-7)；LuminexsuspensionBeadsarray(Luminex悬浮珠排列)(Dunbar，S.A.，ClinChimActa，2006.363(1-2)，p.71-82)；BiotagePyrosequencing(Langaee，T.，etal.，MutatRes，2005.573(1-2)，p.96-102)；AppliedBiosystemsTaqMan和SNPlex基因型分型(DelaVega，F.M.，etal.，MutatRes，2005.573(1-2)，p.111-35)；和RocheCobasAlleleSpecificPCR和模板定向单碱基延伸方法(Chen，X.，etal.，GenomeRes，1999.9(5)，p.492-8)。有几种高通量平台，其包括IlluminaBeadArray-GoldenGate基因型分型分析(Shen，R.，etal.，MutatRes，2005.573(1-2)，p.70-82)；对Affymetrix基因芯片阵列的ParAllele分子倒置探针分析(Matsuzakil，H.，etal.，GenomeRes，2004.14(3)，p.414-25)；和对高密度阵列的Perlegen基因型分型(Easton，D.F.，etal.，Nature，2007.447(7148)，p.1087-93)，其中每个都能同时给多个SNP位点进行基因型分型。
检测SNPs的主要挑战之一是难于开发有力的方法以在野生型序列和包含点突变的相应序列之间区分。许多成功的方法涉及一系列连续反应中多种酶的使用，其中每个连续步骤进一步提高了检测的特异性。目前的多酶SNP检测方案最显著的缺点之一是必须在分析的中间阶段打开测试管以转移反应产物和/或加入下游酶促步骤所需的试剂和反应成分。减少或消除中间用户干预步骤将a)提高分析效率，b)减少时间、成本和c)降低样品操纵之间技术误差的可能性。
改良的检测SNPs的封闭管形式试验的方案显示在图8中。GEXL-PCR形式组合了3’-取代dNTPs和热不稳定磷酸三酯改性引物(Zon，G.，etal.，US专利申请号20070281308)与缺口填充反应(DNA聚合酶)、缺口连接(DNA连接酶)和热启动PCR扩增的效用。该方法描绘了一种由几家公司开发的改良版本的SNP分析(ParAllele，Illumina，AppliedBiosystems)。允许一管形式的关键特征是能够包括下游PCR扩增反应所有成分(酶、dNTPs和引物)而不干扰低温缺口填充和连接步骤。具体地，除了需要填充缺口的那些外所有dNTPs被3’-THFdNTPs取代。此外，结合DonorProbe(包含5’-磷酸酯基团的连接寡核苷酸)的Zipcode区域(与磷酸三酯引物的3’-末端序列互补的核苷酸序列)的生物素化磷酸三酯引物采用热不稳定磷酸三酯引物修饰被阻止延伸。通过在低温(0-20℃)下进行缺口填充/延伸(步骤2)和缺口密封/连接步骤(步骤3)，大大减少了不期望事件的可能性诸如3’-取代基从3’-取代dNTPs上的丢失，可能有不正确dNTP缺口结合，其中随后的连接或生物素化引物不可控制的延伸被大大减少。热激活步骤后(步骤4)，3’-取代dNTPs的3’-THF基团和引物磷酸三酯保护基团被去除，其允许PCR扩增开始并继续下去。整体上，取代成分(3’-取代dNTPs和磷酸三酯引物)的使用通过消除步骤2和4之间的操纵步骤的需要允许制备SNP分析的物质的更简单有效的方法。
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员所通常理解的相同的含义。
本文例证性地描述的发明可在本文没有具体公开的任何元素(element)或多种元素(elements)、限定(limitation)或多种限定(limitations)不存在下合适地进行。因此，例如，术语“包含(comprising)”、“包括(including)”、“含有(containing)”等应当作广义且无限制性地阅读。此外，本文所应用的术语和表达已经作为描述性而非限制性术语使用，并且在使用这样的术语和表达当中没有意图排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到各种修饰在所请求保护的发明范围内都是可能的。
因此，应当理解，尽管本发明已经通过优选的实施方式和任选的特征进行了具体公开，本领域技术人员可想到本文公开的具体发明的修饰、改进和变化，并且这样的修饰、改进和变化被认为在本发明的范围内。这里提供的物质、方法和实例代表了优选的实施方式，是示例性的，并且没有意欲限制本发明的范围。
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Claims (103)
1.复制核酸的方法，所述方法包括：
在37℃至100℃下温育复制反应混合物，所述混合物包括所述核酸、至少一种具有热不稳定3’-取代基的NTP和复制反应缓冲液，而不含用于除去所述热不稳定3’-取代基的化学试剂；和
复制所述复制反应混合物中的所述核酸，
其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP具有式IA的结构：
其中：
n是0或1；
B选自取代或未取代的嘌呤或嘧啶、其任何氮杂或脱氮衍生物、或任何NTP类似物的任何“通用碱基”或“简并碱基”；
A选自O、S、Se、CR1R2和NR1；
W选自O、S、Se、CR1R2和NR1；
每个R1和每个R2独立地选自H、F、Cl、Br、I、OR3、NR3R4以及烷基、链烯基、炔基、芳基和芳烷基，其中任何取代基每个可任选地包含一个或多个杂原子；
每个R3和每个R4独立地选自H或烷基、链烯基、炔基、芳基和芳烷基，其中任何取代基每个可任选地包含一个或多个杂原子；
Z0和Z6每个都独立地选自O、S、CR1R2、和NR1；
Z1、Z4和Z7每个是O；
Z2选自H、CH3、OR3、SR3、NR3R4、(BH3)-M+和C(Y)R5
Z3选自O、3’-O-寡核苷酸基残基和寡核苷酸引物，其中当n是0时，Z3是3’-O-寡核苷酸基残基或寡核苷酸引物，并且其中当n是1时，Z3是O；
Z5和Z8是OH；
Z9选自H、F、OR3、SR3、NR3R4、NR3OR3、NR3-NR3R4、CN、N3、(BH3)-M+、C(Y)R5和磷酸酯；
每个R5选自H、F、Cl、Br、OR3和烷基、链烯基、炔基、芳基和芳烷基，其中任何取代基每个可任选地包含一个或多个杂原子；
Y选自O和S；
M+是阳离子；
X1、X2、X3、X4和X5每个都独立地选自R1、NR3OR3、NR3-NR3R4、CN、N3和SSR3；
R选自
Z10选自O或S；
R7选自具有1-20个碳原子并且包括至少一个取代基的直链或支链的烷基、链烯基或炔基，所述取代基选自羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、环烷基、杂环烷基、和芳氧基；
每个R8、每个R9和每个R10都独立地选自氢以及具有1-20个碳原子的直链或支链的烃基，其中所述烃基是可任选地包括至少一个取代基的烷基、链烯基或炔基，所述取代基选自羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、环烷基、杂环烷基和芳氧基；
每个X6、每个X7、每个X8和每个X9独立地选自下列的任何基团：酰氧基、链烯基、链烯基芳基、烷基、炔基、炔基芳基、烷氧基、烷基芳基、烷基羰基氨基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基氨基、烷基硫代、酰氨基、脒基、氨基、芳基炔基、芳基烷基、芳基、芳基羰基氨基、芳氧基、芳基磺酰基氨基、氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸酯、环链烯基、环烷基、胍基、卤、杂芳基、杂芳基羰基氨基、杂芳氧基、杂芳基磺酰基氨基、烃基羰基、烃氧基羰基、烃基羰氧基、羟基、和磺酰基氨基；
每个X10独立地选自O和S；和
每个Y1独立地选自O和S。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP削弱或防止通过聚合酶进行的核酸延伸。
3.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP是非底物NTP。
4.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP是终止NTP。
5.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP结合到寡核苷酸引物中，导致终止引物。
6.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在核酸复制期间转化成开放的3’-羟基基团。
7.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在37℃和核酸复制的初始热诱导步骤之间转化成开放的3’-羟基基团。
8.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在核酸复制的初始热诱导步骤期间转化成开放的3’-羟基基团。
9.权利要求8的方法，其中转化是部分的。
10.权利要求8的方法，其中转化是完全的。
11.权利要求8的方法，其中所述转化在足以解离所述3’-取代基以形成开放的3’-羟基基团的温度下发生。
12.权利要求8的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在37℃-100℃之间的温度下转化成开放的3’-羟基基团。
13.权利要求8的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在37℃-100℃之间的温度下转化成开放的3’-羟基基团。
14.权利要求8的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在50℃-100℃之间的温度下转化成开放的3’-羟基基团。
15.权利要求8的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在70℃-100℃之间的温度下转化成开放的3’-羟基基团。
16.权利要求8的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在50℃的温度下转化成开放的3’-羟基基团。
17.权利要求8的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在55℃的温度下转化成开放的3’-羟基基团。
18.权利要求8的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在65℃的温度下转化成开放的3’-羟基基团。
19.权利要求8的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在75℃的温度下转化成开放的3’-羟基基团。
20.权利要求8的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在80℃的温度下转化成开放的3’-羟基基团。
21.权利要求8的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在90℃的温度下转化成开放的3’-羟基基团。
22.权利要求8的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代基在95℃的温度下转化成开放的3’-羟基基团。
23.权利要求8的方法，其中在95℃下所述至少一种热不稳定3’-取代基转化成开放的3’-羟基基团的t1/2在1-120分钟之间。
24.权利要求8的方法，其中在95℃下所述至少一种热不稳定3’-取代基转化成开放的3’-羟基基团的t1/2在1-5分钟之间。
25.权利要求8的方法，其中在95℃下所述至少一种热不稳定3’-取代基转化成开放的3’-羟基基团的t1/2在5-30分钟之间。
26.权利要求8的方法，其中在50℃下所述至少一种热不稳定3’-取代基转化成开放的3’-羟基基团的t1/2在1-10分钟之间。
27.权利要求8的方法，其中在55℃下所述至少一种热不稳定3’-取代基转化成开放的3’-羟基基团的t1/2是10分钟。
28.权利要求8的方法，其中在50℃下所述至少一种热不稳定3’-取代基转化成开放的3’-羟基基团的t1/2是1-120分钟。
29.权利要求1-28任一项的方法，其中所述复制反应混合物包括具有两个或更多个不同3’-取代基的至少一种热不稳定3’-取代NTP。
30.权利要求29的方法，其中所述两个或更多个不同3’-取代基在不同温度下转化成开放的3’-羟基基团。
31.权利要求30的方法，其中第一3’-取代基在50℃下转化成开放的3’-羟基基团并且第二3’-取代基在95℃下转化。
32.权利要求1的方法，其中所述复制核酸是通过聚合酶链式反应(PCR)，其中所述PCR选自等位基因特异性PCR、装配PCR或聚合酶循环装配(PCA)、不对称PCR、菌落PCR、乳液PCR、快速PCR、缺口延伸连接PCR(GEXL-PCR)、缺口连接链式反应(缺口LCR)、热启动PCR、序列间特异性(ISSR)PCR、反向PCR、连接介导的PCR、指数后线性PCR(LATE-PCR)、甲基化特异性PCR(MSP)、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、多重PCR、嵌套式PCR、重叠-延伸PCR、PAN-AC、定量PCR(Q-PCR)、定量实时PCR(QRT-PCR)、实时PCR、逆转录(RT)、cDNA末端迅速扩增(RACEPCR)、单分子扩增PCR(SMAPCR)、热不对称交错PCR(TAIL-PCR)、递降PCR、长PCR、等温扩增和逆转录PCR(RT-PCR)。
33.权利要求1的方法，其中核酸复制是PCR。
34.权利要求33的方法，其中所述PCR是热启动PCR。
35.权利要求33的方法，其中所述PCR是缺口延伸连接PCR(GEXL-PCR)。
36.权利要求1的方法，其中所述复制是逆转录(RT)。
37.权利要求1的方法，其中核酸复制是等温扩增。
38.权利要求1的方法，其中所述核酸复制反应混合物包括选自下列的一种或多种酶：DNA依赖性DNA聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶、RNA依赖性RNA聚合酶和限制酶。
39.权利要求1的方法，其中所述核酸复制反应混合物包括选自下列的两种或更多种酶：DNA依赖性DNA聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶、DNA依赖性RNA聚合酶、RNA依赖性RNA聚合酶和限制酶。
40.权利要求1的方法，其中所述核酸是DNA、RNA、LNA、PNA或其组合。
41.权利要求1的方法，其中所述核酸是DNA。
42.权利要求1的方法，其中所述核酸是RNA。
43.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP是选自下列的一种或多种热不稳定3’-取代NTP：热不稳定3’-取代dATP、热不稳定3’-取代dTTP、热不稳定3’-取代dGTP、热不稳定3’-取代dCTP和热不稳定3’-取代dUTP。
44.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP是选自下列的两种或更多种热不稳定3’-取代NTP：热不稳定3’-取代dATP、热不稳定3’-取代dTTP、热不稳定3’-取代dGTP、热不稳定3’-取代dCTP和热不稳定3’-取代dUTP。
45.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP是选自下列的三种或更多种热不稳定3’-取代NTP：热不稳定3’-取代dATP、热不稳定3’-取代dTTP、热不稳定3’-取代dGTP、热不稳定3’-取代dCTP和热不稳定3’-取代dUTP。
46.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP是选自下列的四种或更多种热不稳定3’-取代NTP：热不稳定3’-取代dATP、热不稳定3’-取代dTTP、热不稳定3’-取代dGTP、热不稳定3’-取代dCTP和热不稳定3’-取代dUTP。
47.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3-取代NTP包括热不稳定3’-取代dATP、热不稳定3’-取代dTTP、热不稳定3’-取代dGTP和热不稳定3’-取代dCTP。
48.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP包括热不稳定3’-取代dATP、热不稳定3’-取代dUTP、热不稳定3’-取代dGTP和热不稳定3’-取代dCTP。
49.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP占所述复制反应混合物中总NTP的25％或更少。
50.权利要求的方法1，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP占复制反应混合物中总NTP的25％或更多。
51.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP占复制反应混合物中总NTP的50％至100％。
52.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP占复制反应混合物中总NTP的75％或更多。
53.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP占复制反应混合物中总NTP的80％或更多。
54.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP占复制反应混合物中总NTP的90％或更多。
55.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP占复制反应混合物中总NTP的95％或更多。
56.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP占复制反应混合物中总NTP的100％。
57.权利要求1的方法，其中每个X6、每个X7、每个X8和每个X9独立地选自酰基。
58.权利要求1的方法，其中每个X6、每个X7、每个X8和每个X9独立地选自芳酰基。
59.权利要求1的方法，其中所述至少一种热不稳定3’-取代NTP是手性纯的、外消旋的或非对映异构体的混合物。
60.权利要求1的方法，其中与采用对应的未取代NTP的复制相比，复制反应中的所述至少一种热不稳定3’-取代NTP的存在减少了非特异性产物的形成和随后的复制。
61.权利要求1的方法，其中所述3’-取代基选自苯氧基乙酰氧基；甲氧基乙酰氧基；O-乙酰基；对甲苯磺酰氧基；O-[4-甲氧基]-四氢硫代吡喃基；O-四氢硫代吡喃基；O-[5-甲基]-四氢呋喃基；O-[2-甲基，4-甲氧基]-四氢吡喃基；O-[5-甲基]-四氢吡喃基；和O-四氢噻吩基。
62.权利要求1的方法，其中X2和X3是H；W是CH2；并且Z0和Z6是O。
63.权利要求1的方法，其中A是NH、O、CH2或S；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3、和Z6是O；并且Z2和Z9是OH。
64.权利要求1的方法，其中X2是H、OH、F、CH3、OCH3、N3、NH2或NHCH3；A是O；X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3、和Z6是O；Z2、和Z9是OH。
65.权利要求1的方法，其中X5是H、SH、CH3、F、OCH3、NH2或NHCH3；A是O；X2和X3是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；并且Z2和Z9是OH。
66.权利要求1的方法，其中Z2是OH、SH、(BH3)-M+、OCH3或OCH2CH3；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3、和Z6是O；并且Z9是OH。
67.权利要求1的方法，其中Z9是SH、SCH2CH2CN、OH、F、OCH3、OCH2CH3、OC6H5、NHCH3、NH2、NHCH2CH2NH2、NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2或磷酸酯基团；n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；并且Z2是OH。
68.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；并且Z2和Z9是OH。
69.权利要求1的方法，其中n是1；A是S；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3、和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是对甲苯磺酰氧基。
70.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是对甲苯磺酰氧基。
71.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2是SH；Z9是OH；并且R是对甲苯磺酰氧基。
72.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3、和Z6是O；Z2、是OH；Z9是SH；并且R是对甲苯磺酰氧基。
73.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是O-[4-甲氧基]-四氢硫代吡喃基。
74.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是O-四氢硫代吡喃基。
75.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是O-[5-甲基]-四氢呋喃基。
76.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是O-[2-甲基，4-甲氧基]-四氢吡喃基。
77.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是O-[5-甲基]-四氢吡喃基。
78.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z2和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是O-四氢噻吩基。
79.权利要求1的方法，其中n是1；A是S；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是苯氧基乙酰氧基。
80.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X3和X5是H；X2是-O-CH3；W是CH2；Z0、Z3、和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是苯氧基乙酰氧基。
81.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2和X3是H；X5是-CH3；W是CH2；Z0、Z3、和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是苯氧基乙酰氧基。
82.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z和Z9是OH；Z2是SH；并且R是苯氧基乙酰氧基。
83.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3、和Z6是O；Z2是OH；Z9是SH；并且R是苯氧基乙酰氧基。
84.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是苯氧基乙酰氧基。
85.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是甲氧基乙酰氧基。
86.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3、和Z6是O；Z2、和Z9是OH；并且R是O-乙酰基。
87.权利要求1的方法，其中n是1；A是S；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是O-C(O)-OCH3。
88.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X3和X5是H；X2是O-CH3；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是O-C(O)-OCH3。
89.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2和X3是H；X5是CH3；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是O-C(O)-OCH3。
90.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2是SH；Z9是OH；并且R是O-C(O)-OCH3。
91.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是O-C(O)-OCH3。
92.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是O-C(O)-CH2CH2CN。
93.权利要求1的方法，其中n是1；A是O；X2、X3和X5是H；W是CH2；Z0、Z3和Z6是O；Z2和Z9是OH；并且R是O-C(S)-OCH3。
94.权利要求1的方法，其中n是0并且Z3是3’-O-寡核苷酸基残基或寡核苷酸引物。
95.权利要求1的方法，其中B是胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、氨基烯丙基-尿嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-甲基鸟嘌呤、7-脱氮-7-碘代鸟嘌呤、7-脱氮-7-氨基烯丙基-鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、5-硝基-胞嘧啶、5-氨基烯丙基-胞嘧啶、5-(生物素-16)-胞嘧啶、5-(荧光素-11)-胞嘧啶、4-甲基氨基-胞嘧啶、2-硫代-5-甲基尿嘧啶或4-硫代-5-甲基尿嘧啶。
96.权利要求1的方法，其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
97.权利要求1至28和30-63任一项的方法，其中B可被核酸聚合酶识别。
98.权利要求1的方法，其中R是
99.权利要求1的方法，其中Z10是O。
100.权利要求99的方法，其中R7是具有1-6个碳原子的取代的烷基。
101.权利要求100的方法，其中所述烷基包括烷氧基取代基。
102.权利要求100的方法，其中所述烷基包括环烷基取代基。
103.权利要求29的方法，其中B可被核酸聚合酶识别。
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Effective date of registration: 20230508 Address after: California, USA Patentee after: Chulinke Biotechnology Co.,Ltd. Address before: California, USA Patentee before: TRILINK BIOTECHNOLOGIES |
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