CN102102130A

CN102102130A - 检测rna分子的方法、试剂盒及其相关用途

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Publication number: CN102102130A
Application number: CN2010105939751A
Authority: CN
Inventors: A.阿尔伯斯; W.安肯鲍尔; F.贝格曼; S.弗罗纳; D.海因德尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2011-06-22
Also published as: CA2726378A1; EP2336354A1; JP2011125337A; US20110151444A1

Abstract

本发明涉及检测RNA分子的方法、试剂盒及其相关用途。第一方面，本发明涉及检测RNA分子的方法，所述方法包括以下步骤：提供含有所述RNA分子的样品；将第一多核苷酸与所述RNA分子杂交；延伸所述第一多核苷酸以产生第一链cDNA；将第二多核苷酸与所述第一链cDNA杂交；延伸所述第一链cDNA以产生延伸反应产物；通过聚合酶链式反应扩增所述延伸反应产物；以及通过实时荧光读出，检测扩增产物。另一方面，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含如本发明所定义的第一和第二多核苷酸、一组dNTPs、逆转录酶和检测部分。另一方面，本发明涉及所述试剂盒用于检测RNA分子的用途。

Description

检测RNA分子的方法、试剂盒及其相关用途

技术领域

第一方面，本发明涉及检测RNA分子的方法，所述方法包括以下步骤：提供含有所述RNA分子的样品；将第一多核苷酸与所述RNA分子杂交；延伸所述第一多核苷酸以产生第一链cDNA；将第二多核苷酸与所述第一链cDNA杂交，其特征在于所述第二多核苷酸是3´-不可延伸的寡核苷酸；延伸所述第一链cDNA以产生延伸反应产物；通过聚合酶链式反应扩增所述延伸反应产物；以及通过实时荧光读出（real-time fluorescence readout）检测扩增产物。另一方面，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含如本发明所定义的第一和第二多核苷酸、一组dNTPs、逆转录酶和检测部分。还另一方面，本发明涉及根据本发明的所述试剂盒用于检测RNA分子的用途。

背景技术

RNA分子在多种生物的基因表达中发挥重要作用。最近，发现小RNAs是转录后基因表达，特别是基因沉默的重要调节子，对活细胞中的生理和病理过程有影响。由小RNAs引导的基因沉默过程首先于1993年在线虫类（nematode）秀丽新杆线虫（Caenorhabditis elegans）中发现。在其中，显示lin-4 基因的21-nts长的非编码RNA 转录物介导称为lin-41的靶基因的抑制。这种抑制显示为依赖于短lin-4 RNA分子和源自lin-41基因的mRNA转录物的3´-非翻译区(UTR)之间的互补碱基配对。从那时起，已发现短RNAs是植物、动物和DNA病毒中一类丰富的基因调节子，已在从裂殖酵母到人类的多种生物中鉴定了不同来源和功能的短RNAs。短调节RNAs的种类包含例如miRNA(微RNA)、siRNA(小干扰RNA)、piRNA (Piwi-相互作用RNA)以及rasiRNA (重复相关小干扰RNA)。在它们之中，miRNAs是植物和动物中最丰富类型的小调节RNAs。例如，大约3 %的人类基因编码miRNAs，最多30 %的人类蛋白编码基因被认为由miRNAs调节。迄今，通过克隆和测序已鉴定出大于10.000种不同的miRNAs(参见，例如，miRBase: the microRNA registry database at http://www.mirbase.org/，Sanger Institute，UK)。一般而言，miRNAs的特征为21-25个核苷酸(nts)的长度并由长度大约为70个核苷酸的较长内源发夹转录物（称为前体-miRNAs或pre-miRNAs）加工而来。对于lin-4 RNA的情况，已显示miRNAs通过在miRNA和它的靶mRNA之间形成互补碱基对的机制来调节蛋白表达。该过程引起蛋白翻译的抑制，并且，根据miRNA与它的靶位点之间序列互补的程度，引起mRNA转录物的降解 (综述参见，例如，Bartel，2009)。

改变的miRNA表达已显示出导致人类疾病，特别是癌症，这是基于与正常组织相比，恶性肿瘤和肿瘤细胞系显示失调的miRNA表达概况的发现(综述参见，例如，Sassen等人，2008)。即，在人类癌症中已观察到miRNA水平的总体降低，这表明小调节RNAs可能在肿瘤抑制中具有内在功能。Lu等人 (2005)通过在334种人类癌症、癌症细胞系和正常组织中分析总计217种人类和小鼠miRNAs，首次显示：与相应正常组织相比，许多miRNAs的表达水平在癌症中显著降低。这些作者发现癌症伴随显著降低的总体miRNA表达，并且与分化较高的肿瘤相比，分化较差的肿瘤显示较低miRNA水平。另一项最近的研究检测了241种人类miRNAs在人类癌症细胞系的综合组（comprehensive panel）、NCI-60组，和正常组织中的表达，并且证实了与相应正常组织相比，大部分miRNAs在源自人类肿瘤的细胞系中以较低水平表达的发现 (Gaur等人，2007)。

直到最近，关于在癌症中观察到的改变的miRNA表达是恶性转化的原因还是结果仍有不确定性。在2007年，Kumar等人的研究首次证实了miRNA表达的普遍降低确实促进了肿瘤发生。这些作者通过在细胞系中击倒（knockdown）miRNA-加工酶Drosha和Dicer总体降低了成熟miRNAs的产生。因此，小鼠和人类癌症细胞显示降低的稳态miRNA水平。这些具有总体miRNA损失的细胞在体外显示增强的细胞生长 (Kumar等人，2007)。由于在肿瘤中存在miRNAs的总体减量调节，miRNA概况可反映肿瘤的起源和分化状态。因此，miRNA表达概况的分析将很快发展成癌症诊断的重要工具，对个体中 miRNA 水平的可靠检测和定量方法的应用将成为在这方面最具相关性的先决条件。

RNA分子的检测和定量，包括小调节RNAs例如miRNAs的检测，可原则上通过多种标准方法进行，包括基于标准核酸杂交的技术例如Northern杂交、RNA酶保护、引物延伸或微阵列杂交。但是，这些方法不适用于日常实验室常规应用，原因在于它们依赖于放射性标记试剂的使用和/或成本过高。

实时PCR技术已发展成用于前体和成熟miRNAs的定量(参见，例如，Schmittgen等人，2008)。原则上，常规应用两种方法用于小RNA分子的扩增和检测，包括成熟miRNAs的检测。一种方法基于特异性茎-环RT-引物，其含有通用PCR引物，该引物与miRNA-特异性PCR引物组合用于扩增。在该***中(参见，例如，Applied Biosystems TaqMan

MicroRNA Assay，Applied Biosystems，USA)，通过水解探针检测靶成熟miRNAs。第二种方法利用通用PCR引物(连接到特异性RT-引物)和LNA(锁定核酸，Locked Nucleic Acid)引物进行扩增并利用SybrGreen

进行靶miRNAs的检测(参见，例如，miRCURY LNA

Univeral RT microRNA PCR，Exiqon，Denmark)。但是，通过这些方法很难在一个样品中区分miRNA的成熟形式和前体形式。

因此，始终存在对于检测小RNA分子的改进方法的需要。

发明内容

在本发明的上下文中，令人惊讶地发现通过包括利用可降解的3´-不可延伸的寡核苷酸(下文也称为“辅助寡核苷酸”(“helper oligo”))的方法可检测可变长度的RNA分子，包括小调节RNA分子。本发明的方法特别适合于检测一个样品中的多于一个RNA分子种类，特别是当这些RNA分子源自一个前体分子时。因此，本发明的方法特别适合于检测和区分小调节RNAs的成熟形式和前体形式，包括，例如，miRNAs的成熟形式和前体形式的检测和定量。

因此，第一方面，本发明提供检测RNA分子的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 提供含有所述RNA分子的样品；

b) 将包含第一引物结合位点的第一多核苷酸与所述RNA分子杂交；

c) 通过逆转录所述RNA分子的序列延伸所述第一多核苷酸以产生第一链cDNA；

d) 将第二多核苷酸与所述第一链cDNA杂交，其中所述第二多核苷酸是3´-不可延伸的寡核苷酸，其包含

(i) 3´-部分，其与所述第一链cDNA的一部分互补，以及

(ii) 5´-突出端，其包含第二引物结合位点的序列；

并且其中所述第二多核苷酸包含至少一个或几个dU核苷酸残基；

e) 在不存在dUTP的情况下，延伸所述第一链cDNA以产生延伸反应产物，所述延伸反应产物包含与所述第二引物结合位点互补的序列；以及通过优选不耐热的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)的酶促反应消化所述第二多核苷酸；

f) 在检测部分存在的情况下，使用与所述第一引物结合位点互补的第一引物和与所述第二引物结合位点互补的第二引物，通过聚合酶链式反应扩增所述延伸反应产物；以及

g) 通过实时荧光读出而检测扩增产物。

根据本发明的方法的原理分别图示于图1和图2。详细地，在第一反应步骤中，将第一多核苷酸(本文还命名为RT-(逆转录)-引物)与待测的RNA分子杂交。这种第一多核苷酸被设计为与待测RNA分子的一部分互补，并且进一步包含第一引物结合位点，即第一引物可特异性结合的序列。一旦所述第一多核苷酸与RNA分子退火，通过逆转录酶的酶促反应延伸所述第一多核苷酸，使靶RNA分子的序列以3´到5´方向被逆转录。因此，产生与待测RNA分子的序列互补的cDNA分子。而且，该cDNA分子的长度对应于待测RNA分子的长度。在随后的反应步骤中，第二多核苷酸与之前已通过逆转录产生的cDNA杂交。这种第二多核苷酸被设计为(i)与所述cDNA的一部分互补，(ii)进一步包含5´-突出端，其具有第二引物结合位点，即第二引物可特异性结合的序列，以及(iii)是3´-不可延伸的。第二多核苷酸与它的靶序列退火后，通过逆转录第二多核苷酸的序列，所述cDNA进一步以5´-到3´方向延伸，从而产生DNA延伸反应产物，所述DNA延伸反应产物具有包含与第二引物结合位点互补的序列的5´-部分。通过将第二多核苷酸设计成3´-不可延伸的，在第二反应步骤中，第二多核苷酸的延伸被阻止。第二多核苷酸被设计成可降解的多核苷酸，然后它可例如通过酶切割被降解。然后，在分别与第一和第二引物结合位点互补的第一和第二引物存在的情况下，以及在检测部分存在的情况下，通过聚合酶链式反应进行延伸反应产物的扩增。在本发明的方法应用于平行检测两种不同RNA分子的情况下，当使用两种可区分的检测部分时，可在一个反应设置（one reaction setup）中扩增两种延伸反应产物。而且，如果待测RNA分子具有不同大小，可检测到具有不同长度的不同的延伸反应产物。

如本发明的上下文所用，特征“提供样品”通常是指适于制备含有RNA分子或RNA分子群体的组合物的所有种类的程序。这些程序包括但不限于适于制备细胞或组织提取物的标准生化和/或细胞生物学程序，其细胞和/或组织可源自含有感兴趣RNA分子的任何种类的生物。例如，根据本发明的样品可以是源自生长在细胞培养物中的一个细胞或多个细胞或通过解剖和/或手术从生物体得到的纯化的总RNA和/或大小分级分离的总RNA。具体地，根据本发明的样品可以是从一个或多个患者的一个或多个组织中得到的总RNA。从细胞、细胞提取物或组织中制备总RNA可包括一个或多个生化纯化步骤，例如，举例来说，离心和/或分级分离，通过机械或化学破裂步骤包括例如多次冷冻和/或融化循环、一次或多次盐处理和/或苯酚-氯仿提取进行的细胞裂解。任选地，根据本发明，提供样品还可包括通过聚乙二醇和盐存在下的沉淀和/或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法来去除大的RNA，例如丰富的核糖体rRNA。从细胞和/或组织纯化总RNA的方法是本领域普通技术人员熟知的，并且包括例如标准程序，例如利用硫氰酸胍–酸性苯酚-氯仿提取(例如TRIzol

，Invitrogen，USA)。而且，根据本发明的样品可进一步包含一种或多种合成的RNA分子或由一种或多种合成的RNA分子组成，所述合成的RNA分子可作为用于定量的内标。根据本发明的样品的实例包含例如血液、肺、肝脏或从个体得到的任何其他组织和/或活检样品。

如本文所用，术语“多核苷酸”通常是指具有可变长度和序列的核苷酸分子，其能够通过互补碱基配对结合RNA或DNA靶分子。根据本发明的多核苷酸通常是指包含至少10个、优选至少20个以及更优选至少30个核苷酸的分子。对本领域普通技术人员显而易见的是本发明的多核苷酸具有适当的长度来提供所需要的特异性。一般而言，多核苷酸可以是DNA寡核苷酸或RNA寡核苷酸，优选DNA寡核苷酸。因此，多核苷酸包含由核碱基（nucleobase）(即含氮碱基)，可以是核糖、2`-脱氧核糖或其任何衍生物的五碳糖，以及磷酸基团组成的所有种类的结构。核碱基和糖组成称为核苷的单位。磷酸基团可与糖的2、3或5位碳，特别是与糖的3和5位碳形成键。核糖核苷酸含有核糖作为糖部分，而脱氧核糖核苷酸含有脱氧核糖作为糖部分。核苷酸可含有嘌呤或嘧啶碱基。本发明的多核苷酸可进一步包含一个或多个修饰的核苷酸和/或一个或多个主链修饰，例如，举例来说，2´-O-甲基(2´-OMe)RNA、2´-氟(2´-F)、肽核酸(PNA)或锁定核酸(LNA)。

如本文所用，术语“引物”通常是指能够由模板依赖的DNA聚合酶“引发”DNA合成的寡聚化合物，或可选地，指上述这样的多核苷酸。即，引物的3’-端通常包含游离的3’-OH基团，其他核苷酸可通过3’到5’- 磷酸二酯键的形成连接到其上。本发明的引物可以是长度至少大约10个，优选至少大约20个，以及更优选大约30个核苷酸。如本发明的上下文所用，设计引物，以使它通过碱基对互补特异性地退火和/或结合于它的指定的引物结合位点。在本发明的上下文中，术语“引物”等同地意指“多核苷酸”。本发明的引物是例如分别在实施例1和2的表1和表2中所示例的。

如本文所指，“引物结合位点”意思是被设计为使得能够进行互补引物或多核苷酸的退火和/或杂交的一段核苷酸。在本发明的上下文中，引物结合位点可以由大约10至20个或更多个核苷酸组成，并且可展现被认为适于与感兴趣的引物分子建立互补碱基配对的任何序列。而且，引物结合位点可形成较长多核苷酸的部分，并且可因此位于5´-端附近、3´-端附近或该多核苷酸的序列间的任何位置。具体地，在本发明的上下文中，第一引物结合位点形成第一多核苷酸的部分，第二引物结合位点形成第二多核苷酸的部分。该第一和第二引物结合位点可以是彼此相同的或彼此不同的。优选地，第一和第二引物结合位点显示不同的序列特异性。而且，引物结合位点优选地不表示待测RNA分子的序列。通用引物结合位点例如，举例来说，T7或T3 最小引物位点的序列是本领域普通技术人员熟知的，并且可例如从公共数据库，包括NCBI基因库(National Center for Biotechnology Information，Maryland，USA)中得到。

在根据本发明的方法的步骤b)中，包含第一引物结合位点的第一多核苷酸与待测RNA分子杂交。该第一多核苷酸可以与靶RNA分子的内源序列互补，或者可选地，可以与多核苷酸尾互补，RNA分子已在它的3´-端通过该多核苷酸尾进行延伸。该多核苷酸尾可以是任意核苷酸段，并且优选是聚腺苷酸尾，即多个腺苷残基的序列段。

因此，在本发明的一个实施方式中，第一多核苷酸与待测RNA分子的内源序列互补。在可选实施方式中，第一多核苷酸与特定序列互补，所述特定序列在进行步骤b)之前已连接到RNA分子的3´-端。当使用与RNA分子的序列互补的第一多核苷酸时，即序列特异性的第一多核苷酸时(方法I的原理，参见图1)，与RNA分子的序列互补的第一多核苷酸的那些核苷酸应优选地不与步骤c)中使用的第二多核苷酸的序列重叠。而且，第一多核苷酸的特异性可以通过在逆转录过程中，即步骤c)中，平行使用封闭第一引物结合位点序列的dU-DNA寡核苷酸来进行提高。当使用与已连接到 RNA分子3´-端的序列互补的第一多核苷酸时(方法II的原理，参见图2)，使用锚定的多核苷酸是优选的。在本发明的上下文中，锚定的多核苷酸意思是在连接的多核苷酸尾序列之前携带对靶RNA分子具有特异性的至少一个或多个核苷酸的多核苷酸。在该情况下，如果RNA不是聚腺苷酸化的mRNA，在逆转录之前RNA分子的加尾是需要的。

如本发明的上下文中所指，术语“与……互补”通常意思是通过互补碱基配对，多核苷酸特异性地结合感兴趣的靶序列的能力。互补碱基对在两个彼此互补的核苷酸分子(其可任选地包含修饰)之间形成。在本发明的上下文中，例如在第一多核苷酸和RNA靶分子之间形成的互补碱基对可包含所有种类的规范的或不规范的碱基对，包括但不限于Watson-Crick A-U、Watson-Crick A-T、Watson-Crick G-C、G-U Wobble碱基对、A-U 和A-C反向Hoogsteen碱基对、或嘌呤-嘌呤和嘧啶-嘧啶碱基对例如剪切的G-A碱基对或G-A亚氨基碱基对。优选地，在本发明的上下文中，互补碱基对是指规范的碱基对。

如本文所用，术语“杂交”通常意思是两条互补链的退火。成功的杂交取决于多种因素，包含温度、盐浓度和/或pH。杂交的最适温度优选在低于T_m值5-15 ℃的范围内，其中T_m值定义为杂交物的解链温度 (T_m)，即50 % 的双链核酸链分离时的温度。计算T_m值的各种公式是本领域普通技术人员已知的。在本发明的上下文中，有益于杂交的条件可包括使用缓冲液，所述缓冲液含有试剂以使双链体的形成最大化并抑制多核苷酸非特异性结合它的靶分子。如果需要，可将多核苷酸的终浓度对每个反应进行最优化。有益于杂交的条件还包括使多核苷酸与靶分子温育足够长的时间以进行最优退火。优选地，根据本发明的杂交是指多核苷酸与靶分子在溶液中温育的杂交条件。本发明的杂交条件例如在实施例1和实施例2的方法I和方法II中说明。而且，有利的是在聚合酶反应过程中，例如在第一链cDNA合成以及在辅助寡核苷酸杂交后的延伸过程中，使温度条件最优化。这种最优化是本领域普通技术人员易于进行的。

如本文通常所用，术语“3´-不可延伸的寡核苷酸”意思是由核糖核苷酸、脱氧核苷酸或二者组成的，但在3´-末端不含有反应性、即游离的3´-OH基团的多核苷酸。在缺乏反应性3´-OH基团的情况下，通过酶促添加另外的核苷酸，在5´-到3´-方向上的寡核苷酸的延伸和/或延长被抑制。优选地，根据本发明的3´-不可延伸的寡核苷酸在它的3´-端含有磷酸基团。在本发明的上下文中，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”等同使用。而且，本发明的3´-不可延伸的寡核苷酸的特征在于它包含与它的靶序列具有序列互补性的3´-部分，同时具有包含第二引物结合位点序列的5´-部分。但是，该5´-部分不能与靶序列退火，从而产生5´-突出端。在本发明的上下文中，术语“5´-突出端”是本领域普通技术人员熟知的，并在图1和图2中被进一步说明。

如本文所用，术语“扩增”是指合成与模板核酸(例如，第一链cDNA 和/或根据本发明的方法的步骤e)中产生的延伸反应产物)的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度下使引物与模板核酸退火，以及酶促地从引物延伸以产生扩增产物。变性、退火和延伸步骤的每个可以进行一次。但是，通常地，变性、退火和延伸步骤进行多次以使扩增产物的数量增加，虽然指数扩增不是本方法要求的，但经常指数增加。扩增通常需要脱氧核糖核苷三磷酸、DNA 聚合酶(例如Taq 聚合酶)以及为达到聚合酶最佳活性的适当的缓冲液和/或辅因子(例如，MgCl₂和/或KCl)的存在。本发明的扩增条件例如在实施例1第6和7部分中描述。

如本发明的上下文所用，术语“聚合酶链式反应”或“PCR”通常意思是特异性扩增模板分子的任何测定或方法。聚合酶链式反应是本领域普通技术人员已知的标准方法，其中模板分子是核酸模板。在本发明的上下文中，模板分子可以是DNA或RNA分子，优选的是通过引物延伸和逆转录从RNA分子产生的cDNA分子。模板核酸不是必须要求纯化的；它可以是以仅少量存在的，例如，举例来说，仅以低丰度表达的RNA分子。为了通过聚合酶链式反应扩增延伸反应产物，在诱导引物延伸的反应条件下，将引物与其它PCR 试剂组合。例如，链延伸反应物通常包含50 mM KCl、10 mM Tris-HCl (pH 8.3)、1.5 mM MgCl₂、最多1.0 µg变性的模板DNA、50 皮摩尔每种寡核苷酸引物、2.5 U Taq 聚合酶以及10 % DMSO。反应通常含有150-320 µM的dATP、dCTP、dTTP、dGTP或其一种或多种类似物。在某些情况下，在反应中，可用300-640 µM dUTP替代dTTP。在本发明的上下文中，聚合酶链式反应在第一和第二引物存在的情况下以及在检测部分存在的情况下进行。根据本发明的聚合酶链式反应的实验条件例如在实施例1中描述。

在聚合酶链式反应的过程中，新合成的链形成双链分子，所述双链分子可用于反应的后续步骤。链分离、退火和延伸步骤可根据需要经常重复进行以产生与靶核酸分子相应的所期望数量的扩增产物。反应中的限速因素是反应中存在的引物、耐热酶和核苷三磷酸的量。扩增步骤和杂交步骤优选地重复至少一次。为了在检测中使用，扩增和杂交步骤的数量将取决于例如样品的性质。如果样品仅包含靶核酸的几个拷贝，可能需要更多的扩增和杂交步骤来扩增足以用于检测的靶序列。通常地，扩增和杂交步骤重复至少大约15次，但可以重复多达至少20、30或甚至40次。耐热聚合酶是指热稳定的聚合酶，即，当置于升高的温度下持续实现双链模板核酸变性所必需的时间时，该酶不会不可逆地变性。通常地，合成在各个引物的3'端启动，并以5' 到3' 方向沿模板链进行。耐热聚合酶已从黄栖热菌（Thermus flavus）、红栖热菌（T. ruber）、嗜热栖热菌（T. thermophilus）、水生栖热菌（T. aquaticus）、乳栖热菌（T. lacteus）、红色栖热菌（T. rubens）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）和炽热甲烷嗜热菌（Methanothermus fervidus）中分离。虽然如此，不耐热聚合酶也可在PCR中应用，只要酶是可被补充的。任选地，在本发明的上下文中，聚合酶链式反应可以在尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)存在的情况下进行。

在本发明的上下文中，术语“检测”通常意思是显现、分析和/或定量本发明的扩增产物。具体地，术语“检测” 是指本领域已知的适用于通过荧光读出，优选通过实时RT-PCR检测扩增产物的任何方法。

术语“实时荧光读出”通常意思是本领域已知的适于实时，即在扩增的过程中，显现、检测、分析和/或定量本发明的扩增产物的所有种类的成像方法。具体地，实时荧光读出是指实时聚合酶链式反应(RT-PCR，也称为定量实时聚合酶链式反应，即Q-PCR/qPCR)，其是基于聚合酶链式反应的方法并适于扩增和同时定量靶DNA分子。RT-PCR能够对DNA样品中的一个或多个特定的序列既进行检测又进行定量(当被归一化（mormalized）到DNA输入或另外的归一化基因时，其为拷贝的绝对数量或相对量)。在实时PCR或RT-PCR中，在PCR反应的每个循环中测量荧光，而荧光的量与PCR产物的量成比例。一般而言，在实时PCR中检测产物的两种常用方法是：(1) 嵌入任何双链DNA的非特异性荧光染料，以及 (2) 用荧光报道分子部分标记的序列特异性DNA探针，其允许仅在探针与它的互补DNA靶杂交后进行检测。优选地，根据本发明的实时荧光读出包括，但不限于，使用Lightcycler

*** (Roche，Germany)进行的扩增产物的实时成像。实时PCR和/或RT-PCR的原理是本领域普通技术人员熟知的，并在例如“Critical Factors for Successful Real-Time PCR”，Qiagen，Germany中描述。实时荧光读出得到的结果在本发明的上下文中显示并进一步在图3至图5中示例。

如本文所用，术语“检测部分”通常是指可掺入DNA，或可选地可附着和/或连接到多核苷酸，以及可通过荧光测量用于显现和/或定量感兴趣的扩增产物的任何物质或试剂。根据本发明的检测部分可以是嵌入染料，例如，举例来说SyberGreen

，或非嵌入部分，例如荧光团。SyberGreen

结合所有的双链DNA分子并且一旦结合就发出具有确定波长的荧光信号。嵌入染料的使用使得能够进行许多不同靶的分析，而不需要合成靶特异性标记的探针。但是，由于非特异性RNA产物和引物-二聚体也导致荧光信号，所以当使用嵌入染料例如SyberGreen

时，需要高PCR特异性。荧光团包括但不限于荧光素染料、罗丹明染料或花菁染料。荧光标记可从不同供应商包括例如Invitrogen

(USA)购得。

本发明的方法可适用于检测可变长度的RNA分子。但是，在本发明的上下文中，已发现本文所述的方法特别适于检测小RNA分子。

因此，在优选实施方式中，RNA分子具有15-200个核苷酸，优选20-100个核苷酸的长度。

即，在本发明的上下文中，待测RNA分子可具有10-250个核苷酸，或15-200个核苷酸，或40-120个核苷酸的长度，或优选20-100个核苷酸的长度。但是，对本领域普通技术人员显而易见的是为了获得不同范围，以上的上限和下限也可以进行组合。因此，RNA分子也可具有15-120、或40-100、或80-250个核苷酸的长度。而且，本发明含有的样品可含有具有可变长度的RNA分子群体。即，在本发明的上下文中提供的样品可包含具有相同长度的RNA分子，或可包含具有不同长度的RNA分子，其包括但不限于感兴趣RNA分子的前体形式和成熟形式。优选地，在本发明的上下文中提供的样品包含具有可区分长度的RNA分子，例如，举例来说，RNA分子的前体形式和成熟形式。这些的实例包括但不限于前体miRNA和成熟miRNA，其可在大约50-100个核苷酸的长度上变化。

在进一步优选的实施方式中，RNA分子选自成熟miRNA(miRNA)、前体miRNA(pre-miRNA)、初级miRNA前体(pri-miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi-相互作用RNA(piRNA)、前体piRNA和短发夹RNA(shRNA)。

在本发明的上下文中等同使用的术语“成熟miRNA”、“miRNA”或“微RNA”通常是指在细胞中表达的具有短长度的RNA分子。具体地，术语“miRNA”是指从长度为大约70个核苷酸的内源发夹形前体分子产生的长度为大约20-25个核苷酸的单链RNA。编码miRNAs的基因分别在人类、动物、植物和病毒的基因组中发现。

编码基因的miRNA比加工的成熟miRNA分子长得多。即，miRNAs在细胞核中首先被转录为具有帽和聚腺苷酸尾的初级转录物 (也称为“初级miRNA前体”)，并被加工为称为“前体-miRNA” (pre-miRNA)的短的70个核苷酸的茎-环结构。该加工由称为微处理机复合体（Microprocessor complex）的蛋白复合体在动物中进行，所述蛋白复合体由核酸酶Drosha和双链RNA结合蛋白Pasha组成。然后，这些pre-miRNAs在细胞质中通过与内切核酸酶Dicer的相互作用被加工为成熟miRNAs，所述内切核酸酶Dicer还起始RNA-诱导的沉默复合体(RISC)的形成。该复合体负责由于miRNA表达和RNA干扰而观察到的基因沉默。

术语“小干扰RNA”或“siRNAs”通常意思是这样的RNA分子，其在将dsRNA分子外源递送到细胞后，在长dsRNA的转基因表达后产生，或通过基因转移、细胞转染或细胞转导被引入细胞，或在细胞中内源地表达。术语“siRNA”还指短的调节RNA分子，其参与RNA干扰和基因沉默，优选地引起靶RNA转录物的降解。小干扰RNA可以是单链RNA或可以是由两条分开的RNA链，即有义和反义链组成的双链RNA。小干扰RNAs的长度通常为20-25个核苷酸。

术语“piwi-相互作用RNA”或“piRNA”通常是指在种系发育过程中，特别是在***发生过程中被功能性地连接用于沉默转座子并保持基因组完整性的RNA分子。Piwi-相互作用RNAs通过与Piwi蛋白的相互作用形成RNA-蛋白复合体的部分，并且在大小上不同于miRNAs，这是因为它们优选具有26–31个核苷酸的长度。如本文所用，术语“piRNA”还包含调节性小RNAs的亚类，称为“重复相关小干扰RNA”（“Repeat asociated small interfering RNA”）或“rasiRNA”。RasiRNA既与Ago蛋白亚族又与Piwi Argonaute蛋白亚族缔合，而piRNA仅与Piwi Argonaute亚族缔合。在种系中，rasiRNA参与建立和维持异染色质结构，控制重复序列中出现的转录物以及沉默转座子和逆转座子。RasiRNA在它的大小上也有所不同。与长度为21-23个核苷酸的miRNAs、长度为20-25个核苷酸的siRNAs以及长度为24-31个核苷酸的piRNAs不同，rasiRNAs的长度为24-29个核苷酸，这取决于来源的生物。不同亚类的miRNA、siRNA和piRNA也可通过它们的生物合成方式来区分，因为miRNA需要酶Dicer-1用于它的产生，siRNA需要酶Dicer-2，而rasiRNA不需要这二者。

术语“短发夹RNA”或“shRNA”通常是指具有茎-环发夹结构的短RNA分子。短发夹RNA也可以是源自内源模板的茎-环RNA结构，所述内源模板包括但不限于基因编码载体或质粒。具体地，短发夹RNA意思是可形成紧的发夹转角并可用于沉默基因表达的RNA分子。

在本发明的第一方面的优选实施方式中，步骤a)的RNA分子在3´-末端通过多核苷酸尾延伸，这优选地通过聚腺苷酸聚合酶、末端转移酶或连接酶的酶促反应，更优选地通过聚腺苷酸聚合酶的酶促反应来进行。

如本文所用，术语“多核苷酸尾”通常是指在RNA分子3´-端的一段核苷酸。根据本发明的多核苷酸尾可以具有可变长度，优选地包含大约20-200个核苷酸。根据本发明的多核苷酸尾可以由任何种类的核苷酸组成，如果认为适当，也可包含任何种类的修饰的核苷酸。在本发明的上下文中，设计多核苷酸尾，以使在合适的条件下引物或多核苷酸可与其杂交。如果由聚腺苷酸聚合酶的酶促反应产生，本发明的多核苷酸尾优选由腺苷残基组成。

在本发明的上下文中，“聚腺苷酸聚合酶”通常意思是以不依赖序列的方式催化腺苷添加到RNA分子3´-端的酶。具体地，本发明的聚腺苷酸聚合酶意思是具有酶分类号EC 2.7.7.19的多核苷酸腺苷酰转移酶或类似酶。

术语“末端转移酶”通常是指催化核苷酸添加到DNA分子3’-末端的酶，优选地，如在本发明的上下文中，是指催化核苷酸添加到RNA分子3’-末端的酶。本发明的末端转移酶优选地将核苷酸添加到突出的3’端，但还以较低效率将核苷酸添加到DNA片段平端和3’-凹端。

如本文所用，术语“连接酶”意思是通过在双链体DNA中的单链断裂位点处催化形成磷酸二酯形成而形成新的化学键从而可催化两个大分子连接的酶。本发明的连接酶优选地被分类为EC 6.5.1.1并也可作用于RNA底物。

在另一优选实施方式中，本发明的方法的特征在于第一多核苷酸与RNA分子的序列互补、与多核苷酸尾互补，或与二者均互补。

如上详述，在本方法的步骤b)中与RNA分子杂交的第一多核苷酸可以是与靶核酸互补的序列特异性多核苷酸，或者与多核苷酸尾互补的多核苷酸，当聚腺苷酸聚合酶用于3’ 延伸时，所述多核苷酸尾是聚腺苷酸尾。当使用与多核苷酸尾具有序列互补性的多核苷酸时，使用寡-dT多核苷酸是优选的。寡-dT多核苷酸意思是由脱氧胸苷残基组成的多核苷酸。

在本发明的上下文中，进一步令人惊讶的发现是可降解的多核苷酸(也称为“辅助寡核苷酸”)可用于当需要将某种序列添加和/或延伸到DNA分子的一条链或两条链时的任何应用。使用可降解的多核苷酸是连接反应或使用带尾的PCR引物的替代方案，并且具有扩增和检测与可降解的多核苷酸杂交的准确原始序列的优势。

因此，在还另一个优选实施方式中，本发明的方法的特征在于第二多核苷酸是可降解的多核苷酸。

第二多核苷酸是可降解的多核苷酸，其被设计，以使其可被尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)特异性地消化。尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)催化尿嘧啶和糖之间的N-糖苷键（N-glycosylic bond）的水解，在含有尿嘧啶的单链或双链DNA中留下脱嘧啶位点。因此，为了能被尿嘧啶-DNA-糖基化酶 (UNG)消化，本发明的可降解的多核苷酸应包含脱氧尿嘧啶(dU)核苷酸残基。

在防止PCR携带污染的情况下，在尿嘧啶-DNA-糖基化酶存在的情况下，dU-核苷残基向多核苷酸中的掺入，包括它们的酶促消化，是本领域普通技术人员的公知常识，并且在例如美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述。

在本发明的上下文中，第二多核苷酸包含dU-核苷酸残基并因此可在步骤e)后通过尿嘧啶-DNA-糖基化酶 (UNG)的酶促反应被消化。这具有第二多核苷酸不抑制随后扩增反应的优势。

具体地，通过不耐热的尿嘧啶-DNA-糖基化酶 (UNG) 的处理进行的多核苷酸(即“辅助寡核苷酸”)的降解可以是PCR反应的一部分(例如当UNG被包含在PCR酶混合物中时)。如果之后的PCR确实掺入dUTP，使用的UNG必须是不耐热的。

优选地，可降解的多核苷酸的5’部分包含第二引物结合位点的序列，3’部分包含靶RNA分子5’部分的特异性序列。例如，可降解的多核苷酸的该序列特异性部分可被设计为仅适合靶RNA分子的成熟形式或前体形式或两种形式。可选地，本发明的可降解的多核苷酸也可以由RNA核苷酸组成。

在进一步优选的实施方式中，本发明的方法的特征在于第二多核苷酸具有3´-末端磷酸形式的封闭的3´-末端。

如上详述，3´-末端磷酸基团有效地阻断多核苷酸的任何酶促延伸，即在聚合酶链式反应过程中另外的核苷酸的连接。第二多核苷酸的封闭的3´-末端也可以通过本领域普通技术人员已知的任何其他合适的修饰来得到。封闭的3´-末端的实施方式在本方法的上下文中具有特别的优势。

在优选实施方式中，本发明的方法的特征在于步骤f)中的检测部分是嵌入染料。

如本文所用，术语“嵌入染料”通常意思是结合双链DNA的任何染料。具体地，本发明的嵌入染料是结合双链DNA但不结合单链DNA，并且一旦该染料结合双链DNA，它的荧光会增加，其实例包含，例如，可购得的染料例如SybrGreen

(Invitrogen，USA)。根据本发明的嵌入染料在PCR中结合所有双链DNA，引起染料的荧光。因此，在PCR过程中DNA产物的增加引起荧光强度的增加，并在每个循环测量，从而使得DNA浓度被定量。但是，dsDNA染料例如SybrGreen

将结合所有dsDNA PCR产物，也包含非特异性PCR产物例如，举例来说，“引物二聚体”。这可能潜在地干扰或阻止预期的靶序列的准确定量。一般而言，PCR反应如通常制备，其具有荧光嵌入染料的添加。反应在循环变温器中运行，在每个循环后，用检测器测量荧光水平；染料仅在结合dsDNA(即，PCR产物)时才发出荧光。参考标准稀释物，可测定PCR中的dsDNA浓度。与其他实时PCR方法类似，如此得到的值不具有与它相关的绝对单位 (即mRNA拷贝/细胞)。测量的DNA/RNA样品与标准稀释物的比较将只提供样品相对于标准的分数或比值，仅得到不同组织或实验条件之间的相对比较。为了确保定量的准确度，通常必要的是将靶基因的表达归一化到稳定表达的基因。这可以校正跨实验样品的RNA数量或质量的可能差异。

在另一优选实施方式中，本发明的方法的特征在于步骤f)中的检测部分是水解探针。

如本文所用，术语“水解探针”通常是指可以被酶促水解的寡核苷酸。具体地，在本发明的上下文中，“水解探针”是指在PCR反应过程中可以被Taq DNA聚合酶的5´-到3´外切核酸酶活性水解的寡核苷酸。更优选地，本发明的“水解探针”意思是TaqMan探针，即携带荧光团和猝灭剂部分的序列特异性寡核苷酸，其中荧光团和猝灭剂部分连接到寡核苷酸上以使荧光团(即荧光报道分子或荧光标记)与猝灭剂的邻近性防止报道分子发出荧光。在定量实时PCR分析中使用TaqMan

探针是本领域普通技术人员已知的熟知方法，并且例如在实施例1中示例。一般而言，设计TaqMan

探针，以使荧光团连接在寡核苷酸探针的5´-端或接近寡核苷酸探针的5´-端，而猝灭剂定位在3´-端或接近3´-端。在多核苷酸链式反应(PCR)的组合的退火/延伸阶段中，探针被Taq DNA聚合酶的5´-到3´外切核酸酶活性切割，从而将荧光团和猝灭剂部分分开，结果是荧光报道分子可发出荧光信号，然后该荧光信号可被测量。可检测的荧光与积累的PCR产物的量成比例。

在本发明的上下文中，连接于水解探针的荧光团(即荧光报道分子或荧光标记)可以选自但不限于：荧光素染料的基团，所述荧光素染料例如羧基荧光素(FAM)、6-羧基-4´,5´-二氯-2´7´-二甲氧基荧光素(JOE)、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、四氯荧光素(TET)或5'-六氯-荧光素-CE亚磷酰胺(HEX)；罗丹明染料例如，举例来说，羧基-X-罗丹明(ROX)、Texas Red和四甲基罗丹明(TAMRA)，花菁染料例如吡喃

花菁染料，DY548、Quasar 570、或染料例如Cy3、Cy5、Alexa 568等等。荧光标记的选择通常由它的光谱性质和成像设备的可获得性来决定。定量测定中荧光标记的使用是本领域普通技术人员熟知的标准方法，荧光团可从几个供应商，包括例如Invitrogen

，USA购得。

猝灭剂通常是指吸收从供体分子 (即荧光报道分子)转移的能量的分子。即，供体分子将能量转移到猝灭剂，供体返回到基态并产生猝灭剂的激发态。荧光猝灭还取决于供体和受体分子之间的距离。直到近几年，猝灭剂通常是荧光染料，例如，荧光素作为报道分子以及罗丹明作为猝灭剂(FAM/TAMRA 探针)。最熟知的猝灭剂之一是TAMRA(四甲基-罗丹明)，其用于降低报道染料的发射。由于TAMRA的性质，它适于作为FAM (羧基荧光素)、HEX (六氯荧光素)、TET (四氯-荧光素)、JOE (5'-二氯-二甲氧基-荧光素)和Cy3-染料(花菁)的猝灭剂。可选地，根据本发明的“猝灭剂”可以是非荧光(称为暗)猝灭剂，其通常能够多路进行（multiplexing）。在本发明的上下文中可应用的暗猝灭剂包括但不限于试剂，例如，举例来说，猝灭380-530 nm范围的染料的DABCYL (4-[[4-(二甲基氨基)-苯基]-偶氮]-苯甲酸)，在530 nm具有最大吸收值并有效猝灭520-670 nm光谱的Eclipse® 猝灭剂(4-[[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮]-苯胺，Epoch Biosciences，Inc. Corporation Delaware 21720，23^rd Drive NE，Suite 150，Bothell Washington 98021，USA的商标)，或Black Hole猝灭剂，例如BHQ-1 ([(4-(2-硝基-4-甲基-苯基)-偶氮)-基-((2-甲氧基-5-甲基-苯基)-偶氮)]-苯胺) 和BHQ-2 ([(4-(1-硝基-苯基)-偶氮)-基-((2,5-二甲氧基-苯基)-偶氮)]-苯胺) (均可获自Biosearch Technologies，Inc.)，其能够猝灭整个可见光谱。为了降低背景荧光并以这种方式来改进灵敏度，这些非荧光受体经常用作荧光受体的替代物。

在本发明的上下文中，水解探针用于检测扩增产物的存在或缺乏。如上详述，该技术利用用一个荧光部分和一个猝灭部分标记的单链杂交探针。在PCR(聚合酶链式反应)的退火步骤中，标记的水解探针结合靶DNA(即，扩增产物)并在随后的延伸阶段中，被Taq聚合酶的5’到3’外切核酸酶活性降解。结果，激发的荧光部分和猝灭部分在空间上彼此分离。结果，当没有猝灭剂处于非常接近的位置时，一旦荧光团激发，就可检测到荧光发射。例如，ABI^® PRISM7700序列检测***(Applied Biotechnology Institute，Inc. Corporation Iowa，Building 36，Cal Poly State University San Luis Obispo，California 93407，USA的商标)利用水解探针技术。使用ABI^® PRISM 7700***进行PCR 扩增和检测的信息可见于http://www.appliedbiosystems.com/products.

根据本发明的水解探针以及它们在本发明的方法中的用途例如分别在实施例1和2中描述。

本发明的方法已进一步成功地应用于在一个反应设置中检测多余一种RNA分子。即，在优选实施方式中，应用本发明的方法，以使平行检测至少两种不同RNA分子。在该设置中，RNA分子可以具有不同长度或具有不同的特性或二者均不同。但是，作为在一个反应中平行检测至少两种RNA分子的先决条件，延伸反应产物的扩增应在检测部分存在的情况下进行，其中检测部分不是嵌入染料。优选地，为了在一个反应中检测至少两种不同RNA分子，在步骤f)中相应延伸反应产物的扩增应在序列特异性水解探针存在的情况下进行。

因此，在优选实施方式中，本发明的方法的特征在于在步骤f)中扩增至少两种不同的延伸反应产物。

如上详述，术语“延伸反应产物”是指本方法的步骤e)中产生的分子。即，“延伸反应产物”是与作为步骤f)中扩增模板的RNA分子的序列相对应的分子。

更优选地，本发明的方法的特征在于步骤f)中的扩增在至少两种水解探针存在的情况下进行，其中至少一种所述水解探针对特定种类的RNA分子具有特异性，以及其中所述探针包含不同组的供体/受体部分。

如上详述，用作为荧光报道分子或荧光标记的荧光团标记每个水解探针。因此，在本发明的上下文中，所述荧光团/荧光报道分子/荧光标记理解为“供体部分”。而且，每个水解探针另外用猝灭剂标记。在本发明的上下文中，该猝灭剂，也可以是荧光团，通常理解为“受体部分”。

合适的供体和受体部分是本领域已知，本领域普通技术人员能够选择供体和相应受体分子的合适的组合。如本文关于供体和相应的受体荧光部分所用，“相应的”是指受体荧光部分具有与供体荧光部分的激发光谱重叠的发射光谱。但是，两个信号应可互相分离。因此，受体荧光部分的发射光谱的最大波长优选应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长大至少30 nm，更优选至少50 nm例如至少80 nm，至少100 nm或至少140 nm。

根据本发明的优选的供体荧光部分是荧光标记，其包括但不限于例如荧光染料，例如荧光素染料、罗丹明染料、花菁染料和香豆素染料。例如，供体荧光部分可以是荧光素，而受体荧光部分可以选自LC-Red 610、LC-Red 640、LC-Red 670、LC-Red 705、Cy5和Cy5.5，优选LC-Red 610或LC-Red 640。更优选地，供体荧光部分是荧光素并且受体荧光部分是LC-Red 640或LC-Red 610。供体和受体荧光部分可以通过接头连接到适当的水解探针。每个接头的长度可以是重要的，因为接头将影响供体和受体荧光部分之间的距离。用于本发明目的的接头臂的长度是从核苷酸碱基到荧光部分以埃（Ångstroms）表示的距离。

可选地，受体部分可以是猝灭剂，优选暗猝灭剂。

在本发明的上下文中，羧基荧光素(FAM)作为供体荧光部分和BHQ-2 ([(4-(1-硝基-苯基)-偶氮)-基-((2,5-二甲氧基-苯基)-偶氮)]-苯胺)作为受体部分的组合已发现特别适用于本方法。5'-六氯-荧光素-CE-亚磷酰胺(HEX)作为供体荧光部分和BHQ-2 ([(4-(1-硝基-苯基)-偶氮)-基-((2,5-二甲氧基-苯基)-偶氮)]-苯胺)作为受体部分(即暗猝灭剂)的组合也特别适用于本方法。

因此，供体/受体部分的优选组合是羧基荧光素(FAM)和BHQ-2 ([(4-(1-硝基-苯基)-偶氮)-基-((2,5-二甲氧基-苯基)-偶氮)]-苯胺)，以及5'-六氯-荧光素-CE 亚磷酰胺(HEX) 和BHQ-2 ([(4-(1-硝基-苯基)-偶氮)-基-((2,5-二甲氧基-苯基)-偶氮)]-苯胺)。

在本发明的上下文中，进一步已发现当使用不同供体/受体部分标记的水解探针时，可以在一个反应中检测源自相同种类的不同长度的RNA分子。

即，本发明的方法可以应用于检测两种不同种类的RNA分子，其中所述两种不同种类的RNA分子源自一种前体分子。在那种情况下，本发明的方法可以应用于通过双色检测和定量在一个单独的反应中检测和扩增这两种RNA分子。该情形的实例包括但不限于检测成熟miRNA(miRNA)与前体miRNA(pre-miRNA)。具体地，在此，多核苷酸和/或引物的设计在成熟通道中引起成熟加前体信号的检测，原因在于成熟探针也结合前体中的成熟序列。前体通道仅检测前体信号。

对本领域普通技术人员显而易见的是第一和第二多核苷酸的不同设计将影响区分检测成熟miRNA和前体miRNA的可能性。如果对于不同miRNA形式，即成熟和前体miRNA，第一和第二多核苷酸是相同的，那么第一探针可被设计用于检测前体和成熟miRNA，而第二探针可被设计为仅检测前体形式。检测具有不同长度并源自一种前体分子的两种RNA分子例如在图5中示例。可选地，可设计前体特异性第一多核苷酸以及成熟miRNA特异性寡核苷酸。然后，第一探针可被设计用于检测成熟miRNA，第二探针可被设计用于仅检测前体形式。

因此，在优选实施方式中，RNA分子的特定种类源自一种前体分子，优选地其中RNA分子具有不同长度。

在本发明的上下文中，已发现第一和第二多核苷酸的设计决定检测RNA种类的两种形式(例如成熟和前体miRNA)还是仅检测一种形式。即，靶miRNA的前体形式也可通过产生该靶miRNA的较小扩增子(例如与成熟形式相同的大小)的内部PCR引物来扩增和检测。在这种情况下，水解探针必须被设计为适合在第一和第二多核苷酸之间。然后，前体形式不能在两个通道中都被检测到，而仅在前体通道中被检测到。因此，成熟和前体的定量是分开的。在这种情况下，不需要由可降解的多核苷酸进行的前体形式的延伸。然而，对于前体miRNA的扩增，使用前体特异性第一多核苷酸和第二前体特异性多核苷酸。

因此，在另一优选实施方式中，本发明的方法的特征在于通过不同扩增产物的检测，优选地通过具有可区分的荧光读出的不同扩增产物的检测来确定不同种类RNA分子之间的比例。

对本领域普通技术人员显而易见的是不同扩增产物的检测应包含使用具有不同供体/受体部分的不同水解探针，其可产生可区分的荧光信号。用于确定不同种类的RNA分子之间比例的典型反应包含不同扩增产物的相对定量。相对定量确定靶RNA分子与内源参照分子的量之间的比例，所述内源参照分子通常是合适的管家基因。然后，该归一化的值可用于比较例如不同样品中的差异基因表达。

可选地，相对定量可以通过依赖于C_T 值的直接比较的比较ΔΔC_T 方法来进行。C_T值是阈值循环并且是指扩增图跨过阈值的循环，即，在此处存在荧光的显著可检测的增加。通常地，C_T用作计算每个样品中起始模板量的工具。ΔC_T值描述了靶基因的C_T 值和相应内源参照基因的C_T值之间的差异。当应用比较ΔΔC_T方法时，标准曲线的制备仅需要确定在初始实验中靶和内源参照基因的扩增效率。用于相对定量的比较ΔΔC_T方法是本领域已知的标准方法并且例如在Livak和Schmittgen，2001中详述。

另一方面，本发明提供试剂盒，其包含如本发明的上下文中所定义的第一和第二多核苷酸、一组dNTPs、逆转录酶和检测部分，优选包含对一种或多种不同RNA分子具有特异性的一种或多种水解探针。

在所述方面的优选实施方式中，试剂盒进一步包含(i)具有尿嘧啶-DNA-糖基化酶 (UNG) 活性的酶，和/或(ii) 如本发明的上下文中所定义的第一和/或第二引物。

另一方面，本发明涉及根据本发明的试剂盒用于检测RNA分子，优选用于检测如本发明的上下文中所定义的一种或多种RNA分子的用途。

本发明的另一方面是检测RNA分子的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 提供含有所述RNA分子的样品；

d) 将第二多核苷酸与所述第一链cDNA杂交，其特征在于所述第二多核苷酸是3´-不可延伸的寡核苷酸，其包含

(i) 3´-部分，其与所述第一链cDNA的一部分互补，以及

(ii) 5´-突出端，其包含第二引物结合位点的序列；

e) 延伸所述第一链cDNA以产生延伸反应产物，所述延伸反应产物包含与所述第二引物结合位点互补的序列；

g) 通过实时荧光读出而检测扩增产物。

上述方法的特定方面是这样的方法：其中所述RNA分子具有15-200个核苷酸，优选20-100个核苷酸的长度；或者

其中所述RNA分子选自成熟miRNA(miRNA)、前体miRNA(pre-miRNA)、初级miRNA前体(pri-miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piRNA(piwi-相互作用RNA)、前体piRNA和短发夹RNA(shRNA)；或者其中步骤a)的所述RNA分子在3´-末端通过多核苷酸尾延伸，该延伸优选地通过聚腺苷酸聚合酶、末端转移酶或连接酶的酶促反应，更优选地通过聚腺苷酸聚合酶的酶促反应来进行；或者

其中所述第一多核苷酸与所述RNA分子的序列互补、与所述多核苷酸尾互补，或与二者均互补；或者

其中所述第二多核苷酸是可降解的多核苷酸；或者

其中所述第二多核苷酸包含dU-核苷酸残基并在步骤e)后通过尿嘧啶-DNA-糖基化酶 (UNG)的酶促反应被消化；或者

其中所述第二多核苷酸具有3´-末端磷酸形式的封闭的3´-末端；或者其中所述步骤f)中的检测部分是嵌入染料；或者

其中所述步骤f)中的检测部分是水解探针；或者

其中在步骤f)中扩增至少两种不同的延伸反应产物；或者

其中所述步骤f)中的扩增在至少两种水解探针存在的情况下进行，其中至少一种所述水解探针对特定种类的RNA分子具有特异性，并且其中所述探针包含不同组的供体/受体部分；或者

其中所述特定种类的RNA分子源自一种前体分子，优选地所述特定种类的RNA分子具有不同长度；或者

其中不同种类RNA分子之间的比例通过不同扩增产物的检测，优选地通过具有可区分的荧光读出的不同扩增产物的检测来确定。

本发明的另一方面是试剂盒，其包含：

-如前述权利要求任一项所定义的第一和第二多核苷酸，

-一组dNTPs，

-逆转录酶，和

-检测部分，优选对一种或多种不同RNA分子具有特异性的一种或多种水解探针。

上述试剂盒的特定方面是这样的试剂盒：其进一步包含(i)具有尿嘧啶-DNA-糖基化酶 (UNG) 活性的酶，和/或(ii) 如前述权利要求任一项所定义的第一和/或第二引物。

本发明的另一方面是上述试剂盒用于检测RNA分子，优选用于检测如上所定义的一种或多种RNA分子的用途。

以下附图和实施例的意图是说明本发明的各种实施方式。如此，其中所述的具体修饰不能理解为对本发明范围的限制。对本领域普通技术人员显而易见的是可以进行各种等同方案、变化和修饰而不偏离本发明范围。因此，应理解的是这些等同方案被包含在本文中。

附图说明

图1图解了使用对靶RNA分子具有序列特异性的第一多核苷酸(包含第一引物结合位点，此处命名为通用引物结合位点B = UPB)检测成熟和前体miRNA的方法I的原理。在PCR反应之前使用酶UNG将第二多核苷酸(dU辅助寡核苷酸，包含第二引物结合位点= 通用引物结合位点A，UPA)消化。通过使用第一和第二引物(即分别为UPA和UPB)来进行延伸反应产物的PCR扩增。在两种不同水解探针存在的情况下，进行两种扩增产物的检测，所述两种不同水解探针分别与成熟和前体第一链cDNA互补并用不同的供体/受体部分(即FAM/BHQ2 和HEX/BHQ2)标记。

图2图解了使用与成熟和前体miRNA的聚腺苷酸尾互补的第一多核苷酸和可降解的第二多核苷酸(dU 辅助寡核苷酸)检测miRNA的方法II的原理。此处，靶RNA分子的3´-端首先通过聚腺苷酸-聚合酶的酶促反应延伸，因而产生与第一多核苷酸杂交的聚腺苷酸尾。随后的步骤对应图1所示的方法I的步骤。

实时PCR扩增图，其显示47个扩增循环测量的FAM荧光的增加（图3至图6）。

图3显示使用与成熟miR-21 RNA互补的序列特异性第一多核苷酸(方法I)通过实时RT-PCR荧光读出的方式检测合成的miR-21 RNA寡核苷酸分子(50 fg)。

图4显示使用与成熟miR-21 RNA互补的序列特异性第一多核苷酸(方法I)用于逆转录，通过实时RT-PCR荧光读出的方式从肺癌和正常组织检测内源表达的miR-21 RNA。

图5显示使用分别与miR-21 RNA的成熟和前体形式互补的序列特异性第一多核苷酸用于逆转录，通过实时RT-PCR 荧光读出的方式(方法I)同时检测成熟和前体miR-21 RNA(用合成的寡核苷酸作为原料(input material))。

图6显示使用与聚腺苷酸尾互补的第一多核苷酸(方法II)用于逆转录，通过实时RT-PCR 荧光读出的方式同时检测成熟和前体miR-21 RNA(用合成的寡核苷酸作为原料)。

具体实施方式

实施例

实施例1

方法 I

用特异性RT-引物(第一多核苷酸)和用于第一链cDNA延伸的dU DNA辅助寡核苷酸(第二多核苷酸)检测miRNA。

逆转录

1. miRNA 和 RT- 引物变性 ：将4.5 µl含有miRNA和60 nM (在10 µl RT反应物中的终浓度) 特异性RT-引物的溶液在65℃变性10 min，然后立刻冷却到4 ℃或置于冰上。

2. 添加用于逆转录的反应成分 ：4.5 µl变性的miRNA/RT引物+ 2 µl 5x RT 缓冲液+ 0,25 µl RNA酶抑制剂+ 1 µl dNTP混合物+ 0,25 µl RT酶+ 2 µl PCR级水= 10 µl RT反应物 (参见Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche，Germany的包装插页)

3. 逆转录 ：55 ℃ 5 min 逆转录，85 ℃ 5 min 灭活RT 酶，4 ℃ 冷却

4. 添加 dU DNA 多核苷酸和另外的 RT 酶：+ 1 µl 60 nM dU DNA寡核苷酸+ 0,5 µl 1:4稀释的RT酶(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche，Germany)

5. 第一链 cDNA 的延伸 ：55 ℃ 5 min 逆转录，85 ℃ 5 min灭活RT 酶，4 ℃冷却或储存在-20℃

dU DNA 多核苷酸降解、扩增和检测

6. dU DNA 多核苷酸降解和随后的 PCR 反应：1 µl 来自逆转录的cDNA + 1 x Taqman RNA AMP Kit RNA混合物+ 0,5 µM 通用PCR引物A + 0,5 µM 通用PCR引物B + 0,2 µM mi21成熟探针+ 2,8 mM MgAc (20 µl PCR反应)

7. LC480 PCR 循环仪 (Roche Diagnostics GmbH ， Germany) 上的 PCR 程序

反应体积：20 µl；检测形式：双色水解探针；

扩增循环：47，95 ℃ 15 s，60 ℃ 25 s；冷却40 ℃ 30 min

表1：多核苷酸序列

。

实施例 Ia ：

使用成熟特异性RT-引物进行逆转录以及可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸，检测50 fg 成熟miR-21，其为合成的寡核苷酸。结果显示于图3。结论：在逆转录中使用成熟特异性RT-引物并使用可降解的dU DNA 寡核苷酸进行cDNA延伸，可以检测成熟miR-21，其为合成的多核苷酸。

实施例 Ib ：

使用成熟特异性RT-引物进行逆转录以及可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸，检测从K562细胞系分离的miRNA中的成熟miR-21。结论：在逆转录中使用成熟特异性RT-引物并使用可降解的dU-DNA寡核苷酸进行cDNA延伸，可以检测来自K562细胞系的miRNA中的成熟miR-21。

实施例 Ic ：

使用成熟特异性RT-引物进行逆转录以及可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸，检测从肺癌/正常组织FFPET材料分离的miRNA中的成熟miR-21。结果显示于图4。结论：在逆转录中使用成熟特异性RT-引物并使用可降解的dU DNA 寡核苷酸进行cDNA延伸，可以检测从肺癌/正常组织FFPET材料分离的miRNA中的成熟miR-21。

实施例 Id ：

使用前体特异性RT-引物进行逆转录以及可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸，检测前体miR-21 (原料：合成的寡核糖核苷酸)。结论：在逆转录中使用前体特异性RT-引物并使用可降解的dU DNA 寡核苷酸进行cDNA延伸可以检测以合成的寡核糖核苷酸形式提供的前体miR-21。

实施例 Ie ：

使用成熟和前体特异性RT-引物进行逆转录以及可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸，同时检测成熟和前体miR-21 (原料：合成的寡核苷酸)。结果显示于图5。结论：在逆转录中使用成熟和前体特异性RT-引物以及使用可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸，可在同一反应中检测成熟和前体miR-21。在成熟miR-21的背景中检测前体，当最低至1%前体时仍是可能的。

实施例2

方法 II

使用(锚定的)寡-dT RT-引物(第一多核苷酸)以及用于第一链cDNA 延伸的dU DNA 辅助寡核苷酸(第二多核苷酸)检测miRNA。

聚腺苷酸加尾和miRNA分离

1. 聚腺苷酸加尾 ：根据Poly(A) Tailing Kit (Ambion Inc.，Austin，TX，USA)的包装插页

2. 聚腺苷酸化的 miRNA 的分离 ：根据High Pure miRNA Isolation Kit (Roche DiagnosticsGmbH，Germany)的包装插页中用于分离含有小RNA的总RNA的1-柱方案。仅有变化为：如推荐的，使用等量的缓冲液BB和BE用于使用细胞/组织裂解液进行分离。

逆转录

3. miRNA 和 RT- 引物变性 ：将4.5 µl 含有miRNA和200 nM (在10 µl RT 反应体积中的终浓度)锚定的寡-dT RT-引物的溶液在65℃变性10 min，然后立刻冷却到4 ℃或置于冰上。

4. 添加用于逆转录的反应成分 ：4.5 µl 变性的miRNA/RT引物+ 2 µl 5x RT 缓冲液+ 0.25 µl RNA酶抑制剂+ 1 µl dNTP 混合物+ 0.25 µl RT 酶+ 2 µl PCR级水= 10 µl RT 反应物 (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche DiagnosticsGmbH，Germany的包装插页)。

5. 逆转录和第一链 DNA 的延伸 ：55 ℃ 5 min 逆转录；85 ℃ 5 min 灭活RT 酶；55 ℃ 12 min 逆转录，到达55 ℃后立即添加+ 1µl 100 nM dU DNA寡核苷酸+ 0,5 µl 1:4 稀释的RT 酶(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche)；85 ℃ 5 min 灭活RT 酶；4 ℃ 冷却或储存在-20℃。

dU DNA寡核苷酸降解，扩增和检测

6. dU DNA 寡核苷酸降解和随后的 PCR 反应：1µl来自逆转录的cDNA + 1 x Taqman RNA AMP Kit RNA混合物+ 0.5 µM 通用PCR引物A + 0.5 µM 通用PCR引物B + 0.2 µM mi21成熟探针+ 2.8 mM MgAc (20 µl PCR 反应)。

反应体积：20 µl；检测形式：双色水解探针；扩增循环：47，95 ℃ 15 s，60 ℃ 25 s；冷却40 ℃ 30 min。

表2：多核苷酸序列

实施例 IIa ：

使用(成熟锚定的) 寡-dT RT-引物进行逆转录以及可降解的dU DNA 寡核苷酸进行cDNA延伸，检测5 ng 成熟miR-21，其为合成的寡核苷酸。结论：在逆转录中使用(成熟锚定的) 寡-dT RT-引物以及使用可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸可以检测成熟miR-21，其为合成的寡核苷酸。阴性对照显示不影响miRNA检测的某种二聚体形成(只要miRNA曲线早于二聚体曲线出现)。

实施例 IIb ：

使用(成熟锚定的) 寡-dT RT-引物进行逆转录以及可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸，检测从K562细胞系分离的miRNA中的成熟miR-21。结论：在逆转录中使用(成熟锚定的) 寡-dT RT-引物以及使用可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸可以检测来自K562细胞系的miRNA中的成熟miR-21。阴性对照显示不影响miRNA检测的某种二聚体形成(只要miRNA曲线早于二聚体曲线出现)。

实施例 IIc ：

使用(成熟锚定的) 寡-dT RT-引物进行逆转录以及可降解的dU DNA 寡核苷酸进行cDNA延伸，检测从结肠癌FFPET材料分离的miRNA中的成熟miR-21。结论：在逆转录中使用(成熟锚定的) 寡-dT RT-引物以及使用可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸，可以检测从结肠癌FFPET材料分离的miRNA中的成熟miR-21。阴性对照显示不影响miRNA检测的某种二聚体形成(只要miRNA曲线早于二聚体曲线出现)。

实施例 IId ：

使用(前体锚定的)寡-dT RT-引物进行逆转录以及可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸，检测前体miR-21，其为合成的寡核苷酸。结论：在逆转录中使用(前体锚定的)寡-dT RT-引物以及使用可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA 延伸，可以检测前体miR-21，其为合成的寡核苷酸。成熟通道中的阴性对照显示不影响miRNA检测的某种二聚体形成(只要miRNA曲线早于二聚体曲线出现)。

实施例 IIe ：

使用(成熟和前体锚定的) 寡-dT RT-引物进行逆转录以及可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸，同时检测成熟和前体miR-21 (其为合成的寡核苷酸)。结论：在逆转录中使用(成熟和前体锚定的)寡-dT RT-引物以及使用可降解的dU DNA寡核苷酸进行cDNA延伸，在同一反应中可以检测成熟和前体miR-21 (其为合成的寡核苷酸)。成熟通道中的阴性对照显示不影响miRNA检测的某种二聚体形成(只要miRNA曲线早于二聚体曲线出现)。

参考资料

Bartel D.P (2009)，Cell，136: 215-33.

Gaur A.，Jewell D.A.，Liang Y.，Ridzon D.等人 (2007)，Cancer Res. 67: 2456-2468.

Kumar M.S.，Lu J.，Mercer K.L.，Golub T.R.，Jacks T. (2007)，Nat. Genetics 39: 673-677.

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序列表

<110> Roche Diagnostics GmbH/ F. Hoffmann-La Roche AG

<120> 检测RNA分子的方法、试剂盒及其相关用途

<130> R66746

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 成熟特异性RT-引物 (SEQ ID No.: 1)

<400> 1

gccacccacg agccacgcat caacat 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 前体特异性RT-引物 (SEQ ID No.: 2)

<400> 2

gccacccacg agccacgcat gtcaga 26

<210> 3

<211> 48

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mi21-dU-前体-辅助-UPB (SEQ ID No.: 3)

<400> 3

gccuugccua guccucucag uaauuauauu ugucggguag cuuaucag 48

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 通用PCR 引物 A (SEQ ID No.: 4)

<400> 4

gccacccacg agccacgca 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 通用PCR 引物 B (SEQ ID No.: 5)

<400> 5

gccttgccta gtcctctcag 20

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mi21成熟-探针 (SEQ ID No.: 6)

<220>

<221> misc_结合

<222> < 1

<223> /结合部分="FAM"

<220>

<221> misc_结合

<222> > 27

<223> /结合部分="BHQ2"

<400> 6

tcgggtagct tatcagactg atgttga 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mi21前体-探针 (SEQ ID No.: 7)

<220>

<221> misc_结合

<222> < 1

<223> /结合部分="HEX"

<220>

<221> misc_结合

<222> > 27

<223> /结合部分="BHQ2"

<400> 7

cagcccatcg actggtgttg ccatgag 27

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mi21成熟-rev-UPA (SEQ ID No.: 8)

<400> 8

gcctccctcg cgccatcagt tttttttttt ttttttcaa 39

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mi21前体-rev-UPA (SEQ ID No.: 9)

<400> 9

gcctccctcg cgccatcagt tttttttttt ttttttgtc 39

<210> 10

<211> 56

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mi21-dU-辅助-UPB IIg (SEQ ID No.: 10)

<220>

<221> misc_结合

<222> > 56

<223> /结合部分="磷酸"

<400> 10

gccuugccua guccucucag uaauuauauu ugucggguag cuuaucagac ugaugu 56

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 通用PCR 引物 A (SEQ ID No.: 11)

<400> 11

gcctccctcg cgccatcag 19

Claims

1.检测RNA分子的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 提供含有所述RNA分子的样品；

(i) 3´-部分，其与所述第一链cDNA的一部分互补，以及

(ii) 5´-突出端，其包含第二引物结合位点的序列；

g) 通过实时荧光读出而检测所述扩增产物。

2.权利要求1的方法，其特征在于所述RNA分子具有15-200个核苷酸，优选20-100个核苷酸的长度。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于所述RNA分子选自成熟miRNA(miRNA)、前体miRNA(pre-miRNA)、初级miRNA前体(pri-miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piRNA(piwi-相互作用RNA)、前体piRNA和短发夹RNA(shRNA)。

4.权利要求1至3任一项的方法，其特征在于步骤a)的所述RNA分子在3´-末端通过多核苷酸尾延伸，该延伸优选通过聚腺苷酸聚合酶、末端转移酶或连接酶的酶促反应，更优选通过聚腺苷酸聚合酶的酶促反应来进行。

5.权利要求1至4任一项的方法，其特征在于所述第一多核苷酸与所述RNA分子的序列互补、与所述多核苷酸尾互补，或与二者均互补。

6.权利要求1至5任一项的方法，其特征在于所述第二多核苷酸具有3´-末端磷酸形式的封闭的3´-末端。

7.权利要求1至6任一项的方法，其特征在于步骤f)中的所述检测部分是嵌入染料。

8.权利要求1至7任一项的方法，其特征在于步骤f)中的所述检测部分是水解探针。

9.权利要求8的方法，其特征在于在步骤f)中扩增至少两种不同的延伸反应产物。

10.权利要求9的方法，其特征在于所述步骤f)中的扩增在至少两种水解探针存在的情况下进行，其中至少一种所述水解探针对特定种类的RNA分子具有特异性，并且其中所述探针包含不同组的供体/受体部分。

11.权利要求10的方法，其特征在于所述特定种类的RNA分子源自一种前体分子，优选地所述特定种类的RNA分子具有不同长度。

12.权利要求9至11任一项的方法，其特征在于不同种类的RNA分子之间的比例通过不同扩增产物的检测，优选地通过具有可区分的荧光读出的不同扩增产物的检测来确定。

13.试剂盒，包含:

如前述权利要求任一项所定义的第一和第二多核苷酸，

一组dNTPs，

逆转录酶，以及

检测部分，优选对一种或多种不同RNA分子具有特异性的一种或多种水解探针，

具有尿嘧啶-DNA-糖基化酶 (UNG) 活性的酶，

以及任选地如前述权利要求任一项所定义的第一和/或第二引物。

14.根据权利要求13的试剂盒用于检测RNA分子，优选用于检测如权利要求2-3任一项所定义的一种或多种RNA分子的用途。