CN102099048A - 用于治疗与神经原纤维缠结有关的进行性认知障碍的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于治疗或预防进行性认知疾病、障碍或病症的进展的方法，以及用于在需要其的受试者中改善认知功能复原的方法。

Description

用于治疗与神经原纤维缠结有关的进行性认知障碍的方法

交叉引用

本申请要求于2008年5月21日提交的第61/055,009号美国专利申请的优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。

政府资助声明

本发明是在美国政府支持下做出的，资助号为SBIR-1R43AG029670，由美国国家衰老研究所授予。美国政府对本发明持有一定权利。

技术领域

本发明涉及用于治疗进行性认知障碍的方法，以及用于改善认知功能复原的方法。

背景技术

阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(也称“AD”，“阿尔茨海默型老年性痴呆(SDAT)”或“阿尔茨海默病”)为中枢神经***(“CNS”)的神经变性障碍。通常从患者病史、间接的亲属病史和临床观察，基于出现的特征性神经学和神经心理学特征来临床诊断AD。

AD以大脑皮质和某些皮质下区中神经元和突触的损失为特征。该损失导致受影响区域的总体萎缩，包括颞叶和顶叶、以及部分额叶皮质和扣带回的变性。受AD折磨的人的脑中淀粉状蛋白斑(“AP”)和神经原纤维缠结(“NFT”)通过显微镜都清晰可见。蛋白斑是淀粉状β(“Aβ”)蛋白质和细胞物质在神经元外部和周围的密集的、主要为不溶性的沉积物。NFT是微管相关蛋白“tau”的聚集物，所述微管相关蛋白已经变得高度磷酸化，并在细胞本身的内部积聚。尽管许多年长的个体由于衰老出现了一些蛋白斑和神经原纤维缠结，但AD患者的脑中在特定脑区例如颞叶具有更大数量的这类蛋白斑和神经原纤维缠结。

AD组织学上以脑中存在胞外淀粉状沉积物，同时伴有分布广泛的神经元损失为特征。胞外淀粉状沉积物被称为神经炎斑或老年斑。淀粉状沉积物也可以在血管内部和周围发现。AD和AD样老年斑的主要蛋白质组成为Aβ。Aβ可以在体内血浆和脑脊液(“CSF”)以及体外细胞培养基中检测到。

术语“淀粉状肽”、“淀粉状β肽”和“Aβ”在本文中互换地用来指由淀粉状前体蛋白(APP)的蛋白酶水解过程生成的肽的家族。

APP以三种不同的剪接同工型形式存在，一种具有770个氨基酸(同工型a)(SEQ ID NO：1)，一种具有751个氨基酸(同工型b)(SEQ ID NO：2)，以及一种具有695个氨基酸(SEQ ID NO：3)。本文所用的术语“APP”指所有的三种同工型。术语“淀粉状肽”、“淀粉状β肽”和“Aβ”包括但不限于Aβ40(SEQ ID NO：4)、Aβ42(SEQ ID NO：5)和Aβ43(SEQ ID NO：6)。Aβ的两种主要形式为Aβ40(SEQ ID NO：4)，其对应长40个氨基酸的肽；和Aβ42(SEQID NO：5)，其对应长42个氨基酸的肽。Aβ43(SEQ ID NO：6)对应长43个氨基酸的Aβ肽。

通常认为脑脂质错综复杂地参与Aβ相关的致病途径。Aβ肽是AD患者的脑中发现的淀粉状蛋白斑的主要蛋白质组分，并被许多人认为是导致障碍的元凶。积累的胞外Aβ的数量对AD的病理生物学至关重要，并取决于其产生/分泌及其清除的对抗速率。研究表明神经元依赖早老蛋白(“PS1”)和细胞质连接蛋白(“CLIP-170”)之间的相互作用来产生Aβ并通过脂蛋白受体相关的蛋白质(“LRP”)途径将其吸收。进一步的要求是，Aβ的形成取决于脂筏(“LRs”)中关键蛋白质的组装。本文所用的术语“脂筏”指富集有参与信号转导、蛋白质运输和蛋白质水解的胆固醇、鞘糖脂和葡糖基磷脂酰肌醇(GPI)标记的蛋白质的膜微结构域。在LRs内，人们认为Aβ的前体，淀粉状前体蛋白(“APP”)，一种I型膜蛋白，首先被蛋白酶β-分泌酶(BACE)切割，以产生APP的C末端中间片段CAPPβ，CAPPβ保持嵌入膜中。CAPPβ随后在位于脂质双层内的位点被γ-分泌酶切割。所述γ-分泌酶是一种含有早老蛋白(PS1/PS2)、呆蛋白(nicastrin)、PEN-2和APH-I或其片段的高分子量多蛋白复合体。Aβ最后被释放到细胞外，在那里它可能：i)在寡聚化后开始积聚，并对神经元产生毒性，或ii)通过内吞机制(包括载脂蛋白E(apoE)和LRP或清道夫受体)，或通过包括胰岛素降解酶(IDE)和脑啡肽酶(neprilysin)的胞外蛋白酶降解被清除。

通常认为可溶性Aβ寡聚物，在蛋白斑堆积之前，产生神经毒作用，导致神经变性、突触损失和痴呆。更进一步地，增加的Aβ水平可能由异常的脂质积聚导致，从而引起膜流动性和脂筏组成的改变。

存在NFT是AD脑的特征。这些高度磷酸化tau蛋白的聚集物又称作“成对螺旋纤丝”(PHF)。对于PHF的作用而言，其是作为AD的首要诱发因素还是较***的角色，这是不确定的。然而，PHF的积聚引起微管网络的去稳定化，因此危害神经元骨架，扰乱细胞的运输和信号转导/通讯，并导致神经元死亡。

NFT并不是AD所特有的；NFT也可以见于克-雅综合征、核上性麻痹、皮质基底节神经变性和与染色体17连锁的额颞痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)。这表明NFT可以代表导致可能由许多诱因事件/损伤引发的神经变性的端点。

瘦蛋白

瘦蛋白是由脂肪组织分泌的螺旋状蛋白质，它作用于下丘脑腹内侧核中的受***点以抑制食欲并在体内脂肪储备增加时增加能量消耗。女性体内的瘦蛋白水平是40％更高，并在***前进一步增加50％，随后回到基线水平。禁食会降低瘦蛋白水平，而炎症会使其增加。

已鉴定到了编码瘦蛋白和瘦蛋白受***点的人类基因。编码瘦蛋白的ob基因突变的实验小鼠会出现病态肥胖、糖尿病和不育；对这些小鼠施用瘦蛋白改善了糖耐量，增加了体力活动，将体重降低了30％，并恢复生育力。编码瘦蛋白受体的db基因突变的小鼠也会出现肥胖和糖尿病，但是施用瘦蛋白也不会得到改善。尽管发现瘦蛋白基因和瘦蛋白受体基因在少数具有异常饮食行为的病态肥胖人受试者中存在突变，绝大多数肥胖人没有显示出此类突变，并具有正常或升高的瘦蛋白循环水平。饥饿中可见的免疫缺损可能由瘦蛋白分泌的减少引起。瘦蛋白基因或其受体基因缺乏的小鼠显示出T细胞功能损伤，且在实验室研究中，瘦蛋白引发人CD4淋巴细胞的增殖反应。

瘦蛋白也控制胰岛素敏感性。在CNS内部，瘦蛋白穿过血脑屏障与脑中特定受体结合以调节食物摄入、体重和能量消耗。通常，(i)瘦蛋白以与体脂成比例的水平循环；(ii)瘦蛋白与血浆浓度成比例地进入CNS；(iii)在与调节能量摄入和消耗有关的脑神经元中发现了瘦蛋白受体；和(iv)瘦蛋白通过作用于下丘脑内侧基底部中的受体控制食物摄入和能量消耗。

通常认为瘦蛋白抑制含有神经肽Y(NPY)和野灰蛋白相关肽(agouti-related peptide，AgRP)的神经元的活性，并提高表达α促黑素细胞激素(α-MSH)的神经元的活性。NPY神经元是调节食欲的关键要素；注射到实验动物脑中的小剂量NPY刺激进食，而小鼠NPY神经元的选择性破坏则使它们变得缺乏食欲。相反，α-MSH是重要的饱食调节者，并且脑中α-MSH作用的受体基因的不同与人的肥胖有关。

Aβ肽的产生和聚集的紊乱如何引发AD或其他进行性认知障碍的病理学是未知的。对与神经原纤维缠结的积聚相关的进行性认知障碍的临床治疗和诊断方法仍存在需求。

附图说明

图1显示了RA-SY5Y中瘦蛋白的tau去磷酸化作用的时间和剂量依赖性。SY5Y细胞系的人成神经细胞瘤细胞用视黄酸(RA)(10μM)诱导7天以促使神经元分化(RA-SY5Y)。A.诱导的细胞用瘦蛋白(400ng/ml)处理4小时，或不作处理(安慰剂)。制备全细胞提取物并用抗OB-R(瘦蛋白受体)通过蛋白质印迹进行分析。剥离下膜并用抗α微管蛋白再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。B.从用瘦蛋白(400ng/ml)或安慰剂处理不同时间的细胞制备全细胞提取物，并用抗tau(pSer³⁹⁶)通过蛋白质印迹进行分析。剥离下膜并用抗tau(总的)再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。C.采用光密度测定法分析B的归一化条带密度。结果用相对安慰剂处理的样品的平均±SD％倍数变化表示，其中安慰剂处理的样品被任意地指定为0。D.诱导的细胞用不同浓度的瘦蛋白处理4小时，或用安慰剂处理。然后如同B进行实验。E.D的归一化条带密度如同C进行分析。IC₅₀表示tau(pSer³⁹⁶)磷酸化降低50％的瘦蛋白浓度。^*相对于不作处理的而言p＜0.05。

图2显示了RA-SY5Y中胰岛素的tau去磷酸化作用的时间和剂量依赖性。A.RA-SY5Y用胰岛素(10μM)处理4小时，或不作处理(安慰剂)。制备全细胞提取物并用抗胰岛素受体(β亚基)通过蛋白质印迹进行分析。剥离下膜并用抗α微管蛋白再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。B.从用胰岛素(10μM)或安慰剂处理不同时间的细胞制备全细胞提取物，并用抗tau(pSer³⁹⁶)通过蛋白质印迹进行分析。剥离下膜并用抗tau(总的)再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。C.采用光密度测定法分析B的归一化条带密度。结果用相对安慰剂处理的样品的平均±SD％倍数变化表示，其中安慰剂处理的样品被任意地指定为0。D.诱导的细胞用不同浓度的胰岛素处理4小时，或用安慰剂处理。然后如同B进行实验。E.D的归一化条带密度如同C进行分析。IC₅₀表示tau(pSer³⁹⁶)磷酸化降低50％的胰岛素浓度。^*相对于不作处理的而言p＜0.05。

图3显示了瘦蛋白和胰岛素联合处理产生的tau去磷酸化作用比任一单独处理更强。A.RA-SY5Y用低浓度或高浓度瘦蛋白(100或1600ng/ml)和/或胰岛素(1或20μM)处理4小时，或不作处理(安慰剂)。制备全细胞提取物并用抗tau(pSer³⁹⁶)通过蛋白质印迹进行分析。剥离下膜并用抗tau(总的)再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。B.采用光密度测定法分析A的归一化条带密度。结果用相对安慰剂处理的样品的平均±SD％倍数变化表示，其中安慰剂处理的样品被任意地指定为0。C.细胞用瘦蛋白(1600ng/ml)和胰岛素(20μM)处理4小时，或用安慰剂处理。为了再诱导tau磷酸化，将冷PBS加入到处理后的细胞中保持10分钟、1小时或者不加入冷PBS。然后如同A进行实验。D.C的归一化条带密度如同B进行分析。^*相对于比较组而言p＜0.05，^**相对于比较组而言p＜0.01。

图4显示了RA-SY5Y中5’-AMP-活化蛋白激酶(AMPK)活化的tau去磷酸化作用。A.诱导的细胞用作为AMP-活化蛋白激酶激动剂的氨基咪唑羧酰胺核糖核苷酸(AICAR)(1mM)处理1小时，或不作处理(安慰剂)。制备全细胞提取物并用AMPKα(pThr¹⁷²)通过蛋白质印迹进行分析。剥离下膜并用抗AMPKα(总的)再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。B.从用AICAR(1mM)或安慰剂处理不同时间的细胞制备全细胞提取物，并用抗tau(pSer³⁹⁶)通过蛋白质印迹进行分析。剥离下膜并用抗tau(总的)再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。C.采用光密度测定法分析B的归一化条带密度。结果用相对安慰剂处理的样品的平均±SD％倍数变化表示，其中安慰剂处理的样品被任意地指定为0。D.诱导的细胞用不同浓度的AICAR或安慰剂处理1小时。然后如同B进行实验。E.D的归一化条带密度如同C进行分析。IC₅₀表示tau(pSer³⁹⁶)磷酸化降低50％的AICAR浓度。^*相对于不作处理的而言p＜0.05。

发明概述

根据一个方面，本发明提供一种用于治疗进行性认知障碍的方法，该方法包括步骤：(a)将第一组合物施与需要其的受试者，该组合物包含：(i)调节磷酸化tau积聚的量的瘦蛋白组合物，或其可药用盐，和(ii)可药用载体(carrier)，以及(b)调节受试者脑脊液中磷酸化tau的积聚。根据该方法的一个实施方案，所述进行性认知障碍选自阿尔茨海默病，进行性核上性麻痹，痴呆，拳击员痴呆，克-雅综合征，额颞痴呆，皮克病和FTDP-17(帕金森综合征)皮质基底节变性。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物为瘦蛋白或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物为瘦蛋白模拟物或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物为瘦蛋白衍生物或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物为瘦蛋白激动剂或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述调节磷酸化tau积聚的量为约0.01mg/kg体重至约100mg/kg体重。根据另一个实施方案，所述第一组合物进一步包含第二治疗剂。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为抗生素，抗真菌剂，抗病毒剂，抗原虫剂，甾体抗炎剂，非甾体抗炎剂，抗氧化剂；激素；维生素；抗组胺剂和化疗剂中的至少一种。根据另一个实施方案，所述进行性障碍包含脑中神经原纤维缠结的积聚。

根据另一个方面，本发明提供了用于在需要其的受试者中改善认知功能复原的方法，该方法包括步骤：(a)向受试者施用一种组合物，该组合物包含：(i)认知功能增强量的瘦蛋白组合物，和(ii)可药用载体；以及(b)调节受试者脑脊液中磷酸化tau的积聚。根据该方法的一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白衍生物，AMP依赖性蛋白激酶激活物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白阻滞剂，瘦蛋白阻滞剂的模拟物，瘦蛋白拮抗剂，AMP依赖性蛋白激酶抑制物；或其可药用盐中的至少一种。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物进一步包含第二治疗剂。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为抗生素，抗真菌剂，抗病毒剂，抗原虫剂，甾体抗炎剂，非甾体抗炎剂，抗氧化剂；激素；维生素；抗组胺剂和化疗剂中的至少一种。

具体实施方式

本发明涉及用于治疗或预防进行性认知障碍的方法和用于改善认知功能复原的方法。

根据一个方面，本发明提供用于治疗进行性认知障碍的方法，该方法包括步骤：(a)将第一组合物施与需要其的受试者，该组合物包含：(i)调节磷酸化tau积聚的量的瘦蛋白组合物，和(ii)可药用载体，以及(b)调节受试者脑脊液中磷酸化tau的积聚。

根据另一个方面，本发明提供用于预防进行性认知障碍进展的方法，该方法包括步骤：(a)将第一组合物施与需要其的受试者，该组合物包含：(i)调节磷酸化tau积聚的量的瘦蛋白组合物，和(ii)可药用载体，以及(b)调节受试者脑脊液中磷酸化tau的积聚。

根据一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白模拟物或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白衍生物或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白激动剂或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含AMP依赖性蛋白激酶激活物或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白阻滞剂的模拟物或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白拮抗剂或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含AMP依赖性蛋白激酶抑制物，或其可药用盐。

根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白衍生物，瘦蛋白激动剂，AMP依赖性蛋白激酶激活物，瘦蛋白阻滞剂的模拟物，瘦蛋白拮抗剂，AMP依赖性蛋白激酶抑制物；或其可药用盐中的至少一种。

本文所用的术语“治疗”指能够达到以下之一或者更多：(a)降低障碍的严重性；(b)限制治疗中的障碍的特征性症状的发展；(c)限制治疗中的障碍的特征性症状的恶化；(d)限制患者曾患的障碍复发；和(e)限制患者曾患的障碍的症状复发。

本文所用的术语“降低”指在有发展该疾病的风险的个体限制出现该障碍。

本文所用的术语“调节”指调节、改变、适应或调整到某一数值或比例。

本文所用的术语“疾病”或“障碍”指健康损伤或异常的机能状况。本文所用的术语“综合征”指表示某种疾病或病症的症状的形式。本文所用的术语“损伤”指由外物或力对身体结构或者功能的损害或伤害，它可以是物理的或化学的。本文所用的术语“病症”指各种健康状态，并用于包括由任何潜在机制或紊乱、伤害以及对健康组织和器官的促进作用引发的障碍或疾病。

进行性认知障碍包含但不限于，进行性核上性麻痹，痴呆，拳击员痴呆，AD，克-雅综合征，额颞痴呆，皮克病；其他tau-阳性病理，包括FTDP-17(帕金森综合征)皮质基底节变性；额颞叶变性(FTLD)；缺乏突出组织学的痴呆。

本文所用的术语“施用”指促成服用或分配，包括体内施用以及直接向离体(ex vivo)组织施用。通常，组合物可以以含有所需的常规无毒可药用载体、佐剂和运载体(vehicle)的剂量单位的制剂经口地、经颊地、肠胃外地、局部地、通过吸入或吹入(即，通过口或通过鼻吸入或吹入)、或直肠地全身施用，或者可以通过例如但不限于注射、植入、移植、局部应用或肠胃外地局部施用。

术语“受试者”或“个体”或“患者”可互换地用来指哺乳动物类动物物种的成员，其中所述哺乳动物类动物物种包括人类。

本文所用的短语“患有进行性认知疾病的受试者”指以进行性认知疾病相关的诊断性标记物和/或综合征表示的受试者。进行性认知疾病通常从患者病史、间接的亲属病史和临床观察，基于存在特征性神经学和神经心理学特征以及缺乏交替状况而被临床诊断。这些标准要求通过神经心理学试验证实存在认知损伤和疑似的痴呆综合征。先进的计算机断层成像(CT)医学影像术或核磁共振成像术(MRI)，和单光子发射计算机断层成像术(SPECT)或正电子发射断层成像术(PET)可以用于帮助排除其他脑病理或痴呆亚型。包括记忆力测试在内的智力机能评价能够进一步表征疾病的状况。对于确定性诊断，可能需要包括脑组织的显微镜检查在内的组织病理学证实。对于AD，8个认知区域通常最容易受损：记忆、语言、知觉技能、注意力、建设性能力、定向力、解决问题的能力和功能性能力。这些区域相当于美国精神病学会出版的《精神疾病诊断与统计手册》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)(DSM-IV-TR)列出的NINCDS-ADRDA阿尔茨海默病的标准(其全部内容通过引用的方式并入本文)。

有患进行性认知疾病风险的受试者是具有一个或多个发展为进行性认知疾病的潜在因素的个体。

需要其的受试者是指患有或者有患上进行性认知疾病风险的患者。

本文所用的术语“痴呆”指由于脑中损伤或疾病而引起的认知功能的减退或进行性减退，其中所述的减退或进行性减退超出了可能预期由正常老化引起的减退。术语“认知功能”指引起理解、感知、或者明白个体思想意识，及执行诸如思考、学习、判断、记忆、计算、控制运动功能等脑力任务的能力的智力过程。

术语“肽模拟物”指设计用于模拟或模仿肽的小蛋白质样链。肽模拟物可以包含能够模拟(意为模仿)或拮抗(意为中和或抵消)天然亲本肽的生物学作用的非肽结构元件。术语“瘦蛋白肽模拟物”和“瘦蛋白模拟物”在本文中可互换地用于指包含产生生物学效应的瘦蛋白的功能域的瘦蛋白衍生物。在化学领域，衍生物是指至少理论上可以由前体化合物形成的化合物。这些衍生物可以与另一个分子组合以产生或增强生物学效应。生物学效应可以包括但不限于，例如，调节受试者中的淀粉状肽水平；调节受试者中的tau磷酸化水平；降低受试者中的淀粉状肽水平；降低受试者中的tau 磷酸化水平，等等。

本文所用的术语“拮抗剂”指抵消另一种物质的效果的物质。本文所用的术语“激动剂”指能够激活受体以诱导全部或部分药理学反应的化学物质。本文所用的术语“阻滞剂”指抑制另一种物质的生理学作用的物质。

术语“瘦蛋白激动剂”指能够激活瘦蛋白受体和/或下游效应物，以及能够调节受试者中的淀粉状肽水平或tau磷酸化的化合物。这类效应物可以包括但不限于，例如AMP依赖性蛋白激酶(“AMPK”)和固醇调节元件结合蛋白(“SREBP”)。

瘦蛋白受体(OB-R)，I类细胞因子受体超家族的一个成员，由于可变剪接的结果具有至少6个同工型。本文所用的术语“同工型″指具有与另一个蛋白质相同的功能，但在序列上存在一些小区别的蛋白质形式。OB-R的所有同工型共有相同的胞外配体结合结构域。瘦蛋白的功能受体(OB-Rb)，b同工型，不仅在下丘脑中表达，在那里它调节能量动态平衡和神经内分泌功能，而且也在其他脑区域和周边区域表达，包括所有类型的天然免疫或适应性免疫细胞。全长b同工型(OB-Rb)缺乏内在的酪氨酸激酶活性，并参与几个下游信号转导途径。

术语一种或多种活性物质的“治疗有效量”，“有效量”，或者“药学有效量”可互换地用来指足以提供预期治疗益处的量。根据本发明，可以采用的活性物质的有效量通常为约0.01mg/kg体重至约100g/kg体重。然而，剂量水平取决于多种因素，包括损伤类型、年龄、体重、性别、患者的医学病症、病症的严重性、施用途径以及所用的具体活性物质。因此，剂量方案可以变化很大，但是能够由医师通过标准的方法常规地确定。另外，术语“治疗有效量”和“药学有效量”包括本发明组合物的预防或预防性量。在本发明的预防或预防性应用中，将药物组合物或药物以足够消除或降低疾病、障碍或病症的风险、减轻严重性、或延迟发作的量，施用到易于患上或者否则有危险患上由淀粉状肽积聚引起的疾病、障碍或病症的患者，其中所述的疾病、障碍或病症包括疾病、障碍或病症的生物化学、组织学和/或行为综合征及其并发症，以及在疾病、障碍或病症发展的期间出现的过渡性病理学表型。

本文所用的术语“调节磷酸化tau积聚的量”指调节tau蛋白磷酸化的瘦蛋白组合物的治疗有效量。调节磷酸化tau积聚的量包括本发明组合物的预防或预防性量。

本文所用的术语“增强认知功能的量”指与没有施用增强认知功能的量的组合物或物质的受试者相比，调节受试者感知、记忆、判断或推理的智力过程，以及因此增加、改善或提高受试者精神表现的瘦蛋白组合物的治疗有效量(即，施用剂量和频率)。

增强认知功能的量为约0.01mg/kg体重至约100g/kg体重。

根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约100g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约95g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约90g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约85g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约80g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约75g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约70g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约65g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约60g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约55g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约50g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约45g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约40g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约35g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约30g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约25g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约20g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约15g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约10g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约5g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约4g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约3g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约2g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约1g/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约500mg/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约250mg/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约100mg/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约50mg/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约25mg/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约10mg/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约5mg/kg体重。根据另一个实施方案，调节磷酸化tau积聚的量是从约0.01mg/kg体重至约1mg/kg体重。

本文所用的术语“治疗剂”指提供治疗效果的药物、分子、核酸、蛋白质、组合物或其他物质。本文所用的术语“活性”指本发明组合物起预期治疗效果的成分、组分或组成。术语“治疗剂”和“活性物质”在本文中可互换地使用。活性物质可以是治疗有效量的瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白衍生物，或瘦蛋白激动剂或其可药用盐中的至少一种。

本文所用的术语“治疗组分”指消除、降低或预防一定群体百分比中表现的特定疾病的进展的治疗有效剂量(即，施用剂量和频率)。常用治疗组分的一个例子是ED50，它描述对50％的群体中表现的特定疾病的治疗有效的具体剂量。

本文所用的术语“治疗效果”指认为是期望且有益的治疗结果。治疗效果可以直接或间接地包括阻止、减少或消除疾病表现。治疗效果也可以直接或间接地包括阻止、减少或消除疾病表现的进展。

本文所用的术语“药物”指治疗剂或用于疾病的预防、诊断、减轻、治疗或治愈的除食物之外的任何物质。

本文中所述的组合物是分离的分子。“分离的分子”是这样的分子，所述分子是基本上纯的且不含与该分子一起通常在自然界或体内***中发现的其他物质至实践的和适合预期用途的程度。特别地，组合物足够纯的且充分不含宿主细胞的其他生物学组分，从而可用于，例如生产药物制品或测序，如果组合物为核酸，肽，或多糖的话。由于在药物制品中组合物可以混合可药用载体，组合物可以仅占制品的较小重量百分比。虽然如此，组合物是基本上纯的，因为它已经从活的***中或者在合成期间可能相关的物质实质地分离。本文所用的术语“基本上纯的”指纯度为至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％纯，由分析方法测定。此类方法可以包括但不限于，例如FACS、HPLC、凝胶电泳，层析法等等。

瘦蛋白组合物和/或第一组合物可以与其他治疗剂组合，且可以局部施用。瘦蛋白组合物和/或第一组合物和其他治疗剂可以同时或依次施用。当同时施用其他治疗剂时，它们可以在同一或者分别的制剂中施用，但是是同时施用的。当其他治疗剂和抑制物的施用时间上分开时，其他治疗剂与另一种治疗剂和与瘦蛋白组合物和/或第一组合物依次施用。这些药物之间的施用时间间隔可以是数分钟或者更长。治疗剂可以是瘦蛋白拮抗剂，瘦蛋白阻滞剂，或它们的组合。

根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物和/或第一组合物进一步包含第二治疗剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗生素剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗真菌剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗病毒剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗原虫剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是甾体抗炎剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是非甾体抗炎剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗氧化剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是激素。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是维生素。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗组胺剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是化疗剂。

本文所用的术语“抗生素剂”指具有抑制细菌和其他微生物生长或将它们摧毁的能力的任何化学物质，主要用于治疗感染性疾病。抗生素剂的例子包括但不限于青霉素G；甲氧西林；萘夫西林；苯唑西林；氯唑西林；双氯西林；氨苄西林；阿莫西林；替卡西林；羧苄西林；美洛西林；阿洛西林；哌拉西林；亚胺培南；氨曲南；先锋霉素；头孢克洛；头孢西丁；头孢呋辛；头孢尼西；头孢美唑；头孢替坦；头孢丙烯；氯碳头孢；头孢他美；头孢哌酮；头孢噻肟；头孢唑肟；头孢三嗪；头孢他啶；头孢吡肟；头孢克肟；头孢泊肟；头孢磺啶；氟罗沙星；萘啶酸；诺氟沙星；环丙沙星；氧氟沙星；依诺沙星；洛美沙星；西诺沙星；多西环素；米诺环素；四环素；阿米卡星；庆大霉素；卡那霉素；奈替米星；妥布霉素；链霉素；阿奇霉素；克拉霉素；红霉素；依托红霉素；琥乙红霉素；葡萄庚酸红霉素；乳糖酸红霉素；硬脂酸红霉素；万古霉素；替考拉宁；氯霉素；克林霉素；甲氧苄啶；磺胺甲基异

唑；呋喃妥因；利福平；莫匹罗星；甲硝唑；头孢氨苄；罗红霉素；Co-amoxiclavuanate；哌拉西林和他唑巴坦的组合；以及它们的各种盐、酸、碱和其他衍生物。抗细菌的抗生素剂包括但不限于青霉素类，头孢菌素类，碳头孢烯类，头霉素类，碳青霉烯类，单环β-内酰胺类，氨基糖甙类，糖肽类，喹诺酮类，四环素类，大环内酯类和氟喹诺酮类。

本文所用的术语“抗真菌剂”指具有抑制真菌生长或将它们摧毁的能力的任何化学物质。抗真菌剂包括但不限于两性霉素B，克念菌素，制皮菌素，非律平，制霉色基素，曲古霉素，哈霉素，光明霉素，美帕曲星，纳他霉素，制霉菌素，培西洛星，培里霉素，偶氮丝氨酸，灰黄霉素，寡霉素，新霉素，硝吡咯菌素，西卡宁，杀结核菌素，绿毛菌素，布替萘芬，萘替芬，特比萘芬，联苯苄唑，布康唑，氯登妥因，氯米达唑，氯康唑，克霉唑，益康唑，恩康唑，芬替康唑，氟曲马唑，异康唑，酮康唑，拉诺康唑，咪康唑，奥莫康唑，奥昔康唑，舍他康唑，硫康唑，噻康唑，托西拉酯，托林达酯，托萘酯，Fluconawle，伊曲康唑，沙康唑，特康唑，吖啶琐辛，阿莫罗芬，珍尼柳酯，溴柳氯苯胺，丁氯柳胺，丙酸钙，氯苯甘醚，环吡酮，氯羟喹，艾索帕尔(Coparaffinate)，地马唑，依沙酰胺，氟胞嘧啶，哈利他唑，海克替啶，氯氟卡班，硝呋太尔，碘化钾，丙酸，羟基吡啶硫酮，水杨苯胺，丙酸钠，舒苯汀，替诺尼唑，三醋汀，苄硫噻二嗪乙酸(Ujothion)，十一烯酸和丙酸锌。

本文所用的术语“抗病毒剂”指具有抑制病毒复制或将它们摧毁的能力的任何化学物质，主要用于治疗病毒性疾病。抗病毒剂包括但不限于，阿昔洛韦，西多福韦，阿糖胞苷，双脱氧腺苷，去羟肌苷，依度尿苷，泛昔洛韦，氟尿苷，更昔洛韦，碘苷，异丙肌苷，拉米夫定，MADU，喷昔洛韦，索立夫定，司他夫定，曲氟尿苷，伐昔洛韦，阿糖腺苷，扎西他滨，醋孟南，乙酰亮氨酸，金刚烷胺，脒霉素，地拉韦啶，膦甲酸，茚地那韦，干扰素(例如，IFN-α)，凯托沙，溶菌酶，美替沙腙，吗啉胍，奈韦拉平，鬼臼毒素，利巴韦林，金刚乙胺，利托那韦2，沙奎那韦，Stailimycin，维司托隆(Statolon)，曲金刚胺，齐多夫定(AZT)和珍那佐酸。

本文所用的术语“抗原虫剂”指具有抑制原虫生长或将它们摧毁的能力的任何化学物质，主要用于治疗原虫性疾病。抗原虫剂的例子包括但不限于乙胺嘧啶磺胺嘧啶和甲酰四氢叶酸。

本文所用的“甾体抗炎剂”指含有17-碳-4-环***的许多化合物中的任一种化合物，包括固醇，各种激素(例如促蛋白合成甾类)和糖苷。甾体抗炎剂代表性的例子包括但不限于皮质类固醇，例如氢化可的松，羟基曲安西龙(hydroxyltriamcinolone)，α甲基***，***磷酸盐，二丙酸倍氯米松，戊酸氯倍他索(clobetasol valerate)，***，去羟米松，醋酸去氧皮质酮，***，醋酸双氟拉松，双氟可龙戊酸酯，氟氢缩松(fluadrenolone)，氟氯奈德(fluclorolone acetonide)，氟氢可的松，双氟美松叔戊酸酯(flumethasone pivalate)，氟轻松(fluosinolone acetonide)，肤轻松，氟可丁酯(flucortine butylester)，氟可龙，醋酸氟泼尼定(fluprednylidene)，氟氢缩松(flurandrenolone)，哈西奈德，醋酸氢化可的松，丁酸氢化可的松，甲泼尼龙(methylprednisolone)，曲安奈德(triamcinolone acetonide)，可的松，可托多松(cortodoxone)，flucetonide，氟雄诺龙(fluradrenolone)，丙酮化氟雄诺龙(fluradrenolone acetonide)，甲羟松，安西缩松(amcinafel)，安西非特(amcinafide)，倍他米松及其酯的平衡，氯***，醋酸氯***，氯可特龙(clocortelone)，clescinolone，二氯松(dichlorisone)，二氟泼尼酯(diflurprednate)，氟氯奈德，氟尼缩松，氟米龙，氟培龙，氟泼尼龙，戊酸氢化可的松，环戊丙酸氢化可的松，氢可他酯，甲***，帕拉米松，氢化波尼松，强的松，二丙酸倍氯米松，曲安西龙，以及它们的混合物。

“非甾体抗炎剂”指一大组作用类似阿司匹林的物质，包括布洛芬(Advil)

萘普生钠(Aleve)和对乙酰氨基酚(Tylenol)

可用于本发明的其他非甾体抗炎剂的例子包括但不限于，昔康类(oxicams)，例如吡罗昔康，伊索昔康，替诺昔康，舒多昔康和CP-14,304；双水杨酯，扑炎痛，三水杨酸胆碱镁，痛热宁(safapryn)，阿司匹林(solprin)，二氟尼柳和芬度柳；醋酸衍生物，例如双氯芬酸，芬氯酸，吲哚美辛，舒林酸，托美丁，伊索克酸，呋罗芬酸，硫平酸，齐多美辛，阿西美辛，芬替酸，佐美酸，clindanac，奥昔平酸，联苯乙酸和酮咯酸；芬那酸类，例如甲芬那酸，甲氯芬那酸，氟芬那酸，尼氟酸和托芬那酸；丙酸衍生物，例如布洛芬，萘普生，苯

洛芬，氟比洛芬，酮洛芬，非诺洛芬，芬布芬，吲哚布洛芬，吡洛芬，卡洛芬，奥沙普秦，普拉洛芬，咪洛芬，硫

洛芬，舒洛芬，阿明洛芬和噻洛芬酸；吡唑类，例如保泰松，羟布宗，非普拉宗，阿扎丙宗和三甲保泰松(trimethazone)。也可以使用这些非甾体抗炎剂的混合物，以及皮肤病可用的盐和这些物质的酯类。例如，依托芬那酯，一种氟芬那酸衍生物，对局部施用特别有用。

本文所用的“抗氧化剂”指抑制氧化作用或者由氧或过氧化物促进的反应的物质。可用于本发明上下文中的抗氧化剂的非限制性例子包括抗坏血酸(维生素C)及其盐，脂肪酸的抗坏血酸酯，抗坏血酸衍生物(例如，抗坏血酸磷酸酯镁，抗坏血酸磷酸酯钠，抗坏血酸山梨酸酯)，生育酚(维生素E)，生育酚山梨酸酯，生育酚醋酸酯，生育酚的其他酯类，丁基化羟基苯甲酸以及它们的盐，6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(可从市场购买，商品名TroloxR)，五倍子酸及其烷基酯，特别是五倍子酸丙酯，尿酸及其盐和烷基酯，山梨酸及其盐，硫辛酸，胺类(例如，N，N-二乙基羟胺，氨基胍)，巯基化合物(例如，谷胱甘肽)，二羟基富马酸及其盐，甘氨酸吡酮酸盐(glycine pidolate)，精氨酸吡酮酸盐(arginine pilolate)，去甲二氢愈创木酸，生物类黄酮，姜黄素，赖氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸，超氧化物歧化酶，水飞蓟素，茶提取物，葡萄皮/籽提取物，黑色素和迷迭香提取物。

“化疗剂”指用于治疗或控制疾病的化学品。可用于本发明上下文中的化疗剂的非限制性例子包括正定霉素，阿霉素，伊达比星，氨柔比星，吡柔比星，表柔比星，米托蒽醌，依托泊苷，替尼泊苷，长春碱，长春新碱，丝裂霉素C，5-FU，紫杉醇，多烯紫杉醇，放线菌素D，秋水仙碱，拓扑替康，伊立替康，吉西他滨，环孢菌素，维拉帕米，valspodor，丙磺舒，MK571，GF120918，LY335979，比立考达(biricodar)，特非那定，奎尼丁，pervilleine A和XR9576。

本文所用的“抗组胺剂”指多种能够对抗体内的组胺并用于治疗过敏反应(例如枯草热)和感冒症状(cold symptom)的化合物中的任一种化合物。可用于本发明上下文中的抗组胺剂的非限制性例子包括扑尔敏，溴苯那敏，右氯苯那敏，曲普利啶(tripolidine)，氯马斯汀，苯海拉明，异丙嗪，哌嗪类，哌啶类，阿司咪唑，氯雷他定(loratadine)和特非那定(terfenadine)。

本文中所用的“维生素”指对大部分动物的营养来说以小量必需的多种有机物中的任一种有机物，尤其是作为新陈代谢过程的调节中的辅酶和辅酶的前体发挥作用。可用于本发明上下文中的维生素的非限制性例子包括维生素A及其类似物和衍生物：视黄醇，视黄醛，棕榈酸视黄酯，视黄酸，维A酸，异维A酸(通称为类视黄醇)，维生素E(生育酚及其衍生物)，维生素C(L-抗坏血酸及其酯和其他衍生物)，维生素B₃(烟酰胺及其衍生物)，α羟基酸(例如乙醇酸，乳酸，酒石酸，苹果酸，柠檬酸等)和β羟基酸(例如水杨酸等)。

本文所用的“激素”指由身体器官产生、通过血液输送来激发其他部位的活性的天然物质，或它们的合成类似物。可用于本发明上下文中的合适的激素包括但不限于由神经分泌细胞产生的任一种激素，包括***释放激素(GnRH)，促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)，促甲状腺素释放激素(TRH)，催乳素抑制激素(多巴胺)和食欲素(下丘脑分泌素)，以及重组激素，所述重组激素指通过使用经设计以含有通常不在一起出现的序列的DNA和将该DNA引入宿主细胞的方法产生的激素。

神经原纤维缠结(“NFT”)通常指微管相关蛋白“tau”的聚集物，微管相关蛋白“tau”变得高度磷酸化并在细胞本身的内部积聚。

根据一个实施方案，所述进行性认知障碍包含脑中神经原纤维缠结的积聚。根据另一个实施方案，所述进行性认知障碍为阿尔茨海默病。根据另一个实施方案，所述进行性认知障碍为进行性核上性麻痹。根据另一个实施方案，所述进行性认知障碍为痴呆。根据另一个实施方案，进行性认知障碍为拳击员痴呆。根据另一个实施方案，所述进行性认知障碍为克-雅综合征。根据另一个实施方案，所述进行性认知障碍为额颞痴呆。根据另一个实施方案，所述进行性认知障碍为皮克病。根据另一个实施方案，所述进行性认知障碍为FTDP-17(帕金森综合征)皮质基底节变性。根据另一个方面，本发明提供一种用于在需要其的受试者中改善认知功能复原的方法，该方法包括步骤：(a)向受试者施用组合物，该组合物包含：(i)认知功能增强量的瘦蛋白组合物，和(ii)可药用载体；以及(b)调节受试者脑脊液中磷酸化tau的积聚。

本文所用的术语“复原”指在生病、病症、疾病、综合征或障碍之后或期间返回到最初形态、位置或者功能的能力。

根据该方法的一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白模拟物或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白衍生物或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含AMP依赖性蛋白激酶激活物或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白激动剂或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白阻滞剂或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白阻滞剂的模拟物或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白拮抗剂或其可药用盐。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含AMP依赖性蛋白激酶抑制物。

根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物进一步包含第二治疗剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗生素。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗真菌剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗病毒剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗原虫剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是非甾体抗炎剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗氧化剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是甾体抗炎剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是激素。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是维生素。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗组胺剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是化疗剂。

组合物

组合物以治疗有效量施用。结合这里提供的教导，通过从各种活性化合物和权重因素例如功效，相对生物利用度，患者体重，不利副作用的严重性和优选施用方式中进行选择，可以设计出不会引起相当大毒性但仍对治疗特定受试者有效的预防性或治疗性处理方案。任何特定应用的有效量根据如所治疗的疾病或病症、施用的具体治疗活性瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白衍生肽，瘦蛋白阻滞剂和/或瘦蛋白拮抗剂或其组合，受试者的体积大小，或者疾病或病症的严重性等因素而变化。本领域的技术人员可以经验性地确定具体瘦蛋白组合物和/或其他治疗剂的有效量，而无须过度实验。通常优选使用最大剂量，也就是根据一些医学判断的最高安全剂量。“剂量(dose)”和“剂量(dosage)”在本文中可互换地使用。

对于本文中所描述的任何化合物，治疗有效量最初可以从初步体外研究和/或动物模型确定。对于已经在人体中经过测试的治疗活性瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白衍生肽，瘦蛋白阻滞剂和/或瘦蛋白拮抗剂或其组合，以及对于已知表现出类似药学活性的化合物，例如其他有关活性物质，治疗有效剂量也可以从人体数据确定。应用剂量可以根据施用的化合物或组合物的相对生物利用度和功效调整。根据上述方法和本领域公知的其他方法将剂量调整到最高功效完全在本领域技术人员的能力之内。

第一组合物，瘦蛋白组合物，治疗活性瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白衍生肽，瘦蛋白阻滞剂和/或瘦蛋白拮抗剂或其组合的制剂可以以可药用的溶液施用，其可以常规地含有可药用浓度的盐，缓冲剂，防腐剂，相容性载体，辅料和任选的其他治疗成分。

对于治疗应用，第一组合物和/或瘦蛋白组合物，治疗活性瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白衍生肽，瘦蛋白阻滞剂和/或瘦蛋白拮抗剂或其组合的有效量可以通过任何将瘦蛋白组合物和/或第一组合物递送到期望的表面的方式施用到受试者。可以采用任何本领域技术人员已知的方法实现施用药物组合物。施用途径包括但不限于鞘内施用，动脉内施用，肠胃外施用(例如，静脉内施用)，或肌内施用，经口施用，经颊施用，经鼻施用，直肠施用，或局部施用。

抑制物和其他治疗剂可以在治疗潜在疾病或副作用例如蛛网膜下腔出血或外周血管痉挛的手术期间，或在动脉内操作期间，递送到受试者。

口服组合物

本发明的组合物可以是适合于口服的形式，例如，片剂，糖锭剂，锭剂，水性或油性混悬剂，可分散的粉末或颗粒，乳剂，硬胶囊或软胶囊或糖浆或酏剂。本文所用的术语“经口”指经口腔引入体内，由此在身体的如下一个或多个区域发生吸收：口腔，胃部，小肠，肺(也被明确称为吸入)，和舌下的小血管(也被明确称为舌下施用)。口服组合物可以根据任何已知的方法制备，这类组合物可以包含选自甜味剂，调味剂，着色剂和防腐剂中的一种或多种，以提供药学上美观可口的制剂。片剂可以包含有效成分并混合有适于片剂制造的无毒可药用赋形剂。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂，例如碳酸钙，碳酸钠，乳糖，磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如，玉米淀粉或海藻酸；粘结剂，例如，淀粉，明胶或阿位伯胶树；以及润滑剂，例如，硬脂酸镁，硬脂酸或滑石。片剂可以未包衣或可以采用已知方法包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并因此在较长时间段内提供持续的作用。例如，可以采用如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯等时延材料。也可以将它们包衣用于受控释放。

本发明的组合物也可以制成口服硬明胶胶囊，其中有效成分与惰性固体稀释剂混合，所述惰性固体稀释剂例如碳酸钙，磷酸钙或高岭土，或软明胶胶囊，其中有效成分与水或油类介质混合，所述油类介质例如花生油，液体石蜡或橄榄油。

本发明的组合物可以配制为水性混悬剂，其中有效成分与适用于制造水性混悬剂的赋形剂混合。这类赋形剂为助悬剂，例如，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，海藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，黄芪胶和***胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂或环氧烷烃与脂肪酸的缩聚产物，例如，聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩聚产物，例如，十七乙基-十六烷氧烯醇(heptadecaethyl-eneoxycetanol)，或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇获得的偏酯的缩聚产物，例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酐获得的偏酯的缩聚产物，例如，聚乙烯失水山梨糖醇酐单油酸酯。水质混悬剂也可以含有一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，以及一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。

本发明的组合物可以通过将有效成分混悬在植物油中，例如花生油，橄榄油，芝麻油或椰子油，或矿物油中，例如液体石蜡，配制为油性混悬剂。油性混悬剂可以含有增稠剂，例如，蜂蜡，硬石蜡或十六醇。可以加入如上面所述的那些甜味剂，以及调味剂来提供可口的口服制剂。可以通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸来保存这些组合物。

本发明的组合物可以制剂成适于通过加入水配制成水性混悬剂的可分散粉末和颗粒的形式。这类粉末和颗粒中的有效成分中与分散剂或润湿剂、助悬剂及一种或多种防腐剂混合。合适的分散剂或润湿剂和助悬剂用上面已经提到的那些进行了举例说明。也可以包含另外的赋形剂，例如，甜味剂，调味剂和着色剂。

本发明的组合物也可以为乳剂形式。乳剂为两相体系，通过混合两种不相溶的液体载体制备，其中一种均一地分散于另一种中，并由直径等于或大于最大胶粒直径的微球组成。微球尺寸非常关键，其必须使得体系能够达到最大稳定性。通常，如果没有第三种物质即乳化剂的掺入，将不会出现两相的分离。因此，基本的乳剂含有至少三种组分，两种不相溶液体载体和乳化剂，以及有效成分。大部分乳剂是将水相混入非水相中(或者反之亦然)。然而，制备基本上非水性的乳剂是可能的，例如，甘油和橄榄油非水性不相溶体系的阴离子和阳离子表面活性剂。因此，本发明的组合物可以是水包油乳剂的形式。油相可以为植物油，例如，橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡，或其混合物。合适的乳化剂可以为天然存在的树胶，例如，***胶或黄芪胶，天然存在的磷脂，例如大豆磷脂，卵磷脂，和从脂肪酸和己糖醇酐获得的酯类或偏酯，例如失水山梨糖醇酐单油酸酯，以及偏酯与环氧乙烷的缩聚产物，例如，聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。乳剂也可以含有甜味剂和调味剂。

本发明的组合物也可以制剂成糖浆和酏剂。糖浆和酏剂的配制也使用甜味剂，例如，甘油，丙二醇，山梨醇或蔗糖。这类制剂还可以含有缓和剂，防腐剂，和调味剂及着色剂。缓和剂是主要用于减缓刺激，尤其是粘膜或擦伤的(意指划伤或切伤的)组织的保护剂。许多化学物质具有缓和剂性能。这些物质包括藻酸盐，粘液质，树胶，糊精，淀粉，某些糖类，和聚多羟基乙二醇。其他物质包括阿位伯胶树，琼脂，安息香，卡波姆，明胶，甘油，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，丙二醇，海藻酸钠，黄芪胶，水凝胶等等。

颊含组合物(buccalcomposition)

对于颊含施用，本发明的组合物可以采取由常规方法制剂的片剂或锭剂形式。

肠胃外组合物

本发明的组合物可以为注射用无菌水性或油性混悬剂的形式。本文所用的术语“肠胃外”指通过注射的方法引入体内(即，注射施用)，包括，例如，皮下注射(即，注射到皮肤之下)，肌内注射(即，注射入肌肉内)；静脉内注射(即，注射入静脉内)，鞘内注射(即，注射入脊髓周围的空间)，胸骨内(intrasternal)注射，或输注。本发明的肠胃外施用组合物使用针递送，例如，外科针。本文所用的术语“外科针”指任何适合于将本发明的液体(即，能够流动)组合物递送入所选择的解剖结构的针。可注射制备物，例如注射用无菌水性或油性混悬剂，可以用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂根据已知技术配制。

当希望局部递送时，可以将第一组合物和/或瘦蛋白组合物，治疗活性瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白衍生肽，瘦蛋白阻滞剂和/或瘦蛋白拮抗剂配制成能够通过注射进行肠胃外施用的形式，例如，弹丸式注射(bolus injection)或持续输注。注射剂可以为单位剂量形式，例如，装入安瓿或多剂量容器，并加入防腐剂。组合物可以采用如油性或水性运载体中的混悬剂，溶液或乳剂形式，并可以含有配方剂例如助悬剂，稳定剂和/或分散剂。肠胃外施用的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的混悬剂可以制备成适当的油性注射混悬剂。合适的亲油性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯，或脂质体。水性注射混悬剂可以含有增加混悬剂粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨醇，或葡聚糖。任选地，混悬剂还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解性的物质以允许制备高浓度溶液。可选地，活性化合物可以为粉末形式，用于在使用前用合适的运载体例如无菌无热原水构建。

药物组合物也可以包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这类载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙，磷酸钙，各种糖类，淀粉，纤维素衍生物，明胶和聚合物，例如聚乙二醇。

合适的液体或固体药物制品形式为，例如，微胶囊化的，以及根据需要，具有一种或多种赋形剂，螺旋形式的(encochleated)，涂覆到显微金粒子上，包含在脂质体中，用于植入组织的丸或在对象上干燥以擦入组织。这类药物组合物也可以为颗粒，珠，粉末，片剂，包衣片剂，(微)胶囊，栓剂，糖浆，乳剂，混悬剂，霜剂，滴剂或活性化合物延缓释放的制剂，在制剂中如上所述通常使用赋形剂和添加剂和/或辅料，例如崩解剂，粘合剂，包覆剂，膨胀剂，润滑剂，或增溶剂。药物组合物适合于多种药物递送***中的应用。关于药物递送方法的简要综述，参见Langer 1990Science249，1527-1533，通过引用的方式并入本文。

第一组合物和/或瘦蛋白组合物，治疗活性瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白衍生肽，瘦蛋白阻滞剂和/或瘦蛋白拮抗剂或其组合和任选的其他治疗剂可以本身(净的)或以可药用盐的形式施用。其他治疗剂可以包括但不限于，抗生素剂，抗真菌剂，抗病毒剂，抗原虫剂，甾体抗炎剂，非甾体抗炎剂，抗氧化剂，激素，维生素，抗组胺剂，化疗剂，或它们的组合。当用于药物中时，盐应当是可药用的，但是不可药用盐可以方便地用于制备其可药用盐。这类盐包括但不限于那些从以下酸制备的盐：盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，马来酸，醋酸，水杨酸，对甲苯磺酸，酒石酸，柠檬酸，甲磺酸，蚁酸，丙二酸，琥珀酸，萘-2-磺酸和苯磺酸。这类盐也可以制备为碱金属盐或碱土盐，例如羧酸的钠盐、钾盐或钙盐。“可药用盐”指这些盐，在合理的医学判断范围内，适合于与人类和低等动物的组织接触的应用，无异常毒性，刺激性，过敏反应等等，并具有合理的益处/风险比。可药用盐在本领域是公知的。例如，P.H.Stahl等在“Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use(Wiley VCH，Zurich，Switzerland：2002)”中对可药用盐进行了详细描述。这些盐可以在本发明描述的化合物的最后的分离和纯化期间原位制备，或者通过使游离的碱官能团与合适的有机酸反应而单独制备。代表性的酸加成盐包括但不限于，醋酸盐，己二酸盐，藻酸盐，柠檬酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，二葡糖酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，延胡索酸盐，盐酸盐，溴酸盐，碘酸盐，2-羟基乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)，乳酸盐，马来酸盐，甲磺酸盐，烟酸盐，2-萘磺酸盐，草酸盐，双羟萘酸盐(pamoate)，果胶盐，过硫酸盐，3-苯丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，磷酸盐，谷氨酸盐，重碳酸盐，对甲苯磺酸盐和十一酸盐。另外，碱性含氮基团可以用这类物质季铵化，所述这类物质如低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和十八烷基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，例如苯甲基和苯乙基溴化物及其他。由此可以获得水溶性或油溶性或可分散的产物。可以用来形成可药用酸加成盐的酸的例子包括如盐酸，氢溴酸，硫酸和磷酸等这类无机酸，以及如草酸，马来酸，琥珀酸和柠檬酸等这类有机酸。碱加成盐可以在本发明描述的化合物的最后的分离和纯化过程中，通过使含有羧酸的部分与合适的碱如可药用金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或重碳酸盐等或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应而原位制备。可药用盐包括但不限于，基于碱金属或碱土金属的阳离子，例如锂盐，钠盐，钾盐，钙盐，镁盐和铝盐等等，以及无毒的季铵和胺阳离子，包括铵，四甲铵，四乙铵，甲胺，二甲胺，三甲胺，三乙胺，二乙胺，乙胺等等。用于形成碱加成盐的其他代表性有机胺包括乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺，哌啶，哌嗪等等。可药用盐也可以采用本领域公知的标准方法获得，例如通过使十分碱性的化合物例如胺与提供生理学上可接受的阴离子的合适酸反应。也可以制备羧酸的碱金属(例如，钠，钾或锂)盐或碱土金属(例如钙或镁)盐。

制剂可以方便地为单位剂量形式，并可以采用制药领域公知的任何方法制备。所有方法均包括使瘦蛋白组合物，治疗活性瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白衍生肽，瘦蛋白阻滞剂和/或瘦蛋白拮抗剂或其组合，或可药用盐或其溶剂化物(“活性化合物”)与由一种或多种辅剂组成的载体混合的步骤。通常，通过将活性物质与液体载体或精细分散的固体载体或与这两者均一充分地混合来制备制剂，随后，如果需要，可将产品成形为需要的制剂。

药剂或其可药用的酯、盐、溶剂化物或药物前体可以与不消弱期望作用的其他活性物质，或与补充期望作用的物质混合。用于肠胃外、皮内、皮下、鞘内或局部施用的溶液或混悬剂可以包括但不限于，例如，如下组分：无菌稀释液，例如，注射水，盐溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他合成溶剂；抗菌药，例如苯甲醇或甲基对羟基苯甲酸酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如醋酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节紧张性的物质，例如，氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以装入由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多剂量小瓶中。静脉内施用的特定载体为生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)。

用于肠胃外注射的药物组合物包含可药用的无菌水性或非水性溶液，分散剂，混悬剂或乳剂和用于重构为注射用溶液或分散剂的无菌粉末。合适的水性和非水性载体，稀释剂，溶剂或运载体的例子包括水，乙醇，多元醇(丙二醇，聚乙二醇，甘油，等等)，它们的合适混合物，植物油(例如，橄榄油)和注射用有机酯，例如，油酸乙酯。可以例如通过采用包衣例如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持所需的粒径，和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

这些组合物也可以含有辅助剂，包括防腐剂，润湿剂，乳化剂和分散剂。可以由多种抗菌剂和抗真菌剂例如，对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，等等确保防止微生物的作用。也可以希望包括等渗剂，例如，糖类，氯化钠等。注射用药物制剂的延长的吸收可以通过使用延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

除了活性化合物之外，混悬剂还可以含有助悬剂，例如，乙氧基化异十八烷醇，聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯，微晶纤维素，偏氢氧化铝，膨润土，琼脂-琼脂，黄芪胶，以及它们的混合物。

可注射贮库形式(depot form)通过在生物可降解聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微胶囊基质来制备。取决于药物对聚合物的比率，以及所用特定聚合物的本性，可以控制药物释放速度。这种长时间起作用的制剂可以用合适的聚合物或憎水材料(例如，在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂，或微溶衍生物例如微溶盐来配制。其他生物可降解聚合物的例子包括聚原酸酯和聚酸酐。可注射贮库制剂也可以通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中制备。

局部注射用制剂可以，例如，通过细菌截留过滤器过滤或通过掺入杀菌剂来灭菌，其中所述杀菌剂为无菌固体组合物形式，其可以在使用前溶于或分散在无菌水或其他无菌注射用介质中。注射剂，例如，注射用无菌水性或油性混悬剂可以根据已知技术采用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂配制。无菌注射剂还可以为无毒的肠胃外可接受稀释液或溶剂中的注射用无菌溶液、混悬剂或乳剂，例如1，3-丁二醇溶液。可以采用的可接受运载体和溶剂是水，林格液，U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，常规地使用无菌固定油或作为溶剂或悬浮介质。为了这一目的，可以使用任何刺激性低的固定油，包括合成的单酸甘油酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸也用于制备可注射药。

肠胃外(包括但不限于，皮下，皮内，肌内，静脉内，鞘内和关节内)施用制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其中可以含有使制剂与预定接受者的血液等渗的抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其中可以含有助悬剂和增稠剂。制剂可以装入单位剂量或多剂量容器中，例如密闭安瓿和小瓶，并可以储存在冷冻干燥(冻干)的条件中，仅需要在使用前即刻加入无菌液体载体，例如，盐水，注射水。可以由上述无菌粉末、颗粒和片剂制备当场使用的注射液和混悬剂。

另一个制剂本文中所述组合物的方法涉及使本文中所述的化合物缀合至增强水溶性的聚合物。合适的聚合物的例子包括但不限于聚乙二醇，聚-d-谷氨酸，聚-1-谷氨酸，聚-d-天门冬氨酸，聚-1-天门冬氨酸和它们的共聚物。可以使用分子量在约5,000和约100,000之间，以及分子量在约20,000和约80,000之间的聚谷氨酸，也可以使用分子量在约30,000和约60,000之间的聚谷氨酸。

合适的缓冲剂包括：醋酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)；以及磷酸和盐(0.8-2％w/v)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)和乙基汞硫代水杨酸钠(0.004-0.02％w/v)。

治疗剂，包括瘦蛋白组合物，治疗活性瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白衍生肽，瘦蛋白阻滞剂和/或瘦蛋白拮抗剂或其组合，可以以粒子提供。本文所用的术语“粒子”指纳米粒子或微粒子(或者在一些情况下尺寸更大)，其可以全部或部分含有瘦蛋白组合物，治疗活性瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白衍生肽，瘦蛋白阻滞剂和/或瘦蛋白拮抗剂或其组合，或者如本文中所述的其他治疗剂，包括但不限于，抗生素剂，抗真菌剂，抗病毒剂，抗原虫剂，甾体抗炎剂，非甾体抗炎剂，抗氧化剂，激素，维生素，抗组胺剂，化疗剂，或其组合。粒子可以含有包裹于包衣的核中的治疗剂。治疗剂也可以分散于全部粒子。治疗剂也可以吸附入粒子中。粒子可以为任何级别的释放动力学，包括零级释放，一级释放，二级释放，延迟释放，持续释放，立即释放等等，以及它们的任何组合。除治疗剂之外，粒子还可以包括医药领域中常规使用的那些材料中的任一种材料，包括但不限于可蚀性，不可蚀性，生物可降解，或生物不可降解材料或其组合。粒子可以是在溶液中的或半固体态的含有瘦蛋白组合物，治疗活性瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白衍生肽，瘦蛋白阻滞剂和/或瘦蛋白拮抗剂或其组合的微胶囊。粒子实际上可以是任何形状。

生物不可降解和生物可降解聚合物材料都可以用在递送治疗剂的粒子的制造中。这种聚合物可以是天然或合成聚合物。根据需要的释放时间期间来选择聚合物。特别关注的生物粘附性聚合物包括如Sawhney等人在Macromolecules(1993)26，581-587中描述的生物可蚀性水凝胶，其中的教导合并入本文。这些包括聚透明质酸，酪蛋白，明胶，明胶蛋白，聚酸酐，聚丙烯酸，藻酸盐，壳聚糖，聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸乙酯，聚甲基丙烯酸丁酯，聚甲基丙烯酸异丁酯，聚甲基丙烯酸己酯，聚甲基丙烯酸异癸酯，聚甲基丙烯酸月桂酯，聚甲基丙烯酸苯酯，聚丙烯酸甲酯，聚丙烯酸异丙酯，聚丙烯酸异丁酯和聚丙烯酸十八酯。

吹入组合物

本发明的组合物可以是用于吸入或吹入施用(通过口或通过鼻)递送的可分散干燥粉末形式。干燥粉末组合物可以采用本领域已知的工艺制备，例如，如WO 91/16038号国际专利公开和6,921,527号美国专利中披露的冻干法和喷射研磨法，其所公开的内容通过引用的方式并入本文。例如，喷雾干燥是一种这样的工艺，其中，通过喷嘴(例如，双液体喷嘴)、旋转盘或等同的装置将药物和载体的均匀水混和物引入到热气流中，以使溶液雾化形成微细液滴。水混和物可以是溶液，悬浊液，浆料等等，但是需要均一以确保组分在混合物和最终的粉末组合物中均匀分布。溶剂，通常是水，从液滴迅速蒸发，产生粒子直径约为1μm至5μm的干燥粉末。喷雾干燥在导致产生组成基本均匀的无定形粉末的条件下进行，该无定形粉末具有可吸入粒径，较低的含湿量，以及允许容易雾化的流动特性。优选地，得到的粉末中粒径约为10μm或者更小的粒子超过约98％质量，且粒径约小于5μm的粒子约90％质量。可选地，约95％质量为粒径小于10μm的粒子，且粒径小于5μm的粒子约80％质量。干燥粉末组合物也可以通过冻干法和喷射研磨法制备，如WO 91/16038号国际专利公开所披露的，其中所公开的内容通过引用的方式并入本文。

术语“可分散性”或“可分散的”是指含湿量小于约10％重量(％w)的水，通常低于约5％w，和优选小于约3％w；粒径约1.0-5.0μm质量中值直径(MMD)，通常为1.0-4.0μm MMD，和优选地1.0-3.0μmMMD；递送剂量约＞30％，通常＞40％，优选地＞50％，最优选地＞60％；以及气溶胶粒径分布约为1.0-5.0μm质量中值空气动力学直径(MMAD)，通常为1.5-4.5μm MMAD，和优选地1.5-4.0μm MMAD的干燥粉末。1995年4月14日提出的美国申请序列号08/423,568披露了用于改善可分散性的方法和组合物，其中所公开的内容通过引用的方式并入本文。

术语“粉末”指由精细分散的固体粒子组成的组合物，所述固体粒子是自由流动的并能够容易地分散在吸入装置中，随后由受试者吸入，从而粒子到达肺部，渗透进肺泡。因此，粉末被认为是“可吸入的”。优选平均粒径为小于约10微米(μm)，具有相对均匀的球形分布。更优选粒径为小于约7.5μm，最优选小于约5.0μm。通常，粒径分布在约0.1μm至约5μm之间，特别为约0.3μm至约5μm。

术语“干燥”指组合物具有的含湿量能够使粒子容易地分散在吸入装置中形成气溶胶。该含湿量一般低于约10％重量(％w)的水，通常低于约5％w，和优选小于约3％w。

可药用载体的量是提供必需的稳定性、可分散性、一致性和体积特性以确保将组合物均匀地递送到需要其的受试者肺部所需要的量。用数字表示，该量可以为约0.05％w至约99.95％w，取决于所用药物的活性。优选使用约5％w至约95％。载体可以是一种或两种或更多种药用赋形剂的组合，但通常基本上不含任何“渗透促进剂”。“渗透促进剂为促进药物穿过粘膜或衬，并提议用于鼻内，直肠内和***内药物制剂的表面活性化合物。示例性的渗透促进剂包括胆盐，例如，牛磺胆酸盐，甘胆酸盐和脱氧胆酸盐；夫西地酸盐(fusidates)，例如，牛磺脱氢夫西地酸盐(taurodehydrofusidate)；和生物相容性去垢剂，例如，吐温，Laureth-9，等等。然而，渗透促进剂在用于肺部的制剂中的使用通常是不希望的，因为这种表面活性化合物会对肺上皮血液屏障产生不利影响。本发明的干燥粉末组合物无需使用渗透促进剂就能够容易地吸收到肺中。

用作肺部递送载体的药用赋形剂的类型包括稳定剂，例如人血清白蛋白(HSA)，填充剂，例如，碳水化合物，氨基酸和多肽；pH调节剂或缓冲剂；盐类，例如氯化钠；等等。这些载体可以是结晶或无定形形式或可以是两者的混合物。

对肺部递送特别有价值的填充剂包括相容性碳水化合物，多肽，氨基酸或其组合。合适的碳水化合物包括单糖，例如半乳糖，D-甘露糖，山梨糖，等等；二糖，例如乳糖，海藻糖，等等；环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精；和多糖，例如，棉子糖，麦芽糖糊精，葡聚糖，等等；糖醇，例如甘露醇，木糖醇，等等。优选的碳水化合物包括乳糖，海藻糖，棉子糖，麦芽糖糊精和甘露醇。合适的多肽包括天冬甜素。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，优选甘氨酸。

为了喷雾干燥过程中构象稳定性和为了改善粉末的可分散性，可以包括肺递送组合物的小组分的添加剂。这些添加剂包括憎水氨基酸，例如色氨酸，酪氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，等等。

对于吸入或吹入递送，本发明的组合物以足够为受试者提供单位剂量治疗的量装在合适的剂量容器中。剂量容器为装在合适的吸入装置中的剂量容器，以允许干燥粉末组合物通过分散入气流中雾化，形成气溶胶，随后将这样产生的气溶胶捕集在具有吹嘴的室内，所附的吹嘴用于需要治疗的受试者随后的吸入。这种剂量容器包括本领域已知的任何盛装组合物的容器，例如，带有允许将气流(例如，空气)导入容器以将干燥粉末组合物分散的可移动部的明胶或塑料胶囊。这类容器在4,227,522号美国专利；4,192,309号美国专利；以及4,105,027号美国专利中被举例说明。合适的容器也包括与Glaxo’s 

Rotohaler牌粉末吸入器或Fison’s

牌粉末吸入器组合使用的那些容器。另一种提供优异防潮性能的合适单位剂量容器由铝箔塑料层压板制成。药物基粉末以重量或体积计装入可成形箔的低压中，并用箔-塑料层压板覆盖物密封。这种与粉末吸入装置配合使用的容器在4,778,054号美国专利被描述，并与(4,627,432；4,811,731号美国专利；和5,035,237号美国专利)结合使用。所有这些文献通过引用的方式并入本文。

本发明的组合物可以以滴剂或喷雾剂(例如，鼻喷雾，气溶胶喷雾，或泵喷雾)或组合其他用于经鼻施用(鼻内递送)的运载体的形式使用。气溶胶喷雾剂可以装在压力容器中，具有合适的推进剂，例如，烃类推进剂。泵喷雾分配器可以分配具有特定粒径或小滴尺寸的定量剂量或剂量。可以布置任何分配装置来分配仅单一剂量或多剂量。更具体地，本发明的组合物，尤其是为鼻内施用配制的那些，也可以提供为溶液，混悬剂，或粘性组合物(例如，凝胶剂，洗剂，霜剂或膏剂)。

直肠组合物

本发明的组合物可以是组合物的用于直肠施用的栓剂形式。本文所用的术语“直肠的”或“直肠地”指通过直肠导入体内，在那里经由直肠壁发生吸收。这些组合物可以通过将药物与合适的无刺激性赋形剂，例如可可脂和聚乙二醇混合来制备，其中所述的赋形剂在常温下为固体，但是在直肠温度下为液体，因此在直肠中将会熔化，并释放出药物。当配制成栓剂时，本发明的组合物可以混合常规的粘合剂和载体，例如甘油三酸酯来配制。

局部组合物

术语“局部的”指本发明的组合物在应用点处或者紧挨应用点下方的施用。短语“局部应用”描述应用到一种或多种表面上，包括上皮表面。尽管与经皮施用相比，局部施用通常提供局部而非全身作用，如本文中所用，除非另外指出或显示，术语局部施用和经皮施用可互换地使用。为了该应用的目的，局部施用将包括漱液和含漱剂。

局部施用也可以包括经皮施用的使用，例如，可以根据本领域公知的方法和步骤制备的经皮施用贴剂或离子电渗疗法装置。术语“经皮递送***”、“经皮贴剂”或“贴剂”指放置在皮肤上的粘合体系，以递送随时间释放的药物剂量，药物从该剂型中经皮肤穿过，以使药物能经由全身循环而分布。经皮贴剂为用于递送多种药物的广为接受的技术，包括但不限于，用于晕动病的东莨菪碱，用于治疗心绞痛的***油，用于高血压的可乐定，用于绝经后适应症的***，和用于戒烟的尼古丁。

适用于本发明的贴剂包括但不限于，(1)基质贴剂；(2)储库型贴剂(reservoir patch)；(3)多层型药物在粘胶层的贴剂(multi-laminate drug-in-adhesive patch)；和(4)整体型药物在粘胶层的贴剂(monolithic drug-in-adhesive patch)；Transdermal and Topical Drug Delivery Systems，pp.249-297(Tapash K.Ghosh等人编著，1997)，在本文中通过引用的方式并入本文。这些贴剂在本领域中是公知的，通常可以从市场上购买到。

载体和其他成分

在一些实施方案中，本发明的组合物可以与赋形剂、运载体或载体来配制，其中所述赋形剂、运载体或载体选自溶剂、助悬剂、粘结剂、填充剂、润滑剂、崩解剂和润湿剂/表面活性剂/增溶剂。术语“赋形剂”、“运载体”或“载体”指当与活性化合物混合时，能有助于活性化合物的使用而不会与其发生有害反应的物质。术语“活性”指本发明的组合物起预期疗效的成分、组分或组成。载体必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使它们适用于被治疗的受试者。载体可以是惰性的，或它可以具有药学上的益处。

当与给定组合物的活性组分和其他组分组合时，载体可以是液体或固体，并根据头脑中计划的施用方式进行选择，以提供需要的体积和一致性等。典型的药用载体包括但不限于，粘结剂(包括但不限于，预胶化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(包括但不限于，乳糖和其他糖类，微晶纤维素，果胶，明胶，硫酸钙，乙基纤维素，聚丙烯酸盐或磷酸氢钙。)；润滑剂(包括但不限于，硬脂酸镁，滑石，硅石，胶态二氧化硅(sollidal silicon dioxide)，硬脂酸，硬脂酸金属盐，氢化植物油，玉米淀粉，聚乙二醇，苯甲酸钠，醋酸钠)；崩解剂(包括但不限于，淀粉，羟基乙酸淀粉钠)和润湿剂(包括但不限于，十二烷基硫酸钠)。其他可用于本发明组合物的合适的载体包括但不限于，水，盐溶液，醇，植物油，聚乙二醇，明胶，乳糖，直链淀粉，硬脂酸镁，滑石，硅酸，粘性石蜡，芳香油；单脂肪酸甘油酯和双脂肪酸甘油酯，petroethral脂肪酸酯(petroethral fatty acid esters)，羟甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，等等。药物制剂可以灭菌，如果需要可以混合有不与活性化合物起有害反应的助剂，例如，润滑剂，防腐剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，用于影响渗透压的盐类，缓冲剂，着色剂，调味剂和/或芳香物质等等。

本文所用的术语“可药用载体”指常规地对药物施用有用的任何基本无毒的载体，其中的活性组分将保持稳定和生物有效。在一些实施方案中，本发明组合物的可药用载体包括释放剂，例如，持续释放或延迟释放载体。在这样的实施方案中，载体可以是任何能够使瘦蛋白肽有效成分持续或延迟释放的材料，以提供更有效的施用，从而降低有效成分的施用频率和/或减少其剂量，易于处理，并延长或延缓作用。这类载体的非限制性例子包括天然和合成聚合物的脂质体，微海绵，微球，或微胶囊等等。脂质体可以从多种磷酯例如胆固醇，十八胺或磷脂酰胆碱制得。

在一些实施方案中，本发明的组合物可以进一步包括一种或多种相容的有效成分，目的在于除由瘦蛋白组合物，治疗活性瘦蛋白，瘦蛋白模拟物肽或它们的衍生物提供的药效之外，还为组合物提供另外的药效。本文所用的“相容的”是指，以普通使用条件下不存在明显会降低各有效成分或组合物的功效的相互作用的方式，这种组合物的有效成分可以相互组合。在本发明的另一个方面中，组合物也可以顺次地或与其他组合物联合施用来治疗由淀粉状肽积聚导致的疾病、病症或障碍。例如，不限制地，这样的其他组合物可以包括单克隆抗体(例如，单克隆抗β淀粉状肽和单克隆抗β分泌酶)；以及抗炎化合物(包括但不限于非甾体抗炎剂(NSAIDs)，例如布洛芬，吲哚美辛和氟比洛芬)。抗炎化合物已经在细胞培养物以及AD样淀粉状变性病的转基因模型中显示出引导降低Aβ的性能。

活性物质的浓度选择应使其发挥疗效，但是在本领域技术人员的知识范围和合理的判断内足够低以避免显著副作用。组合物的有效量可以随治疗中的生物受试者的年龄和身体状况，病症的严重性，治疗持续的时间，同步治疗的本性，所用的具体化合物、组合物或其他有效成分，所用的具体载体等因素变化。本领域的技术人员能够容易地评估这些因素并基于该信息，确定本发明组合物用于预期目的具体有效浓度。另外，在本发明的治疗应用中，将组合物或药物以足以治愈或至少部分阻止疾病、障碍或病症的量施用到疑似患上或已经患上或者已经承受着这种疾病、障碍或病症的患者，包括在疾病、障碍或病症发展中的并发症和过渡性病理学表型。在一些方法中，施用本发明的组合物减少或消除还没有发展为疾病、障碍或病症的特征病理的患者的认知损伤。

足够达到治疗性或预防性治疗的量在本文中定义为治疗有效剂量。在预防性和治疗性方案中，本发明组合物的量通常都以数个剂量施用直到达到足够有益的反应。典型地，对该反应进行监控，并且如果该反应开始衰退时给予重复剂量。通过确定以能引起一定作用强度的剂量单位的剂量(意指使用单位)，以下称作“单位剂量”，本领域的技术人员能够确定本发明组合物的药理有效量。术语“剂量-强度关系”指个体接受者体内作用强度与剂量相关的方式。作用强度通常指定为最大强度的50％。相应的剂量称为50％有效剂量或个体ED50。术语“个体”的使用是将在本文中所用的基于作用强度的ED50区别于从群体响应数据的频率确定的半数有效剂量，也简称ED50。本文所用的“功效”指本发明的组合物达到期望反应的性能，“最大功效”指最大可以达到的效果。对治疗特定障碍或病症有效的本发明组合物中的化合物用量取决于障碍或病症的本性，并能够采用标准的临床方法确定。(参见，例如，Goodman和Gilman的THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，Joel G.Harman，Lee E.Limbird，Eds.；McGraw Hill，New York，2001；THE PHYSICIAN’S DESK REFERENCE，Medical Economics Company，Inc.，Oradell，N.J.，1995；和DRUG FACTS AND COMPARISONS，FACTS AND COMPARISONS，INC.，St.Louis，Mo.，1993)。配方中待采用的精确剂量也取决于施用途径，以及疾病或障碍的严重性，应当根据医师的判断和每个患者的情况确定。各种施用模式对本领域的技术人员是显然的。

本发明组合物施用的剂量范围是足够产生期望疗效的那些范围。优选地，本发明组合物的治疗有效量为有规律地每天施用一次或多次。向受试者施用的典型剂量在约0.01mg组合物/kg(体重)/天至约0.5mg组合物/kg(体重)/天之间。例如，没有限制地，组合物的最小剂量确定为约0.01mg/kg/天，约0.025mg/kg/天，约0.05mg/kg/天，约0.075mg/kg/天，约0.08mg/kg/天，约0.1mg/kg/天，约0.125mg/kg/天，约0.15mg/kg/天，约0.175mg/kg/天，约0.2mg/kg/天，约0.225mg/kg/天，约0.25mg/kg/天，约0.275mg/kg/天，约0.3mg/kg/天，约0.325mg/kg/天，约0.35mg/kg/天，约0.375mg/kg/天，约0.4mg/kg/天，约0.45mg/kg/天，约0.475mg/kg/天，或约0.5mg/kg/天，最大剂量为确定为约0.5mg/kg/天，约0.475mg/kg/天，约0.45mg/kg/天，约0.4mg/kg/天，约0.375mg/kg/天，约0.35mg/kg/天，约0.325mg/kg/天，约0.3mg/kg/天，约0.275mg/kg/天，约0.25mg/kg/天，约0.225mg/kg/天，约0.2mg/kg/天，约0.175mg/kg/天，约0.15mg/kg/天，约0.125mg/kg/天，约0.1mg/kg/天，约0.08mg/kg/天，约0.075mg/kg/天，约0.05mg/kg/天，约0.025mg/kg/天，或约0.01mg/kg/天。在本发明在人体的一些实施方案中，剂量可以为约0.01mg至约0.3mg组合物/kg(体重)/天，以及在人体的其他实施方案中，在0.01至0.08mg组合物/kg(体重)/天之间。

本发明的其他组合物可以采用本领域已知的技术容易地制备，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences中所描述的技术，第18或19版，由宾夕法尼亚州伊士顿的Mack Publishing Company出版，通过引用的方式并入本文。

施用

根据本方法的另一个实施方案，该方法包括步骤：手术植入或注射瘦蛋白组合物凝胶，瘦蛋白组合物缓释固体或瘦蛋白组合物半固体到患者体内以将药物物质递送到目的部位。由于瘦蛋白组合物凝胶，瘦蛋白组合物缓释固体或瘦蛋白组合物半固体药物被特定地(局部地)递送到所述部位，治疗进行性认知障碍需要的剂量将会是适当的，从而减少、预防或避免阻止更高的全身剂量施用的主要副作用，例如，毒性。最好是将该药物的有效量递送到特定部位(无不想要的副作用)。

控释***

治疗剂包括但不限于瘦蛋白组合物，可以包含在控释***中。为了延长药物的作用，经常需要减缓由皮下、鞘内或肌内注射的药物的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体混悬剂实现。药物的吸收速度于是取决于其溶解速度，溶解速度反过来取决于晶体大小和晶型。

术语“控释”用来指任何含有药物的制剂，其中药物从制剂释放的方式和形态是受控的。这指速释和非速释制剂，非速释制剂包括但不限于，持续释放和延迟释放制剂。在本文中使用的术语“持续释放”(也称为“延迟释放”)常规意义上指提供药物在延长的时间期间逐渐释放的药物制剂，优选地，尽管不必需，在延长的时间期间产生基本上恒定的血药水平。可选地，肠胃外施用药物的延迟吸收通过将药物溶解或混悬在油运载体中实现。在本文中使用的术语“延迟释放”常规意义上指制剂的施用和从那里的药物释放之间具有时间延迟的药物制剂。“延迟释放”可以包括或不包括药物在延长的时间期间的逐渐释放，因此可以是或可以不是“持续释放”。

使用长期持续释放植入物可以特别适合于治疗慢性病症。在本文中使用的术语“长期”释放指构建和布置植入物以递送有效成分的治疗水平至少7天，优选约30至约60天。长期持续释放植入物对本领域普通技术人员是公知的，包括如上所述的一些释放***。

根据另一个实施方案，本发明的可药用载体包括持续释放或延迟释放载体。载体可以是任何能够使化合物持续或延迟释放的材料，以提供更有效的施用，从而降低化合物的施用频率和/或减少其剂量，易于处理，并延长或延迟对上皮相关病症的作用。

根据另一个方面，本发明提供一种用于在需要其的受试者中改善认知功能复原的方法，该方法包括步骤：(a)向受试者施用一种组合物，该组合物包含：(i)认知功能增强量的瘦蛋白组合物，和(ii)可药用载体。根据一个实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白衍生物，AMP依赖性蛋白激酶激活物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白阻滞剂，瘦蛋白阻滞剂的模拟物，瘦蛋白拮抗剂，AMP依赖性蛋白激酶抑制物；或其可药用盐中的至少一种。根据另一个实施方案，所述瘦蛋白组合物进一步包括第二治疗剂。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为抗生素。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为抗真菌剂。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为抗病毒剂。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为抗原虫剂。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为甾体抗炎剂。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为非甾体抗炎剂。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为抗氧化剂。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为激素。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为维生素。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为抗组胺剂。根据另一个实施方案，所述第二治疗剂为化疗剂。

本领域技术人员会认识到本发明组合物的合适治疗剂量的初始适应症能够在体外和体内动物模型***，以及人类临床试验中确定。本领域技术人员将知道使用动物研究和人类经验确定可以安全地施用而不产生毒性或其他副作用的剂量。对于急性治疗，优选治疗剂量接近最大的耐受剂量。对于慢性预防用途，由于考虑到长期作用，最好采用较低的剂量。

本发明组合物和方法的效果可以由多种方案进行评价。增强人受试者认知功能的效果可以通过对本领域技术人员来说常规的方法确定，包括但不限于，纸笔试验(paper and pencil)和计算机试验。本领域技术人员也可以直接测定动物模型中淀粉状肽积聚水平、神经原纤维缠结的形成和神经变性。此外，淀粉状肽可以由脊髓开孔导出液体(spin tap)中获得的受试者的脑脊液(CSF)样品进行测定。淀粉状肽积聚的一个度量值是受试者血液中循环水平的增加。这类水平可以采用一对抗体，一个用于捕集，另一个用于检测，通过夹心酶联免疫吸附试验(ELISAs)测定。这些方法对本领域普通技术人员是公知的。

除非另有说明，在本文中使用的所有技术和科学术语如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的那样，具有相同的含义。尽管任何与本文中所述的那些类似或等同的方法和材料也可用在本发明的实施和试验中，但现在对优选的方法和材料进行描述。在本文中所提及的所有公开出版物通过引用的方式并入本文，以结合引用的公开出版物披露和描述这些方法和/或材料。

在提供数值范围的情况下，除非文中另外指明，应当理解为该范围及任一其他所描述范围的上限和下限之间的每一个中间值，到下限单位的十分之一，或在所描述范围内的中间值包括在本发明的范围内。独立地包括在这些较小范围的上限和下限也包括在本发明的范围内，在所描述的范围内可以明确地排除任何界限。当所描述的范围包括一个或者两个界限时，排除这些所包括的界限的两者中任一个的范围也包括在本发明中。

在参照本发明的具体实施方案对其进行描述时，本领域技术人员应当理解的是，在不偏离本发明真实精神和范围的情况下，可以做出各种改变及等同替换。此外，可以做出许多修改以适应具体的情况、材料、物质组成、方法、工艺步骤或步骤。所有这些修改均在所附权利要求的范围之内。在提供数值范围的情况下，除非文中另外指明，应当理解为该范围及任一其他所描述范围的上限和下限之间的每一个中间值，到下限单位的十分之一，或在所描述范围内的中间值包括在本发明的范围内。独立地包括在这些较小范围的上限和下限也包括在本发明的范围内，在所描述的范围内可以明确地排除任何界限。当所描述的范围包括一个或者两个界限时，排除这些所包括的界限的两者中任一个的范围也包括在本发明中。

必须注意的是，除非上下文另外明确地指明，在本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括指称复数形式。在本文中使用的所有技术和科学术语具有相同的含义。

本文中讨论的公开出版物的提供仅是因为它们公开于本发明的申请日之前。本文中并没有内容可理解为承认本发明由于在先发明而不能早于这样的出版物。此外，所提供的公开日也可能不同于需要独立核实的实际公开日。

本发明可以用不脱离其精神或实质特点的其他具体形式体现，因此，应当参照所附的权利要求而非前面的说明书来确定本发明的范围。

虽然在已经参照本发明的具体实施方式对其进行描述的情况下，本领域技术人员应当理解的是，在不偏离本发明真实精神和范围的情况下，可以做出多种改变及等同替换。此外，可以做出许多修改以适应具体的情况、材料、物质组成、方法、工艺步骤或步骤。所有这些修改均在所附权利要求的范围之内。

实施例

提出以下的实施例，从而为本领域普通技术人员提供如何做出和使用本发明的完整公开和描述，并不是用来限制发明人认为的本发明的范围，也不是用来代表下面的实验是所做出的所有进行了的或者仅做了的实验。已经为确保有关所用数值(例如用量，温度等等)的准确度作出了努力，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，份数为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏温度，压力为大气压或接近大气压。

试剂和抗体

最小必需培养基(MEM)购买自ATCC(Manassas，VA)。神经元(Neurobasal)培养基，B27补充物和L-谷氨酰胺购买自Gibco(Carlsbad，CA)。胰蛋白酶-EDTA和青霉素-链霉素-两性霉素溶液购买自MP Biomedicals(Solon，Ohio)。胎牛血清(FBS)，全反式视黄酸(RA)，也称为ATRA，人重组瘦蛋白和人重组胰岛素购买自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖核苷(AICAR)，一种实验上广泛用于激活AMP依赖性蛋白激酶(AMPK)的药物，购买自Cell Signaling Technology(Danvers，MA)。已知AMPK在激活之后促进脂解并抑制脂肪生成。

兔抗AMPKα(pThr¹⁷²)，兔抗AMPKα(全部)和tau(pSer³⁹⁶)小鼠mAb购买自Cell Signaling Technology。用于总tau检测的Tau小鼠mAb(克隆5E2)购买自Upstate Cell Signaling Solutions(LakePlacid，NY)。PHF-tau小鼠mAb(克隆AT8)购买自Pierce Biotechnology(Rockd，IL)。PHF-1小鼠mAb由Albert Einstein College of Medicine(Bronx，NY)的Peter Davies博士赠与。兔抗瘦蛋白受体(OB-R)和α微管蛋白小鼠mAb购买自Affinity BioReagents(Golden，CO)。胰岛素受体(β-亚基)mAb购买自Millipore(Billerica，MA)。

细胞系的培养

人成神经细胞瘤细胞系SH-SY5Y和胚胎性癌细胞系NTera-2(NT2)购买自American Type Culture Collection(ATCC)。根据生产商的具体指导方针进行细胞培养。简单而言，SY5Y和NT2细胞在25cm²的组织培养瓶(Corning；Corning，NY)上，在含有10％胎牛血清(FBS)的最小必需培养基(MEM)(Eagle)中繁殖，直到建立80-90％的汇合。用0.1％胰蛋白酶-EDTA并轻刮将SY5Y和NT2细胞从培养瓶分别分离，并以1∶5的比率进行传代培养。

神经元诱导

为了诱导神经元分化，将1×10⁶个SY5Y或NT2细胞被分别接种在25或75cm²的组织培养瓶中。细胞在由含有5％FBS的MEM组成且补充10μM RA的神经元诱导培养基(NIM)中培育。SY5Y在NIM中培养6天，并在第7天处理和收获前转换为无血清NIM。NT2细胞的神经元分化的诱导是基于前面描述的实验方案[P.W.Andrews，Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro，Dev.Biol.103(1984)285-293，通过引用的方式并入本文]。简单而言，NT2细胞在NIM中培养5周，每3天更换50％的NIM。处理和收获前的那天将分化的NT2细胞(NT2N)转换为无血清NIM。

大鼠原代神经元的培养

原代大鼠皮质神经元购买自Brain Bits LLC(

IL)，并按照生产商的指导说明培养。简单而言，将组织分散，并将上清液转移到一个新的管子中，在1100转/分钟转速下离心1分钟。神经元随后被接种到包被有多聚-D-赖氨酸(BD Biosciences；San Jose，CA)的6孔培养板上，并在补充有B27补充物(Invitrogen)和0.5mML-谷氨酰胺的神经元(Neurobasal)培养基进行培育。在4天后更换培养基，在第7天处理并收获培养基中的神经元。

蛋白质提取和蛋白质印迹(Western Blotting)

蛋白质印迹(或者免疫印迹)分析是检测给定的组织匀浆或提取物样品中特定蛋白质的方法，通常采用SDS-凝胶电泳法由多肽分子量来分离一般是变性的蛋白质。蛋白质随后被转移到膜上(一般为硝化纤维素或PVDF)，在那里采用靶蛋白质的特异性抗体对蛋白质进行检测。

在用瘦蛋白、胰岛素和/或AICAR、SY5Y、NT2N处理之后，通过刮下收获大鼠皮质神经元。将细胞沉淀物用冰冷的1×PBS(磷酸盐缓冲液)(pH 7.4)洗涤两次，重新悬浮在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制物的、由25mM Tris-HCl，pH 7.6、150mM NaCl、1％NP-40、1％脱氧胆酸钠和0.1％SDS组成的1×RIPA裂解/提取缓冲液(Pierce)中，然后在干冰/乙醇浴中进行冷冻/解冻循环。获得无细胞、全细胞裂解物，用Coomassie(Bradford)Protein Assay Kit(Pierce)确定总蛋白。采用10％SDS-PAGE预制凝胶(Lonza；Rockland，ME)通过蛋白质印迹法分析全细胞提取物(25μg)，将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore)上。膜在4℃用一抗孵育过夜，随后在第二天用HRP缀合的IgG通过2小时孵育检测。除tau-pSer396(1∶500)、总tau(1∶500)和PHF-tauAT8(1∶200)外，所有的一抗和二抗分别以1∶1000和1∶10000的最终稀释液进行使用。HRP用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce)显色，使用BioRad(Hercules，CA)ChemiDoc XRS System成像。用Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer(Pierce)剥离下膜，用于采用其他抗体再探测。封闭缓冲液由在TBS(Tris缓冲盐水)中的0.1％吐温中的5％牛奶组成。

统计学分析

采用方差分析和Tukey-Kramer多重比较试验进行统计学数据分析。采用UN-SCAN-IT gel 6.1软件(Silk Scientific；Orem，UT)进行光密度分析。p＜0.05被认为是统计学显著的。

实施例1.瘦蛋白和RA诱导的SY5Y细胞中的tau磷酸化

已经报道了RA诱导人成神经细胞瘤细胞系SY5Y来诱导AD相关位点的tau高度磷酸化。我们因此采用视黄酸诱导的SY5Y细胞(RA-SY5Y)，诱导7天作为我们的主要体外模型来研究瘦蛋白和其他处理对tau磷酸化的作用。

第一组实验研究了瘦蛋白受体(OB-R)在用400ng/ml瘦蛋白或安慰剂处理的RA-SY5Y细胞中的表达。发现处理过的细胞和安慰剂细胞都表达相对高水平的OB-R(图1A)。我们接下来测定瘦蛋白是否对tau磷酸化有影响。在一系列时间段内用400ng/ml瘦蛋白或安慰剂对细胞进行处理，并测定了在tau的微管结合区内的Ser³⁹⁶位点的tau磷酸化(图1B和图1C)。与安慰剂相比，在用瘦蛋白处理1小时、2小时或4小时的细胞中观察到tau(Ser³⁹⁶)磷酸化的显著(p＜0.05)降低(图1C；远在右边的柱状图)。与4小时相比，用瘦蛋白处理24小时的细胞中没有观察到tau(Ser³⁹⁶)磷酸化的变化(数据未显示)。

为了确定瘦蛋白和tau Ser³⁹⁶磷酸化之间的剂量-反应关系，RA-SY5Y细胞用瘦蛋白在一系列浓度下处理4小时(图1D和图1E)。我们观察到用100ng/ml瘦蛋白处理的细胞中tau(Ser³⁹⁶)磷酸化的显著(p＜0.05)降低(图1E；左起第二个柱状图)。在浓度达到1600ng/ml瘦蛋白时观察到tau(Ser³⁹⁶)磷酸化降低(右起第二个柱状图)，该浓度产生最大作用。瘦蛋白的50％tau(Ser³⁹⁶)磷酸化抑制浓度(IC₅₀)评估获得的值为750ng/ml，或46.9nM。

实施例2.胰岛素和RA诱导的SY5Y细胞中的tau磷酸化

我们测试了胰岛素处理对RA-SY5Y细胞中tau(Ser³⁹⁶)磷酸化的作用，并将其和瘦蛋白的作用进行了比较。

第一组实验研究了胰岛素受体在用10μM胰岛素或安慰剂处理的RA-SY5Y细胞中的表达。发现胰岛素和安慰剂处理的细胞都表达高水平的胰岛素受体(图2A)。我们接下来测定胰岛素对tau磷酸化的作用。在一系列时间段内用10μM胰岛素或安慰剂对细胞进行处理，测定了tau(Ser³⁹⁶)磷酸化(图2B和图2C)。与安慰剂处理的细胞相比，在用胰岛素处理2小时或4小时的细胞中观察到tau(Ser³⁹⁶)磷酸化的显著(p＜0.05)降低(图2C；远在右边的柱状图)。与4小时相比，用胰岛素处理24小时的细胞中没有观察到tau(Ser³⁹⁶)磷酸化的变化(数据未显示)。

与在瘦蛋白研究(图1D和图1E)中一样，建立了RA-SY5Y细胞中胰岛素对tau(Ser³⁹⁶)磷酸化的剂量-反应曲线(图2D和图2E)。我们观察到用10μM胰岛素处理的细胞中tau(Ser³⁹⁶)磷酸化的显著降低(p＜0.05)(图2E；右起第三个柱状图)。另外，在20μM胰岛素的浓度时观察到最大的tau(Ser³⁹⁶)磷酸化降低(右起第二个柱状图)。胰岛素的50％tau(Ser³⁹⁶)磷酸化抑制浓度(IC₅₀)评估获得的数值为13.8uM。

总结：

研究了瘦蛋白对AD中已知会高度磷酸化的位点处的tau磷酸化水平的作用。RA诱导的人SY5Y表达高度磷酸化的tau，因此在我们的处理模型中被采用。由于胰岛素降低体外和体内模型中磷酸化的tau水平，我们的研究通过比较瘦蛋白和胰岛素功效开始(图1和2)。发现瘦蛋白在比胰岛素浓度(图2；IC₅₀＝13.8μM)小300倍的浓度下(图1；IC₅₀＝46.9nM)，将tau磷酸化降低50％。

实施例3.瘦蛋白和胰岛素的联合处理和tau磷酸化

RA-SY5Y细胞用次优或最大效应剂量的瘦蛋白和/或胰岛素的组合或单独处理4小时，测定了tau(Ser³⁹⁶)磷酸化(图3A和图3B)。与任一单独处理相比(图3B；左起第一、三、五个柱状图)，在用次优剂量的瘦蛋白(100ng/ml)和胰岛素(1μM)联合处理的细胞中观察到磷酸化的显著(p＜0.05)降低。与安慰剂处理相比，最大效应剂量的瘦蛋白(1600ng/ml)和胰岛素(20μM)共处理产生最为显著(p＜0.01)的磷酸化降低(右起第一个柱状图)。与任一单独处理相比，最大效应剂量的瘦蛋白和胰岛素共处理没有产生显著(p＞0.05)tau(Ser³⁹⁶)的磷酸化降低。

总结：

与任一单独处理相比，次优剂量瘦蛋白(100ng/ml)和胰岛素(1μM)联合处理产生显著的tau磷酸化降低(图3)。该结果表明瘦蛋白和胰岛素由于可以产生加性效应，联合治疗AD的潜在益处。实施例4.瘦蛋白和胰岛素诱导的去磷酸化的可逆性

已经报道了Tau磷酸化随动物体内寒冷温度应激而增加。我们因此采用类似的方法来确定瘦蛋白和胰岛素诱导的tau在Ser³⁹⁶处的去磷酸化是否是可逆的。RA-SY5Y用瘦蛋白(1600ng/ml)和胰岛素(20μM)的共处理4小时，或用安慰剂处理。在处理期结束时，收获细胞，或用冰冷的PBS(pH7.4)将细胞后处理10分钟或1小时(图3C和图3D)。与仅采用共处理相比(图3D；左起第一个和第二个柱状图)，用冷PBS后处理10分钟的细胞显示出tau磷酸化的显著(p＜0.05)增加。与根本没有处理的细胞相比，用冷PBS后处理1小时的细胞显示出显著的(p＜0.01)tau高度磷酸化(右起第一个柱状图)。这些结果表明瘦蛋白和胰岛素对tau去磷酸化的作用是可逆的。这些结果也证明tau磷酸化形式的抗体特异性。

实施例5.1瘦蛋白、胰岛素和其他AD相关位点的tau磷酸化

为了评价所观察到的瘦蛋白和胰岛素对tau在Ser³⁹⁶处的磷酸化(图1和图2)的作用是否与其他AD相关位点一致，采用了针对已知在成对螺旋纤丝(PHF)tau中待磷酸化的tau表位的抗体。PHF是NFT病理的首要要素，由tau高度磷酸化和随后的微管去稳定化和寡聚物形成所致。Ser^396/404和Ser²⁰²/Thr²⁰⁵处的Tau磷酸化分别通过PHF-1(小鼠)抗体和AT8(小鼠)抗体识别。

RA-SY5Y细胞用瘦蛋白和/或胰岛素处理，如图3和图3B，测定了特异性tau位点的磷酸化(表1)。

表1.在处理的神经元培养物中相对的tau磷酸化

简单而言，RA诱导的SY5Y和NT2N用低浓度和高浓度瘦蛋白(100ng/ml或1600ng/ml)和/或胰岛素(1μM或20μM)处理4小时，或不作处理(安慰剂)。原代大鼠皮质神经元用瘦蛋白处理24小时或用安慰剂处理。制备全细胞提取物，并采用磷酸化tau特异性抗体(pSer³⁹⁶，PHF-1或AT8)通过蛋白质印迹进行分析。将膜剥离，并用抗tau(总的tau)再探测以归一化。采用光密度测定法分析归一化条带密度，结果用相对未处理样品的平均±SD％倍数变化表示，未处理样品被任意地指定为数值0(ND：未测定的)。^*相对于不作处理的而言p＜0.05。

通过PHF-1抗体和AT8抗体的检测，观察到瘦蛋白和/或胰岛素处理对tau磷酸化具有类似的效应(表1)。与用pSer³⁹⁶抗体观察到的结果相比，可观察到的不同仅是瘦蛋白在浓度为100ng/ml时不能够诱导tau磷酸化的显著(p＞0.05)降低。这些结果证明瘦蛋白和胰岛素处理RA-SY5Y细胞都可以降低至少两个单独的AD相关tau位点的磷酸化。

实施例5.2瘦蛋白、胰岛素和其他神经元细胞中的tau磷酸化

我们接下来确定了瘦蛋白和/或胰岛素对tau磷酸化的作用是否是RA-SY5Y细胞特有的或是否与其他神经元细胞一致。为了实现这个目的，我们采用了用RA处理会产生神经元分化的人NT2细胞(NT2N)，以及大鼠原代皮质神经元。

NT2N细胞用瘦蛋白和/或胰岛素进行处理，如图3A和图3B，测定了Ser³⁹⁶处的tau磷酸化(表1)。观察到胰岛素和联合胰岛素/瘦蛋白处理具有与用RA-SY5Y细胞观察到的作用类似的作用(表1)。

对于大鼠原代神经元，我们确定了瘦蛋白处理24小时对tau磷酸化的作用，这一点通过PHF-1抗体和AT8抗体检测(表1)。选择了瘦蛋白的中等剂量(800ng/ml)，因为该浓度在RA-SY5Y中产生50％的(ID₅o)tau磷酸化降低(图1)。与安慰剂处理的细胞相比，瘦蛋白产生显著的(p＜0.05)tau磷酸化降低，如由PHF-1抗体所检测的(表1)。然而，用AT8抗体没有检测到瘦蛋白诱导的tau磷酸化降低(表1)。

综上，瘦蛋白诱导多种神经元细胞中Ser^396/404处tau磷酸化的降低(如用PHF-1抗体所检测的)。此外，它诱导所测试的大部分但并非所有种类神经元细胞中Ser²⁰²/Thr²⁰⁵处tau磷酸化的降低(如用AT8抗体所检测的)。

总结：

对人NT2N细胞和大鼠原代皮质神经元中的Tau磷酸化进行了研究(表1)，以证明瘦蛋白的作用和其他神经元***一致。在RA-SY5Y中观察到相似的结果，除瘦蛋白没有显著改变大鼠皮质神经元中Ser²⁰²/Thr²⁰⁵处的磷酸化(AT8小鼠mAb)之外。不受理论上的限制，该结果可能与抗体的种属特异性有关。

实施例6.RA-SY5Y细胞中的AMPK信号传导和tau磷酸化

能量稳态酶AMP活化蛋白激酶(AMPK)用细胞可通透激活剂AICAR直接激活，以研究瘦蛋白和胰岛素在tau磷酸化调节中的作用。

AICAR处理产生pThr¹⁷²AMPKα带密度大的增加(图4A，上排)，因此证明了AMPKα的有效激活。我们接下来确定了AICAR对tau磷酸化的作用。用1mM AICAR将RA-SY5Y处理不同的时间，或用安慰剂处理(图4B和图4C)。与安慰剂相比，在用AICAR处理10分钟到4小时的细胞中观察到Ser³⁹⁶磷酸化的显著降低(p＜0.05)(图4C；灰色柱状图)。

RA-SY5Y用一系列浓度的AICAR处理1小时，以建立剂量-反应关系(图4D和图4E)。我们观察到在用1mM AICAR处理的细胞中Ser³⁹⁶磷酸化的显著(p＜0.05)降低(图4E；右起第三个柱状图)。在浓度达到2mM AICAR(右起第二个柱状图)时，观察到Ser³⁹⁶磷酸化降低，这产生最大效应。AICAR的50％tau(Ser³⁹⁶)磷酸化抑制浓度(IC₅₀)评估获得的数值为2.7mM。

综上，观察到的结果表明，瘦蛋白或胰岛素活化AMPKα能在AD相关的位点对tau磷酸化产生类似的作用。

研究了tau磷酸化中受体后信号传导途径的收敛点(point of convergence)。已知能量稳态酶AMPK是由胰岛素和瘦蛋白(图4)激活，并且也已知它与糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)相互作用。AICAR激活AMPK在10分钟内产生tau磷酸化的显著变化。这些结果表明，AMPK可以为降低AD相关的tau磷酸化提供一种新的治疗靶。我们证明了AMPK的活化与瘦蛋白/胰岛素的作用类似。

实施例7.临床试验

对瘦蛋白在人中的临床开发进行了研究。预试验包括3组人数相同、诊断为早期阿尔茨海默病的患者[安慰剂对照双盲]，每天接受1次皮下注射0mg(安慰剂)、5mg或10mg瘦蛋白，持续16周。在试验的开始、试验期间和试验结束时获得CSF和血清样品，测定Ab40、Ab42和磷酸化tau。在试验开始和试验结束时，患者还接受了神经生理学评估。该试验证实了临床前的结果，并证明了瘦蛋白在选择性靶向AD的两种病理中的价值。

临床试验数据和临床前的数据证明瘦蛋白对Aβ和tau相关的病理都有改善。这些数据和瘦蛋白的药学特性共同支持了它用作一种新的阿尔茨海默病治疗剂。

实施例8.用瘦蛋白或胰岛素处理的RA诱导的SY5Y和NT2N

RA诱导的SY5Y和NT2N用低浓度或高浓度瘦蛋白(分别为100ng/ml或1600ng/ml)和/或胰岛素(分别为1μM或20μM)处理4小时，或不作处理(安慰剂)(表1)。原代大鼠皮质神经元用瘦蛋白处理24小时，或用安慰剂处理。制备全细胞提取物，并用磷酸化tau特异性抗体(pSer³⁹⁶、PHF-1或AT8)通过蛋白质印迹进行分析。将膜剥离，并用抗tau(总的tau)再探测以归一化。用光密度测定法分析归一化条带密度，结果用相对未处理样品的平均±SD％倍数变化表示，未处理样品被任意地指定为数值0(ND：未测定的)。^*相对于不作处理的而言p＜0.05。

在已经参照本发明的具体实施方式对其进行描述的情况下，本领域技术人员应当理解的是，在不偏离本发明真实精神和范围的情况下，可以做出各种改变及等同替换。此外，可以做出许多修改以适应具体的情况、材料、物质组成、方法、工艺步骤或步骤。所有这些修改均在所附权利要求的范围之内。

Claims (14)

1.一种用于治疗进行性认知障碍的方法，该方法包括步骤：

(a)将第一组合物施与需要其的受试者，该组合物包含：

(i)调节磷酸化tau积聚的量的瘦蛋白组合物，或其可药用盐，和

(ii)可药用载体，以及

(b)调节受试者脑脊液中磷酸化tau的积聚。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述进行性认知障碍选自阿尔茨海默病，进行性核上性麻痹，痴呆，拳击员痴呆，克-雅综合征，额颞痴呆，皮克病和FTDP-17(帕金森综合征)皮质基底节变性。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述瘦蛋白组合物为瘦蛋白或其可药用盐。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述瘦蛋白组合物为瘦蛋白模拟物或其可药用盐。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述瘦蛋白组合物为瘦蛋白衍生物或其可药用盐。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述瘦蛋白组合物为瘦蛋白激动剂或其可药用盐。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述调节磷酸化tau积聚的量为约0.01mg/kg体重至约100mg/kg体重的量。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一组合物进一步包含第二治疗剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第二治疗剂为抗生素，抗真菌剂，抗病毒剂，抗原虫剂，甾体抗炎剂，非甾体抗炎剂，抗氧化剂；激素；维生素；抗组胺剂和化疗剂中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述进行性障碍包含脑中神经原纤维缠结的积聚。

11.一种用于在需要其的受试者中改善认知功能复原的方法，该方法包括步骤：

(a)向受试者施用组合物，该组合物包含：

i.认知功能增强量的瘦蛋白组合物，和

ii.可药用载体；以及

(b)调节受试者脑脊液中磷酸化tau的积聚。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白，瘦蛋白模拟物，瘦蛋白衍生物，AMP依赖性蛋白激酶激活物，瘦蛋白激动剂，瘦蛋白阻滞剂，瘦蛋白阻滞剂的模拟物，瘦蛋白拮抗剂，AMP依赖性蛋白激酶抑制物；或其可药用盐中的至少一种。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述瘦蛋白组合物进一步包含第二治疗剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述第二治疗剂为抗生素，抗真菌剂，抗病毒剂，抗原虫剂，甾体抗炎剂，非甾体抗炎剂，抗氧化剂；激素；维生素；抗组胺剂和化疗剂中的至少一种。

Images