CN102099016A - 载药的聚合物纳米微粒及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及纳米微粒，所述纳米微粒具有约0.2-约35重量百分比的治疗剂；和约10-约99重量百分比的生物相容的聚合物诸如二嵌段聚乳酸-聚乙二醇。本发明的其他方面包括制备这种纳米微粒的方法。

Description

载药的聚合物纳米微粒及其制备和使用方法

相关申请

本申请要求2008年6月16日提交的U.S.S.N.61/061760；2008年10月16日提交的U.S.S.N.61/105916；2008年10月20日提交的U.S.S.N.61/106777；2009年4月15日提交的U.S.S.N.61/169514；2009年5月4日提交的U.S.S.N.61/175209；2008年6月16日提交的U.S.S.N61/061704；2009年4月15日提交的U.S.S.N.61/169519；2009年5月4日提交的U.S.S.N.61/175219；2008年6月16日提交的U.S.S.N.61/061697；2008年8月12日提交的U.S.S.N.61/088159；2009年4月15日提交的U.S.S.N.61/169541；2009年5月4日提交的U.S.S.N.61/175226；2009年4月29日提交的U.S.S.N.61/173784；2009年5月29日提交的U.S.S.N.61/182300和2009年4月29日提交的U.S.S.N.61/173790的优先权；它们中的每一个均通过引用整体并入本文。

背景技术

长期以来，已经公认将某些药物递送至患者(例如，靶向特定的组织或细胞类型或靶向具体的疾病组织而非正常组织)的***或控制药物释放的***是有益的。

例如，包含活性药物和例如，靶向特定的组织或细胞类型或靶向特异性的疾病组织而非正常组织的那些的治疗剂，可以减少药物在机体非靶向组织中的量。当治疗诸如癌症(其中希望细胞毒剂量的药物递送至癌细胞而不杀伤周围的癌性组织)的病症时，这是特别重要的。有效的药物靶向作用可以减少在抗癌治疗中常见的不希望的和有时威胁生命的副作用。此外，这种治疗剂可以允许药物到达某些它们以其它方式不能到达的组织。

提供控制释放和/或靶向疗法的治疗剂也必须能够递送有效量的药物，所述药物在其它纳米微粒递送***中是公知的限制。例如，它可以解决下述问题：制备纳米微粒***(含有适当量的药物相关的各纳米微粒)，同时保持所述纳米微粒的尺寸足够小，从而具有有利的递送特性。希望用高量的治疗剂装载纳米微粒，而使用过高的药物负荷(drug load)的纳米微粒制剂将产生对实际治疗应用而言过大的纳米微粒。

相应地，存在对纳米微粒治疗剂和制备所述纳米微粒方法的需求，它可以递送治疗水平的药物以治疗疾病诸如癌症，同时也减少患者的副作用。

发明内容

在一方面，本发明提供治疗性纳米微粒，所述治疗性纳米微粒包括活性剂或治疗剂，例如紫杉烷和一、二或三种生物相容的聚合物。例如，本文公开治疗性纳米微粒，所述治疗性纳米微粒包含约0.2-约35重量百分比的治疗剂；约10-约99重量百分比的聚乳酸-嵌段-聚乙二醇共聚物或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-嵌段-聚乙二醇共聚物；和约0-约50重量百分比的聚乳酸或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸。示例性治疗剂包括抗肿瘤药剂，诸如紫杉烷，例如多西他赛和可以包含约10-约30重量百分比的治疗剂，例如，紫杉烷药剂。

公开的纳米微粒的流体力学直径可以是，例如，约60-约120nm或约70-约120nm。

示例性治疗性纳米微粒可以包含约40-约90重量百分比的聚乳酸-聚乙二醇共聚物或约40-约80重量百分比的聚乳酸-聚乙二醇共聚物。这种聚乳酸-嵌段-聚乙二醇共聚物可以包括具有约15-20kDa(或例如约15-约100kDa，例如约15-约80kDa)的数均分子量的聚乳酸，和具有约2-约10kDa，例如，约4-约6kDa的数均分子量的聚乙二醇。例如，公开的治疗性纳米微粒可以包含约70-约90重量百分比的PLA-PEG和约15-约25重量百分比的多西他赛、或约30-约50重量百分比的PLA-PEG、约30-约50重量百分比的PLA或PLGA，和约15-约25重量百分比的多西紫杉醇(doxetaxel)。这种PLA(聚乳酸)可以具有约5-约10kDa的数均分子量。这种PLGA(聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly(lacticacid-co-glycolic acid)))可以具有约8-约12kDa的数均分子量。

公开的治疗性纳米微粒可以是稳定的(例如基本上保留大多数活性剂)，在25℃保持至少5天，例如可以在体外(例如在蔗糖溶液中)保持稳定超过5天。在另一个实施方式中，当将公开的微粒放置在室温、或37℃的磷酸盐缓冲溶液中时，它可以基本上立即释放低于约2％或低于约5％、或甚至低于约10％的治疗剂。在一个实施方式中，公开的纳米微粒可以保留尺寸和/或分子量超过一周或一个月或更长。

在一些实施方式中，公开的纳米微粒可以进一步包含约0.2-约10重量百分比的PLA-PEG(其被靶向配体官能化)和/或可以包含约0.2-约10重量百分比的聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-嵌段-PEG(其被靶向配体官能化)。在一些实施方式中，这种靶向配体可以共价结合至PEG，例如，经由亚烷基连接子(alkylene linker)结合至PEG，例如PLA-PEG-亚烷基-GL2。例如，公开的纳米微粒可以包含约0.2-约10摩尔百分比的PLA-PEG-GL2或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-PEG-GL2。应当理解参考PLA-PEG-GL2或PLGA-PEG-GL2涉及下述部分：可以包含将PEG连接至GL2的亚烷基连接子(例如C₁-C₂₀，例如，(CH₂)₅)。例如，公开的纳米微粒可以是选自下述的聚合物化合物：

其中R₁选自基团H，和任选地被卤素取代的C₁-C₂₀烷基基团；

R₂是键、酯连接基(linkage)、或酰胺连接基；

R₃是C₁-C₁₀亚烷基或键；

x是50-约1500，例如约170-约260；

y是0-约50，例如y是0；和

z是约30-约456或约30-约200，例如，z是约80-约130。

在一个实施方式中，治疗性纳米微粒可以包含约0.2-约35重量百分比的治疗剂；约30-约99重量百分比的聚乳酸-聚乙二醇共聚物或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物；约0-约50重量百分比的聚乳酸或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸；和约0.2-约10重量百分比或约0.2-约30重量百分比的PLA-PEG-GL2或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-PEG-GL2。例如，PLA-PEG-GL2可以包含具有约10,000Da-约20,000Da的数均分子量的聚乳酸和具有约4,000-约8,000的数均分子量的聚乙二醇。

提供组合物，诸如包含多个公开的纳米微粒和药学上可接受的赋形剂的组合物。在一些实施方式中，这种组合物可以含有低于约10ppm的钯。

示例性组合物可以包括多个聚合物纳米微粒，各包含约0.2-约35重量百分比的紫杉烷药剂和约10-约99重量百分比的聚乳酸-聚乙二醇共聚物或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物；和药学上可接受的赋形剂，诸如蔗糖。本文还提供纳米微粒配制剂，所述纳米微粒配制剂包含：多个公开的纳米微粒、蔗糖和水；其中例如，所述纳米微粒/蔗糖/水的重量比率是约5-10％/10-35％/60-90％(w/w/w)或约4-10％/10-30％/60-90％(w/w/w)。

本文还提供治疗癌症，例如***癌的方法，包括给予有此需要的患者有效量的治疗性纳米微粒，所述治疗性纳米微粒包含约0.2-约35重量百分比的抗肿瘤药诸如多西紫杉醇；约30-约90重量百分比的聚乳酸-聚乙二醇共聚物或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物；任选地，约5-约20重量百分比的聚乳酸或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸；和，任选地，约0.2-约30重量百分比(例如，约0.2-约20重量百分比或约0.2-约10重量百分比)的PLA-PEG-GL2或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-PEG-GL2。

附图说明

图1描述公开的纳米微粒的一个实施方式的图示。

图2描述公开的纳米微粒的示例性合成的方案。

图3是形成公开的纳米微粒的乳化过程的流程图。

图4是公开的乳化过程的流程图。

图5描述粗乳液(coarse emulsion)制剂对骤冷的微粒尺寸的影响。使用标准水相(1％胆酸钠、2％苯甲醇、4％乙酸乙酯)在W∶O为5∶1乳化，使用30％固体的安慰剂有机物(placebo organic)。

图6描述进料压力(feed pressure)对所得的微粒尺寸的影响。

图7描述微粒尺寸取决于标度(scale)。

图8描述固体浓度对微粒尺寸的影响。

图9描述载药的固体浓度的影响。

图10描述均聚物PLA与PLGA-PEG或PLA-PEG对DTXL(多西他赛)装载(loading)的影响。

图11描述作为纳米微粒一部分的均聚物PLA对纳米微粒的药物释放速率的影响。

图12描述鲸蜡醇对纳米微粒的药物释放的初始速率的影响。

图13描述相对于常规的多西他赛，多西他赛从公开的纳米微粒中的体外释放。

图14描述固体浓度和聚乳酸均聚物对西罗莫司(雷帕霉素)的装载百分比的影响。

图15描述公开的纳米微粒的西罗莫司随时间的体外释放。

图16描述聚乳酸均聚物对坦罗莫司的装载百分比的影响。

图17描述固体浓度对含有坦罗莫司的微粒的微粒尺寸的影响。

图18描述公开的纳米微粒的坦罗莫司随时间的体外释放。

图19描述示例性公开的纳米微粒(包含长春瑞滨)的体外释放特性。

图20描述公开的纳米微粒(包含长春新碱或多西他赛)的体外释放特性。

图21描述长春新碱和长春新碱PTNP在大鼠中的药物代谢动力学。

图22描述在乳腺癌的MX-1移植小鼠模型中给予公开的纳米微粒(包含多西他赛)之后的平均肿瘤体积。

图23描述在静脉给予公开的纳米微粒(包含多西他赛)24小时之后，在乳腺癌的MX-1异种移植物小鼠模型的小鼠肿瘤中的多西他赛浓度。

图24在给予接种有人类LNCaP***癌细胞的小鼠之后，具有多西他赛的公开的纳米微粒的***肿瘤分布。

图25显示在给予含有多西他赛的公开的纳米微粒之后，在接种有人类LNCaP***癌细胞的小鼠中的肿瘤生长抑制。

发明详述

本发明一般地涉及聚合物纳米微粒，包含活性剂或治疗剂或药物，及其制备和使用这种治疗性纳米微粒的方法。一般而言，“纳米微粒”指具有低于1000nm，例如约10nm-约200nm的直径的任意微粒。公开的治疗性纳米微粒可以包括具有约60-约120nm、或约70-约130nm、或约60-约140nm的直径的纳米微粒。

公开的纳米微粒可以包含约0.2-约35重量百分比、约3-约40重量百分比、约5-约30重量百分比、10-约30重量百分比、15-25重量百分比、或甚至约4-约25重量百分比的活性剂，诸如抗肿瘤药，例如紫杉烷药剂(例如多西他赛)。

本文公开的纳米微粒包括一、二、三或更多种生物相容的和/或生物可降解的聚合物。例如，考虑的纳米微粒可以包含约10-约99重量百分比的一种或多种嵌段共聚-聚合物(包含生物可降解的聚合物和聚乙二醇)，和约0-约50重量百分比的生物可降解的均聚物。

在一个实施方式中，公开的治疗性纳米微粒可以包含在有此需要的患者中有效治疗疾病或障碍，诸如***癌的靶向配体，例如，低-分子量PSMA配体。在某些实施方式中，所述低-分子量配体是轭合至聚合物，并且纳米微粒包含某些比率(ratio)的配体-共轭聚合物(conjugated polymer)(例如，PLA-PEG-配体)与非-官能化聚合物(例如PLA-PEG或PLGA-PEG)。纳米微粒可以具有优化比率的这两种聚合物，使得有效量的配体与治疗疾病或障碍的纳米微粒相关联。例如，增加的配体密度可以增加靶结合(细胞结合/靶摄取)，使得纳米微粒“靶专一性”。另选地，在纳米微粒中的某些浓度的非-官能化聚合物(例如，非-官能化PLGA-PEG共聚物)可以控制炎症和/或免疫原性(即，引起免疫反应/应答的能力)，和允许纳米微粒具有循环半衰期(适用于治疗疾病或障碍(例如，***癌)。另外，在一些实施方式中，非-官能化聚合物可以经由网状内皮***(RES)降低从循环***中的清除速率。从而，非-官能化聚合物可以提供具有可以允许微粒在给药之后通过机体行进的特征的纳米微粒。在一些实施方式中，非-官能化聚合物可以使另外高浓度的配体平衡，所述配体可以以其它方式通过受试者加速清除，进而导致向靶细胞的更低递送。

例如，本文公开可以包含轭合至配体的官能化聚合物的纳米微粒，所述配体构成大约0.1-50，例如，0.1-30，例如，0.1-20，例如，0.1-10摩尔百分比的整个聚合物组合物的纳米微粒(即，官能化+非-官能化聚合物)。在又一个实施方式中，本文还公开包含与一种或多种低-分子量配体轭合(例如，共价地(即通过连接子(例如亚烷基连接子)或键)的聚合物的纳米微粒，其中低-分子量配体相对于总聚合物而言，其重量百分比是约0.001-5，例如，约0.001-2，例如，约0.001-1。

本文还提供包含约2约20重量百分比的活性剂的聚合物纳米微粒。例如，包含这种纳米微粒的组合物可以能够递送有效量至例如患者的靶机体区域(body area)。

例如，公开的纳米微粒可以能够有效地结合至生物学本体(biological entity)或以其它方式与生物学本体缔合(associate)，所述生物学本体例如，特定的膜组分或细胞表面受体。希望治疗剂的靶向(例如，靶向至特定的组织或细胞类型，靶向至具体的疾病组织但是并非正常组织等)，用于治疗组织特异性疾病诸如实体瘤癌症(例如***癌)。例如，与细胞毒抗癌药剂的全身递送相比，本文公开的纳米微粒可以基本上预防药剂杀伤健康细胞。额外地，公开的纳米微粒可以便于较低剂量的药剂的给药(与不含有公开的纳米微粒或配制剂的给予的有效量药剂相比)，所述公开的纳米微粒可以减少一般与传统化学疗法有关的不希望的副作用。

聚合物

在一些实施方式中，本发明的纳米微粒包含聚合物的基质和治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂和/或靶向部分(即，低-分子量PSMA配体)可以与至少部分聚合物基质缔合。例如，在一些实施方式中，靶向部分(例如配体)可以共价地与聚合物基质的表面缔合。在一些实施方式中，共价缔合(covalent association)是由连接子介导的。治疗剂可以与聚合物基质的表面缔合、包封在聚合物基质中、被聚合物基质包围和/或分散遍及聚合物基质。

多种聚合物和用于从其中形成微粒的方法在药物递送领域是已知的。在一些实施方式中，公开内容涉及具有至少两种高分子的纳米微粒，其中所述第一种高分子包含结合至低-分子量配体(例如靶向部分)的第一聚合物；和第二种高分子包含并未结合至靶向部分的第二聚合物。纳米微粒可以任选地包含一种或多种额外的非官能化聚合物。

任意聚合物可以根据本发明来使用。聚合物可以是天然或非天然(合成的)聚合物。聚合物可以是均聚物或共聚物，其包含两种或更多种单体。就序列而言，共聚物可以是随机序列、嵌段序列或包含随机和嵌段序列的组合。一般地，根据本发明聚合物是有机聚合物。

本文使用的术语“聚合物”，以本领域使用的通常含义提供，即，包含通过共价键连接的一种或多种重复单元(单体)的分子结构。所述重复单元可以全部等同或在某些情况中，可以是在聚合物中存在的超过一种类型的重复单元。在某些情况中，聚合物可以是生物学上衍生的，即，生物聚合物。非-限制实例包括肽或蛋白质。在某些情况中，额外的部分也可以存在于聚合物，例如生物学部分诸如下述那些中。如果超过一种类型的重复单元存在于聚合物中，那么所述聚合物是“共聚物”。应当理解，在采用聚合物的任意实施方式中，在某些情况中采用的聚合物可以是共聚物。形成共聚物的重复单元可以以任何式样排列。例如，重复单元可以以随机的次序、以任何交替的次序排列或作为嵌段共聚物，即，包含一个或多个区域(各包含第一重复单元(例如，第一嵌段)，和一个或多个区域(各包含第二重复单元(例如，第二嵌段))等。嵌段共聚物可以具有两(二嵌段共聚物)、三(三嵌段共聚物)或更多数量的不同嵌段。

公开的微粒可以包含共聚物，在一些实施方式中，描述了通常通过两种或更多种聚合物一起共价结合使得彼此已经缔合的两种或多种聚合物(诸如本文描述的那些)。从而，共聚物可以包含第一聚合物和第二聚合物，它们已经一起轭合以形成嵌段共聚物，其中所述第一聚合物可以是所述嵌段共聚物的第一嵌段和所述第二聚合物可以是所述嵌段共聚物的第二嵌段。当然，那些本领域的普通技术人员将理解，在某些情况中，嵌段共聚物可以含有多种嵌段的聚合物，并且本文使用的″嵌段共聚物″不局限于仅具有单一第一嵌段和单一第二嵌段的唯一的嵌段共聚物。例如，嵌段共聚物可以包含含有第一聚合物的第一嵌段、含有第二聚合物的第二嵌段和含有第三聚合物或第一聚合物的第三嵌段等。在某些情况中，嵌段共聚物可以含有任意数量的第一聚合物的第一嵌段和第二聚合物的第二嵌段(和在某些情况中，第三嵌段、第四嵌段等)。此外，应当注意地是，在某些情况中嵌段共聚物也可以从其它嵌段共聚物中形成。例如，第一嵌段共聚物可以轭合至其它聚合物(它可以是均聚物、生物聚合物，其它嵌段共聚物等)，以形成含有多种类型的嵌段的新的嵌段共聚物，和/或轭合至其它部分(例如，轭合至非-聚合物部分)。

在一些实施方式中，聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)可以是两亲的，即，具有亲水部分和疏水部分或相对亲水部分和相对疏水部分。亲水聚合物可以是一般地吸引水的聚合物和疏水聚合物可以是一般地排斥水的聚合物。亲水或疏水聚合物可以是经鉴定的，例如，通过制备聚合物的样品和测量它与水的接触角(一般地，聚合物将具有低于60°的接触角，而疏水聚合物将具有高于约60°的接触角)。在某些情况中，两种或更多种聚合物的亲水性可以相对于彼此来测量，即，第一聚合物可以比第二聚合物更亲水。例如，第一聚合物可以具有比第二聚合物更小的接触角。

在一组实施方式中，本文考虑的聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)包括生物相容的聚合物，即，这种聚合物：当它被***或注射进入活的受试者时，一般不诱导不利的应答，例如没有引起显著的炎症和/或聚合物被免疫***(例如，经由T-细胞应答)的急性排斥反应。相应地，本文考虑的治疗性微粒可以是非-免疫原性的。本文使用的术语非-免疫原性的指内源性生长因子处于其幼稚(naive)状态，它通常不产生或仅产生最低水平的循环抗体、T-细胞或反应免疫细胞，和通常不在个体中产生针对其自身的免疫应答。

生物相容性一般地指材料被至少一部分免疫***的急性排斥反应，即，非生物相容的材料植入受试者所引起的在所述受试者中的免疫应答，所述免疫应答可以足够严重使得材料被免疫***的排斥反应不能充分被控制，和常常达到某种程度使得所述材料必须从所述受试者中除去。一个测定生物相容性的简单试验可以是使聚合物体外暴露于细胞；生物相容的聚合物是这种聚合物：其在适中浓度，例如，在50微克/10⁶细胞的浓度一般地将不造成显著细胞死亡。例如，当生物相容的聚合物暴露于细胞诸如成纤维细胞或上皮细胞时，甚至如果被所述细胞吞噬或以其它的方式摄取时，它可以导致低于约20％的细胞死亡。可以在本发明的各种实施方式中有用的生物相容的聚合物的非-限制实例包括聚二烷酮(PDO)、聚羟基脂肪酸酯、聚羟基丁酸酯、聚(癸二酸甘油酯)(poly(glycerol sebacate))、聚乙醇酸交酯、聚丙交酯(polylactide)、PLGA、聚己内酯或包含这些和/或其它聚合物的共聚物或衍生物。

在某些实施方式中，考虑的生物相容的聚合物可以是生物可降解的，即，所述聚合物在化学和/或生物学上在生理学环境(诸如体内)能够降解。本文使用的″生物可降解的″聚合物是那些，当被引入细胞时，通过分子机构(生物学上可降解的)和/或通过化学过程，诸如水解(化学上可降解的)分解成细胞可以再利用或除去的组分，而对细胞没有显著毒性作用。在一个实施方式中，生物可降解的聚合物和它们的降解副产物可以生物相容。

例如，考虑的聚合物可以是在暴露于水(例如，在受试者内)时同时水解的聚合物，所述聚合物在暴露于热(例如，在约37℃的温度)时可以降解。聚合物的降解可以以变化的速率出现，取决于使用的聚合物或共聚物。例如，聚合物的半衰期(其中50％的聚合物可以降解成单体和/或其它非聚合物部分的时间)可以约为数天、数周、数月或数年，取决于聚合物。聚合物可以是生物学上可降解的，例如，通过酶活性或分子机构，在某些情况中，例如，通过暴露于溶菌酶(例如，具有相对低的pH)。在某些情况中，聚合物可以分解成单体和/或细胞可以再利用或除去的其它非聚合物，而对细胞没有显著毒性作用(例如，聚丙交酯可以水解以形成乳酸，聚乙醇酸交酯可以水解以形成乙醇酸等)。

在一些实施方式中，聚合物可以是聚酯类，包括含有乳酸和乙醇酸单元的共聚物，诸如聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚丙交脂-乙交脂共聚物(poly(lactide-co-glycolide))，在本文共同被称作″PLGA″；和包含乙醇酸单元的均聚物，在本文被称作″PGA″，和乳酸单元，诸如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D，L-乳酸、聚-L-丙交酯(lactide)，聚-D-丙交酯，和聚-D，L-丙交酯，在本文共同被称作″PLA″。在一些实施方式中，示例性聚酯类包括，例如，多羟基酸类；PEG化的聚合物以及丙交酯和乙交脂的共聚物(例如，PEG化的PLA、PEG化的PGA、PEG化的PLGA及其衍生物。在一些实施方式中，聚酯类包括，例如，聚酐类、聚(原酸酯)PEG化的聚(原酸酯)、聚(己内酯)、PEG化的聚(己内酯)、聚赖氨酸、PEG化的聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、PEG化的聚(乙烯亚胺)、聚(L-丙交酯-共聚-L-赖氨酸)(poly(L-lactide-co-L-lysine))、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]，及其衍生物。

在一些实施方式中，聚合物可以是PLGA。PLGA是生物相容的和生物可降解的乳酸和乙醇酸的共聚-聚合物，和各种形式的PLGA的特征可以在于乳酸∶乙醇酸的比率。乳酸可以是L-乳酸、D-乳酸或D，L-乳酸。PLGA的降解速率可以通过改变乳酸-乙醇酸比率来调节。在一些实施方式中，根据本发明要使用的PLGA的特征可以在于乳酸∶乙醇酸的比率为大约85∶15、大约75∶25、大约60∶40、大约50∶50、大约40∶60、大约25∶75或大约15∶85。在一些实施方式中，可以选择在微粒的聚合物(例如，PLGA嵌段共聚物或PLGA-PEG嵌段共聚物)中乳酸与乙醇酸单体的比率对各种参数优化(可以优化诸如水摄取、治疗药剂的释放和/或聚合物降解动力学)。

在一些实施方式中，聚合物可以是一种或多种丙烯酸聚合物。在某些实施方式中，丙烯酸聚合物包括，例如，丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰乙酯(cyanoethyl methacrylate)、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物、聚腈基丙烯酸酯以及包含一种或多种前述聚合物的组合。丙烯酸聚合物可以包含丙烯酸和甲基丙烯酸酯(含有低含量的季铵基团)的完全-聚合的共聚物。

在一些实施方式中，聚合物可以是阳离子聚合物。一般而言，阳离子聚合物能够缩合和/或保护核酸(例如DNA、RNA或其衍生物)带负电的链。在一些实施方式中，在公开的微粒中考虑使用含有胺的聚合物诸如聚(赖氨酸)、聚乙烯亚胺(PEI)和聚(酰氨胺)树状聚合物(dendrimer)。

在一些实施方式中，聚合物可以是携带有阳离子侧链的可降解的聚酯类。这些聚酯类的实例包括聚(L-丙交酯-共聚-L-赖氨酸)、聚(丝氨酸酯)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)。

本文公开的微粒可以含有或可以不含有PEG。此外，某些实施方式可以涉及含有聚(酯-醚)的共聚物，例如，具有通过酯键(例如，R-C(O)-O-R′键)和醚键(例如，R-O-R′键)连接的重复单元的聚合物。在本发明的一些实施方式中，生物可降解的聚合物，诸如可水解的聚合物(含有羧酸基团)可以与聚(乙二醇)重复单元轭合以形成聚(酯-醚)。含有聚(乙二醇)重复单元的聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)也可以被称作″PEG化″聚合物。

考虑PEG可以是封端的(terminated)和包含端基，例如，当PEG没有轭合至配体时。例如，PEG可以端接羟基、甲氧基或其它烷氧基基团、甲基或其它烷基基团、芳基基团、羧酸、胺、酰胺、乙酰基基团、胍基基团或咪唑。其它考虑的端基包括叠氮化物、炔、马来酰亚胺、醛、酰肼、羟胺，烷氧基胺或硫醇部分。

那些本领域的普通技术人员将知晓用于PEG化聚合物的方法和技术，例如，通过使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)以使聚合物向端接胺的PEG基团反应，通过开环聚合技术(ROMP)等。

在一个实施方式中，可以优化聚合物的分子量用于本文公开的有效治疗。例如，聚合物的分子量可以影响微粒降解速率(诸如当生物可降解的聚合物的分子量可以被调节时)、溶解度、水摄取和药物释放动力学。例如，聚合物的分子量可以被调节成，微粒在被治疗的受试者中在合理的时间段(从几小时到1-2周、3-4周、5-6周、7-8周等)内生物降解。公开的微粒可以，例如包含PEG和PL(G)A的二嵌段共聚物，其中例如，PEG部分可以具有约1,000-20,000，例如，约2,000-20,000，例如，约2-约10,000的数均分子量，和PL(G)A部分可以具有约5,000-约20,000或约5,000-100,000，例如，约20,000-70,000，例如，约15,000-50,000的数均分子量。

例如，本文公开的是示例性治疗性纳米微粒，所述治疗性纳米微粒包含约10-约99重量百分比的聚乳酸-聚乙二醇共聚物或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物，或约20-约80重量百分比、约40-约80重量百分比、或约30-约50重量百分比、或约70-约90重量百分比的聚乳酸-聚乙二醇共聚物或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物。示例性聚乳酸-聚乙二醇共聚物可以包含约15-约20kDa或约10-约25kDa的数均分子量的聚乳酸和约4-约6或约2kDa-约10kDa的数均分子量的聚乙二醇。

公开的纳米微粒可以任选地包含约1-约50重量百分比的聚乳酸或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸(不包含PEG)，或可以任选地包含约1-约50重量百分比、或约10-约50重量百分比、或约30-约50重量百分比的聚乳酸或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸。例如，聚乳酸或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸可以具有约5-约15kDa或约5-约12kDa的数均分子量。示例性PLA可以具有约5-约10kDa的数均分子量。示例性PLGA可以具有约8-约12kDa的数均分子量。

在某些实施方式中，纳米微粒的聚合物可以轭合至脂类(lipid)。例如，聚合物可以是脂类-封端的PEG。如下描述，聚合物的脂类部分可以用于与其它聚合物自装配，使得便于形成纳米微粒。例如，亲水聚合物能轭合至脂类，所述脂类将与疏水聚合物自装配。

在一些实施方式中，脂类是油。一般而言，本领域已知的任意油可以轭合至本发明使用的聚合物。在一些实施方式中，油可以包含一种或多种脂肪酸基团或其盐。在一些实施方式中，脂肪酸基团可以包含可消化的、长链(例如，C₈-C₅₀)、取代的或未经取代的烃。在一些实施方式中，脂肪酸基团可以是C₁₀-C₂₀脂肪酸或其盐。在一些实施方式中，脂肪酸基团可以是C₁₅-C₂₀脂肪酸或其盐。在一些实施方式中，脂肪酸可以是不饱和的。在一些实施方式中，脂肪酸基团可以是单不饱和的。在一些实施方式中，脂肪酸基团可以是多不饱和的。在一些实施方式中，不饱和脂肪酸基团的双键可以是顺式构型。在一些实施方式中，不饱和脂肪酸基团的双键可以是反式构型。

在一些实施方式中，脂肪酸基团可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、萮树酸或木蜡酸中的一种或多种。在一些实施方式中，脂肪酸基团可以是棕榈油酸、油酸、异油酸、亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚油酸、花生四烯酸、鳕油酸、精氨基琥珀酸、二十五碳五烯酸、二十二碳六烯酸或芥酸中的一种或多种。

在一个特定的实施方式中，脂类是式V：

及其盐，其中各R独立地是C_1-30烷基。在式V的一个实施方式中，脂类是1，2二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)，及其盐，例如，钠盐。

在一个实施方式中，任选小分子靶向部分键合，例如，共价键合至纳米微粒的脂类组分。例如，本文提供的是纳米微粒，所述纳米微粒包含治疗剂、聚合物基质(包含官能化和非-官能化聚合物)、和脂类、和低-分子量PSMA靶向配体，其中所述靶向配体键合，例如，共价键合至纳米微粒的脂类组分。在一个实施方式中，键合至低-分子量靶向部分的脂类组分是式V。在另一个实施方式中，本发明提供靶向-特异性的纳米微粒，所述纳米微粒包含治疗剂、聚合物基质、DSPE、和低-分子量PSMA靶向配体，其中所述配体是键合，例如，共价键合至DSPE。例如，本发明的纳米微粒可以包含含有PLGA-DSPE-PEG-配体的聚合物基质。

考虑的纳米微粒可包含一定比率的有效治疗***癌的配体-结合聚合物与非-官能化聚合物，其中亲水、配体-结合聚合物轭合至将与疏水聚合物自装配的脂类，使得疏水和亲水聚合物构成非共价结合的纳米微粒。“自装配”指高次结构(higher order structure)的自发装配过程，这依赖于高次结构的组分(例如，分子)彼此地天然吸引。典型地，它基于大小、形状、组成或化学特性，通过分子的随机运动和键的形成出现。例如，这种方法包括提供第一聚合物，所述第一聚合物与脂类反应，以形成聚合物/脂类轭合物。然后所述聚合物/脂类轭合物与低-分子量配体反应以制备配体-结合的聚合物/脂类轭合物；和将所述配体-结合的聚合物/脂类轭合物与第二、非-官能化聚合物，和治疗剂混合；从而形成纳米微粒。在某些实施方式中，所述第一聚合物是PEG，从而形成脂类-封端的PEG。在一个实施方式中，式V的脂类是，例如，2二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)及其盐，例如，钠盐。然后，所述脂类-封端的PEG可以，例如，与PLGA混合以形成纳米微粒。

靶向部分

本文提供的是纳米微粒，所述纳米微粒可以包括任意的靶向部分，即，能够结合至生物学本体或以其它方式与生物学本体缔合的部分，所述生物学本体例如，膜组分、细胞表面受体、***特异性膜抗原或诸如此类。在微粒表面存在的靶向部分可以允许微粒适合局限于特定的靶向位点，例如，肿瘤、患处、组织、器官、细胞的类型等。这样，然后所述纳米微粒可以是“靶专一性”。在某些情况中，然后药物或其它有效负荷(payload)可以从微粒中释放和被允许与特定的靶向位点局部相互作用。

在一个实施方式中，公开的纳米微粒包含靶向部分，所述靶向部分是低-分子量配体，例如，低-分子量PSMA配体。本文使用的术语“结合”指一对相应的分子或其部分之间的相互作用，所述分子或其部分之间展示相互的亲和力或结合能力，一般地由于特异性的或非-特异性结合或相互作用，包括但不限于生物化学、生理学和/或化学相互作用。“生物学结合”定义了相互作用的类型，所述相互作用在分子(包括蛋白质、核酸、糖蛋白、碳水化合物、激素或诸如此类)对之间出现。术语“结合伴侣(binding partner)”指可以经历与特定分子结合的分子。“特异性结合”指能够结合至或识别结合伴侣(或有限数量的结合伴侣)的分子(诸如聚核苷酸)，其以相对于其它、相似生物学本体基本上更高的程度来结合或识别。在一组实施方式中，所述靶向部分具有低于约1微摩尔、至少约10微摩尔或至少约100微摩尔的亲和力(经由解离常数测量的)。

例如，靶向部分可以使得微粒适合局限于受试者体内的肿瘤(例如实体瘤)、患处、组织、器官、细胞类型等，这取决于使用的靶向部分。例如，低-分子量PSMA配体可以适合局限于实体瘤，例如乳腺或***肿瘤或癌细胞。所述受试者可以是人类或非-人类动物。受试者的实例包括但不限于哺乳动物诸如狗、猫、马、驴、兔子、母牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、灵长类、人类，或诸如此类。

考虑靶向部分包括小分子。在某些实施方式中，术语“小分子”指无论是否是天然存在的或是人工产生的(例如，经由化学合成)具有相对的低分子量且不是蛋白质、多肽或核酸的有机化合物。小分子一般地具有碳-碳多键。在某些实施方式中，小分子的尺寸是低于约2000g/Mol。在一些实施方式中，小分子低于约1500g/mol或低于约1000g/mol。

在一些实施方式中，小分子低于约800g/mol或低于约500g/mol，例如约100g/mol-约600g/mol、或约200g/mol-约500g/Mol。

例如，靶向部分可以小靶向(small target)***癌肿瘤，例如靶向部分可以是PSMA肽酶抑制剂。这些部分在本文也称作“低-分子量PSMA配体”。当与正常组织中的表达相比较时，***特异性膜抗原(PSMA)在恶性***的表达相对于在正常组织中的表达是至少10-倍过表达的，和随着疾病发展至转移期PSMA表达的水平进一步上调(Silver等人1997，Clin.cancer Res.，3：81)。

在一些实施方式中，所述低-分子量PSMA配体是式I、II、III或IV：

及其对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、非对映异构体或外消旋体；

其中m和n各自独立地是0、1、2或3；p是0或1；

R¹、R²、R⁴和R⁵各自独立地选自取代的或未取代的烷基(例如，C_1-10-烷基、C_1-6-烷基或C_1-4-烷基)、取代的或未取代的芳基(例如，苯基或吡啶基(pyrdinyl))，及其任意的组合；和R³是H或C_1-6-烷基(例如，CH₃)。

对于式I、II、III和IV的化合物，R¹、R²、R⁴或R⁵包含连接至纳米微粒的点，例如，连接至聚合物(形成公开的纳米微粒的部分，例如，PEG)的点。连接的点可以通过下述键形成：共价键、离子键、氢键，通过吸附(包括化学吸附和物理吸附)形成的键、通过范德华键或色散力形成的键。例如，如果R¹、R²、R⁴或R⁵被定义为苯胺或C_1-6-烷基-NH₂基团，这些官能团的任意氢(例如，氨基氢)可以被除去使得低-分子量PSMA配体共价结合至纳米微粒的聚合物基质(例如，聚合物基质的PEG-嵌段)。本文使用的术语“共价结合”指两个原子之间通过共有至少一对电子所形成的键。

在式I、II、III或IV的特定的实施方式中，R¹、R²、R⁴和R⁵各自独立地是C_1-6-烷基或苯基或C_1-6-烷基或苯基的任意组合，其独立地被OH、SH、NH₂或CO₂H取代一次或更多次，并且其中所述烷基基团可以被N(H)、S或O隔断。在另一个实施方式中，R¹、R²、R⁴和R⁵各自独立地是CH₂-Ph、(CH₂)₂-SH、CH₂-SH、(CH₂)₂C(H)(NH₂)CO₂H、CH₂C(H)(NH₂)CO₂H、CH(NH₂)CH₂CO₂H、(CH₂)₂C(H)(SH)CO₂H、CH₂-N(H)-Ph、O-CH₂-Ph或O-(CH₂)₂-Ph，其中各Ph可以独立地被OH、NH₂、CO₂H或SH取代一次或更多次。对于这些式，所述NH₂、OH或SH基团充当共价连接至纳米微粒(例如，-N(H)-PEG，-O-PEG或-S-PEG)的点。

在又一实施方式中，所述低-分子量PSMA配体选自

及其对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、非对映异构体或外消旋体，并且其中所述NH₂、OH或SH基团充当共价连接至纳米微粒(例如，-N(H)-PEG、-O-PEG或-S-PEG)的点。

在又一个实施方式中，所述低-分子量PSMA配体选自

及其对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、非对映异构体或外消旋体，其中R是独立地选自NH₂、SH、OH、CO₂H、被NH₂、SH、OH或CO₂H取代的C_1-6-烷基，和被NH₂、SH、OH或CO₂H取代的苯基，并且其中R充当共价连接至纳米微粒(例如，-N(H)-PEG、-S-PEG、-O-PEG或CO₂-PEG)的点。

在又一个实施方式中，所述低-分子量PSMA配体选自

及其对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、非对映异构体或外消旋体，其中所述NH₂或CO₂H基团充当共价连接至纳米微粒(例如，-N(H)-PEG或CO₂-PEG)的点。这些化合物可以进一步被下述基团取代：NH₂、SH、OH、CO₂H、被NH₂、SH、OH或CO₂H取代的C_1-6-烷基或被NH₂、SH、OH或CO₂H取代的苯基，其中这些官能团还可充当共价连接至纳米微粒的点。

在又一个实施方式中，所述低-分子量PSMA配体是

及其对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、非对映异构体或外消旋体，其中n是1、2、3、4、5或6。对于该配体，NH₂基团充当共价连接至纳米微粒(例如，-N(H)-PEG)的点。

在又一实施方式中，所述低-分子量PSMA配体是

及其对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、非对映异构体或外消旋体。特别地，丁胺化合物具有易于合成的优势，特别是因为它缺少苯环。另外，不希望受到理论的束缚，所述丁胺化合物将可能分解成天然存在的分子(即，赖氨酸和谷氨酸)，由此使相关毒性最小化。

在一些实施方式中，可以用于靶向与实体瘤(诸如，***或乳腺癌肿瘤)有关的细胞的小分子靶向部分包括PSMA肽酶抑制剂，诸如2-PMPA、GPI5232、VA-033、苯基烷基膦酰胺(phenylalkylphosphonamidate)和/或其类似物和衍生物。在一些实施方式中，可以用于靶向与***癌肿瘤有关的细胞的小分子靶向部分包括硫醇和吲哚硫醇衍生物，诸如2-MPPA和3-(2-巯基乙基)-1H-吲哚-2-甲酸衍生物。在一些实施方式中，可以用于靶向与***癌肿瘤有关的细胞的小分子靶向部分包括氧肟酸盐衍生物。在一些实施方式中，可以用于靶向与***癌肿瘤有关的细胞的小分子靶向部分包含基于PBDA-和脲的抑制剂(诸如ZJ 43、ZJ 11、ZJ 17、ZJ 38和/或和及其类似物和衍生物)、雄激素受体靶向药剂(ARTAs)、聚胺(诸如腐胺、精胺和精脒)、酶谷氨酸羧化酶II(enzyme glutamate carboxylase II)(GCPII)的抑制剂，也称作NAAG肽酶或NAALAD酶。

在本发明的又一个实施方式中，所述靶向部分可以是靶向Her2、EGFR或toll受体的配体。

例如，考虑所述靶向部分可以包括核酸、多肽、糖蛋白、碳水化合物或脂类。例如，靶向部分可以是结合至细胞类型特异性标志物(marker)的核酸靶向部分(例如适体，例如，A10适体)。一般而言，适体是结合至特定的靶(诸如多肽)的寡核苷酸(例如，DNA、RNA或其类似物或衍生物)。在一些实施方式中，靶向部分可以是细胞表面受体的天然存在的或合成的配体，例如，生长因素、激素、LDL、转铁蛋白等。靶向部分可以是抗体，所述术语意旨包括抗体片段、抗体的特征的部分，单链靶向部分可以，例如，使用操作诸如噬菌体展示鉴定。

靶向部分可以是靶向肽或靶向拟肽(peptidomimetic)，其具有高至约50个残基的长度。例如，靶向部分可以包括氨基酸序列AKERC、CREKA、ARYLQKLN或AXYLZZLN，其中X和Z是可变的氨基酸或保守变体或其拟肽。在特定的实施方式中，所述靶向部分是包括氨基酸序列AKERC、CREKA、ARYLQKLN或AXYLZZLN的肽，其中X和Z是可变氨基酸，并且具有低于20、50或100个残基的长度。还考虑所述CREKA(Cys Arg Glu Lys Ala)肽或其拟肽或辛肽AXYLZZLN作为靶向部分，以及肽或保守变体或其拟肽(结合胶原IV或靶组织基膜(例如，血管的靶组织基膜)或与其形成复合物)，可以用作靶向部分。示例性靶向部分包含靶向ICAM(细胞间粘附分子，例如ICAM-1)的肽。

本文公开的靶向部分一般地轭合至公开的聚合物或共聚物(例如PLA-PEG)，并且这种聚合物轭合物可以形成部分公开的纳米微粒。例如，公开的治疗性纳米微粒可以任选地包含约0.2-约10重量百分比的PLA-PEG或PLGA-PEG，其中所述PEG被靶向配体(例如PLA-PEG-配体)官能化。考虑治疗性纳米微粒可以包括，例如，约0.2-约10摩尔百分比的PLA-PEG-GL2或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-PEG-GL2。例如，PLA-PEG-GL2可以包括约10kDa-约20kDa的数均分子量和约4,000-约8,000的数均分子量。

在一些实施方式中，这种靶向配体可以共价结合至PEG(例如，经由亚烷基连接子结合至PEG)，例如PLA-PEG-亚烷基-GL2。例如，公开的纳米微粒可以包含约0.2-约10摩尔百分比的PLA-PEG-GL2或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-PEG-GL2。应当理解地是，参考PLA-PEG-GL2或PLGA-PEG-GL2指可以包括将PLA-PEG或PLGA-PEG连接至GL2的亚烷基连接子(例如C₁-C₂₀，例如，(CH₂)₅)的部分。

示例性聚合物轭合物包括：

其中R₁选自H，和被一、二、三或更多个卤素任选地取代的C₁-C₂₀烷基基团；

R₂是键、酯连接基或酰胺连接基；

R₃是C₁-C₁₀亚烷基或键；

x是50-约1500或约60-约1000；

y是0-约50；和

z是约30-约200或约50-约180。

在不同的实施方式中，x表示0-约1摩尔分数；和y可以表示约0-约0.5摩尔分数。在一个示例性的实施方式中，x+y可以是约20-约1720，和/或z可以是约25-约455。

例如，公开的纳米微粒可以包括式VI所示的聚合物靶向部分：

其中n是约200-约300，例如，约222，和m是约80-约130，例如约114。在某些实施方式中，公开的纳米微粒可以包含约0.1-约4％(按重量计)的例如式VI的聚合物轭合物，或约0.1-约2％、或约0.1-约1％、或约0.2％-约0.8％(按重量计)的例如式VI的聚合物轭合物。

在一个示例性的实施方式中，公开的纳米微粒包含含有PLA-PEG-亚烷基-GL2轭合物的纳米微粒，其中，例如，PLA具有约16,000Da的数均分子量，PEG具有约5000Da的分子量，和例如，亚烷基连接子是C₁-C₂₀亚烷基，例如(CH₂)₅。

例如，公开的纳米微粒可以包含由下式表示的轭合物：

其中y是约222和z是约114。

公开的聚合物轭合物可以使用任意适宜的轭合技术形成。例如，使用下述技术两种化合物(诸如靶向部分和生物相容的聚合物，生物相容的聚合物和聚(乙二醇)等)可以一起轭合，诸如EDC-NHS化学(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸化物和N-羟基琥珀酰亚胺)或牵涉马来酰亚胺或羧酸的反应，其可以轭合至硫醇、胺或类似地官能化的聚醚的一端。这种聚合物的轭合(例如，聚(酯)和聚(醚)的轭合以形成聚(酯-醚))可以在下述有机溶剂中进行，诸如但不限于二氯甲烷、乙腈、氯仿、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、丙酮或诸如此类。使用不超过常规的实验，本领域的那些普通技术人员可以确定具体的反应条件。

在又一组实施方式中，轭合反应可以通过包含羧酸官能团(例如，聚(酯-醚)化合物)的聚合物与聚合物或包含胺的其它部分(诸如靶向部分)反应来进行。例如，靶向部分，诸如低-分子量PSMA配体，可以与胺反应以形成含有胺的部分，然后所述含有胺的部分可以轭合至聚合物的羧酸。这种反应可以作为单-步反应出现，即，所述轭合不使用中间体诸如N-羟基琥珀酰亚胺或马来酰亚胺来进行。在一组实施方式中，通过将含有胺的部分加入到含有羧酸-封端的聚合物的溶液中，可以实现在含有胺的部分和羧酸-封端的聚合物(诸如聚(酯-醚)化合物)之间的所述轭合反应，所述含有胺的部分溶解于有机溶剂诸如(但不限于)二氯甲烷、乙腈、氯仿、四氢呋喃、丙酮、甲酰胺、二甲基甲酰胺、吡啶、二

烷或二甲基亚砜。所述羧酸-封端的聚合物可以包含于有机溶剂诸如但不限于二氯甲烷、乙腈、氯仿、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或丙酮中。在某些情况中，在含有胺的部分和羧酸-封端的聚合物之间的反应可以自发地出现。未轭合的反应物可以在这种反应之后被洗涤掉，并且所述聚合物可以在溶剂诸如，例如，二***、己烷、甲醇或乙醇中沉淀。

作为具体的实例，低-分子量PSMA配体可以如下在微粒中作为靶向部分制备。羧酸改性的聚丙交脂-乙交脂共聚物(PLGA-COOH)可以轭合至胺-改性的异双功能聚(乙二醇)(NH₂-PEG-COOH)以形成PLGA-PEG-COOH的共聚物。使用胺-改性的低-分子量PSMA配体(NH₂-Lig)，通过将PEG的羧酸端轭合至所述配体上的胺官能团可以形成PLGA-PEG-Lig的三嵌段聚合物。然后可以使用多嵌段聚合物，例如如如下讨论的例如，用于治疗性应用。

本文使用的术语“烷基”包括饱和的脂族基团，包括直-链烷基基团(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、支-链烷基基团(异丙基、叔-丁基、异丁基等)、环烷基(脂环)基团(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、烷基取代的环烷基基团、和环烷基取代的烷基基团。

术语“芳基”包括这样的基团，其包括可以含有0-4个杂原子的5-和6-元单-环芳族基团，例如，苯基、吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、异噻唑、咪唑、***、四唑、吡唑、

唑、异

唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、和嘧啶，和诸如此类。另外，术语“芳基”包括多环芳基基团，例如，三环、双环，例如，萘、苯并

唑、苯并二

唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噻吩、亚甲基二氧基苯基、喹啉、异喹啉、蒽基、菲基、萘啶(napthridine)、吲哚、苯并呋喃、嘌呤、苯并呋喃，脱氮杂嘌呤(deazapurine)或吲嗪。那些在环结构中含有杂原子的芳基基团也可以被称作“芳基杂环”、“杂环”、“杂芳基”或“杂芳族化合物”。所述芳族环可以在一个或多个环位置被如上所述的这种取代基取代，例如，烷基、卤素、羟基、烷氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧基羰基氧基、羧酸根(carboxylate)、烷基羰基、烷基氨基羰基(alkylaminoacarbonyl)、芳烷基氨基羰基、烯基氨基羰基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、烯基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基、磷酸根(phosphate)、膦酸根(phosphonato)、次膦酸根(phosphinato)、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基，和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸根、硫酸根、烷基亚硫酰基、磺酸根(sulfonato)、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或芳族或杂芳族部分。芳基基团也可以与脂环或杂环(非芳环)稠合或桥接以形成聚环(例如，四氢萘)。

靶向部分可以，例如，进一步被官能团(其可以与本发明的聚合物(例如，PEG)反应)取代，从而产生轭合至靶向部分的聚合物。所述官能团包括可以用于与聚合物(例如，PEG)产生共价键的任意部分，诸如氨基、羟基、和硫代。在一个特定的实施方式中，小分子可以被NH₂、SH或OH取代，它们直接结合至小分子或经由额外的基团，例如，烷基或苯基结合至小分子。在一个非-限制性实例中，在本文引用的专利、专利申请、和非-专利参考文献中公开的小分子可以是结合至苯胺、烷基-NH₂(例如，(CH₂)_1-6NH₂)或烷基-SH(例如，(CH₂)_1-6NH₂)，其中所述NH₂和SH基团可以与聚合物(例如，PEG)反应，以与聚合物形成共价键，即，形成聚合物轭合物。

例如，本文公开的是纳米微粒，所述纳米颗粒包含治疗剂；和第一高分子，所述第一高分子包含轭合至配体的PLGA-PEG共聚物或PLA-PEG共聚物，所述配体具有约100g/mol-500g/mol的分子量，其中轭合至配体的所述PLGA-PEG共聚物或PLA-PEG共聚物是约0.1-约30摩尔百分比的总聚合物含量、或约0.1-约20摩尔百分比、或约0.1-约10摩尔百分比、或约1-约5摩尔百分比的纳米微粒的总聚合物含量。这种纳米微粒可以进一步包含第二高分子，所述第二高分子包含PLGA-PEG共聚物或PLA-PEG共聚物，其中所述共聚物并未结合至靶向部分；和药学上可接受的赋形剂。例如，相对于总聚合物含量，所述第一共聚物可以含有约0.001-5的重量百分比的配体。

示例性纳米微粒可以包括治疗剂；和聚合物组合物，其中所述聚合物组合物包含：含有结合至配体的第一聚合物的第一高分子；和含有未结合至靶向部分的第二聚合物的第二高分子；其中所述聚合物组合物包含约0.001-约5.0重量百分比的所述配体。这种配体可以具有约100g/mol-约6000g/mol、或低于约1000g/mol，例如约100g/mole-约500g/mol的分子量。在另一个实施方式中，本文提供的是药物组合物，包含多种靶-特异性的聚合物纳米微粒，各包含治疗剂；和聚合物组合物，其中所述聚合物组合物包含约0.1-约30摩尔百分比、或约0.1-约20摩尔百分比、或约0.1-约10摩尔百分比的含有结合至配体的第一聚合物的第一高分子；和含有未结合至靶向部分的第二聚合物的第二高分子；和药学上可接受的赋形剂。

纳米微粒

公开的纳米微粒可以具有基本上球形的(即，所述微粒一般地似乎是球形的)或非-球形的结构。例如，所述微粒，在膨胀或皱缩后，可以采用非-球形的结构。在某些情况中，所述微粒可以包括聚合物掺合物。例如，可以形成聚合物掺合物，它包含含有靶向部分(即，低-分子量PSMA配体)和生物相容的聚合物的第一聚合物，和含有生物相容的聚合物而不含有靶向部分的第二聚合物。通过控制第一和第二聚合物在最终聚合物中的比率，可以容易地将所述最终聚合物中的靶向部分的浓度和位置控制到任意合适的程度。

公开的纳米微粒可以具有低于约1微米的特征尺度，其中微粒的所述特征尺度是具有与所述微粒相同体积的正球形的直径。例如，所述微粒可以具有下述的所述微粒的特征尺度：在某些情况中可以低于约300nm、低于约200nm、低于约150nm、低于约100nm、低于约50nm、低于约30nm、低于约10nm、低于约3nm或低于约1nm。在特定的实施方式中，本发明的纳米微粒具有约80nm-200nm、约60nm-约150nm或约70nm-约200nm的直径。

在一组实施方式中，所述微粒可以具有内部和表面，其中所述表面具有不同于内部的组成，即，在内部可以至少存在一种不存在于表面上的化合物(或反之亦然)，和/或至少一种化合物以不同的浓度是存在于内部和表面上。例如，在一个实施方式中，化合物，诸如本发明的聚合物轭合物的靶向部分(即，低-分子量配体)，可以存在于所述微粒的内部和表面，但是相对于所述微粒的内部，它以较高浓度存在于所述微粒的表面，尽管在某些情况中，所述微粒在内部的浓度可以基本上为非零，即，在所述微粒的内部存在可检测量的化合物。

在某些情况中，所述微粒的内部比所述微粒的表面更加疏水。例如，相对于所述微粒的表面，所述微粒的内部可以是相对疏水的，并且药物或其它有效负荷可以是疏水的，和容易地与相对疏水的所述微粒的中心缔合。从而所述药物或其它有效负荷可以包含于所述微粒的内部中，这可以使其遮蔽而免于接触所述微粒周围的外部环境(或反之亦然)。例如，给予受试者的包含在微粒中的药物或其它有效负荷将被保护而免于接触受试者身体，并且身体也将与所述药物分离。本发明的还又一方面涉及聚合物微粒，所述聚合物微粒含有超过一种存在的聚合物或高分子，和牵涉这种聚合物或高分子的库(libraries)。例如，在一组实施方式中，微粒可以含有超过一种可辨别的聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)，并且两种(或更多种)聚合物的比率是可以被独立地控制的，这便于所述微粒的特性的控制。例如，第一聚合物可以是含有靶向部分和生物相容的部分的聚合物轭合物，和第二聚合物可以含有生物相容的部分而不含有靶向部分、或第二聚合物可以含有与第一聚合物可辨别的生物相容的部分。因此，聚合物微粒中的这些聚合物的量的控制可以用于控制所述微粒的多种物理、生物学或化学特性，例如，所述微粒的尺寸(例如，通过改变聚合物之一或二者的分子量)、表面电荷(例如，通过控制所述聚合物的比率，如果所述聚合物具有不同的电荷或端基)、表面亲水性(例如，如果所述聚合物具有不同的分子量和/或亲水性)、所述靶向部分的表面密度(例如，通过控制两种或更多种聚合物的比率)等。

作为具体的实例，微粒可以包含含有聚(乙二醇)和轭合至所述聚(乙二醇)的靶向部分的第一二嵌段聚合物，和含有聚(乙二醇)而不含靶向部分或含有聚(乙二醇)和靶向部分的第二聚合物，其中所述第二聚合物的聚(乙二醇)具有相对于所述第一聚合物的聚(乙二醇)不同的长度(或重复单元的数目)。作为又一实例，微粒可以包含含有第一生物相容的部分和靶向部分的第一聚合物，和含有不同于第一生物相容的部分的第二生物相容的部分的第二聚合物(例如，具有不同的组成、基本上不同的重复单元的数目等)和靶向部分。作为还又一实例，第一聚合物可以包含生物相容的部分和第一靶向部分，和第二聚合物可以包含生物相容的部分和不同于第一靶向部分的第二靶向部分。

例如，本文公开的是能够结合至靶的治疗性聚合物纳米微粒，包含第一非-官能化聚合物；任选的第二非-官能化聚合物；含有靶向部分的官能化聚合物；和治疗剂；其中所述纳米微粒包含约15-约300分子的官能化聚合物、或约20-约200分子、或约3-约100分子的官能化聚合物。

在一个特定的实施方式中，本发明纳米微粒的第一或第二高分子聚合物是PLA、PLGA或PEG或其共聚物。在具体的实施方式中，第一高分子的聚合物是PLGA-PEG共聚物，和第二高分子是PLGA-PEG共聚物或PLA-PEG共聚物。例如，示例性纳米微粒可具有PEG冠(corona)，其密度为约0.065g/cm³或约0.01-约0.10g/cm³。

公开的纳米微粒可以是稳定的(例如保留基本上全部活性剂)，例如在室温或在25℃在含有糖的溶液中保持稳定至少约3天、约4天或至少约5天。

在一些实施方式中，公开的纳米微粒也可以包含脂肪醇，其可以增加药物释放的速率。例如，公开的纳米微粒可以包含C₈-C₃₀醇诸如鲸蜡醇、辛醇、硬脂醇、花生醇、山嵛醇(docosonal)或octasonal。

纳米微粒可以具有控制释放特性，例如，在延长的时间段，例如1天、1周或更长的时间内，可以能够将一定量的活性剂递送至患者，例如，患者的具***点。在一些实施方式中，公开的纳米微粒基本上立即释放(例如在约1分钟-约30分钟)低于约2％、低于约5％或低于约10％的活性剂(例如紫杉烷)药剂，例如当被放置在室温和/或在37℃的磷酸盐缓冲溶液。

例如，含有治疗剂的公开的纳米微粒可以，在一些实施方式中，当被放置在例如，25C的水溶液中可以以基本上相应于下述的速率释放治疗剂：a)在约1小时后释放约0.01-约20％的总治疗剂；b)在约8小时后释放约10-约60％的治疗剂；c)在约12小时后释放约30-约80％的总治疗剂；和d)在约24小时后释放不低于约75％的总治疗剂。

在一些实施方式中，在将含有公开的纳米微粒的公开的纳米微粒或组合物给予受试者或患者之后，相对于如果单独给予的治疗剂(例如，不作为纳米微粒的一部分)的C_max而言，治疗剂在所述患者中的血浆峰浓度(C_max)基本上更高。

在又一个实施方式中，相对于单独给予的治疗剂的t_max而言，当将含有治疗剂的公开的纳米微粒给予受试者时，所述治疗剂可以具有的治疗剂的t_max基本上更长。

也可以形成这种微粒库。例如，通过改变两种(或更多种)聚合物在所述微粒中的比率，这些库可以用于筛选测试、高-通量测定、或诸如此类。通过诸如上面描述的那些特性，库内的实体(Entities)可以变化，和在某些情况中，所述微粒的一种以上特性可以在库内变化。相应地，本发明的一个实施方式涉及具有不同比率的聚合物(具有不同特性)的纳米微粒的库。所述库可以包含任意适宜比率的聚合物。

图1说明使用聚合物诸如上面描述的那些聚合物可以产生库。例如，在图1，聚合物微粒包含含有生物相容的疏水的聚合物、生物相容的亲水聚合物，和低-分子量PSMA配体的第一高分子，和含有生物相容的疏水的聚合物和生物相容的亲水聚合物的第二高分子，所述聚合物微粒可以用于产生具有不同比率的第一和第二高分子的微粒的库。

这种库可用于实现具有任意数目的希望的特性的微粒，例如特性诸如表面官能度、表面电荷、尺寸、zeta(ζ)电位、疏水性、控制免疫原性的能力、或诸如此类。

作为具体的实例，在本发明的一些实施方式中，所述库包含含有生物相容的聚合物和低-分子量配体的聚合物轭合物的微粒，如本文所讨论。参考图1，显示的这种微粒是非-限制实例。在该图中，公开的聚合物轭合物用于形成微粒10。形成微粒10的聚合物包含存在于所述微粒表面的低-分子量配体15，和生物相容的部分17。在某些情况中，如在此所示，靶向部分15可以是轭合至生物相容的部分17。然而，并非全部生物相容的部分17被显示轭合至靶向部分15。例如，在某些情况中，微粒，诸如微粒10可以使用含有生物相容的部分17和低-分子量配体15的第一聚合物，和含有生物相容的部分17而不含靶向部分15的第二聚合物来形成。通过控制第一和第二聚合物的比率，可以形成具有不同特性的微粒，并且在某些情况中，可以形成这种微粒的库。此外，药物12包含在微粒10的中心。在某些情况中，由于疏水效应，药物12可以包含在所述微粒中。例如，相对于所述微粒的表面，所述微粒的内部可以是相对疏水的，并且药物可以是与所述微粒的相对疏水中心缔合的疏水药物。在一个实施方式中，治疗剂与纳米微粒的表面缔合、被包封在纳米微粒中、被纳米微粒包围或分散在整个纳米微粒中。在另一个实施方式中，所述治疗剂被纳米微粒的疏水核包封。

作为具体的实例，微粒10可以包含含有相对疏水的生物相容的聚合物和相对亲水的靶向部分15的聚合物，使得在微粒形成期间，更高浓度的亲水靶向部分暴露在表面上和更高浓度的疏水的生物相容的聚合物存在于所述微粒的内部。

在一些实施方式中，生物相容的聚合物是疏水聚合物。生物相容的聚合物的非-限制实例包括聚丙交酯、聚乙醇酸交酯、和/或聚丙交脂-乙交脂共聚物。

在不同的实施方式中，该公开提供纳米微粒包含1)聚合物基质；2)任选地，两亲的化合物或层，其包围所述聚合物基质或分散在聚合物基质中，形成所述微粒的连续或不连续的壳；3)非-官能化聚合物，其可以形成部分聚合物基质，和4)共价连接至聚合物的低分子量PSMA配体，其可以形成部分聚合物基质。例如，两亲的层可以减少水穿透进入纳米微粒，由此增强药物包封效率和减慢药物释放。

本文使用的术语“两亲的”指其中分子具有极性部分和非-极性部分的特性。常常，两亲的化合物具有连接至长疏水尾部的极性头。在一些实施方式中，极性部分可溶于水，而非-极性部分不溶于水。此外，所述极性部分可以具有有效的正电荷或有效的负电荷。另选地，所述极性部分可以具有有效的正电荷和有效的负电荷，并且是两性离子或内盐。对于本发明的意图而言，所述两亲的化合物可以但不限于下述的一种或多种：天然衍生的脂类、表面活性剂或用亲水和疏水的部分合成的化合物。

两亲的化合物的具体实例包括但不限于，磷脂类，诸如1，2二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、花生四烯酰磷脂酰胆碱(DAPC)，二山嵛酰磷脂酰胆碱(DBPC)，二二十三酰磷脂酰胆碱(DTPC)，和dilignoceroylphatidylcholine(DLPC)，以0.01-60(重量脂类/w聚合物)、最优选0.1-30(重量脂类/w聚合物)的比率掺入。可以使用的磷脂类包括但不限于，磷脂酸、含有饱和和不饱和的脂类的磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰衍生物、心磷脂、和β-酰基-y-烷基磷脂。磷脂类的实例包括但不限于，磷脂酰胆碱，诸如二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二十五酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、花生四烯酰磷脂酰胆碱(DAPC)、二山嵛酰磷脂酰胆碱(DBPC)、二二十三酰磷脂酰胆碱(DTPC)，dilignoceroylphatidylcholine(DLPC)；和磷脂酰乙醇胺类，诸如二油酰磷脂酰乙醇胺或1-十六烷基-2-棕榈酰甘油磷酸(glycerophos)-磷酸乙醇胺(phoethanolamine)。可以使用含有非对称酰基链(例如，含有一条6个碳的酰基链和另一条12个碳的酰基链)的合成磷脂。

在一个特定的实施方式中，可以用于形成两亲的层的两亲的组分是卵磷脂，和，特别地，磷脂酰胆碱。卵磷脂是两亲的脂类和，这样，形成具有面向它们周围的亲水(极性)头(其时常含水)，和彼此相对的疏水尾部的磷脂双层。卵磷脂具有可用形式的天然脂类(例如，大豆)的优势，和已经获得FDA的批准用于其它递送装置。此外，脂类诸如卵磷脂的混合物相对于单个纯脂类更为有利。

在某些实施方式中，公开的纳米微粒具有两亲的单层，意旨所述层不是磷脂双层，但是作为单个连续或不连续的层围绕纳米微粒或在其中存在。所述两亲的层是与本发明的纳米微粒“缔合”，意旨它位于聚合物基质附近，诸如包围聚合物壳的外部或分散在组成纳米微粒的聚合物中。

纳米微粒的制备

该公开的又一方面涉及制备公开的纳米微粒的***和方法。在一些实施方式中，以不同的比率使用两种或更多种不同的聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)和从所述聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)产生微粒，控制所述微粒的特性。例如，一种聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)可以包括低-分子量PSMA配体，而为了其生物相容性和/或控制所得的颗粒的免疫原性的能力可以选择另一种聚合物(例如，共聚物，例如，嵌段共聚物)。

在一组实施方式中，通过提供包含一种或多种聚合物的溶液，和将所述溶液与聚合物非溶剂接触以产生所述微粒，来形成所述微粒。所述溶液可以是与所述聚合物非溶剂可混溶的或不可混溶的。例如，水-可混溶的液体诸如乙腈可以含有所述聚合物，和随着乙腈与水、聚合物非溶剂接触(例如，通过以控制速率将乙腈倾倒进入水)形成微粒。包含在溶液中的聚合物，在聚合物非溶剂接触时，随后可以沉淀形成微粒诸如纳米微粒。在环境温度和压力，当一种液体不溶于另一种的程度为至少10％(按重量计)时，两种液体被称为彼此“不可混溶”或不混溶。一般地，有机溶液(例如，二氯甲烷、乙腈、氯仿、四氢呋喃、丙酮、甲酰胺、二甲基甲酰胺、吡啶、二

烷、二甲基亚砜等)和含水液体(例如，水或含有溶解的盐或其它物种的水、细胞或生物学介质、乙醇等)彼此不可混溶。例如，第一溶液可以倾倒进第二溶液(以适宜的速率或速度)。在某些情况中，随着第一溶液接触不可混溶的第二液体，微粒诸如纳米微粒可以形成，例如，在接触时聚合物沉淀导致聚合物形成纳米微粒，而第一溶液倾倒的进入第二液体，和在某些情况中，例如，当引入的速率是仔细地控制和保持相对慢的速率时，纳米微粒可以形成。通过本领域的普通技术人员仅使用惯例实验可以容易地优化控制这种微粒形成。

使用公开的方法，可以高度控制特性诸如表面官能性、表面电荷、尺寸、zeta(ζ)电位、疏水性、控制免疫原性的能力，和诸如此类。例如，微粒的库可以被合成，和筛选以鉴别具有特定的比率的聚合物的微粒，所述聚合物使所述微粒在所述微粒的表面上存在具有具体密度的部分(例如，低-分子量PSMA配体)。这允许具有一种或多种具体的特性的微粒被制备，例如，具体的尺寸和具体的表面密度的部分，而无需过度的劳动。相应地，本发明的某些实施方式涉及使用这种库的筛选技术，以及使用这种库鉴别的任意微粒。此外，可通过任意适宜的方法来鉴别。例如，鉴别可以是直接的、或间接的、或定量进行或定性进行。

在一些实施方式中，使用与那些描述用于产生配体-官能化聚合物轭合物的操作相同的操作，用靶向部分使已经-形成的纳米微粒官能化。例如，第一共聚物(PLGA-PEG，聚丙交脂-乙交脂共聚物和聚(乙二醇))与治疗剂混合以形成微粒。然后，所述微粒与低-分子量配体缔合以形成纳米微粒，所述纳米微粒可以用于治疗癌症。所述微粒可以与不同量的低-分子量配体缔合从而控制所述纳米微粒的配体表面密度，由此改变所述纳米微粒的治疗特征。另外，例如，通过控制参数诸如分子量、PEG的分子量，和纳米微粒表面电荷，可以获得非常精确的控制微粒。

在又一个实施方式中，提供纳米乳化过程，诸如图3和4所表示的过程。例如，治疗剂、第一聚合物(例如，二嵌段共聚-聚合物诸如PLA-PEG或PLGA-PEG，其中任何一个可以是任选地结合至配体，例如，GL2)和任意的第二聚合物(例如(PL(G)A-PEG或PLA)与有机溶液形成第一有机相。这种第一相可以包含约5-约50％重量的固体，例如约5-约40％固体、或约10-约30％固体。所述第一有机相可以与第一水溶液组合以形成第二相。所述有机溶液可以包括，例如，甲苯、甲乙酮、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、乙酸异丙酯、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、丙酮、苯甲醇、吐温80、司盘80等等，及其组合。在一个实施方式中，所述有机相可以包括苯甲醇、乙酸乙酯及其组合。所述第二相可以是约1-50重量％，例如，约5-40重量％固体。所述水溶液可以是水，任选地与一种或多种胆酸钠、乙酸乙酯、聚乙酸乙烯酯和苯甲醇组合。

例如，油或有机相可以使用仅部分与非溶剂(水)混溶的溶剂。因此，当以足够低的比率混合和/或当使用水与有机溶剂预饱和时，所述油相保持液体。使用，例如，高能量分散液***，诸如匀浆器或超声破碎器，所述油相可以被乳化成水溶液和，作为液体微滴，剪切进入纳米微粒。乳液的含水部分(另外被称作“水相”)可以是由胆酸钠组成的表面活性剂溶液，并且被乙酸乙酯和苯甲醇预饱和。

乳化第二相以形成乳相可以在一或两个乳化步骤中进行。例如，可以制备初乳液(primary emulsion)以形成细乳液。例如，使用简单混合、高压匀浆器(high pressure homogenizer)、探头超声波破碎仪、搅拌子(stir bar)或转子-定子式匀浆器可以形成所述初乳液。通过使用例如探头超声波破碎仪或高压匀浆器，例如使用通过匀浆机的1、2、3或更次经过(passes)，所述初乳液可以成为细乳液。例如，当使用高压匀浆器时，使用的压力可以是约1000-约8000psi、约2000-约4000psi、4000-约8000psi、或约4000-约5000psi，例如，约2000、2500、4000或5000psi。

可以需要溶剂蒸发或稀释以完成溶剂的提取和固化所述微粒。为了对提取的动力学的更佳的控制和更加可伸缩的过程，可以使用经由含水骤冷液(quench)的溶剂稀释。例如，乳液可以被稀释进入冷水以达到足以溶解全部有机溶剂以形成骤冷(quench)相的浓度。骤冷可以至少部分在约5℃或更低的温度进行。例如，在骤冷中使用的水可以处于低于室温的温度(例如约0-约10℃、或约0-约5℃)。

在一些实施方式中，在该阶段并非全部治疗剂(例如多西他赛)都包封在所述微粒，并且将药物增溶剂加入到骤冷相以形成增溶相(solubilized phase)。所述药物增溶剂可以是例如，吐温80、吐温20、聚乙稀吡咯烷酮、环糊精、十二烷基硫酸钠或胆酸钠。例如，可以将吐温-80加入到骤冷纳米微粒悬浮液以溶解游离药物和预防药物晶体的形成。在一些实施方式中，药物增溶剂与治疗剂(例如多西他赛)的比率是约100∶1-约10∶1。

可以过滤增溶相以回收纳米微粒。例如，超滤膜可以用于浓缩所述纳米微粒悬浮液和基本上消除有机溶剂、游离药物，和其它加工助剂(表面活性剂)。示例性过滤可以使用切向流过滤***进行。例如，通过使用具有适宜保留纳米微粒而允许溶质、微团和有机溶剂通过的孔径的膜，可以选择性分离纳米微粒。可以使用具有约300-500kDa(～5-25nm)的截点的分子量的示例性膜。

渗滤(diafiltration)可以使用定容方法进行，意旨可以将渗滤液(冷去离子水，例如约0-约5℃、或0-约10℃)以与将滤液从悬浮液中除去的速率相同的速率加入到进料悬浮液。在一些实施方式中，过滤可以包括使用约0-约5℃或0-约10℃的第一温度，和约20-约30℃、或15-约35℃的第二温度的第一过滤。例如，过滤可以包括在约0-约5℃处理约1-约6个过滤体积(diavolume)，和在约20-约30℃处理至少一个过滤体积(例如约1-约3或约1-2个过滤体积)。

在纯化和浓缩纳米微粒悬浮液，所述微粒可以是通过一、二或更多灭菌和/或厚度过滤器，例如，用～0.2μm厚度预过滤器。

在制备纳米微粒的又一个实施方式中，有机相由治疗剂(例如，多西他赛)和聚合物(均聚物、共聚-聚合物和与配体的共聚-聚合物)的混合物组成而形成。所述有机相以大约1∶5比率(油相∶水相)与水相混合，其中所述水相是由表面活性剂和一些溶解的溶剂组成。通过简单混合或通过使用转子-定子式匀浆器将两相组合形成初乳液。然后，通过使用高压匀浆器使所述初乳液成为细乳液。然后，通过在混合下加入去离子水骤冷细乳液。骤冷液∶乳液比率是大约8.5∶1。然后将吐温(例如，吐温80)的溶液加入到骤冷液以实现总共大约2％吐温。这用以溶解游离、未包封的药物。然后通过离心或超滤/渗滤分离纳米微粒。

将预期，可用于制备配制剂的聚合物和治疗剂或活性剂的量可与最终配制剂的量不同。例如，一些活性剂可以不适合完全掺入纳米微粒，并且这种游离治疗剂可以被例如过滤出。例如，在一个实施方式中，可以是使用约20重量百分比的活性剂(例如多西他赛)和约80重量百分比聚合物(例如聚合物可以包含约2.5摩尔百分比的PLA-PEG-GL2和约97.5摩尔百分比的PLA-PEG)制备配制剂，所述配制剂产生例如包含约10重量百分比活性剂(例如多西他赛)和约90重量百分比聚合物(其中所述聚合物可以包含约1.25摩尔百分比的PLA-PEG-GL2和约98.75摩尔百分比的PLA-PEG)的最终的纳米微粒。这种方法可以提供适宜对患者给药的最终的纳米微粒，所述纳米微粒包含约2-约20重量百分比的治疗剂，例如约5、约8、约10、约15重量百分比的治疗剂。

治疗剂

根据本发明，包括，例如，治疗剂(例如抗癌药)、诊断药剂(例如造影剂；放射性核素；和荧光、发光和磁性部分)，预防性药剂(例如疫苗)和/或营养性药剂(nutraceutical agent)(例如维生素、矿物质等)的任意药剂可以通过所述公开的纳米微粒来递送。按照本发明要递送的示例性药剂包括但不限于小分子(例如细胞毒素剂)、核酸(例如，siRNA、RNAi和mircoRNA药剂)、蛋白质(例如抗体)、肽、脂类、碳水化合物、激素、金属、放射性元素和化合物、药物、疫苗、免疫药剂等，和/或其组合。在一些实施方式中，要递送的所述药剂是在治疗癌症(例如，***癌)中有用的药剂。

例如，如果使用，靶向部分可以靶向或使所述微粒适合局限于受试者的具体部分，并且有效负荷可以是递送至那些部分。在一个特定的实施方式中，所述药物或其它有效负荷可以以控制释放的方式从所述微粒中释放并允许其与特定的靶向位点(例如，肿瘤)局部地相互作用。本文使用的术语“控制释放”(和所述术语的变体)(例如，上下文的“控制-释放***”)一般地意旨涵盖在选择的位点或以其它方式在速率、间隔和/或量可控的释放物质(例如，药物)。控制释放涵盖，但是不必然限于，基本上连续递送、模式递送(patterned delivery)(例如，被规则的或不规则的时间间隔中断的在时间段内间断递送)，和选择物质的药丸的递送(例如，如果物质在相对短的时间段(例如，几秒或几分钟)内释放的预定的、分离的量)。

活性剂或药物可以是治疗剂，诸如抗肿瘤药，诸如mTor抑制剂(例如，西罗莫司、坦罗莫司或依维莫司)、长春花生物碱，诸如长春新碱、二萜衍生物或紫杉烷，诸如紫杉醇(或它的衍生物，诸如DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇(paxlitaxel))或多西他赛。

在一组实施方式中，所述有效负荷是药物或超过一种药物的组合。这种微粒可以在下述实施方式中有用：例如，其中靶向部分可以用于将含有药物的微粒指引至受试者的特定的局部位置，例如，允许药物的局部递送的出现。示例性治疗剂包括化疗药剂，诸如多柔比星(阿霉素)、吉西他滨(健择)、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、长春瑞滨(venorelbine)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春花生物碱诸如长春碱或长春新碱；博来霉素、紫杉醇(泰素)、多西他赛(泰索帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT-11、10-羟基-7-乙基喜树碱(SN38)、达卡巴嗪、S-I卡培他滨、替加氟、5′去氧氟尿苷(5′deoxyflurouridine)、UFT、恩尿嘧啶、脱氧胞苷酸、5-氮杂胞嘧啶、5-氮脱氧胞苷(5-azadeoxycytosine)、别嘌醇、2-氯腺苷、三甲曲沙、氨基蝶呤，亚甲基-10-去氮杂氨基蝶呤(MDAM)、oxaplatin、picoplatin、四铂、沙铂、铂-DACH、奥马铂、CI-973、JM-216及其类似物、表柔比星、磷酸依托泊苷、9-氨基喜树碱、10，11-亚甲基二氧基喜树碱、karenitecin、9-硝基喜树碱、TAS 103、长春地辛、L-苯丙氨酸氮芥、ifosphamidemefosphamide、培磷酰胺、氯乙环磷酰胺卡莫司汀、司莫司汀、epothilones A-E、拓优得、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、安吖啶、磷酸依托泊苷、karenitecin、阿昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、金刚烷胺、金刚乙胺、拉米夫定、齐多夫定、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、5-氟尿嘧啶，及其组合。

潜在适宜的药物的非-限制实例包括抗癌药，包括例如，多西他赛、米托蒽醌、和盐酸米托蒽醌。在另一个实施方式中，所述有效负荷可以是抗癌药，诸如20-epi-1，25二羟基维生素D3、4-甘薯苦醇、5-乙炔基尿嘧啶、9-二氢紫杉醇、阿比特龙、阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、acylfiilvene、腺环戊醇、阿多来新、阿地白介素、全部-tk拮抗剂、六甲蜜胺、氨莫司汀、安波霉素、阿美蒽醌醋酸盐、amidox、氨磷汀、氨鲁米特、氨基-γ-酮戊酸、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、穿心莲内酯、血管发生抑制剂、拮抗剂D、拮抗剂G、安雷利克斯、安曲霉素、抗背部化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizdng morphogenetic protein-1)、***对抗剂、抗癌肽类、反义寡核苷酸、阿非迪霉素甘氨酸盐、细胞凋亡基因调节剂、细胞凋亡调节剂、无嘌呤核酸、ARA-CDP-DL-PTBA、精氨酸脱氨基酶、天冬酰胺酶、曲林菌素、asulacrine、阿他美坦、阿莫司汀、海洋环肽1(axinastatin 1)、海洋环肽2、海洋环肽3、阿扎胞苷、阿扎司琼、阿扎毒素、重氮酪氨酸、阿扎替派、阿佐霉素、浆果赤霉素III衍生物、balanol、巴马司他、苯并二氢卟吩、苯佐替派、benzoylstaurosporine、β内酰胺衍生物，β-alethine、betaclamycin B、桦木脑酸、BFGF抑制剂、比卡鲁胺、比生群、比生群盐酸化物、bisazuidinylspermine、双奈法德、二甲磺酸双奈法德、bistratene A、比折来新、博来霉素、硫酸博来霉素、BRC/ABL拮抗剂、breflate、布喹那钠、溴匹立明、布度钛、白消安、丁硫氨酸-亚砜亚胺、放线菌素C、卡泊三醇、calphostin C、卡普睾酮、喜树碱衍生物、金丝雀痘IL-2、卡培他滨、caraceraide、卡贝替姆、卡铂、羧酰胺-氨基-***、羧酰氨***、carest M3、卡莫司汀、earn 700、软骨(cartilage)衍生的抑制剂、卡柔比星盐酸化物、卡折来新、酪蛋白激酶抑制剂、澳洲栗精胺(castanosperrnine)、杀菌肽B、西地芬戈、西曲瑞克、苯丁酸氮芥、二氢卟酚、氨磺酰氯喹噁啉、西卡前列素、西罗霉素、顺铂、顺式卟啉(cis-porphyrin)、克拉屈滨、氯米芬类似物、克霉唑、collismycin A、collismycin B、考布他汀A4、combretastatin类似物、conagenin、crambescidin 816、克立那托、克立那托甲磺酸酯、cryptophycin  8、cryptophycin  A  衍生物、curacin  A、cyclopentanthraquinones、环磷酰胺、cycloplatam、cypemycin、阿糖胞苷、cytarabine ocfosfate、溶细胞因子、磷酸己烷雌酚、达卡巴嗪、达昔单抗、放线菌素D、柔红霉素盐酸化物、地西他滨、脱氢膜海鞘素B、地洛瑞林、右异环磷酰胺、右奥马铂、右雷佐生、右维拉帕米、地扎呱宁、甲磺酸地扎呱宁、地吖醌、代代宁B、didox、diethyhiorspermine、二氢-5-氮胞苷、dioxamycin、二苯基螺莫司汀、多西他赛、二十二烷醇、多拉司琼、去氧氟尿苷、多柔比星、多柔比星盐酸化物、屈洛昔芬、枸橼酸屈洛昔芬、屈他雄酮丙酸酯、屈***酚、达佐霉素、duocannycin SA、依布硒、依考莫司汀、依达曲沙、依地福新、依决洛单抗、eflomithine、eflomithine盐酸化物、榄烯、elsarnitrucin、乙嘧替氟、恩洛铂、恩普氨酯、依匹哌啶、表柔比星、表柔比星盐酸化物、依立雄胺、厄布洛唑、红细胞基因治疗媒介(vector)***、依索比星盐酸化物、雌莫司汀、雌莫司汀类似物、雌莫司汀磷酸钠、***激动剂、***拮抗剂、依他硝唑、依托泊苷、依托泊苷磷酸酯、氯苯乙嘧胺、依西美坦、法倔唑、法倔唑盐酸化物、法扎拉滨、芬维A胺、非格司亭、非那雄胺、flavopiridol、氟

斯汀、氟尿苷、fluasterone、氟达拉滨、氟达拉滨磷酸酯、fluorodaunorunicin盐酸化物、氟尿嘧啶、氟西他滨、福酚美克、福美坦、磷喹酮、福司曲星、福司曲星钠、福莫司汀、gadoliniumtexaphyrin、硝酸镓、加洛他滨、加尼瑞克、明胶酶抑制剂、吉西他滨、吉西他滨盐酸化物、谷胱甘肽抑制剂、hepsulfam、heregulin、乙撑-双乙酰胺、羟基脲、金丝桃素、伊班膦酸、伊达比星、伊达比星盐酸化物、艾多昔芬、伊决孟酮、异环磷酰胺、ihnofosine、伊洛马司他、咪唑并吖啶酮、咪喹莫特、免疫刺激肽、胰岛素-样生长因子-1受体抑制剂、干扰素激动剂、干扰素α-2A、干扰素α-2B、干扰素α-N1、干扰素α-N3、干扰素β-IA、干扰素γ-IB、干扰素、白细胞介素、碘苄胍、碘阿霉素、iproplatm、伊立替康、伊立替康盐酸化物、伊罗普拉、伊索拉定、isobengazole、isohomohalicondrin B、伊他司琼、促微丝聚合剂(jasplakinolide)、kahalalide F、片螺素-N三醋酸酯、兰瑞肽、醋酸兰瑞肽、leinamycin、来格司亭、香菇多糖硫酸酯、leptolstatin、来曲唑、非白血性白血病抑制因子、白细胞α干扰素、醋酸亮丙立德、亮丙立德/***/***、亮丙瑞林、左旋咪唑、利阿唑、利阿唑盐酸化物、直链聚胺类似物、亲脂二糖肽、亲脂铂化合物、lissoclinamide、洛铂、蚯蚓磷脂、洛美曲索、洛美曲索钠、洛莫司汀、氯尼达明、洛索蒽醌、洛索蒽醌盐酸化物、洛伐他汀、洛索立宾、勒托替康、lutetiumtexaphyrin lysofylline、溶菌肽、美坦新、mannostatin A、马立马司他、马索罗酚、maspin、基质溶解因子抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、美登素、氮芥盐酸化物、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、merbarone、巯嘌呤、美替瑞林、蛋氨酸酶、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠、甲氧氯普胺、氯苯氨啶、美妥替哌、微藻蛋白激酶C抑制剂、MIF抑制剂、米非司酮、米替福新、米立司亭、错位双链RNA、米丁度胺、mitocarcin、丝裂红素、米托洁林、米托胍腙、二溴卫矛醇、米托马星、丝裂霉素、丝裂霉素类似物、米托萘胺、米托司培、米托坦、mitotoxin成纤维细胞生长因子-皂草素、米托蒽醌、米托蒽醌盐酸化物、莫法罗汀、莫拉司亭、单克隆抗体、人类绒促性素、单磷酸类脂a/分支杆菌细胞壁SK、莫哌达醇、多药耐药基因抑制剂、基于多瘤抑制基因1的疗法(multiple tumor suppressor 1-based therapy)、氮芥抗癌剂、印度洋海绵B(mycaperoxide B)、分支杆菌细胞壁提取物、麦考酚酸、myriaporone、正-乙酰基地那林、那法瑞林、nagrestip、纳洛酮/喷他佐辛、napavin、萘萜二醇、那托司亭、奈达铂、奈莫柔比星、奈立膦酸、中性内肽酶、尼鲁米特、nisamycin、一氧化氮调节剂、一氧化氮抗氧化剂、nitrullyn、诺考达唑、诺拉霉素、n-取代的苯并酰胺、O6-苄基鸟嘌呤、奥曲肽、okicenone、寡核苷酸、奥那司酮、昂丹司琼、oracin、口腔细胞因子诱导剂、奥马铂、奥沙特隆、奥沙利铂、oxaunomycin、奥昔舒仑、紫杉醇、紫杉醇类似物、紫杉醇衍生物、palauamine、棕榈酰根霉素、帕米膦酸、人参炔三醇、帕诺米芬、副球菌素、帕折普汀、培门冬酶、培得星、培利霉素、奈莫司汀、木聚硫钠、喷司他丁、pentrozole、硫酸培洛霉素、全氟溴烷、培磷酰胺、紫苏醇、苯连氮霉素、乙酸苯酯、磷酸酶抑制剂、溶链菌、毛果芸香碱盐酸化物、哌泊溴烷、哌泊舒凡、吡柔比星、吡曲克辛、吡罗蒽醌盐酸化物、placetin A、placetin B、纤溶酶原活化剂抑制剂、铂络合物、铂化合物、铂-三胺络合物、普卡霉素、普洛美坦、卟吩姆钠、泊非霉素、泼尼莫司汀、丙卡巴肼盐酸化物、丙基双-吖啶酮、***素J2、***癌抗雄激素物质、蛋白酶体抑制剂、基于蛋白质A的免疫调节剂、蛋白激酶C抑制剂、蛋白酪氨酸磷酸酯酶抑制剂、嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂、嘌罗霉素、嘌罗霉素盐酸化物、红紫素、pyrazorurin、吡唑啉吖啶、吡哆醛血红蛋白聚氧乙烯复合物(pyridoxylated hemoglobin polyoxyethylene conjugate)、RAF拮抗剂、雷替曲塞、雷莫司琼、RAS法尼基蛋白转移酶抑制剂、RAS抑制剂、RAS-GAP抑制剂、脱甲基瑞替普汀、铼RE 186依替膦酸、根霉素、利波腺苷、核酶、RH retinarnide、RNAi、罗谷亚胺、罗希吐碱、罗莫肽、罗喹美克、rubiginone B1、ruboxyl、沙芬戈、沙芬戈盐酸化物、saintopin、sarcnu、sarcophytol A、沙格司亭、SDI1模拟物、司莫司汀、衰老衍生的抑制剂1、正义寡核苷酸、信号转导抑制剂、信号转导调节剂、辛曲秦、单链抗原结合蛋白、西佐喃、索布佐生、硼卡钠、苯乙酸钠、solverol、生长介素结合蛋白、索纳明、sparfosafe sodium、膦门冬酸、司帕霉素、spicamycin D、锗螺胺盐酸化物、螺莫司汀、螺铂、splenopentin、spongistatin 1、角鲨胺、干细胞抑制剂、干-细胞***抑制剂、stipiamide、链黑霉素、链佐星、间充质溶解素抑制剂、sulfinosine、磺氯苯脲、强效血管肠肽拮抗剂、suradista、苏拉明、苦马豆碱、合成的氨基多糖、他利霉素、他莫司汀、他莫昔芬methiodide、牛磺莫司汀、他扎罗汀、替可加兰钠、替加氟、tellurapyrylium、端粒酶抑制剂、替洛蒽醌盐酸化物、替莫泊芬、替莫唑胺、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酯、tetrachlorodecaoxide、红四氮唑(tetrazomine)、thaliblastine、沙利度胺、硫咪嘌呤、噻可拉林、硫鸟嘌呤、塞替派、血小板生成素、血小板生成素模拟物、胸腺法新、胸腺生成素受体激动剂、胸腺曲南、甲状腺刺激激素、tiazofurin、乙基锡初紫红素、替拉扎明、二氯环戊二烯钛、托泊替康盐酸化物、topsentin、托瑞米芬、枸橼酸托瑞米芬、全能干细胞因子、翻译抑制剂、曲托龙醋酸酯、维A酸、三乙酰尿苷、曲西立滨、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、三甲曲沙葡糖醛酸酯、曲普瑞林、托烷司琼、妥布氯唑盐酸化物、妥罗雄脲、酪氨酸激酶抑制剂、酪氨酸磷酸化抑制剂、UBC抑制剂、乌苯美司、乌拉莫司汀、乌瑞替派、泌尿生殖窦-衍生的生长抑制因子、尿激酶受体拮抗剂、伐普肽、variolin B、维拉雷琐、藜芦明明、verdins、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸长春罗新、长春瑞滨或酒石酸长春瑞滨、硫酸长春罗定、vinxaltine、硫酸长春利定、vitaxin、伏氯唑、扎诺特隆、折尼铂、亚苄维C、净司他丁、净司他丁斯酯或佐柔比星盐酸化物。

药物配制剂

根据本发明又一方面，本文公开的纳米微粒可以与药物可接受的载体组合以形成药物组合物。本领域的技术人员将会认识到，所述载体可以基于如下描述的给药途径、靶向问题的位置、被递送的药物、递送药物的时间过程等来选择。

本发明的药物组合物可以通过本领域公知的方式(包括口服和胃肠外途径)给予患者。本文使用的术语“患者”，指人类以及非-人类，包括，例如，哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物和鱼。例如，非-人类可以是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、灵长类动物或猪)。在某些实施方式中希望胃肠外途径，其原因在于它们避免与被发现存在于消化道的消化酶接触。根据这种实施方式，本发明组合物可以通过下述方式来给予：注射(例如，静脉内、皮下或肌肉内、腹膜内注射)、经直肠、经***、局部(通过粉末、霜剂、软膏剂或滴剂)或通过吸入(通过喷雾剂)。

在一个特定的实施方式中，将本发明的纳米微粒全身给予有此需要的受试者，例如，通过IV输注或注射。

注射制剂，例如，无菌可注射的水性或油状悬浮液，可以根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌注射制剂也可以是在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液、悬浮液或乳液，例如，在1，3-丁二醇中的溶液。在可以采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格溶液、U.S.P，和等渗氯化钠溶液。此外，常规采用无菌、非挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此，可以采用任意温和的非挥发油，包括合成的甘油一或二酯。此外，使用脂肪酸，诸如油酸制备注射剂。在一个实施方式中，本发明轭合物悬浮于载体流体，所述载体流体包含1％(w/v)的羧甲基纤维素钠和0.1％(v/v)的吐温^TM 80。所述注射配制剂可以，例如，通过过滤经过保留细菌的过滤器或通过掺入无菌固体组合物形式的杀菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可以在使用前溶解或分散在无菌水或其它无菌注射介质中。

用于口服给药的固体剂型，包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和微粒剂。在这种固体剂型中，包封的或未包封的轭合物与下述至少一种混合：惰性、药学上可接受的赋形剂或载体，诸如枸橼酸钠或磷酸二钙和/或(a)填料或膨胀剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)粘合剂，诸如，例如，羧甲纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和***胶，(c)保湿剂，诸如甘油，(d)崩解剂，诸如琼脂-琼脂、碳酸钙、土豆或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐，和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂(solution retarding agent)，诸如石蜡，(f)吸收加速剂，诸如季铵化合物，(g)润湿剂，诸如，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油，(h)吸收剂，诸如白陶土和膨润土，和(i)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型也可以包含缓冲液。

将认识到每个医生考虑到要治疗的患者来选择PSMA-靶向微粒的精确剂量，一般而言，调节剂量和给药以向被治疗的患者提供有效量的PSMA-靶向微粒。本文使用的″有效量″的PSMA-靶向微粒指，引起希望的生物学反应/应答的必需的量。正如本领域的普通技术人员将认识到，有效量的PSMA-靶向微粒可以变化，这取决于诸如下述的因素：希望的生物学终点、要递送的药物、靶组织、给药途径等。例如，含有抗癌药物的PSMA-靶向微粒的有效量可能是这样的量，其通过希望时间段内的希望的量导致肿瘤尺寸减少。可以考虑的额外的因素包括疾病状态的严重性；被治疗患者的年龄、重量和性别；饮食、给药的时间和频率；药物组合；反应的敏感性；和对疗法耐受/应答。

本发明的纳米微粒可以配制在容易给药和剂量均匀的剂量单元(dosage unit)形式中。本文使用的表述“剂量单元形式”指适用于要治疗的患者的在物理上分离的纳米微粒的单元。然而，将理解每日使用本发明的组合物的总和将通过主治医生在其合理的医药判断的范围内来确定。对于任意的纳米微粒，最初可以在细胞培养测定或通常为小鼠、兔、购或猪的动物模型中估计在治疗性上有效的剂量。所述动物模型也用于实现希望的浓度范围和给药途径。然后，这种信息可以被用于确定在人类中的有用的剂量和给药途径。纳米微粒的治疗效力和毒性可以通过在细胞培养或实验动物中的标准药物程序来测定，例如，ED₅₀(在50％的群体中在治疗上有效的剂量)和LD₅₀(使50％的群体中死亡的剂量)。毒性与治疗效果的剂量比是治疗指数，并且所述治疗指数可以表示为，LD₅₀/ED₅₀的比率。展示出大的治疗指数的药物组合物在一些实施方式中是有用的。从细胞培养测定和动物实验中获得的数据可以用于配制人用的一系列剂量。

在一个实施方式中，本文公开的组合物可以包含低于约10ppm的钯或低于约8ppm或低于约6ppm的钯。例如，在此提供的这样的组合物，其包含具有聚合物轭合物PLA-PEG-GL2的纳米微粒，其中所述组合物具有低于约10ppm的钯。

在一个示例性的实施方式中，公开的药物组合物包含多个纳米微粒，各包含治疗剂；约0.1-约30摩尔百分比的纳米微粒的总聚合物含量、或约0.1-约20摩尔百分比、或约0.1-约10摩尔百分比、或约1-约5摩尔百分比的纳米微粒的总聚合物含量的含有PLGA-PEG共聚物或PLA-PEG共聚物的第一高分子，所述共聚物轭合至具有约100g/mol-500g/mol分子量的配体；和含有PLGA-PEG共聚物或PLA-PEG共聚物的第二高分子，其中所述共聚物是未结合至靶向部分；和药学上可接受的赋形剂。例如，所述第一共聚物可以具有相对于总聚合物含量的约0.001-5重量百分比的配体。

在一些实施方式中，预期适用于冷冻的组合物，包括本文公开的纳米微粒和适用于冷冻的溶液，例如，将蔗糖溶液加入到纳米微粒悬浮液。所述蔗糖可以例如，预防所述微粒在冷冻时聚集的冷冻保护剂。例如，本文提供的是纳米微粒配制剂，所述纳米微粒配制剂包含多个公开的纳米微粒，蔗糖和水；其中所述纳米微粒/蔗糖/水是约3-30％/10-30％/50-90％(w/w/w)或约5-10％/10-15％/80-90％(w/w/w)。

治疗方法

在一些实施方式中，根据本发明的靶向微粒可以用于治疗、缓解、改善、缓和、延缓一种或多种症状或者疾病、障碍和/或病症的发作，抑制一种或多种症状或者疾病、障碍和/或病症的进展，减轻一种或多种症状或者疾病、障碍和/或病症的严重性，和/或减少一种或多种症状的发生率或者疾病、障碍和/或病症的特征。在一些实施方式中，本发明的靶向微粒可以用于治疗实体瘤，例如，癌症和/或癌症细胞。在某些实施方式中，本发明的靶向微粒可以用于治疗任意癌症，其中PSMA在有此需要的患者的癌症细胞的表面上或肿瘤新血管***(包括***或非-***实体瘤的新血管***)中表达。PSMA-有关的适应症的实例包括但不限于，***癌、乳腺癌、非-小细胞肺癌、直肠癌和胶质母细胞瘤。

术语“癌症”包括恶性前(pre-malignant)以及恶性癌症。癌症包括但不限于，***、胃癌、结直肠癌、皮肤癌，例如，黑色素瘤或基底细胞癌、肺癌、乳腺癌、头和颈的癌症、支气管癌、胰腺癌、膀胱癌、脑或中枢神经***癌症、周围神经***癌症、食管癌、口腔癌症或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌症、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织的癌症，和诸如此类。“癌症细胞”可以是肿瘤的形式，单独存在于受试者(例如，白血病细胞)中或衍生自癌症的细胞系。

癌症可以与多种物理症状有关。癌症的症状一般取决于肿瘤的类型和位置。例如，肺癌可以导致咳嗽、呼吸急促和胸痛，而结肠癌常常导致腹泻、便秘和便血。然而，提供但仅几个实例，下述症状常常一般地与许多癌症相关：发烧、寒战、夜汗、咳嗽、呼吸困难、重量减轻、食欲不振、厌食、恶心、呕吐、腹泻、贫血、黄疸、肝肿大、咳血、疲劳、萎靡不振、认知功能障碍、抑郁、激素紊乱、嗜中性白血球减少、疼痛、未-治愈溃疡、***肿大、周围神经病变和性功能障碍。

在发明一方面，提供用于治疗癌症(例如***或乳腺癌)的方法。在一些实施方式中，治疗癌症包括以实现希望的结果所必需的这种量和时间给予有此需要的受试者治疗有效量的本发明的靶向微粒。在本发明的某些实施方式中，本发明的靶向微粒的“治疗有效量”是这样的量，所述量有效治疗、缓解、改善、缓和、延缓一种或多种症状或者癌症的发作，抑制一种或多种症状或癌症的进展，减轻一种或多种症状或者癌症的严重性，和/或减少一种或多种症状的发生率或者癌症的特征。

在本发明的一方面，提供给予罹患癌症(例如***癌)的受试者本发明组合物的方法。在一些实施方式中，以实现希望的结果(即，治疗癌症)所必需的这种量和时间给予受试者微粒。在本发明的某些实施方式中，本发明的靶向微粒的“治疗有效量”是这样的量，所述量有效治疗、缓解、改善、缓和、延缓一种或多种症状或者癌症的发作，抑制一种或多种症状或癌症的进展，减轻一种或多种症状或者癌症的严重性，和/或减少一种或多种症状的发生率或者癌症的特征。

本发明治疗方案牵涉给予健康个体(即，未显示癌症的任意症状和/或未曾诊断患有癌症的受试者)治疗有效量的本发明的靶向微粒。例如，在癌症的进展和/或癌症的症状发作之前，可以用本发明的靶向微粒使健康个体“免疫”；处于风险之中的个体(例如，具有癌症家族史的患者；携带一种或多种与癌症进展有关的基因突变的患者；具有与癌症进展有关的遗传性多态现象的患者；通过与癌症进展有关的病毒感染的患者；具有与癌症进展有关的习性和/或生活方式的患者等)可以基本上与癌症症状的发作(例如，在48小时、在24小时或在12小时)同时治疗。当然，已知患有癌症的个体可以在任意时间接受本发明的治疗。

在其它实施方式中，本发明的纳米微粒可以用于抑制癌症细胞，例如，***癌细胞的生长。本文使用的术语“抑制癌症细胞生长”指任意癌症细胞增殖和/或迁移的速率的减慢、癌症细胞增殖和/或迁移的阻止或癌症细胞的杀伤，使得癌症细胞生长的速率相对于未治疗的对照癌症细胞的观察或预测的速率降低。术语“抑制生长”也可以指癌症细胞或肿瘤的尺寸减少或消失，以及其转移潜能的降低。优选地，这种抑制在分子水平可以减少患者的癌症尺寸、阻止患者的癌症生长、降低患者的癌症侵犯或预防或抑制患者的癌症转移灶。通过任意的多种适宜的标记，本领域技术人员可以容易地确定癌细胞生长是否抑制。

癌症细胞生长的抑制可以通过下述方式证实：例如，通过在细胞周期的特定阶段阻止癌症细胞，例如，在癌症细胞周期的G2/M期阻止。癌症细胞生长的抑制也可以通过下述方式证实：通过直接或间接测量癌症细胞或肿瘤尺寸。在人类癌症患者中，一般地使用下述方法进行这种测量：使用已知的成像方法，诸如磁共振成像、计算机化轴向层面X射线摄影法和X-射线。癌症细胞生长也可以间接测定，诸如通过测定循环癌胚抗原的水平、***特异性抗原或其它癌症-特异性抗原，它们与癌症细胞生长相关。癌症生长的抑制一般也与受试者的延长的生存和/或增加的健康以及安康相关。

本文还提供给予患者本文公开的纳米微粒的方法，所述纳米微粒包含活性剂，其中，在对患者给药时，相对于药剂的单独(即并非公开的纳米微粒)给药，这种纳米微粒基本上降低分布的体积和/或基本上降低游离的Cmax。

实施例

现在一般地描述本发明，将很容易地理解通过参考下述实例(包括仅意欲对本发明的某方面和实施方式示例)，并且不意欲以任何方式限制本发明。

实施例1：低-分子量PSMA配体(GL2)的合成

将5g(10.67mmol)的起始化合物溶解于150mL的无水DMF。向该溶液中加入烯丙基溴(6.3mL，72mmol)和K₂CO₃(1.47g，10.67mmol)。将反应搅拌2h，除去溶剂，将粗物质溶解于AcOEt并且用H₂O洗涤，直到pH为中性。用MgSO₄(无水)干燥有机相和蒸发以得到5.15g(95％)的物质。(TLC于CH₂Cl₂∶MeOH 20∶1中Rf＝0.9，起始化合物Rf＝0.1，其用水合茚三酮和uv光揭示)。

向化合物(5.15g，10.13mmol)在CH₃CN(50mL)中的溶液中加入Et₂NH(20mL，0.19mol)。在室温搅拌反应达40min。除去溶剂和通过柱色谱法(己烷∶AcOEt 3∶2)纯化化合物以得到2.6g(90％)。(TLC于CH₂Cl₂∶MeOH 10∶1中Rf＝0.4，其用水合茚三酮揭示(所述化合物具有紫色)。¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ5.95-5.85(m，1H，-CH₂CHCH₂)，5.36-5.24(m，2H，-CH₂CHCH₂)，4.62-4.60(m，3H，-CH₂CHCH₂，NHBoc)，3.46(t，1H，CH(Lys))，3.11-3.07(m，2H，CH₂NHBoc)，1.79(bs，2H，NH₂)，1.79-1.43(m，6H，3CH₂(Lys))，1.43(s，9H，Boc)。

在-78℃，向二烯丙基谷氨酸酯(diallyl glutamate)(3.96g，15mmol)和三光气(1.47g，4.95mmol)在CH₂Cl₂(143mL)中的搅拌溶液中加入在CH₂Cl₂(28mL)中的Et₃N(6.4mL，46mmol)。使得反应混合物温热至室温并且搅拌达1.5h。然后，在-78℃加入在CH₂Cl₂(36mL)的溶液中的赖氨酸衍生物(2.6g，9.09mmol)并且在室温搅拌反应达12h。所述溶液用CH₂Cl₂稀释，用H₂O洗涤两次，在MgSO₄(无水)上干燥和通过柱色谱法(己烷∶AcOEt 3∶1→2∶1→AcOEt)纯化以得到4g(82％)(TLC于CH₂Cl₂∶MeOH中20∶1Rf＝0.3，其用水合茚三酮揭示)。¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ5.97-5.84(m，3H，3-CH₂CHCH₂)，5.50(bt，2H，2NH脲)，5.36-5.20(m，6H，3-CH₂CHCH₂)，4.81(bs，1H，NHBoc)，4.68-4.40(m，8H，3-CH₂CHCH₂，CH(Lys)，CH(glu))，3.09-3.05(m，2H，CH₂NHBoc)，2.52-2.39(m，2H，CH₂(glu.))，2.25-2.14和2.02-1.92(2m，2H，CH₂(glu.))，1.87-1.64(m，4H，2CH₂(Lys))，1.51-1.35(m，2H，CH₂(Lys))，1.44(s，9H，Boc)。

向化合物(4g，7.42mmol)在干燥CH₂Cl₂(40mL)中的溶液中加入0℃的TFA(9mL)。在室温搅拌反应达1h。在真空下除去溶剂直到完全干燥，以得到4.1g(定量的)。(TLC于CH₂Cl₂∶MeOH 20∶1中Rf＝0.1，其用水合茚三酮揭示)。¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ6.27-6.16(2d，2H，2NH脲)，5.96-5.82(m，3H，3-CH₂CHCH₂)，5.35-5.20(m，6H，3-CH₂CHCH₂)，4.61-4.55(m，6H，3-CH₂CHCH₂)，4.46-4.41(m，2H，CH(Lys)，CH(glu))，2.99(m，2H，CH₂NHBoc)，2.46(m，2H，CH₂(glu.))，2.23-2.11和2.01-1.88(2m，2H，CH₂(glu.))，1.88-1.67(m，4H，2CH₂(Lys))，1.45(m，2H，CH₂(Lys))。

在氩下、在0℃，向化合物(2g，3.6mmol)在DMF(无水)(62mL)中的溶液中加入Pd(PPh₃)₄(0.7g，0.6mmol)和吗啉(5.4mL，60.7mmol)。在室温搅拌反应达1h。除去溶剂。粗产物用CH₂Cl₂洗涤两次，然后溶解于H₂O。向该溶中加入NaOH(0.01N)的稀释溶液直到pH称极碱性的。在减压下除去溶剂。用CH₂Cl₂、AcOEt、和MeOH-CH₂Cl₂(1∶1)的混合物再次洗涤固体，溶解于H₂O中和用Amberlite IR-120H⁺树脂中和。蒸发溶剂，并且化合物用MeOH沉淀，以得到1g(87％)的GL2。¹H-NMR(D₂O，300MHz)δ4.07(m，2H，CH(Lys)，CH(glu))，2.98(m，2H，CH₂NH₂)，2.36(m，2H，CH₂(glu.))，2.08-2.00(m，1H，CH₂(glu))，1.93-1.60(m，5H，CH₂(glu.)，2CH₂(Lys))，1.41(m，2H，CH₂(Lys))。质量ESI(Mass ESI)：320.47[M+H⁺]，342.42[M+Na⁺]。

实施例2：低-分子量PSMA配体(GL1)的合成

将130mg(0.258mmol)的起始化合物溶解于3mL的DMF(无水)中。向该溶液中加入烯丙基溴(150μL，1.72mmol)和K₂CO₃(41mg，0.3mmol)。将反应搅拌1h，除去溶剂，粗产物溶解于AcOEt中，并且用H₂O洗涤直到pH为中性。用MgSO₄(无水)干燥有机相和蒸发以得到130mg(93％)。(TLC于CH₂Cl₂∶MeOH中20∶1Rf＝0.9，起始化合物Rf＝0.1，用水合茚三酮和uv光揭示)。¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.81-7.05(12H，芳族化合物)，6.81(bs，1H，NHFmoc)，5.93-5.81(m，1H，-CH₂CHCH₂)，5.35-5.24(m，2H，-CH₂CHCH₂)，5.00(bd，1H，NHboc)，4.61-4.53(m，5H，-CH₂CHCH₂，CH₂(Fmoc)，CH(pheala.))，4.28(t，1H，CH(Fmoc))，3.12-2.98(m，2H，CH₂(pheala.)，1.44(s，9H，Boc)。

向化合物(120mg，0.221mmol)在干燥CH₂Cl₂(2mL)中的的溶液中加入0℃的TFA(1mL)。在室温搅拌反应达1h。在真空下除去溶剂，加入水和再次除去，加入CH₂Cl₂和再次除去直到完全干燥以得到120mg(定量的)。(TLC于CH₂Cl₂∶MeOH 20∶1中Rf＝0.1，其用水合茚三酮和uv光揭示)。¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.80-7.00(13H，芳族化合物，NHFmoc)，5.90-5.75(m，1H，-CH₂CHCH₂)，5.35-5.19(m，3H，-CH₂CHCH₂，NHboc)，4.70-4.40(2m，5H，-CH₂CHCH₂，CH₂(Fmoc)，CH(pheala.))，4.20(t，1H，CH(Fmoc))，3.40-3.05(m，2H，CH₂(pheala.))。

在-78℃，向二烯丙基谷氨酸酯(110mg，0.42mmol)和三光气(43mg，0.14mmol)在CH₂Cl₂(4mL)中的搅拌溶液中加入在CH₂Cl₂(0.8mL)中的Et₃N(180μL，1.3mmol)。使得反应混合物温热至室温并且搅拌达1.5h。然后，在-78℃将在CH₂Cl₂(1mL)和Et₃N(70μL，0.5mmol)的溶液中的苯丙氨酸衍生物(140mg，0.251mmol)加入并且在室温搅拌反应达12h。所述溶液用CH₂Cl₂稀释，用H₂O洗涤两次，在MgSO₄(无水)上干燥和通过柱色谱法(己烷∶AcOEt 3∶1)纯化，以得到100mg(57％)(TLC于CH₂Cl₂∶MeOH 20∶1中Rf＝0.3，用水合茚三酮和uv光揭示)。¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ7.80-6.95(13H，芳族化合物，NHFmoc)，5.98-5.82(m，3H，3-CH₂CHCH₂)，5.54(bd，1H，NH脲)，5.43-5.19(m，7H，3-CH₂CHCH₂，NH脲)，4.85-4.78(m，1H，CH(pheala.))，4.67-4.50(m，9H，3-CH₂CHCH₂，CH₂(Fmoc)，CH(glu.))，4.28(t，1H，CH(Fmoc))，3.05(d，2H，CH₂(pheala.))，2.53-2.33(m，2H，CH₂(glu.))，2.25-2.11和1.98-1.80(2m，2H，CH₂(glu.))。

向原料(60mg，0.086mmol)在CH₃CN(1mL)中的溶液中加入Et₂NH(1mL，10mmol)。在室温搅拌反应达40min。除去溶剂并且化合物通过柱色谱法(己烷∶AcOEt 2∶1)纯化，以得到35mg(85％)。(TLC于CH₂Cl₂∶MeOH 10∶1中Rf＝0.5，起始化合物Rf＝0.75，其用水合茚三酮(所述化合物具有紫色)和uv光揭示)。¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)δ6.85和6.55(2d，4H，芳族化合物)，5.98-5.82(m，3H，3-CH₂CHCH₂)，5.56(bd，1H，NH脲)，5.44-5.18(m，7H，3-CH₂CHCH₂，NH脲)，4.79-4.72(m，1H，CH(pheala.))，4.65-4.49(m，7H，3-CH₂CHCH₂，CH(glu.))，3.64(bs，2H，NH₂)，3.02-2.89(m，2H，CH₂(pheala.))，2.49-2.31(m，2H，CH₂(glu.))，2.20-2.09和1.91-1.78(2m，2H，CH₂(glu.))。

在氩下、在0℃，向化合物(50mg，0.105mmol)在DMF(无水；1.5mL)中的溶液中加入Pd(PPh₃)₄(21mg，0.018mmol)和吗啉(154μL，1.77mmol)。在室温搅拌反应达1h。除去溶剂。粗物质用CH₂Cl₂洗涤两次，并且溶解于H₂O中。向该溶中加入NaOH(0.01N)的稀释溶液直到pH呈极碱性的。在减压下除去溶剂。所述固体用CH₂Cl₂、AcOEt、和MeOH-CH₂Cl₂(1∶1)的混合物再次洗涤，溶解于H₂O中和用AmberliteIR-120H⁺树脂中和。蒸发溶剂并且化合物用MeOH沉淀，以得到25mg(67％)的GL1。¹H-NMR(D₂O，300MHz)δ7.08和6.79(2d，4H，芳族化合物)，4.21(m，1H，CH(pheala.))，3.90(m，1H，CH(glu.))，2.99和2.82(2dd，2H，CH₂(pheala.))，2.22-2.11(m，2H，CH₂(glu.))，2.05-1.70(2m，2H，CH₂(glu.))。¹³C-NMR(D₂O，75MHz)δ176.8，174.5，173.9(3COO)，153.3(NHCONH)，138.8(H₂N-C(Ph))，124.5，122.9，110.9(芳族化合物)，51.3(CH(pheala.))，49.8(CH(glu.))，31.8(CH₂(pheala.))，28.4和23.6(2CH₂-glu.))。质量ESI：354.19[M+H⁺]，376.23[M+Na⁺]。

实施例3：PLA-PEG的制备

合成通过d，l-丙交酯与作为高分子-引发剂(macro-initiator)的α-羟基-ω-甲氧基聚(乙二醇)的开环聚合作用来完成，并且在升高的温度使用作为催化剂的2-乙基己酸锡(II)来进行，如下显示(PEG Mn≈5,000Da；PLA Mn≈16,000Da；PEG-PLA M_n≈21,000Da)

聚合物通过将其溶解于二氯甲烷中来纯化，和在己烷和***的混合物中沉淀。从该步骤中回收的聚合物将在干燥箱中干燥。

实例4：PLA-PEG-配体制备

合成(显示在图2中)通过FMOC、BOC赖氨酸与烯丙基溴和碳酸钾在二甲基甲酰胺中的反应，将FMOC、BOC赖氨酸转化为FMOC、BOC、烯丙基赖氨酸开始，然后用在乙腈中的二乙胺处理。所述BOC、烯丙基赖氨酸随后与三光气和二烯丙基谷氨酸酯反应，然后用在二氯甲烷中的三氟乙酸处理以形成化合物“GL2P”。

然后，通过加入羟基-PEG-羧酸以及EDC和NHS使GL2P中的赖氨酸的侧链胺被PEG化。GL2P经由酰胺连接基轭合至PEG。该所得化合物的结构被标记“HO-PEG-GL2P”。PEG化之后，d，l-丙交酯与HO-PEG-GL2P(作为引发剂)中的羟基基团的开环聚合作用(ROP)用于将聚丙交酯嵌段聚合物经由酯键连接至HO-PEG-GL2P产生“PLA-PEG-GL2P”。2-乙基己酸锡(II)用作用于开环聚合作用的催化剂。

最后，用在二氯甲烷中的吗啉和四(三苯基膦)合钯(作为催化剂)除去在PLA-PEG-GL2P上的烯丙基基团，以产生最终产物PLA-PEG-配体。所述最终化合物通过在30/70％(v/v)***/己烷中沉淀来纯化。

实例5：纳米微粒制备-纳米沉淀(nanoprecipitation)

纳米微粒可以使用GL1或GL2配体来制备。根据方案1中显示的过程，基于脲的PSMA抑制剂GL2(其具有位于在对于PSMA结合不关键的区域中的氨基基团)从商购原料Boc-Phe(4NHFmoc)-OH和二烯丙基谷氨酸来合成。纳米微粒使用纳米沉淀来形成：聚合物配体轭合物溶解于水可混溶的有机溶剂以及用于示踪微粒摄取的药物其它药剂中。可以包含额外的非-官能化聚合物以调节配体表面密度。聚合物溶液分散于水相中并且通过过滤收集所得微粒。所述微粒可以是干燥的或用于体外细胞摄取或体内抗-***肿瘤活性的立即测试。

方案1

实例6：纳米微粒制备-乳化过程

有机相由5％固体(wt％)形成，包含2％聚丙交脂-乙交脂共聚物-聚(乙二醇)二嵌段共聚物(PLGA-PEG；45kDa-5kDa)、2％聚(D，L-丙交酯)(PLA；8.5kDa)和1％多西他赛(DTXL)，其中多西他赛具有结构

有机溶剂是乙酸乙酯(EA)和苯甲醇(BA)，其中BA包含20％(wt％)的有机相。使用BA部分用于溶解多西他赛。所述有机相与水相以大约1∶5比率(油相∶水相)混合，其中所述水相由在水中的0.5％胆酸钠、2％BA、和4％EA(wt％)组成。通过简单混合或通过使用转子-定子式匀浆器将两相组合形成初乳液。然后，通过使用探头超声波破碎仪或高压匀浆器使初乳液成为细乳液。

然后，在混合下通过加入去离子水的冷的骤冷液(0-5℃)骤冷细乳液。所述骤冷液∶乳液的比率是大约8.5∶1。然后，将25％(wt％)的吐温80溶液加入至骤冷液以达到大约2％的全部吐温80。然后，通过离心或超滤/渗滤分离所述纳米微粒。然后，纳米微粒悬浮液可以用冷冻保护剂，诸如10wt％蔗糖来冷冻。

此外，发现除了PLGA-PEG共聚物，加入PLA显著增加药物负荷。很可能，使用BA本身也同样起到增加包封效率的作用，即使不需要BA溶解DTXL也增加包封效率。发现骤冷的温度在载药中起到了关键的作用。相对于使用室温的骤冷液时的载药，使用冷的骤冷液(一般地保持在0-5℃)显著增加载药。

DTXL具有极低的水溶解度，并且发现未包封的DTXL常常形成晶体，所述晶体难以从形成的纳米微粒中分离。在细乳液已经被骤冷之后加入药物增溶剂(吐温80)。吐温80能够有效溶解DTXL晶体和通过下述方式允许纳米微粒从未包封的DTXL中分离：通过防止DTXL晶体的形成，和/或通过有效溶解当细乳液骤冷时形成的任意DTXL晶体。一组标准纳米乳化的条件如下：

对照：

加入作为产生的添加剂的均聚物增加药物负荷，而微粒尺寸减少，如下所示：

骤冷温度

在此，用于比较的对照不同于上述对照，由于那些已经在冷的骤冷温度进行。

示例性参数

实施例7乳化过程

下述过程使用增加的油相的固体含量。过程的总流程图在图3中描述，和过程的流程图在图4中描述。通过减少乳化油相的溶剂含量，在纳米微粒硬化时，更少的药物损失于骤冷流体。选择固体和溶剂***以避免过度粘稠，这可以限制乳化成～100nm微滴的能力。使用相对地低分子量共聚物(～16kDa-5kDa的PLA-PEG)和低分子量均聚物(～7kDa的PLA)允许配制剂在高固体含量保持足够低的粘度。选择具有适宜溶剂化本领的溶剂***以使得药物在溶液中保持高浓度。使用共溶剂***(一般地79∶21的乙酸乙酯∶苯甲醇)为具有80∶20的聚合物：多西他赛掺合物的高至50％固体的连续溶液创造条件。

有机相由多西他赛(DTXL)和聚合物(均聚物、共聚-聚合物和与配体的共聚-聚合物)组成而形成。所述有机相与水相以大约1∶5的比率(油相∶水相)混合，其中所述水相由表面活性剂和一些溶解溶剂组成。为了实现高载药，使用在有机相中的约30％固体。

有机相由多西他赛(DTXL)和聚合物(均聚物、共聚-聚合物和与配体的共聚-聚合物)的混合物组成而形成。组合物和有机溶剂在表中列出。所述有机相与水相以大约1∶5的比率(油相∶水相)混合，其中所述水相由表面活性剂和一些溶解溶剂组成。通过简单混合或通过使用转子-定子式匀浆器将两相组合形成初乳液。然后，通过使用高压匀浆器使初乳液成为细乳液。然后，在混合下、在给定的温度(列于下表)，通过加入去离子水骤冷所述细乳液。所述骤冷液∶乳液的比率是大约8.5∶1。然后，将25％(wt％)的吐温80溶液加入至骤冷液以达到大约2％的全部吐温80。这适用于溶解游离、未包封的药物，和使纳米微粒分离过程可行。然后，通过离心或超滤/渗滤，分离所述纳米微粒。

对照

如下提供一组标准纳米乳化条件。形成含有无-配体的微粒(非-靶向纳米微粒)。

10％固体

20％固体

40％固体

用于微粒尺寸减少的具有较高表面活性剂浓度的30％固体；靶向纳米微粒批次。

实施例8：纳米微粒制备-乳化过程2

有机相由多西他赛(DTXL)和聚合物(均聚物、共聚-聚合物和与配体的共聚-聚合物)组成而形成。所述有机相与水相以大约1∶5的比率(油相∶水相)混合，其中所述水相由表面活性剂和一些溶解溶剂组成。为了实现高载药，使用在有机相中的约30％固体。

通过简单混合或通过使用转子-定子式匀浆器将两相组合形成初、粗乳液。转子/定子产生均匀的乳状溶液，而搅拌子产生明显较大的粗乳液。观察搅拌子方法导致附着于进料容器侧面的显著的油相微滴，表明粗乳液尺寸对于品质而言并非关键的过程参数，而应该使其适宜地细化以防止产率损失或相分离。因此，虽然在更大规模高速混合器可能是适宜的，但是使用所述转子定子作为形成粗乳液的标准方法。

然后，通过使用高压匀浆器使初乳液成为细乳液。在连续经过(103)通过匀浆机之后，粗乳液的尺寸并未明显影响所述微粒尺寸。M-110-EH(图5)。

发现匀浆机进料压力对所得的微粒尺寸具有显著影响。在气动(pneumatic)和电动M-110EH匀浆机上，发现降低进料压力也减少所述微粒尺寸(图6)。因此，对于M-110EH使用的标准操作压力是4000-5000psi/互作用腔(interaction chamber)，这是单元上的最小处理压力。所述M-110EH也具有一或二个互作用腔的选择。它依照标准配有限制性Y-腔，其与低限制性200μm Z-腔相连。发现在除去Y-腔和用空白腔替换时，所述微粒尺寸实际上减少。另外，除去Y-腔显著增加乳液在加工过程中的流速。

在2-3次经过之后，所述微粒尺寸并未显著减少，并且连续经过甚至可以导致微粒尺寸增加。所述结果总结在图7中，其中安慰剂有机相由25.5％聚合物原料(stock)(50∶50 16.5/5PLA/PEG：8.2PLA)组成。有机相用标准水相按O∶W为5∶1乳化，并且进行多次(multiple)谨慎经过(discreet passes)，在每次经过后骤冷小部分乳液。指示的标度表示配制剂的总固体。

标度对微粒尺寸的影响显示出人意料的标度依赖性。所述趋势显示在2-10g的批次尺寸范围内，较大批次产生较小微粒。已经证实，当考虑高于10g的标度批次时，标度依赖性消失。在油相中使用的固体的量是约30％。图8和9描述固体浓度对微粒尺寸和载药的影响；除了15-175组之外，所有批次均是安慰剂。对于安慰剂批次，％固体的值表示，％固体是药物以标准20％w/w存在。

表A总结乳化过程的参数。

表A

然后，在混合下在给定温度通过加入去离子水骤冷细乳液。在骤冷单位操作中，在搅拌下将乳液加入至冷的含水骤冷液。这适合于提取显著部分的油相溶剂，为了下游过滤有效的硬化的纳米微粒。冷的骤冷液显著改善药物包封。骤冷液∶乳液的比率是大约5∶1。

然后，将35％(wt％)的吐温80溶液加入至骤冷液以达到大约2％的全部吐温80。然后，在乳液骤冷后，加入吐温-80的溶液，其充当了药物增溶剂，便于在过滤期间有效除去未包封的药物。表B指出各骤冷过程的参数。

表B：总结骤冷过程的参数。

温度必须用足够稀的悬浮液(足够低的溶剂浓度)保持足够的冷以保持在在所述微粒的T_g以下。如果Q∶E比率不足够高，那么较高浓度的溶剂使所述微粒增塑并且便于药物渗漏。相反地，更冷的温度便于在低Q∶E的比率(至～3∶1)的高药物包封，使得所述过程可能更有效的运行。

然后，通过切向流过滤过程分离纳米微粒以浓缩所述纳米微粒悬浮液并且缓冲液将溶剂、游离药物和药物增溶剂从骤***液交换至水中。使用具有分子量截点(MWCO)为300的再生纤维素膜。

进行定容渗滤(DF)除去骤***剂、游离药物和吐温-80。为了进行定容DF，以除去滤液的相同速率将缓冲液加入渗余物容器。TFF操作的过程参数总结在表C中。交叉流动速率指溶液流过进料通道(channel)和穿过膜的速率。该流动提供清除可以污染膜和限制滤液流动的分子的力。跨膜压力是驱动可渗透的分子通过膜的力。

表C：TFF参数

然后，在后处理(workup)期间，过滤的纳米微粒浆料热循环至升高的温度。在第一次暴露于25℃后，小部分(一般地5-10％)的包封的药物从纳米微粒中非常快速地释放。因为该现象，在整个后处理期间保持冷状态的批次易于在递送或任意部分的未冷冻贮藏期间形成游离药物或药物晶体。在后处理期间，通过将纳米微粒浆料暴露于升高的温度，以在载药中的小滴(small drop)为代价，该‘松散地包封’药物可以被除去并改善产物的稳定性。表D总结在25℃处理的两个实施例。其它实验已经显示，在～2-4个过滤体积暴露于25℃之后，产物是足够稳定的，未损失大多数包封的药物。使用5个过滤体积作为在25℃处理之前的冷处理的量。

表D：

¹25℃后处理：在各种时间段的至少5个过滤体积之后，亚批次(sublot)暴露于25℃。报告范围，其原因在于有多个亚批次暴露于25℃。

²稳定性：数据表示，在浆料中形成晶体之前，终产物可在25℃在10-50mg/ml的纳米微粒浓度中保持的时间(通过显微镜检查法可视)。

³体外裂解(burst)：表示药物在第一时间点(本质上立即)释放。

在过滤过程之后，纳米微粒悬浮液经过灭菌级滤器(0.2μm，绝对的(abosolute))。使用预过滤器以保护灭菌级滤器，从而使用用于所述过程的合理的过滤面积/时间。值在表E中总结。

表E：

过滤组(filtration train)是E rtel Alsop Micromedia XL厚度过滤器M953P膜(0.2μm，标称的)；Pall SUPRAcap，配有Seitz EKSP厚度过滤介质(0.1-0.3μm，标称的)；Pall Life Sciences Supor EKV 0.65/0.2微米灭菌级PES过滤器。

可以使用，用于厚度过滤器的0.2m²的过滤面积/kg的纳米微粒和用于灭菌级滤器的1.3m²的过滤面积/kg的纳米微粒。

实施例9

可以制备的特异性靶向的纳米微粒，包含生物相容的聚合物，其轭合至例如PEG，本文所描述的化疗药物，和任选地轭合至GL1或GL2。示例性纳米微粒在表1中显示：

实施例10

在表2中显示的纳米微粒，使用实施例8中的操作来制备。如在实验1和2中所示来制备包含PLGA-PEG的高分子和PLGA-PEG-小-分子配体(SML)的高分子的纳米微粒。在实验3和4中，制备包含PLA-PEG的高分子、PLGA-PEG-SML的高分子和PLA的高分子的纳米微粒(DB＝二嵌段共聚物)。

可以调节小-分子靶向部分-官能化高分子与未官能化高分子的比率，并且使用实验1，可以制备具有聚合物组合物的纳米微粒，所述聚合物组合物是大约0.94摩尔％、4.63摩尔％和9.01摩尔％的官能化高分子(参考“总Poly的DB-GL2的mol％”)。额外地，使用这些方法，可以制备包含大约0.015、0.073和0.143重量％(相对于总聚合物而言)的小-分子配体的纳米微粒(参考“Wt.％wrt GL2poly”)。

也可以制备具有官能化聚合物的纳米微粒，所述聚合物构成大约0.1-30、例如，0.1-20、例如，0.1-10摩尔百分比的整个聚合物组合物的纳米微粒，并且纳米微粒的重量百分比的低-分子量配体相对于总聚合物而言是0.001-5，例如，0.001-2，例如，0.001-1。

实施例11

如在表F中描述和比较的，使用实施例8形成各种纳米微粒配制剂：

表F：

如图10所示，不使用均聚物PLA和不显著牺牲药物负荷，可以实现最佳的微粒尺寸。相对于使用共聚-聚合物单独制成的批次而言，具有PLA均聚物的批次释放药物显著更快(图11)。各种聚合物类型和分子量未添加优化药物负荷和微粒尺寸的额外的值。相反，在具有“备选聚合物”类型微粒的15％总固体，其尺寸一般大于100-120nm的靶尺寸。在5wt％鲸蜡醇的掺入一般增加体外释放速率(图12)。

实施例12冷冻保护剂

冷冻纳米乳化纳米微粒在单独的去离子水中的悬浮液导致微粒聚集。据信，这是由于纳米微粒表面上的PEG链的结晶和缠绕(Jaeghere等人；Pharmaceutical Research 16(6)，p 859-852)。基于糖的赋形剂(蔗糖、海藻糖或甘露醇)可以起到在冷冻/解冻条件下冷冻保护这些纳米微粒的作用，而对于稀释(～10mg/ml)纳米微粒悬浮液而言浓度如1wt％一样低。一种配制剂包含10wt％蔗糖，其含有所需要的过量蔗糖并且是与生理盐水具有相同的重量克分子渗透浓度。

表G显示16/5PLA-PEG共聚-聚合物不易于冷冻-解冻聚集。

表G

实施例13去除钯

基于人类临床试验的剂量水平(ug/天)，在PLA-PEG-GL2组合物中最大可接受的钯水平是大约10ppm。在二氯甲烷(DCM)中的聚合物(PLA-PEG-GL2)溶液(20或35mg/mL)装载到5g树脂柱(用10mLDCM预先溶剂化)上并且随后在重力下使用30mL DCM***。聚合物通过使用旋转蒸发除去溶剂，然后在室温真空干燥来回收。聚合物回收率重量分析来测定，并且残余的钯含量通过在Galbraith LaboratoriesInc的电感耦合等离子体(ICP)光谱测定。

表H

如表H所见，评价了在聚合物负荷/单元树脂重量硫醇、TMT、脲和硫脲官能团使得钯水平低于50ppm。然而，仅TMT(三聚硫氰酸(trimecaptotriazine))树脂产生良好的(＞90％)聚合物回收率。此外，TMT树脂也产生在10ppm接受阈值之下的钯含量。结果似乎有一些变异性，这取决于使用的实验条件。特别地，当5g TMT树脂柱用1050mg聚合物装载时，更有效的除去钯。这可能由于在实验条件下聚合物种类和钯催化剂的更长停留时间。

实施例14配制剂

包含纳米微粒的PLA-PEG-配体、PLA、PLA-PEG、和多西他赛的配制剂在蔗糖/水组合物中形成：

组分	标称的浓度(mg/mL)
		多西他赛	5
PLA-PEG-配体	1.1
		PLA-PEG	21.4
PLA	22.5
		蔗糖	100
水	适量

实施例15体外释放

体外释放方法用于测定在室温和37℃的条件下初始裂解相从这些纳米微粒中释放。为了保持漏槽状态(sink condition)和预防纳米微粒进入释放样品，设计渗析***。在获得能够造粒100nm微粒的超速离心机之后，除去渗析膜并且离心用于从包封的药物中分离释放药物。

渗析***如下：通过移液器，将3mL多西他赛纳米微粒(大约250μg/mL药物/PLGA/PLA纳米微粒，相应于2.5mg/mL固体浓度)在DI-水的浆料放置在300kDa MWCO渗析器(dialyzer)的内管。所述纳米微粒是在该介质中的悬浮液。将渗析器放入含有130ml释放介质的玻璃瓶(在PBS中的2.5％羟基β环糊精)，在150rpm使用振荡器不断搅拌以防止在膜/外溶液界面形成未搅拌的水层。在预定的时间点，从外溶液(渗析液)取回等分试样的样品(1mL)并且通过HPLC分析多西他赛浓度。

离心***使用相似条件在较低的悬浮液体积(无渗析袋)运行。样品在60,000g离心30分钟和为了药物含量测定上清液以测量释放的药物。

实施例16多西他赛纳米微粒的体外释放

将如在实施例8中制备的多西他赛纳米微粒的悬浮液(10％重量的多西他赛和90％重量的聚合物(1.25wt％PLA-PEG-GL2和98.75wt％PLA-PEG，Mn PLA＝16Da；Mn PEG＝5Da)放置在渗析盒中并且在搅拌下在37℃的PBS储库中温育。收集渗析液的样品，并且使用反相HPLC分析多西他赛。为了比较，常规的多西他赛经历相同的过程。图13描述纳米微粒相对于常规的多西他赛的体外释放特征。包封的多西他赛在第一个24小时内从聚合物基质的释放本质上与剩余部分在约96小时的时间段内从所述微粒的逐渐释放成线性关系。

实施例17西罗莫司纳米微粒

使用实施例8的一般操作，用80％(w/w)聚合物-PEG、或含均聚物PLA的聚合物-PEG(各40％(w/w))、一批5％、15％和30％的总固体％，制备纳米微粒批次。使用溶剂：21％苯甲醇和79％乙酸乙酯(w/w)。对于各2克的批次尺寸，使用400mg的药物和使用1.6g的16-5聚合物-PEG或0.8g的16-5聚合物-PEG+0.8g的10kDa PLA(均聚物)。使用二嵌段聚合物16-5PLA-PEG或PLGA-PEG(50∶50的L∶G)，和如果使用，所述均聚物：PLA，含Mn＝6.5kDa、Mw＝10kDa和Mw/Mn＝1.55。

在2g批次中制备有机相(药物和聚合物)：向20mL闪烁瓶中加入药物和聚合物。在固体浓度％，需要的溶剂的质量如下显示：

i.5％固体：7.98g苯甲醇+30.02g乙酸乙酯

ii.15％固体：2.38g苯甲醇+8.95g乙酸乙酯

iii.30％固体：0.98g苯甲醇+3.69g乙酸乙酯

水溶液用0.5％胆酸钠、2％苯甲醇和4％乙酸乙酯在水中制备。向2L瓶中加入7.5g胆酸钠、1402.5g的DI水、30g的苯甲醇和60g的乙酸乙酯，并且在搅拌板(stir plate)上混合直到溶解。

为了形成乳液，使用的水相与油相的比率是5∶1。将有机相倾倒入水溶液中并且使用IKA在室温均质化10秒以形成粗乳液。在9Kpsi(45psi，在测量仪上)通过匀浆机(110S)供给溶液用于2次谨慎经过以形成纳米乳。

将乳液倾倒入在＜5℃的骤冷液(D.I.水)同时在搅拌盘上搅拌。骤冷液与乳液的比率是8∶1。将35％(w/w)吐温80加入水中以25∶1的吐温80∶药物的比率来骤冷。所述纳米微粒通过TFF浓缩并且骤冷液在具有500kDa Pall盒(2膜)的TFF上用浓缩至～100mL。渗滤使用～20个过滤体积(2升)的冷DI水来进行，并且所述体积降低至最低体积，然后收集最终的浆料，～100mL。未过滤的最终浆料的固体浓度通过下述方式来测定：使用配衡的20mL闪烁瓶和加入4mL最终浆料并在真空下在冻干/干燥箱上干燥，并且测定了纳米微粒在4mL的完全干燥(dry down)的浆料中的重量。将浓缩的蔗糖(0.666g/g)加入最终浆料样品以获得10％蔗糖。

0.45um过滤的最终浆料的固体浓度通过下述方式测定：通过过滤约5mL的最终浆料样品，然后通过0.45μm注射器过滤器加入蔗糖；向配衡的20mL闪烁瓶中加入4mL的过滤样品并在真空下在冻干/干燥箱上干燥。

未过滤的最终浆料的剩余样品与蔗糖冷冻。

雷帕霉素(西罗莫司)配制剂

固体含量的影响和聚乳酸均聚物的包含物的影响已在图14中显示。

体外释放实验通过将纳米微粒分散在37℃的含有10％(w/w)的吐温20(T20)的PBS中来研究。使用T20以增加雷帕霉素在PBS中的溶解度以与通过HPLC的检测保持水平以及保持漏槽状态。将3mL的载药纳米微粒以已知浓度(大约250μg/ml)再分散于在罐中的130mL的释放介质中。选择这些体积以确保药物在释放介质中的最大浓度总是低于10％的最大溶解度，即，漏槽状态。所述介质和纳米微粒悬浮液在150rpm搅拌。在预定的时间点，在50,000rpm(236,000g)4ml的等分试样离心1hr以从洗脱介质中分离纳米微粒。将洗脱介质是注射进入HPLC以测定药物从纳米微粒中的释放。雷帕霉素的释放显示缓慢和持续释放，如图15显。

实施例18-坦罗莫司

如在实施例17和8制备纳米微粒，除了乳化之前在有机相中使用具有30％固体含量的坦罗莫司：

图16描述坦罗莫司的重量％和图17描述用于具有坦罗莫司的不同的聚合物纳米微粒的纳米微粒。如在实施例17的体外释放实验的结果显示如在图18显示的缓慢和持续释放的坦罗莫司的缓慢和持续释放。

实施例19长春瑞滨纳米微粒

使用实施例8的一般操作，用80％(w/w)聚合物-PEG、或含均聚物PLA的聚合物-PEG(各40％(w/w))、一批5％、15％和30％的总固体％，制备纳米微粒批次。使用溶剂：21％苯甲醇和79％乙酸乙酯(w/w)。对于各2克的批次尺寸，使用400mg的长春瑞滨和使用1.6g的16-5聚合物-PEG或0.8g的16-5聚合物-PEG+0.8g的10kDaPLA(均聚物)。使用二嵌段聚合物16-5PLA-PEG或PLGA-PEG(50∶50的L∶G)，和如果使用，所述均聚物：PLA，含Mn＝6.5kDa、Mw＝10kDa和Mw/Mn＝1.55。

在2g批次中制备有机相(药物和聚合物)：向20mL闪烁瓶中加入药物和聚合物。在固体浓度％，需要的溶剂的质量如下显示：

i.5％固体：7.98g苯甲醇+30.02g乙酸乙酯

ii.15％固体：2.38g苯甲醇+8.95g乙酸乙酯

iii.30％固体：0.98g苯甲醇+3.69g乙酸乙酯

水溶液用0.5％胆酸钠、2％苯甲醇和4％乙酸乙酯在水中制备。向瓶中加入7.5g胆酸钠、1402.5g的DI水、30g的苯甲醇和60g的乙酸乙酯，并且在搅拌板(stir plate)上混合直到溶解。

为了形成乳液，使用的水相与油相的比率是5∶1。将有机相倾倒入水溶液中并且使用IKA在室温均质化10秒以形成粗乳液。在9Kpsi(45psi，在测量仪上)通过匀浆机(110S)供给溶液用于2次谨慎经过以形成纳米乳。

将乳液倾倒入在＜5℃的骤冷液(D.I.水)同时在搅拌盘上搅拌。骤冷液与乳液的比率是8∶1。将35％(w/w)吐温80加入水中以25∶1的吐温80∶药物的比率来骤冷。所述纳米微粒通过TFF浓缩并且骤冷液在具有500kDa Pall盒(2膜)的TFF浓缩至～100mL。渗滤使用～20个过滤体积(2升)的冷DI水来进行，并且所述体积降低至最低体积，然后收集最终的浆料，～100mL。未过滤的最终浆料的固体浓度通过下述方式来测定：使用配衡的20mL闪烁瓶和加入4mL最终浆料并在真空下在冻干/干燥箱上干燥，并且测定了纳米微粒在4mL的完全干燥的浆料中的重量。将浓缩的蔗糖(0.666g/g)加入最终浆料样品以获得10％蔗糖。

0.45um过滤的最终浆料的固体浓度通过下述方式测定：通过过滤约5mL的最终浆料样品，然后通过0.45μm注射器过滤器加入蔗糖；向配衡的20mL闪烁瓶中加入4mL的过滤样品并在真空下在冻干/干燥箱上干燥。

未过滤的最终浆料的剩余样品与蔗糖冷冻。

长春瑞滨配制剂：

^＊＝在样品上的体外释放

在30％的总固体的三个配制剂(16-5PLA-PEG；16-5PLA-PEG+PLA；和16-5PLGA-PEG+PLA)上进行体外释放，并且在37℃在空气室使用在PBS溶液中的10％脲作为释放介质来收集体外释放数据。在下表和图19描述结果：

实施例20-长春新碱

使用实施例8的一般操作，制备包含长春新碱的纳米微粒配制剂。

长春新碱配制剂

参考编号	组分	组合物(按Wt.(％)计)
			50-103-3-5	mPEG(5k)-lPLA(16K)/长春新碱	96/4
50-117-1-5	mPEG(5k)-lPLA(16K)/长春新碱	95/5
			50-117-2-5	mPEG(5k)-lPLA(16K)/长春新碱	96/4
50-103-4	mPEG(5k)-lPLA(16K)/lPLA(16K)/长春新碱	46/46/8
			50-103-2	mPEG(5k)-lPLA(16K)/lPLA(16K)/长春新碱	47/47/6

长春新碱配制剂的分析特征

在长春新碱配制剂上进行体外释放，和在37℃在空气室使用在PBS溶液中的10％脲作为释放介质来收集体外释放数据。图20描述若干参考批次的体外释放。

实施例21药物代谢动力学

如在实施例20中制备的具有长春新碱的纳米微粒和如在实施例8中制备的具有多西他赛的纳米微粒的药物代谢动力学(PK)在Sprague-Dawley(SD)大鼠中测定。在时间＝0，对大鼠(大约300g的雄性Sprague Dawley，颈静脉插管)给予0.5mg/kg游离药物的单次静脉内剂量或单次静脉内给予含5mg/kg药物和PTNP的包封药物的被动靶向纳米微粒(10wt％药物，90wt聚合物(PLA-PEG，Mn PLA＝16Da；Mn PEG＝5Da，PTNP)。在给药后的不同时间点，从颈静脉插管将血液样本收集到含有肝素锂的小管，并且制备血浆。血浆水平通过从血浆中提取药物，然后通过LCMS分析来测定。

图21描述长春新碱和长春新碱PTNP，和多西他赛和多西他赛PTNP的PK特征。

实施例22微粒尺寸的分析

微粒尺寸通过两种技术-动态光散射(DLS)和激光衍射分析。在25℃、使用Brookhaven ZetaPals设备、在稀释的水性悬浮液中使用在90°散射的位于660nm激光进行DLS，并且使用Cumulants和NNLS方法(TP008)分析。用Horiba LS950设备、在稀释的水性悬浮液中、使用在90°散射的位于633nm的HeNe laser和位于405nm的LED，进行激光衍射并且使用Mie optical模型(TP009)分析。从DLS的输出与所述微粒的流体力学半径(包括PEG ‘冠’)相关，而激光衍射设备与PLA微粒‘核’的几何尺寸更相关。

实施例23-配体密度

假定整个微粒直径等同于通过Brookhaven微粒尺寸测量的流体力学直径，纳米微粒是正球形，并且全部亲水PEG和配体在表面上表达，以及全部PEG是完全水合的，可以建立所述微粒表面的模型，如表I所示：

表I：16/5共聚-聚合物和6.5kDa均聚物的100nm微粒的纳米微粒表面模型

实施例24-乳腺癌肿瘤靶向

在移植有MX-1异种移植物的小鼠种，评价了如在实例8中制备的静脉内给予的纳米微粒(10wt％多西他赛、90wt聚合物(～1.25wt％PLA-PEG-GL2；和～98.75％PLA-PEG，Mn PLA＝16Da；Mn PEG＝5Da)(标记为BIND-14)相对于具有相同药物/聚合物组合物(PTNP)的常规的多西他赛和非-靶向控制微粒而言，抑制非-***肿瘤生长的能力。当肿瘤达到300mm³的平均体积，对小鼠每4天给予试验物品(蔗糖、多西他赛、PTNP、BIND-14)3次。各治疗组随时间的平均肿瘤体积显示在图22。

在携带有人类MX-1乳腺癌异种移植物的小鼠中评价了，在静脉内给药之后靶向纳米微粒(BIND-14)增强多西他赛向肿瘤递送的能力，其中平均肿瘤体积为1700mm³。使用LC/MS/MS，在IV给药24小时后，在来自给予BIND-14、PTNP和常规的多西他赛的动物的切除肿瘤中，分析了用于多西他赛含量的多西他赛的浓度(ng/mg)，并且在图23中所示。

实施例25***癌肿瘤靶向

在携带有人类LNCaP***癌的异体移植物的雄性SCID小鼠中评价了，在静脉给药后，使用如在实施例8中制备的纳米微粒(10wt％多西他赛、90wt聚合物(～1.25wt％PLA-PEG-GL2；和～98.75％PLA-PEG，Mn PLA＝16Da；Mn PEG＝5Da；BIND-14)，多西他赛的纳米微粒向肿瘤的递送。雄性SCID小鼠皮下接种有人类LNCaP***癌细胞。在接种后的三至四周，单次IV给予5mg/kg的多西他赛，所述多西他赛为BIND-014或常规的多西他赛。在给药2h或12h后杀死小鼠。从各组切除肿瘤和通过LC-MS方法测定多西他赛。

在单次给予50mg/kg的BIND-14的12小时之后，接受BIND-14的动物中的肿瘤多西他赛浓度，相对于接受常规的DTXL动物中的肿瘤多西他赛浓度而言，高大约7倍，表明如图24所示长-循环PSMA-靶向纳米微粒向肿瘤位点递送更多DTXL。

如图25所示，也在LNCaP异种移植物肿瘤模型中评价了，重复给予BIND-014抑制肿瘤生长的能力。雄性SCID小鼠皮下接种有人类LNCaP***癌细胞。在接种之后的三至四周，每隔1天给予小鼠BIND-014、常规的多西他赛(DTXL)、包封在非-靶向纳米微粒(PTNP)中的DTXL、和媒介物(对照)4次。在4次5mg/kg给药后，相对于接受常规的多西他赛或非-靶向微粒(PTNP)的动物中而言，肿瘤体积在接受BIND-014的动物中的减少更大。在肿瘤中多西他赛浓度的增加导致更显著的细胞毒效果。

等价物

使用不超过常规实验，本领域的那些技术人员将认识到或可以确定，本文描述的本发明的具体实施方式的多种等价物。这种等价物意欲被涵盖在下述权利要求中。

通过参考并入

本文引用的全部专利、公开的专利应用、网址和其它参考文献的全部内容在此特别以全文的方式通过引用并入本文。

Claims (52)

1.治疗性纳米微粒，包含：

约0.2-约35重量百分比的治疗剂；

约10-约99重量百分比的二嵌段聚乳酸-聚乙二醇共聚物或二嵌段聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物；和

约0-约75重量百分比的聚乳酸或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸。

2.权利要求1的治疗性纳米微粒，其中所述治疗剂是紫杉烷。

3.权利要求1的治疗性纳米微粒，其中所述治疗剂是长春花生物碱。

4.权利要求3的治疗性纳米微粒，其中所述治疗剂是长春新碱或长春瑞滨。

5.权利要求1的治疗性纳米微粒，其中所述治疗剂是mTOR抑制剂。

6.权利要求5的治疗性纳米微粒，其中所述治疗剂是西罗莫司、坦罗莫司或依维莫司。

7.权利要求1-6中任一项的治疗性纳米微粒，其中所述治疗性纳米微粒的流体力学直径是约60-约120nm。

8.权利要求1-7中任一项的治疗性纳米微粒，其中所述流体力学直径是约70-约120nm。

9.权利要求1-8中任一项的治疗性纳米微粒，其中所述治疗性纳米微粒在25℃基本上保留治疗剂至少5天。

10.权利要求1-2或7-9中任一项的治疗性纳米微粒，包含约10-约20重量百分比的紫杉烷药剂。

11.权利要求1、3、4或7-9中任一项的治疗性纳米微粒，包含约10-约20重量百分比的长春花生物碱。

12.权利要求1或5-9中任一项的治疗性纳米微粒，包含约10-约20重量百分比的西罗莫司。

13.权利要求1-12中任一项的治疗性纳米微粒，包含约40-约90重量百分比的聚乳酸-聚乙二醇共聚物。

14.权利要求13的治疗性纳米微粒，其中所述聚乳酸-聚乙二醇共聚物包含具有约15-100kDa的数均分子量的聚乳酸和具有约2-约10Da的数均分子量的聚乙二醇。

15.权利要求13的治疗性纳米微粒，其中所述聚乳酸-聚乙二醇共聚物包含具有约15-20kDa的数均分子量的聚乳酸和具有约4-约6kDa的数均分子量的聚乙二醇。

16.权利要求1-15中任一项的治疗性纳米微粒，其中当所述微粒被放置在室温的磷酸盐缓冲溶液中时，它在1小时内基本上立即释放低于约5％的治疗剂。

17.权利要求1-15中任一项的治疗性纳米微粒，其中当所述微粒被放置在室温的磷酸盐缓冲溶液中时，它在24小时内基本上立即释放低于约10％的治疗剂。

18.权利要求1-17中任一项的治疗性纳米微粒，其中当所述微粒被放置在37℃的磷酸盐缓冲溶液中时，它基本上立即释放低于约10％的治疗剂。

19.权利要求1-18中任一项的治疗性纳米微粒，包含约30-约50重量百分比的PLA-PEG、约30-约50重量百分比的PLA或PLGA和约15-约25重量百分比的活性剂。

20.权利要求1-19中任一项的治疗性纳米微粒，其中所述PLA具有约5-约10kDa的数均分子量。

21.权利要求1-19中任一项的治疗性纳米微粒，其中所述PLA具有约5-约100kDa的数均分子量。

22.权利要求1-19中任一项的治疗性纳米微粒，其中所述PLGA具有约8-约12kDa的数均分子量。

23.权利要求1-19中任一项的治疗性纳米微粒，其中所述PLGA具有约8-约100kDa的数均分子量。

24.权利要求1-23中任一项的治疗性纳米微粒，还包含被靶向配体官能化的约0.2-约30重量百分比的PLA-PEG。

25.权利要求1-23中任一项的治疗性纳米微粒，还包含被靶向配体官能化的约0.2-约30重量百分比的聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-PEG。

26.权利要求24或25的治疗性纳米微粒，其中所述靶向配体共价结合至PEG。

27.权利要求1-23中任一项的治疗性纳米微粒，还包含被靶向配体官能化的约0.2-约10重量百分比的PLA-PEG。

28.权利要求1-27中任一项的治疗性纳米微粒，还包含约0.2-约10摩尔百分比的PLA-PEG-GL2或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-PEG-GL2。

29.权利要求1-27中任一项的治疗性纳米微粒，还包含选自下述的聚合物化合物：

其中R₁选自H和任选地被卤素取代的C₁-C₂₀烷基基团；

R₂是键、酯连接基或酰胺连接基；

R₃是C₁-C₁₀亚烷基或键；

x是50-约1500；

y是0-约50；和

z是约30-约200。

30.权利要求1-27中任一项的治疗性纳米微粒，还包含由下式表示的聚合物化合物：

其中y是约222和z是约114。

31.治疗性纳米微粒，包含：

约0.2-约35重量百分比的治疗剂；

约30-约99重量百分比的聚乳酸-聚乙二醇共聚物或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物；

约0-约50重量百分比的聚乳酸或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸；和

约0.2-约10重量百分比的PLA-PEG-GL2或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-PEG-GL2。

32.权利要求31的治疗性纳米微粒，其中所述PLA-PEG-GL2包含具有约10,000Da-约20,000Da的数均分子量的聚乳酸和具有约4,000-约8,000的数均分子量的聚乙二醇。

33.权利要求32的治疗性纳米微粒，包含选自下述的聚合物化合物：

其中R₁选自H，和任选地被卤素取代的C₁-C₂₀烷基基团；

R₂是键、酯连接基或酰胺连接基；

R₃是C₁-C₁₀亚烷基或键；

x是约100-约300；

y是0-约50；和

z是约70-约200。

34.权利要求33的治疗性纳米微粒，其中y是0。

35.权利要求33或34的治疗性纳米微粒，其中x是约170-约260。

36.权利要求31-35中任一项的治疗性纳米微粒，其中z是约80-约130。

37.权利要求31-36中任一项的治疗性纳米微粒，其中PLA-PEG-GL2由下式表示：

其中y是约222和z是约114。

38.权利要求1-37中任一项的治疗性纳米微粒，还包含脂肪醇。

39.权利要求38的治疗性纳米微粒，其中所述脂肪醇是鲸蜡醇。

40.组合物，包含权利要求1-39中任一项的多个纳米微粒，和药学上可接受的赋形剂。

41.权利要求39的组合物，包含低于约10ppm的钯。

42.药物组合物，包含：

多个聚合物纳米微粒，各包含约0.2-约35重量百分比的治疗剂，约70-约99重量百分比的生物相容的聚合物，和任选地脂肪醇；其中所述生物相容的聚合物选自：a)聚乳酸-聚乙二醇共聚物；b)聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物；c)a)或b)和聚乳酸或聚乳酸-共聚-乙醇酸共聚物的组合；和

药学上可接受的赋形剂。

43.权利要求42的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂是蔗糖。

44.权利要求43的药物组合物，其中当所述纳米微粒被放置在25℃的磷酸盐缓冲溶液中一个小时时，它释放低于约10％的紫杉烷药剂。

45.权利要求42-44中任一项的药物组合物，其中所述纳米微粒在25℃基本上保留治疗剂至少5天。

46.权利要求42-45中任一项的药物组合物，其中所述治疗剂选自多西他赛、长春新碱、长春瑞滨、西罗莫司和tersirolimus。

47.纳米微粒配制剂，包含：

权利要求1-39中任一项的多个纳米微粒；

蔗糖；和

水。

48.权利要求47的纳米微粒配制剂，其中所述纳米微粒/蔗糖/水是约5-10％/10-35％/60-90％(w/w/w)。

49.适用于治疗实体瘤的在治疗上可接受的纳米微粒，包含：

其中y是约222和z是约114；和约5-约25重量百分比的活性剂。

50.权利要求49的在治疗上可接受的纳米微粒，其中所述活性剂选自mTOR抑制剂、紫杉烷或长春花生物碱。

51.治疗***或乳腺癌的方法，包括给予有此需要的患者有效量的权利要求1-50中任一项的任意治疗性纳米微粒或组合物。

52.治疗***或乳腺癌的方法，包括给予有此需要的患者有效量的治疗性纳米微粒，所述治疗性纳米微粒包含：

约0.2-约35重量百分比的多西紫杉醇；

约30-约90重量百分比的聚乳酸-聚乙二醇共聚物或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物；

任选地，约5-约75重量百分比的聚乳酸或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸；和

约0.2-约10重量百分比的PLA-PEG-GL2或聚乳酸-共聚-聚乙醇酸-PEG-GL2。

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